CN111996190A - 一种全血基因组dna提取试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及DNA提取试剂盒技术领域，尤其涉及一种全血基因组DNA提取试剂盒，包括裂解液、调节珠、纳米磁珠、洗涤液A、洗涤液B和洗脱液；所述裂解液中包含异硫氰酸胍、N‑月桂酰肌氨酸钠、盐酸胍、蛋白酶k和Tween20；所述调节珠包含半透膜球囊，半透膜球囊的内部放置有氯化钠；所述纳米磁珠为包裹有氧化硅的四氧化三铁；所述洗涤液A包含十六烷基三甲基溴化铵、Tris‑HCl、异硫氰酸胍，无水乙醇和FMES；所述洗涤液B包含Tris‑HCl和无水乙醇；所述洗脱液包括Tris‑HCl、EDTA二钠，该试剂盒在使用过程中，通过调节珠来吸收裂解过程中产生的一些水分，调节裂解液的浓度，核酸的回收效率不会受到不良的影响，保证检测结果的准确性。

Description

一种全血基因组DNA提取试剂盒

技术领域

本发明涉及DNA提取试剂盒技术领域，尤其涉及一种全血基因组DNA提取试剂盒。

背景技术

核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作。核酸提取是指利用物理、化学方法将核算从载体中分离出来的过程。目前，在国内大部分医疗机构及科研领域均需要从大批量血液样本中提取核酸。因此，为了保证抽提出高浓度的核酸，人们不断开发出新的技术。

核酸提取方法繁多，包括传统的酚-氯仿法、盐析法、滤膜离心柱法等。这些方法各有其优缺点，但总体上核酸提取的效果差强人意。磁珠法是通过磁性硅胶吸附细胞，随后加入细胞裂解液裂解细胞。从细胞中游离出来的核酸被吸附到磁性颗粒表面，而蛋白等分子不被吸附而留在溶液中。在磁场作用下，磁性颗粒与液体分离。此时，弃去含有杂质的液体，并用相应的洗脱液洗脱磁珠上吸附的核酸。该方法不需离心，操作简单，可以使核酸提取效率显著升高，已成为目前新兴的核酸提取技术。

在本领域中，磁珠法提取核酸普遍使用的裂解液为含有胍盐的裂解液。胍盐是一种强蛋白质变性剂，采用高浓度的胍盐来裂解细胞，可迅速破坏细胞结构，裂解细胞，使核酸从蛋白质中释放出来。磁珠法提取核酸所使用的磁珠，表面包裹了各种活性基团，有研究表明裂解液中的离子强度、pH等条件会直接影响这些功能集团的活性，进而影响磁珠吸附核酸的量。有研究表明，当胍盐裂解液稀释度降低到60％以下时，样品DNA回收效率明显降低。全血中的蛋白质等物质在水解过程中，会对裂解液的浓度造成一定影响，面对这种情况，就必须控制加入经前处理的样本量，以保证胍盐液的浓度，避免因过量稀释而影响磁珠与核酸的结合，从而导致核酸回收效率降低，导致检测结果不准确。

因此，我们提出了一种全血基因组DNA提取试剂盒用于解决上述问题。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种全血基因组DNA提取试剂盒。

一种全血基因组DNA提取试剂盒，包括裂解液、调节珠、纳米磁珠、洗涤液A、洗涤液B和洗脱液；

所述裂解液中包含异硫氰酸胍、N-月桂酰肌氨酸钠、盐酸胍、蛋白酶k和Tween20；

所述调节珠包含半透膜球囊，半透膜球囊的内部放置有氯化钠；

所述纳米磁珠为包裹有氧化硅的四氧化三铁；

所述洗涤液A包含十六烷基三甲基溴化铵、Tris-HCl、异硫氰酸胍，无水乙醇和FMES；

所述洗涤液B包含Tris-HCl和无水乙醇；

所述洗脱液包括Tris-HCl、EDTA二钠。

优选的，所述裂解液的pH值为5.0-7.5；所述裂解液中异硫氰酸胍的浓度为1-3mM、N-月桂酰肌氨酸钠的浓度为0.5%-1%，盐酸胍的浓度为2-4M、蛋白酶k的浓度为1%-3%，Tween20的浓度为2%-4%。

优选的，所述调节珠中半透膜球囊的直径为2-4mm，半透膜球囊内氯化钠的质量为40-100mg。

优选的，所述半透膜球囊的外侧包覆有聚丙烯酰胺，聚丙烯酰胺的质量为氯化钠质量的0.01-0.06倍。

优选的，所述纳米磁珠的直径为500-2000nm，浓度为50-100mg/ml。

优选的，所述洗涤液A中十六烷基三甲基溴化铵的浓度为50-100mM、pH值为7.0-8.5的Tris-Hcl的浓度为10-30mM、异硫氰酸胍的浓度为1-2M，无水乙醇的体积百分数为40%-60%、FMES的浓度为10-50mM。

优选的，所述洗涤液B中pH值为7.0-8.5的Tris-HCl的浓度为10-30mM、无水乙醇的体积百分数为40%-60%。

优选的，所述洗脱液的pH值为7.0-8.5，所述洗脱液中Tris-HCl的浓度为10-30mM、EDTA二钠的浓度为0.2-0.4mM。

优选的，所述试剂盒的使用方法包括以下步骤：

S1、取100-300ul新鲜全血样本于1.5ml离心管中，使用无菌移液器加入200-400ul裂解液，并加入1-2个调节珠，30-60℃水浴20-30min；

S2、取出调节珠，并使用无菌移液器向离心管中加入300-500ul异丙醇和15-30ul纳米磁珠，震荡混匀10-15min；

S3、将经步骤S2处理的离心管置于磁力架上40-50S，待纳米磁珠完全吸附至管壁之后，使用无菌移液器吸弃上清溶液；

S4、使用无菌移液器向步骤S3离心管中加入500-800ul洗涤液A，将该离心管震荡混匀2min，置于磁力架上30-60s，待纳米磁珠完全吸附至管壁之后，使用无菌移液器吸弃上清溶液；

S5、使用无菌移液器向步骤S4离心管中加入500-800ul洗涤液B，将该离心管震荡混匀2min，置于磁力架上30-60s，待纳米磁珠完全吸附至管壁之后，使用无菌移液器吸弃上清溶液；

S6、使用无菌移液器向步骤S5离心管中加入70-200ul洗脱液，40-60℃水浴10-15min，然后将离心管置于磁力架上30-60s，待纳米磁珠完全吸附至管壁之后，使用无菌移液器吸取上清至新的离心管中，即获得所需DNA。

本发明的有益效果是：该试剂盒在使用过程中，通过调节珠来吸收裂解过程中产生的一些水分，调节裂解液的浓度，使得异硫氰酸胍和盐酸胍的浓度不会降低，从而使得后续反应过程中磁珠与核酸正常的结合，核酸的回收效率不会受到不良的影响，保证检测结果的准确性。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。

实施例1中，一种全血基因组DNA提取试剂盒，包括裂解液、调节珠、纳米磁珠、洗涤液A、洗涤液B和洗脱液；

所述裂解液中包含异硫氰酸胍、N-月桂酰肌氨酸钠、盐酸胍、蛋白酶k和Tween20；

所述调节珠包含半透膜球囊，半透膜球囊的内部放置有氯化钠；

所述纳米磁珠为包裹有氧化硅的四氧化三铁；

所述洗涤液A包含十六烷基三甲基溴化铵、Tris-HCl、异硫氰酸胍，无水乙醇和FMES；

所述洗涤液B包含Tris-HCl和无水乙醇；

所述洗脱液包括Tris-HCl、EDTA二钠。

进一步的，裂解液的pH值为5.0-7.5；所述裂解液中异硫氰酸胍的浓度为1mM、N-月桂酰肌氨酸钠的浓度为0.5%，盐酸胍的浓度为2M、蛋白酶k的浓度为1%，Tween20的浓度为2%。

进一步的，调节珠中半透膜球囊的直径为2mm，半透膜球囊内氯化钠的质量为40mg。

进一步的，半透膜球囊的外侧包覆有聚丙烯酰胺，聚丙烯酰胺的质量为氯化钠质量的0.01倍。

进一步的，纳米磁珠的直径为500nm，浓度为50mg/ml。

进一步的，洗涤液A中十六烷基三甲基溴化铵的浓度为50mM、pH值为7.0-8.5的Tris-Hcl的浓度为10mM、异硫氰酸胍的浓度为1M，无水乙醇的体积百分数为40%、FMES的浓度为10mM。

进一步的，洗涤液B中pH值为7.0-8.5的Tris-HCl的浓度为10mM、无水乙醇的体积百分数为40%。

进一步的，洗脱液的pH值为7.0-8.5，所述洗脱液中Tris-HCl的浓度为10mM、EDTA二钠的浓度为0.2mM。

进一步的，试剂盒的使用方法包括以下步骤：

S1、取100ul新鲜全血样本于1.5ml离心管中，使用无菌移液器加入200ul裂解液，并加入1个调节珠，30℃水浴20min；

S2、取出调节珠，并使用无菌移液器向离心管中加入300ul异丙醇和15ul纳米磁珠，震荡混匀10min；

S3、将经步骤S2处理的离心管置于磁力架上40S，待纳米磁珠完全吸附至管壁之后，使用无菌移液器吸弃上清溶液；

S4、使用无菌移液器向步骤S3离心管中加入500ul洗涤液A，将该离心管震荡混匀2min，置于磁力架上30s，待纳米磁珠完全吸附至管壁之后，使用无菌移液器吸弃上清溶液；

S5、使用无菌移液器向步骤S4离心管中加入500ul洗涤液B，将该离心管震荡混匀2min，置于磁力架上30s，待纳米磁珠完全吸附至管壁之后，使用无菌移液器吸弃上清溶液；

S6、使用无菌移液器向步骤S5离心管中加入70ul洗脱液，40℃水浴10min，然后将离心管置于磁力架上30s，待纳米磁珠完全吸附至管壁之后，使用无菌移液器吸取上清至新的离心管中，即获得所需DNA。

实施例2中，一种全血基因组DNA提取试剂盒，包括裂解液、调节珠、纳米磁珠、洗涤液A、洗涤液B和洗脱液；

所述裂解液中包含异硫氰酸胍、N-月桂酰肌氨酸钠、盐酸胍、蛋白酶k和Tween20；

所述调节珠包含半透膜球囊，半透膜球囊的内部放置有氯化钠；

所述纳米磁珠为包裹有氧化硅的四氧化三铁；

所述洗涤液A包含十六烷基三甲基溴化铵、Tris-HCl、异硫氰酸胍，无水乙醇和FMES；

所述洗涤液B包含Tris-HCl和无水乙醇；

所述洗脱液包括Tris-HCl、EDTA二钠。

进一步的，裂解液的pH值为5.0-7.5；所述裂解液中异硫氰酸胍的浓度为3mM、N-月桂酰肌氨酸钠的浓度为1%，盐酸胍的浓度为4M、蛋白酶k的浓度为3%，Tween20的浓度为4%。

进一步的，调节珠中半透膜球囊的直径为4mm，半透膜球囊内氯化钠的质量为100mg。

进一步的，半透膜球囊的外侧包覆有聚丙烯酰胺，聚丙烯酰胺的质量为氯化钠质量的0.06倍。

进一步的，纳米磁珠的直径为2000nm，浓度为100mg/ml。

进一步的，洗涤液A中十六烷基三甲基溴化铵的浓度为100mM、pH值为7.0-8.5的Tris-Hcl的浓度为30mM、异硫氰酸胍的浓度为2M，无水乙醇的体积百分数为60%、FMES的浓度为50mM。

进一步的，洗涤液B中pH值为7.0-8.5的Tris-HCl的浓度为30mM、无水乙醇的体积百分数为60%。

进一步的，洗脱液的pH值为7.0-8.5，所述洗脱液中Tris-HCl的浓度为30mM、EDTA二钠的浓度为0.4mM。

进一步的，试剂盒的使用方法包括以下步骤：

S1、取300ul新鲜全血样本于1.5ml离心管中，使用无菌移液器加入400ul裂解液，并加入2个调节珠，60℃水浴30min；

S2、取出调节珠，并使用无菌移液器向离心管中加入500ul异丙醇和30ul纳米磁珠，震荡混匀15min；

S3、将经步骤S2处理的离心管置于磁力架上50s，待纳米磁珠完全吸附至管壁之后，使用无菌移液器吸弃上清溶液；

S4、使用无菌移液器向步骤S3离心管中加入800ul洗涤液A，将该离心管震荡混匀2min，置于磁力架上60s，待纳米磁珠完全吸附至管壁之后，使用无菌移液器吸弃上清溶液；

S5、使用无菌移液器向步骤S4离心管中加入800ul洗涤液B，将该离心管震荡混匀2min，置于磁力架上60s，待纳米磁珠完全吸附至管壁之后，使用无菌移液器吸弃上清溶液；

S6、使用无菌移液器向步骤S5离心管中加入200ul洗脱液，60℃水浴15min，然后将离心管置于磁力架上60s，待纳米磁珠完全吸附至管壁之后，使用无菌移液器吸取上清至新的离心管中，即获得所需DNA。

实施例3中，一种全血基因组DNA提取试剂盒，包括裂解液、调节珠、纳米磁珠、洗涤液A、洗涤液B和洗脱液；

所述裂解液中包含异硫氰酸胍、N-月桂酰肌氨酸钠、盐酸胍、蛋白酶k和Tween20；

所述调节珠包含半透膜球囊，半透膜球囊的内部放置有氯化钠；

所述纳米磁珠为包裹有氧化硅的四氧化三铁；

所述洗涤液A包含十六烷基三甲基溴化铵、Tris-HCl、异硫氰酸胍，无水乙醇和FMES；

所述洗涤液B包含Tris-HCl和无水乙醇；

所述洗脱液包括Tris-HCl、EDTA二钠。

进一步的，裂解液的pH值为5.0-7.5；所述裂解液中异硫氰酸胍的浓度为2mM、N-月桂酰肌氨酸钠的浓度为0.5%，盐酸胍的浓度为3M、蛋白酶k的浓度为2%，Tween20的浓度为3%。

进一步的，调节珠中半透膜球囊的直径为3mm，半透膜球囊内氯化钠的质量为80mg。

进一步的，半透膜球囊的外侧包覆有聚丙烯酰胺，聚丙烯酰胺的质量为氯化钠质量的0.3倍。

进一步的，纳米磁珠的直径为1000nm，浓度为70mg/ml。

进一步的，洗涤液A中十六烷基三甲基溴化铵的浓度为80mM、pH值为7.0-8.5的Tris-Hcl的浓度为20mM、异硫氰酸胍的浓度为1.5M，无水乙醇的体积百分数为50%、FMES的浓度为30mM。

进一步的，洗涤液B中pH值为7.0-8.5的Tris-HCl的浓度为20mM、无水乙醇的体积百分数为50%。

进一步的，洗脱液的pH值为7.0-8.5，所述洗脱液中Tris-HCl的浓度为20mM、EDTA二钠的浓度为0.3mM。

进一步的，试剂盒的使用方法包括以下步骤：

S1、取200ul新鲜全血样本于1.5ml离心管中，使用无菌移液器加入300ul裂解液，并加入1-2个调节珠，40℃水浴25min；

S2、取出调节珠，并使用无菌移液器向离心管中加入400ul异丙醇和20ul纳米磁珠，震荡混匀12min；

S3、将经步骤S2处理的离心管置于磁力架上45S，待纳米磁珠完全吸附至管壁之后，使用无菌移液器吸弃上清溶液；

S4、使用无菌移液器向步骤S3离心管中加入600ul洗涤液A，将该离心管震荡混匀2min，置于磁力架上50s，待纳米磁珠完全吸附至管壁之后，使用无菌移液器吸弃上清溶液；

S5、使用无菌移液器向步骤S4离心管中加入600ul洗涤液B，将该离心管震荡混匀2min，置于磁力架上50s，待纳米磁珠完全吸附至管壁之后，使用无菌移液器吸弃上清溶液；

S6、使用无菌移液器向步骤S5离心管中加入150ul洗脱液，40-60℃水浴12min，然后将离心管置于磁力架上50s，待纳米磁珠完全吸附至管壁之后，使用无菌移液器吸取上清至新的离心管中，即获得所需DNA。

实施例1-3中，该试剂盒在使用过程中，通过调节珠来吸收裂解过程中产生的一些水分，调节珠使用时，调节珠的内部为高浓度的盐水，外界的水会慢慢的通过半透膜，调节珠的外侧还设置有聚丙烯酰胺，聚丙烯酰胺对液体内的蛋白质具有一定的絮凝作用，便于蛋白质的初步分离，待核酸被磁珠吸引后调节裂解液的浓度，使得异硫氰酸胍和盐酸胍的浓度不会降低，从而使得后续反应过程中磁珠与核酸正常的结合，核酸的回收效率不会受到不良的影响，保证检测结果的准确性。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种全血基因组DNA提取试剂盒，其特征在于，包括裂解液、调节珠、纳米磁珠、洗涤液A、洗涤液B和洗脱液；

所述裂解液中包含异硫氰酸胍、N-月桂酰肌氨酸钠、盐酸胍、蛋白酶k和Tween20；

所述调节珠包含半透膜球囊，半透膜球囊的内部放置有氯化钠；

所述纳米磁珠为包裹有氧化硅的四氧化三铁；

所述洗涤液A包含十六烷基三甲基溴化铵、Tris-HCl、异硫氰酸胍，无水乙醇和FMES；

所述洗涤液B包含Tris-HCl和无水乙醇；

所述洗脱液包括Tris-HCl、EDTA二钠。

2.根据权利要求1所述的一种全血基因组DNA提取试剂盒，其特征在于，所述裂解液的pH值为5.0-7.5；所述裂解液中异硫氰酸胍的浓度为1-3mM、N-月桂酰肌氨酸钠的浓度为0.5%-1%，盐酸胍的浓度为2-4M、蛋白酶k的浓度为1%-3%，Tween20的浓度为2%-4%。

3.根据权利要求1所述的一种全血基因组DNA提取试剂盒，其特征在于，所述调节珠中半透膜球囊的直径为2-4mm，半透膜球囊内氯化钠的质量为40-100mg。

4.根据权利要求3所述的一种全血基因组DNA提取试剂盒，其特征在于，所述半透膜球囊的外侧包覆有聚丙烯酰胺，聚丙烯酰胺的质量为氯化钠质量的0.01-0.06倍。

5.根据权利要求1所述的一种全血基因组DNA提取试剂盒，其特征在于，所述纳米磁珠的直径为500-2000nm，浓度为50-100mg/ml。

6.根据权利要求1所述的一种全血基因组DNA提取试剂盒，其特征在于，所述洗涤液A中十六烷基三甲基溴化铵的浓度为50-100mM、pH值为7.0-8.5的Tris-Hcl的浓度为10-30mM、异硫氰酸胍的浓度为1-2M，无水乙醇的体积百分数为40%-60%、FMES的浓度为10-50mM。

7.根据权利要求1所述的一种全血基因组DNA提取试剂盒，其特征在于，所述洗涤液B中pH值为7.0-8.5的Tris-HCl的浓度为10-30mM、无水乙醇的体积百分数为40%-60%。

8.根据权利要求1所述的一种全血基因组DNA提取试剂盒，其特征在于，所述洗脱液的pH值为7.0-8.5，所述洗脱液中Tris-HCl的浓度为10-30mM、EDTA二钠的浓度为0.2-0.4mM。

9.根据权利要求1-8任一所述的一种全血基因组DNA提取试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的使用方法包括以下步骤：

S1、取100-300ul新鲜全血样本于1.5ml离心管中，使用无菌移液器加入200-400ul裂解液，并加入1-2个调节珠，30-60℃水浴20-30min；

S2、取出调节珠，并使用无菌移液器向离心管中加入300-500ul异丙醇和15-30ul纳米磁珠，震荡混匀10-15min；

S3、将经步骤S2处理的离心管置于磁力架上40-50S，待纳米磁珠完全吸附至管壁之后，使用无菌移液器吸弃上清溶液；

S4、使用无菌移液器向步骤S3离心管中加入500-800ul洗涤液A，将该离心管震荡混匀2min，置于磁力架上30-60s，待纳米磁珠完全吸附至管壁之后，使用无菌移液器吸弃上清溶液；

S5、使用无菌移液器向步骤S4离心管中加入500-800ul洗涤液B，将该离心管震荡混匀2min，置于磁力架上30-60s，待纳米磁珠完全吸附至管壁之后，使用无菌移液器吸弃上清溶液；

S6、使用无菌移液器向步骤S5离心管中加入70-200ul洗脱液，40-60℃水浴10-15min，然后将离心管置于磁力架上30-60s，待纳米磁珠完全吸附至管壁之后，使用无菌移液器吸取上清至新的离心管中，即获得所需DNA。