JP5265552B2 - 陰イオン交換を用いる核酸精製方法 - Google Patents
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Description
a)前記細胞を溶解液で溶解して核酸含有水溶液を生成する段階、
b)陰イオン交換体が核酸を結合するような条件下で、核酸含有水溶液を固体支持マトリックスに結合された陰イオン交換体に接触させる段階、及び
c)核酸溶離液からなる水性移動相を用いて前記陰イオン交換体を溶離する段階
を含んでなる方法において、
前記溶離液が水性移動相のpHを約pH9〜約pH13にするような添加剤を含み、溶離液中における添加剤の存在が添加剤の不存在下での前記核酸の回収率に比べて陰イオン交換体からの核酸回収率の増加をもたらすことを特徴する方法を提供する。
(a)血液からのゲノムDNAの単離
血液からのゲノムDNA単離は2段階で行われる。第1の段階は細胞の溶解であり、第2の段階はイオン交換カラムクロマトグラフィーを用いるゲノムDNAの精製である。
1.5mlの全血を50mlの円錐形遠心管に加える。
2.5mlの予冷した溶解1液及び15mlの冷水を試料に加える。管をラックに入れ、管を10〜15回転倒させることでよく混合する。
3.周囲温度で10分間インキュベートする。
4.1500×gで10分間遠心する。
5.ペレットを乱すことなく、希釈漂白液を入れた廃棄物容器内に上澄みを廃棄する(又はEHSによって推奨される適切な安全対策に従う)。
6.1mlの溶解1液及び3mlの水を遠心管に加え、短時間渦動させることでペレットを再懸濁する。
7.5000×gで10分間遠心する。
8.白血球ペレットを乱すことなしに上澄みを注意深く廃棄する。
9.最高速度で30秒〜1分間渦動させることで白血球ペレットを5mlの溶解2液中に再懸濁する。
10.50μlのプロテイナーゼK(20mg/ml)(AG Scientific社)を加え、短時間渦動させ、周囲温度で20分間インキュベートする。
11.5mlのローディング液を遠心管に加え、管を渦動させることでよく混合し、この溶液を精製カラム上にロードする。
12.イオン交換精製カラム(計器上での自動化プロセスを用いて充填された、プラスチック管内の約1.5mlのイオン交換樹脂)の頂部からキャップを取り除く。デカントによって溶液を捨てる。ノッチの位置でカラムの閉鎖端を切断し、カラムアダプターを用いてカラムを50ml遠心管内に配置する。
13.上記の段階11から得られた溶解液をカラムに移し、重力によって樹脂中を完全に流通させる。
14.5mlのローディング液をカラムに適用する。
15.すべてのローディング液が樹脂を通過した後、カラムを新しい50ml遠心管内に配置する。
16.2.5mlの溶離液をカラムに加え、生成物を溶出液中に捕集する。
17.脱塩カラムのキャップを取り除き、溶液を捨てる。ノッチの位置でカラムの閉鎖端を切断し、アダプターを用いてカラムを遠心管内に配置する。
18.25mLの1×TE緩衝液(10mMトリス−HCl、pH8.0、1mM EDTA)を適用することでカラムを平衡化する。これは、LabMate PD−10緩衝液溜め(GE Healthcare社)を用いることで一段階で達成できる。
19.精製段階16からの溶出液(2.5ml)を脱塩カラムに移し、重力によって流通させる。
20.溶液がゲルベッドに完全に入った後、カラムを新しい50ml遠心管内に配置する。
21.3.5mlの1×TE緩衝液を各カラムに加え、ゲノムDNAを含む溶出液を捕集する。こうして得られた脱塩試料は定量化及び下流用途のために使用するできる。
下記の段階によって組織試料を調製する。精製プロセスから良好な収量のゲノムDNAを得るためには、完全にホモジナイズした試料を使用することが極めて重要である。
1.微小片に切断することで約100mgの組織を秤取する。
2.組織を1×PBS緩衝液で洗う。1mlの1×PBS緩衝液を加え、渦動させ、1000RPMで1分間遠心する。洗液を捨て、管内に残った微量の緩衝液をピペットで除去する。
3.0.5mlの1×PBS緩衝液を加え、試料をハンドヘルドホモジナイザーでホモジナイズする。
4.0.5mLの溶解液をホモジナイズド試料に加え(PBSと溶解液との比=1:1)、可能な最高速度で20〜30秒間渦動させる。
5.50μlのプロテイナーゼK(20mg/ml)溶液を加え、短時間渦動させ、60℃で1〜1.5時間インキュベートする。
6.インキュベーション期間後、反応管を氷浴中で3分間冷却する。20μlのRNアーゼA溶液(20mg/ml)を加え、37℃で15分間インキュベートする。
7.粗溶解物を4mlの無DNアーゼ水及び5mlのローディング液で希釈し、5000×gで15分間遠心して粒子状物質をペレット化する。
8.精製カラムの頂部からキャップを取り除く。デカントによって溶液を捨てる。ノッチの位置でカラムの閉鎖端を切断し、カラムアダプターを用いてカラムを50ml遠心管内に配置する。
9.溶解液をカラムに移し、重力によって樹脂中を完全に流通させる。
10.5mlのローディング液をカラムに適用する。
11.すべてのローディング液が樹脂を通過した後、カラムを新しい50ml遠心管内に配置する。
12.2.5mlの溶離液をカラムに加え、生成物を溶出液中に捕集する。
13.脱塩カラムのキャップを取り除き、溶液を捨てる。ノッチの位置でカラムの閉鎖端を切断し、アダプターを用いてカラムを遠心管内に配置する。
14.25mLの1×TE緩衝液を適用することでカラムを平衡化する。これはLabMate PD−10緩衝液溜めを用いることで達成できる。
15.精製段階12からの溶出液(2.5ml)を脱塩カラムに移し、重力によって流通させる。
16.溶液がゲルベッドに完全に入った後、カラムを新しい50ml遠心管内に配置する。
17.3.5mlの1×TE緩衝液を各カラムに加え、ゲノムDNAを含む溶出液を捕集する。こうして得られた脱塩試料は定量化及び下流用途のために使用できる。
下記のプロトコルに従って細胞培養細胞を集め、溶解する。精製及び脱塩は、上記のプロトコル(b)(「組織試料からのゲノムDNAの単離」)に記載したようにして行う。
1.1×107個〜2.0×107個までの細胞を1×PBS緩衝液(2×55mL)で洗う。細胞を5mlの1×PBS緩衝液中に懸濁し、2000×gで10分間遠心する。緩衝液をペレットから注意深くデカントし、プロセスをもう一度繰り返す。
2.30秒〜1分間渦動させることで、細胞ペレットを1mlの1×PBS緩衝液中に完全に再懸濁する。
3.4.5mlの溶解液を加え、30秒〜1分間渦動させる。
4.50μlのプロテイナーゼK(20mg/ml)を加え、短時間(2秒間)渦動させる。
5.60℃で1〜2時間インキュベートする。
6.管を氷浴中で2分間冷却し、20μlのRNアーゼA(20mg/ml)を加える。
7.37℃で15分間インキュベートする。
精製ゲノムDNA試料の定量化は、ブランクとしての1×TE緩衝液(pH8.0)及び光路長1cmのキュベットを使用しながら、UV分光光度計によって行った。3つの試料の読みをA260、A280及びA320で求めた。DNAの収量(μg)=A260×50μg×溶出試料体積(3.5ml)。
(i)血液gDNAプロトコル
溶解1液:30mMトリス−HCl、10mM塩化マグネシウム、2%トリトンX100及び0.6Mスクロース。
(ii)組織プロトコル
溶解液:20mMトリス−HCl、20mM EDTA、100mM塩化ナトリウム及び1%SDS。
(iii)細胞培養物プロトコル
溶解液:20mMトリス−HCl、20mM EDTA、100mM塩化ナトリウム及び1%SDS。
ゲノムDNA精製のための最適溶離液を見付けようという努力の中で、血液陰イオン交換体からのゲノムDNA溶離に関して高イオン塩強度溶液を試験した。
1.50mMトリス−HCl、pH8.0、1mM EDTA、2000mM NaCl。
2.50mMトリス−HCl、pH8.0、1mM EDTA、2000mM NaCl+0.2M炭酸ナトリウム。
3.50mMトリス−HCl、pH8.0、1mM EDTA、2000mM NaCl+0.2M過塩素酸ナトリウム。
4.50mMトリス−HCl、pH8.0、1mM EDTA、2000mM NaCl+0.2M重炭酸ナトリウム。
5.50mMトリス−HCl、pH8.0、1mM EDTA、2000mM NaCl+0.2M塩化マグネシウム。
6.2Mヨウ化ナトリウム。
7.2M過塩素酸ナトリウム。
8.3M酢酸アンモニウム。
9.3M酢酸アンモニウム+0.2M重炭酸ナトリウム。
10.3M酢酸アンモニウム+0.2M炭酸ナトリウム。
11.3M酢酸アンモニウム+0.2M二ホウ酸ナトリウム。
12.3M重炭酸アンモニウム。
13.3M重炭酸ナトリウム(完全には溶解せず)。
14.3M炭酸ナトリウム。
15.3Mリン酸ナトリウム(完全には溶解せずに沈殿する)。
16.50mMトリス−HCl、pH8.0、1mM EDTA、2000mM NaCl+25mM水酸化ナトリウム。
17.50mMトリス−HCl、pH8.0、1mM EDTA、2000mM NaCl+50mM水酸化ナトリウム。
18.50mMトリス−HCl、pH8.0、1mM EDTA、2000mM NaCl+75mM水酸化ナトリウム。
19.50mMトリス−HCl、pH8.0、1mM EDTA、2000mM NaCl+100mM水酸化ナトリウム。
20.50mMトリス−HCl、pH8.0、1mM EDTA、2000mM NaCl+75mM水酸化リチウム。
21.2M塩+500mM L−アルギニン。
22.1M塩化ナトリウム+1M炭酸ナトリウム。
残りの結合物質の回収は、高い塩濃度と水酸化ナトリウムを用いて高めたpHとの組合せで達成できる。しかし、水酸化ナトリウムは苛性を示すばかりでなく、核酸の不可逆的な変性及び経時的な分解を引き起こすことがある。
ゲノムDNAの回収率及び溶離を向上させる溶離液は、約10.5〜11.6の高いpHという共通の特徴を有することが注目された。グアニジンを用いた核酸溶離の向上は、溶離液中に炭酸塩(又は重炭酸塩)が存在することで促進されるように思われる。このような観察結果に基づき、高いpHの効果を試験するためにさらなる実験を実施した。炭酸ナトリウムを含む2M塩化ナトリウム或いはトリス塩基又はアルギニンを含む2M塩化ナトリウムを比較した。得られた結果を表3に示す。
数種の溶液の評価結果に基づけば、塩強度に加えてpHがゲノムDNAの回収に決定的な役割を果たすように思われる。溶離の向上のためには、1〜2M塩化ナトリウムと0.25〜0.5Mアルギニン、0.5〜1M炭酸ナトリウム又は0.5〜1Mトリス塩基との組合せが使用できる。
1.2M NaCl+0.2M L−アルギニン
2.2M NaCl+0.5M 炭酸グアニジン
3.2M NaCl+0.5M グリシン
4.2M NaCl+0.5M 炭酸グアニジン+0.5M L−グルタミン酸
5.2M NaCl+0.5M プロピオン酸グアニジン
結果は、1M〜2M塩化ナトリウム溶液へのアルギニン、炭酸グアニジン又は他のグアニジン誘導体(例えば、プロピオン酸グアニジン)の添加がイオン交換樹脂からのゲノムDNAの溶離に対して同様な効果を有することを明確に実証している(表4)。
(C)溶離液中におけるL−アルギニン、炭酸グアニジン及び炭酸カリウムの比較
塩化ナトリウムと炭酸ナトリウムの組合せがある程度の回収率向上をもたらしたので、炭酸カリウムを塩化ナトリウムと組み合わせた溶液を炭酸グアニジン及びL−アルギニンと比較して評価する。塩化ナトリウム及び炭酸ナトリウムの溶液のpHは、イオン交換樹脂から核酸を完全に回収するためには最適でない。炭酸カリウムは一層高いpHの溶液を与えるので、イオン交換樹脂からの核酸の一層高い回収率を与えるものと予想される。実際、塩化ナトリウムと炭酸カリウムの組合せは高いpHを有する溶液を与え、溶離プロファイルは炭酸グアニジン又はアルギニンを含む溶液に十分匹敵していた。実験の詳細は上記セクション(B)の場合と同様である。この場合にも、ゲノムDNA供給源としてヒト血液を使用し、(A)(a)に記載した血液プロトコルに準拠した。結果を表5に示す。
表5中のデータから明らかな通り、炭酸カリウムを含む塩化ナトリウム溶液は、炭酸グアニジン又はL−アルギニンを含む溶液と比較した場合、イオン交換樹脂からのゲノムDNA溶離に関して等しく有効である。
プロトコルセクションに記載した手順を用いて8mlのヒト血液試料を溶解した。粗溶解物をローディング液で希釈し、イオン交換精製カラム上にロードした。すべての溶液が樹脂を通過した後、さらに5mlのローディング液をカラム上に加えた。樹脂の上部にもはや溶液が存在しなくなった後、2.5mlの溶離液(1M塩化ナトリウム+0.5M炭酸カリウム)を加え、ゲノムDNAを含む溶出液を捕集管に捕集した。得られた生成物をNAP−25カラムを用いて脱塩した。単離したゲノムDNAのサイズをパルス電界ゲル電気泳動(図1)によって決定した。生成物の純度をUV分光測光及びゲル分析(図2)によって評価した。この方法によって得られたゲノムDNAはまた、制限酵素消化(図3)、多重PCR及びリアルタイムPCR(図4)のような下流用途においても評価した。
200ミリグラムのラット肝臓組織をホモジナイズし、プロトコルセクションに記載したようにして溶解した。粗溶解物をローディング液で希釈し、遠心して粒子状物質をペレット化した。透明な溶解物をイオン交換精製カラム上にロードした。すべての溶液が樹脂を通過した後、5mlのローディング液をカラムに加えた。樹脂の上部にもはや溶液が存在しなくなった後、2.5mlの溶離液(1M塩化ナトリウム+0.5M炭酸カリウム)をカラムに加え、生成物を溶出液中に捕集した。こうして得られたゲノムDNAをNAP−25カラムを用いて脱塩した。生成物の純度をUV分光測光及びゲル分析によって評価した。プロトコルの一貫性にアクセスするために複数の試料を処理した。単離したゲノムDNAのサイズをパルス電界ゲル電気泳動(図5)によって決定した。この方法によって得られたゲノムDNAはまた、リアルタイムPCR(図6)及び制限酵素消化(図7)のような下流用途においても評価した。
プロトコルセクションに記載した手順を用いて約2×107個のMRC5細胞を溶解した。粗溶解物をローディング液で希釈し、イオン交換精製カラムに移した。すべての溶液が樹脂を通過した後、5mlのローディング液をカラムに加えた。樹脂の上部にもはや溶液が存在しなくなった後、2.5mlの溶離液をカラムに加え、生成物を溶出液中に捕集した。こうして得られたゲノムDNAをNAP−25カラムを用いて脱塩した。生成物の純度をUV分光測光及びゲル分析によって評価した。単離したゲノムDNAのサイズをパルス電界ゲル電気泳動によって決定した。この方法によって得られたゲノムDNAはまた、リアルタイムPCR及び制限酵素消化のような下流用途においても評価した。
Claims (10)
- 細胞から核酸を分離及び/又は精製する方法であって、
a)前記細胞を溶解液で溶解して核酸含有水溶液を生成する段階、
b)陰イオン交換体が核酸を結合するような条件下で、前記核酸含有水溶液を固体支持マトリックスに結合された陰イオン交換体に接触させる段階、
c)核酸溶離液からなる水性移動相を用いて前記陰イオン交換体から核酸を溶離する段階、及び
d)下流用途に適するように前記溶離核酸を脱塩する段階
を含んでなる方法において、
炭酸カリウムを含む添加剤を前記溶離液中に添加して前記溶離液のpHをpH9〜pH13にすることを含み、溶離液中における前記添加剤の存在が前記添加剤の不存在下での前記核酸の回収率に比べて陰イオン交換体からの核酸回収率の増加をもたらすことを改良点とする方法。 - 前記添加剤が炭酸カリウムである、請求項1記載の方法。
- 前記炭酸カリウムが0.1〜2Mの濃度で存在する、請求項1記載の方法。
- 前記核酸がゲノムDNAである、請求項1記載の方法。
- 前記陰イオン交換体がANX Fast Flow樹脂である、請求項1記載の方法。
- 前記陰イオン交換体がDEAE Sephadex(登録商標)A25樹脂、Q Sepharose(登録商標)Fast Flow樹脂、Q Sepharose(登録商標)XL及びCapto(登録商標)Q樹脂からなる群から選択される、請求項1記載の方法。
- 細胞から核酸を分離及び/又は精製するためのキットであって、
a)前記細胞から核酸含有水溶液を生成するための溶解液、
b)核酸を結合するための、固体支持マトリックスに結合された陰イオン交換体、
c)前記陰イオン交換体から核酸を溶離するための溶離液であって、炭酸カリウムを含んでいてpH9〜pH13のpHを有する溶離液、及び
d)前記溶離核酸を脱塩するための脱塩手段
を含んでなるキット。 - 前記炭酸カリウムが0.1〜2Mの濃度で存在する、請求項7記載のキット。
- 前記陰イオン交換体が高流速樹脂である、請求項7記載のキット。
- 前記陰イオン交換体がDEAE Sephadex(登録商標)A25樹脂、Q Sepharose(登録商標)Fast Flow樹脂、Q Sepharose(登録商標)XL及びCapto(登録商標)Q樹脂からなる群から選択される、請求項7記載のキット。
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