CN102866038A

CN102866038A - 血斑标本采集和处理方法及其采集卡干血斑dna提取方法

Info

Publication number: CN102866038A
Application number: CN 201210364294
Authority: CN
Inventors: 苏彬峰; 邱美兰; 卢敏
Original assignee: Hybribio Ltd
Current assignee: Hybribio Ltd
Priority date: 2012-09-26
Filing date: 2012-09-26
Publication date: 2013-01-09

Abstract

本发明公开了一种血斑标本采集和处理方法及其采集卡干血斑DNA提取方法。所述血斑标本采集和处理方法，包括以下步骤：（1）采血；（2）采集卡血斑处理；（3）采集卡干血斑的保存；（4）采集卡干血斑的递送。本发明的血斑标本可在常温保存，耐运输，方便送检，可代替抗凝全血作为基因诊断的DNA提取标本。

Description

血斑标本采集和处理方法及其采集卡干血斑DNA提取方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是一种血斑标本采集和处理方法及其采集卡干血斑DNA提取方法。

背景技术

目前，用于地中海贫血基因诊断的DNA是从抗凝全血中提取的。该方法用柠檬酸钠或EDTA抗凝管保存静脉血，需在-20℃冰箱中低温保存，不耐运输，送检不方便。因些，急需一种方便运输的样本采集方法和高提取率的DNA提取方法。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述问题，提供一种血斑标本采集和处理方法及其采集卡干血斑DNA提取方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种血斑标本采集和处理方法，包括以下步骤：

（1）采血

Figure 2012103642947100002DEST_PATH_IMAGE001

. 婴儿采血

（）用热毛巾温浴采血部位：不超过41℃，3～5分钟；

（

Figure 2012103642947100002DEST_PATH_IMAGE003

）酒精消毒，用无菌纱布垫擦干；

（

）针刺，无菌纱布垫擦去第一滴血；

（

Figure 2012103642947100002DEST_PATH_IMAGE005

）用血样标本采集卡蘸取单个血滴，让血滴充分浸润采血圈，形成血斑；至少采集3个采血圈；

上述婴儿采血，6周～4月或小于5kg的婴儿采用脚后跟采血法； 4～10月或5～10kg的婴儿采用脚大拇指采血；大于10月或大于10kg的婴儿采用手指采血；

. 采用静脉采血，用柠檬酸钠或EDTA抗凝管静脉血，采集的抗凝全血用移液器移取75～80ul全血，对准血样标本采集卡采血圈中心缓慢将血液滴加在采集卡上，形成血斑，避免气泡产生；至少采集3个血圈；

上述静脉采血用于婴儿之外的人群；

（2）采集卡血斑处理

血样采集完毕后，将制成的采集卡在干燥桌面放置3～4小时风干，形成干血斑，不要放在太阳下晾晒或用任何人工方法（如烘干机）加速干燥；

（3）采集卡干血斑的保存

采集卡风干后，将每张采集卡分装入封口袋中，并在封口袋中放入干燥剂，轻轻将封口袋的空气挤压出去在封口，遵循一袋一卡的原则，以避免交叉污染；

（4）采集卡干血斑的递送

准确填写样本信息卡后，将采集卡和信息卡一同放入大信封，采用常温运输。

上述采集卡干血斑DNA提取方法，包括以下步骤：

（1）将采集卡上的2个或以上血斑用打孔器打孔3*3mm（或将圆形的血斑剪下后，剪为约3*3mm的样品），置于1.5ml离心管中；

（2）加入300～400ul的Tissue Lysis Buffer,加入20ul蛋白酶K，震荡混匀；

（3）56℃温浴1h，期间颠倒混匀3～5次；

（4）取200ul上清液转入新的1.5ml离心管中，加入200ul的溶液L，70℃温浴10min，期间颠倒2～3次；

（5）加入200ul 4℃的无水乙醇，室温放置5min；

（6）将液体转入带硅胶柱的2ml离心管中，10000rpm离心1min，倒掉离心管的收集管中的废液，将硅胶柱放入收集管中；

（7）在硅胶柱中加入500ul溶液W1，10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将硅胶柱放入收集管中；

（8）在硅胶柱中加入500ul溶液W2，10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；

（9）重复步聚8；

（10）将硅胶柱放入收集管中，12000rpm空管离心3min，倒掉收集管中的废液；

（11）将硅胶柱放入新的1.5ml离心管中，开盖静置1～2min，往硅胶柱中心加入60ul的TE洗脱液，静置2～5min，12000rpm离心2min，弃柱得DNA；

所述溶液L为含有10% GuSCN、10% Tris的水溶液，溶液W1为含有10%GuSCN、1%EDTA、25%无水乙醇的水溶液，溶液W2为含有75%无水乙醇的水溶液，TE洗脱液为含有1%Tris、1%EDTA的水溶液，以上溶液除无水乙醇是体积浓度外，其他的皆为质量百分比浓度。

本发明采用过柱法的提取DNA,操作简单，快速省时，获得的DNA纯度高。血斑标本可在常温保存，耐运输，方便送检，可代替抗凝全血作为基因诊断的DNA提取标本。

附图说明

图1为本发明所采用的血样标本采集卡。

图2为采集卡干血斑。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明进行详细的说明。

实施例：

一、对22个成年人进行本发明的血斑标本采集和处理

1. 静脉采血：用柠檬酸钠抗凝管静脉血，采集的抗凝全血用移液器移取80ul全血，对准如图1所示的血样标本采集卡采血圈中心缓慢将血液滴加在采集卡上，形成血斑，避免气泡产生；采集3个血圈；

2. 采集卡血斑处理

血样采集完毕后，将制成的采集卡在干燥桌面放置4小时风干，形成如图2所示的干血斑；

3. 采集卡干血斑的保存

4. 采集卡干血斑的递送

上述采集卡干血斑DNA提取：

1. 将采集卡上的2个圆形的血斑剪下后，剪为3*3mm的样品，置于1.5ml离心管中（每处理完一个样本后，剪刀均需用75%乙醇擦拭，晾干后在酒精灯上烧热）；

2. 加入300ul的Tissue Lysis Buffer,加入20ul蛋白酶K，震荡混匀；

3. 56℃温浴1h，期间颠倒混匀4次；

4. 取200ul上清液转入新的1.5ml离心管中，加入200ul的溶液L，70℃温浴10min，期间颠倒3次；

5. 加入200ul 4℃的无水乙醇，室温放置5min；

6. 将液体转入带硅胶柱的2ml离心管中，10000rpm离心1min，倒掉离心管的收集管中的废液，将硅胶柱放入收集管中；

7. 在硅胶柱中加入500ul溶液W1（使用前先检查是否加入无水乙醇），10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将硅胶柱放入收集管中；

8. 在硅胶柱中加入500ul溶液W2（使用前先检查是否加入无水乙醇），10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；

9. 重复步聚8；

10. 将硅胶柱放入收集管中，12000rpm空管离心3min，倒掉收集管中的废液；

11. 将硅胶柱放入新的1.5ml离心管中，开盖静置2min，往硅胶柱中心加入60ul的TE洗脱液（55℃预热），静置5min，12000rpm离心2min，弃柱得血斑DNA。

二、对上述22个成年人进行传统的抗凝全血DNA采集和处理

使用传统检测手段对同样的22个成年人进行抗凝全血DNA的采集和处理，得到抗凝全血DNA。

三、样品检测

将上述提取的血斑DNA和抗凝全血DNA采用潮州凯普生物化学有限公司生产的α-和β-地中海贫血基因检测试剂盒进行地贫基因检测。

22例抗凝全血DNA和血斑DNA的地贫基因检测结果如下：

序号	样本编号	抗凝全血DNA地贫基因检测结果	血斑DNA地贫基因检测结果
				1	A22	αα/αα,β^41-42/β^A	αα/αα,β^41-42/β^A
2	A24	αα/αα,β^A/β^A	αα/αα,β^A/β^A
				3	A26	-α^3.7/-α^3.7,β^A/β^A	-α^3.7/-α^3.7,β^A/β^A
4	A27	αα/αα,β⁶⁵⁴/β^A	αα/αα,β⁶⁵⁴/β^A
				5	A28	-α^3.7/αα^QS,β^A/β^A	-α^3.7/αα^QS,β^A/β^A
6	A30	--^SEA/αα,β^A/β^A	--^SEA/αα,β^A/β^A
				7	A32	-α^4.2/αα,β^A/β^A	-α^4.2/αα,β^A/β^A
8	A36	αα/αα,β^71-72/β^A	αα/αα,β^71-72/β^A
				9	A37	αα/αα,β^41-42/β^A	αα/αα,β^41-42/β^A
10	A40	-α^3.7/αα,β^A/β^A	-α^3.7/αα,β^A/β^A
				11	A41	αα/αα,β^71-72/β^A	αα/αα,β^71-72/β^A
12	A46	--^SEA/-α^4.2,β^A/β^A	--^SEA/-α^4.2,β^A/β^A
				13	A47	-α^3.7/αα,β^A/β^A	-α^3.7/αα,β^A/β^A
14	A51	-α^4.2/αα,β^A/β^A	-α^4.2/αα,β^A/β^A
				15	A52	--^SEA/αα,β^A/β^A	--^SEA/αα,β^A/β^A
16	A54	-α^4.2/-α^4.2,β^A/β^A	-α^4.2/-α^4.2,β^A/β^A
				17	A60	-α^4.2/αα,β^A/β^A	-α^4.2/αα,β^A/β^A
18	A63	--^SEA/αα,β^A/β^A	--^SEA/αα,β^A/β^A
				19	A64	αα/αα,β^A/β^A	αα/αα,β^A/β^A
20	A66	αα/αα,β^41-42/β^A	αα/αα,β^41-42/β^A
				21	A67	-α^4.2/αα,β^A/β^A	-α^4.2/αα,β^A/β^A
22	A74	-α^4.2/αα,β^A/β^A	-α^4.2/αα,β^A/β^A

22例血样的地贫基因检测结果：14例为α-地中海贫血，6例为β-地中海贫血，2例为正常。血斑DNA的检测结果与抗凝全血DNA的检测结果完全一致。

上述实验结果说明，血斑DNA与抗凝全血DNA的基因检测结果在灵敏度和特异度方面具有很高的一致性，同时血斑标本具有易保存、易运输的优点，更适合于样本送检和基因谱查。