CN109735601A - Dna提取方法及亲权鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种DNA提取时间相对较短、提取效率高的DNA提取方法和亲权鉴定方法。该DNA提取方法通过缩短纯水洗脱时间和温浴时间，甚至不进行温浴处理，验证发现无论是对于新鲜血斑还是陈旧血斑等血样，得到的结果均与通过标准方法进行DNA提取得到的结果一致，因此，该打破常规的DNA提取方法可广泛使用在样品尤其是血样的DNA提取过程中，具有缩短提取时间、提高提取效率的有益效果。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其是涉及一种DNA提取方法及亲权鉴定方法。
背景技术
目前在法医物证领域中，使用Chelex-100法是对血斑进行DNA提取的常用方法之一。Chelex-100是一种由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成的化学螯合树脂，含有成对的亚氨基二乙酸盐离子，可螯合多价离子，特别是对高价金属离子有很高的亲和力和螯合作用，如螯合镁离子。Chelex-100螯合镁离子就如磁铁吸附铁一样，镁离子被吸附起来，镁离子去除后，核酸酶会失活，从而保护DNA分子不被降解。在低离子强度、碱性及煮沸条件下，可以使细胞膜破裂，并使蛋白质变性，通过离心除去Chelex-100颗粒，使其结合的物质如镁离子与上清中的DNA分离。
针对血液或血斑等血样，在传统的Chelex-100标准方法(参“中华人民共和国司法部司法鉴定管理局SF/Z JD0105001—2010《亲权鉴定技术规范》”)提取血样DNA过程中，首先取不小于3μL血液或9mm2血斑加入1mL纯水，室温放置30min以上；然后离心去上清，向沉淀加入200μL Chelex-100，于55℃消化30min以上；最后煮沸8min以上，离心后置4℃冰箱内低温保存备用。Chelex-100标准方法提取DNA可在一个试管内进行，具有操作相对简单、样品不涉及转移、可减少外源DNA污染、降低检材的损失等优点，已成为业内通用方法，无论对于何种血样，例如不论是新鲜血样还是陈旧血样，不论是量足的血样还是不足的血样，操作人员一般都不会再去变更操作流程，而是直接按照标准方法进行DNA提取。
然而，使用Chelex-100标准方法提取样本中的DNA所花的时间大概在75min以上，整个时间花费仍较长，提取效率还有待提高。
发明内容
基于此，有必要提供一种DNA提取时间相对较短、提取效率高的DNA提取方法。
一种DNA提取方法，包括如下步骤：
步骤一：将待测样品加入纯水中，小心混匀后放置小于30min；
步骤二：离心去除上清，向沉淀中加入Chelex-100后直接进行沸水浴处理，或者向沉淀中加入Chelex-100后先温浴小于30min，再进行沸水浴处理；
步骤三：离心收集上清。
在其中一个实施例中，所述待测样品是血液样品。
在其中一个实施例中，在步骤一的放置过程中，间歇或始终对样品溶液进行涡旋振荡处理。
在其中一个实施例中，在步骤一中，所述放置小于30min是放置5min～8min。
在其中一个实施例中，在步骤二中，温浴的温度是55℃。
在其中一个实施例中，在步骤二中，所述沸水浴处理是煮沸或沸水浴至少8min。
在其中一个实施例中，所述离心是于10000r/min～15000r/min的转速下离心2min～3min。
在其中一个实施例中，在步骤二的沸水浴处理之前和/或在步骤三的离心收集上清之前，还包括对样品溶液进行高速振荡5s～10s的步骤。
在其中一个实施例中，在步骤一中，每3μL血液或9mm2血斑样品加入1mL纯水；和/或
在步骤二中，每3μL血液或9mm2血斑样品加入100～200目的浓度为5wt％的Chelex-100溶液200μL。
此外，还有必要提供一种基于该DNA提取方法的鉴定时间短、效率高的亲权鉴定方法。
一种亲权鉴定方法，包括如下步骤：
按照上述任一实施例所述的DNA提取方法提取待测DNA；
将所述待测DNA与待比较对象进行亲权鉴定。
研究发现，传统的Chelex-100标准方法提取DNA时，加入纯水是用于洗脱去除其中抑制PCR反应的血红蛋白，接下来的温浴过程有助于提高DNA产量。在实际检测过程中，发明人经常遇到的是新鲜的血斑且量远远足够，不像公安机关等在案发现场提取到的DNA含量可能极其微少的检材，因此，发明人进行大胆的创造性尝试，通过缩短纯水洗脱时间和温浴时间，甚至不进行温浴处理，验证发现无论是对于新鲜血斑还是陈旧血斑等血样，得到的结果均与通过标准方法进行DNA提取得到的结果一致，因此，该打破常规的DNA提取方法可广泛使用在样品尤其是血样的DNA提取过程中，具有缩短提取时间、提高提取效率的有益效果。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明提供了一种DNA提取方法，其包括如下步骤：
步骤一：将待测样品加入纯水中，小心混匀后放置小于30min；
步骤二：离心去除上清，向沉淀中加入Chelex-100后直接进行沸水浴处理，或者向沉淀中加入Chelex-100后先温浴小于30min，再进行沸水浴处理；
步骤三：离心收集上清。
待测样品优选是血液样品(简称“血样”)，例如可以是血液，或者是血斑，可以是采集时间在一周内的新鲜血斑，也可以是一年以上的陈旧血斑；更优选地，待测样品足量。
在一个具体示例中，在步骤一的放置过程中，间歇或始终对样品溶液进行涡旋振荡处理，以加快洗脱过程。对于新鲜血斑等血样，其较之陈旧血斑更易洗脱，因此，还可以根据具体情况适当降低洗脱时间，例如放置5min～8min。
在步骤二中，温浴的温度优选是55℃，温浴的时间可大大缩短，甚至直接省去温浴步骤。
在步骤二中，沸水浴处理是煮沸或沸水浴至少8min。
优选地，所述离心是于10000r/min～15000r/min的转速下离心2min～3min。
进一步，在一个具体示例中，在步骤二的沸水浴处理之前和/或在步骤三的离心收集上清之前，还包括对样品溶液进行高速振荡5s～10s的步骤。
更具体地，在步骤一中，每3μL血液或9mm2血斑样品加入1mL纯水；在步骤二中，每3μL血液或9mm2血斑样品加入100～200目的浓度为5wt％的Chelex-100溶液200μL。
本发明还提供了一种基于该DNA提取方法的鉴定时间短、效率高的亲权鉴定方法。该亲权鉴定方法按照上述任一实施例的DNA提取方法提取待测DNA；再将待测DNA与待比较对象进行亲权鉴定。
所述待比较对象可以是已知基因型的对象，也可以是身份已知的对象(基因型待测)，例如犯罪嫌疑人或者假设父等。该亲权鉴定方法可广泛使用在亲子鉴定、身份鉴定等场合，具有时间较短、效率高的优点。
该DNA提取方法通过缩短纯水洗脱时间和温浴时间，甚至不进行温浴处理，验证发现无论是对于新鲜血斑还是陈旧血斑等血样，得到的结果均与通过标准方法进行DNA提取得到的结果一致。因此，该打破常规的DNA提取方法可广泛使用在样品尤其是血样的DNA提取过程中，具有缩短提取时间、提高提取效率的有益效果。
以下结合具体的验证实施例对本发明的DNA提取方法和亲权鉴定方法作进一步详细的说明。
取5个采集时间一周内的普通血斑样本，5个一年以上的血斑样本分别使用标准方法和本发明的改进方法作对照实验提取DNA后应用亲子鉴定方面的荧光标记商业化试剂盒华厦白金在9700扩增仪上扩增，ABI3500XL遗传分析仪上进行毛细管电泳，经GenemapperID-X软件分析查看相对荧光强度，计算每个样本所有扩增峰高(相对荧光强度)的平均值并查看两种提取方法扩增后的STR分型结果是否一致(验证改进方法扩增是否会发生等位基因扩增丢失现象)，结果如下表1所示。
表1
结果显示，改进后的Chlex-100提取方法与标准提取方法在STR分型结果上一致，相对荧光强度改进方法相比标准方法略低；血斑越陈旧，两种提取方法后的荧光强度均降低，考虑为DNA的降解。
通过使用本发明的DNA提取方法，DNA提取时间可压缩到20分钟，且与标准提取方法相比后续扩增峰高略有降低，但STR分型结果保持一致且相对荧光强度能满足亲子鉴定业务的需要(相对荧光强度大于100)，说明改进有效。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种DNA提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：将待测样品加入纯水中，小心混匀后放置小于30min；
步骤二：离心去除上清，向沉淀中加入Chelex-100后直接进行沸水浴处理，或者向沉淀中加入Chelex-100后先温浴小于30min，再进行沸水浴处理；
步骤三：离心收集上清。
2.如权利要求1所述的DNA提取方法，其特征在于，所述待测样品是血液样品。
3.如权利要求1所述的DNA提取方法，其特征在于，在步骤一的放置过程中，间歇或始终对样品溶液进行涡旋振荡处理。
4.如权利要求3所述的DNA提取方法，其特征在于，在步骤一中，所述放置小于30min是放置5min～8min。
5.如权利要求1所述的DNA提取方法，其特征在于，在步骤二中，温浴的温度是56℃。
6.如权利要求1所述的DNA提取方法，其特征在于，在步骤二中，所述沸水浴处理是煮沸或沸水浴至少8min。
7.如权利要求1～6中任一项所述的DNA提取方法，其特征在于，所述离心是于10000r/min～15000r/min的转速下离心2min～3min。
8.如权利要求1～6中任一项所述的DNA提取方法，其特征在于，在步骤二的沸水浴处理之前和/或在步骤三的离心收集上清之前，还包括对样品溶液进行高速振荡5s～10s的步骤。
9.如权利要求1～6中任一项所述的DNA提取方法，其特征在于，在步骤一中，每3μL血液或9mm2血斑样品加入1mL纯水；和/或
在步骤二中，每3μL血液或9mm2血斑样品加入100～200目的浓度为5wt％的Chelex-100溶液200μL。
10.一种亲权鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
按照如权利要求1～9中任一项所述的DNA提取方法提取待测DNA；
将所述待测DNA与待比较对象进行亲权鉴定。
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