CN108998445A

CN108998445A - 一种从石蜡切片样本中提取核酸的试剂盒及其方法

Info

Publication number: CN108998445A
Application number: CN201810934181.3A
Authority: CN
Inventors: 许嘉森; 吴诗扬; 刘志明; 赖炳林
Original assignee: Surexam Bio Tech Co Ltd
Current assignee: Surexam Bio Tech Co Ltd
Priority date: 2018-08-15
Filing date: 2018-08-15
Publication date: 2018-12-14

Abstract

本发明公开了一种从石蜡切片样本中提取核酸的试剂盒及其方法，涉及分子生物技术领域。该试剂盒包括有脱腊油，脱腊油包括有正十六烷和松节油，正十六烷和松节油的体积比为(3～6)：1。采用该脱蜡油对石蜡切片样本进行脱蜡，无需使用有毒化学品，正十六烷和松节油的配合使用具有良好脱蜡效果，无毒环保，简化了脱蜡过程中繁琐的洗涤步骤，且松节油具有氧化后会变色的效果，便于操作人员准确吸取裂解液层进行后续核酸提取的实验步骤，此外，该试剂盒具有能够提取数量更大、质量更高的石蜡DNA的优点。

Description

一种从石蜡切片样本中提取核酸的试剂盒及其方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种从石蜡切片样本中提取核酸的试剂盒及其方法。

背景技术

福尔马林固定石蜡包埋组织(formalin fixed and paraffin embeddedtissues，FFPE)是医疗机构最常用的保存病例组织的方法，由于新鲜标本难以得到，为进行肿瘤分子生物学研究，对已有病例进行回顾性研究时，只能从石蜡包埋组织中进行基因提取，因此石蜡包埋组织就成为来源最丰富的珍贵资源。随着生物分子技术的发展，对于FFPE不单只进行光学显微检查，分析其核酸(DNA和RNA)变化已日渐重要。同时，还会将从此类样品中获得的核酸利用高度灵敏的技术，如聚合酶链反应(PCR)进行后续分析。因此，建立一种相对简便有效，安全可行的从FFPE样品中提取高质量DNA，并通过PCR能扩增得到长片段DNA的方法尤为重要。

采用福尔马林固定组织材料并将其包埋在石蜡中以加固样本材料。该石蜡切片样本中的组织随保存时间的变化，在组织内部形成生物分子的大量交联(核酸和蛋白之间以及蛋白之间或核酸之间的交联)。这些处于细胞内部和外部的交联结构促成了不溶性碎片或者说很难裂解或不可裂解的碎片的产生。石蜡包埋样本通常被制成切片以供病理学家鉴定，这些切片也可用作核酸分析的起始材料。进行核酸提纯时，必须在裂解后去除细胞碎片和石蜡。否则这些成分可能妨碍接下来的分离和分析工作。同时，石蜡切片样本在染色免疫荧光实验等样本处理中，包埋在石蜡块中的肿瘤组织DNA不可避免地经历了多重损伤，这也是石蜡样本提取的核酸通常易高度降解的根本原因。

目前，传统的石蜡包埋组织DNA提取采用二甲苯脱蜡、蛋白酶K孵育的方法，该方法整个抽提过程长，操作繁琐，同时在提取过程中所使用的有机溶剂二甲苯试剂易造成环境的污染和对操作者身体的伤害。且现有技术所应用针对的对象，即FFPE样本多为1年内的样本，这也为临床研究的应用带来很大的限制。因此，需要研发更有效的能适用于更长时间保存的FFPE样本的核酸提取方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从石蜡切片样本中提取核酸的试剂盒，该试剂盒能够快速提取到高质量的石蜡切片样本核酸，为后期开展更多检测实验提供便利。

本发明的另一目的在于提供一种从石蜡切片样本中提取核酸的方法，能快速地提取数量更大，质量更高的石蜡切片样本中的核酸。

本发明是这样实现的：

一种从石蜡切片样本中提取核酸的试剂盒，试剂盒包括有脱腊油，脱腊油包括有正十六烷和松节油，正十六烷与松节油的体积比为(3～6)：1。

一种从石蜡切片样本中提取核酸的方法，采用上述的试剂盒提取石蜡切片样本中的核酸。

本发明具有以下有益效果：

本发明的从石蜡切片样本中提取核酸的试剂盒，该试剂盒包括有脱腊油，脱腊油包括有正十六烷和松节油，正十六烷和松节油的体积比为(3～6)：1。采用该脱蜡油对石蜡切片样本进行脱蜡，无需使用有毒化学品，正十六烷和松节油的配合使用具有良好脱蜡效果，无毒环保，简化了脱蜡过程中繁琐的洗涤步骤，且松节油具有氧化后会变色的效果，便于操作人员准确吸取裂解液层进行后续核酸提取的实验步骤，此外，该试剂盒具有能够提取数量更大、质量更高的石蜡DNA的优点。

本发明实施例还提供一种从石蜡切片样本中提取核酸的方法，该方法具有能够快速高效提取陈年FFPE样本核酸的优点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明第四对比例中本发明和参比试剂盒提取样本基因组的琼脂糖凝胶电泳图。

图2为本发明第五对比例中本发明和参比试剂盒提取样本基因组的荧光定量PCR结果分析图(图中纵坐标表示Ct值，横坐标表示样本编号)。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例提供的从石蜡切片样本中提取核酸的试剂盒及其方法进行具体说明。

本发明实施例提供的从石蜡切片样本中提取核酸的试剂盒，其含有正十六烷和松节油。

松节油是植物来源烃类溶剂中的代表，属于松香类溶剂存在于一种叫松脂的天然树脂中，为混合烃类，主要成分是α-蒎烯及β-蒎烯和少量1-莰烯。是油脂、蜡、树脂的良好溶剂，使用时安全性良好，并且松节油容易于空气中氧化，当有水分存在时，则氧化变为黄色粘稠状的物质，因而与裂解液层有明显区别，便于水相与有机相之间界面的光学分辨。

正十六烷和松节油的配合使用，替代了传统脱蜡过程中使用的二甲苯，使得在石蜡切片样本提取核酸的脱蜡过程中无需添加有毒化学品(二甲苯)，且脱腊油具有很好的脱蜡效果。此外，在提取核酸的过程中无需采用繁复的洗涤步骤，松节油具有氧化后会变色的效果，便于指示操作人员准确吸取裂解液层进行后续的核酸提取实验步骤。

进一步地，正十六烷与松节油的体积比为(3～6)：1。该配比能够使正十六烷和松节油在脱蜡过程中发挥协同作用，以达到更好的脱蜡效果。具体地，正十六烷与松节油的体积比可以为3:1、4:1、5:1或6:1。

本发明实施例提供的试剂盒还包括有裂解液、结合液、第一洗涤液、第二洗涤液以及洗脱液中的一种或多种。

裂解液包括硼氢化钠、Tris-HCl、EDTA、DTT(二硫苏糖醇)、SDS(十二烷基硫酸钠)、Tween-20、Triton X-100、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)以及Carrier RNA。具体地，硼氢化钠的浓度为1.8～2.2％(m/m)，Tris-HCl的浓度为95～105mmol/L，EDTA的浓度为45～55mmol/L，DTT的浓度为0.8～1.2％(m/m)，SDS的浓度为1.8～2.2％(m/m)，Tween-20浓度为5.8～6.2％(v/v)，Triton X-100的浓度为0.8～1.2％(v/v)，CTAB的浓度为1.8～2.2％(m/m)，Carrier RNA的浓度为0.48～0.52μg/μL。

具体地，硼氢化钠的浓度可以为1.8％、1.9％、2.0％、2.1％或2.2％。在该浓度范围下的硼氢化钠能将甲醛还原为甲醇并蒸发，解除了甲醛对细胞结构的固定，减少甲醛对细胞的约束，从而提高石蜡DNA的产量。同时，在该组分及组分配比下的该裂解液可以有效去除在组织内部形成生物分子的大量交联，减少DNA与蛋白的交联，彻底释放DNA，提高从石蜡切片样本中提取的DNA质量。

结合液包括有Tris-HCl、EDTA-2Na、(NH₄)₂SO₄、Nonidet P40以及异硫氰酸胍。具体地，在结合液中，Tris-HCl的浓度为95～105mmol/L，EDTA-2Na的浓度为48～52mmol/L，(NH₄)₂SO₄浓度为0.78～0.82M，Nonidet P 40浓度为3.8～4.2％(v/v)，异硫氰酸胍浓度为4.8～5.2M。

第一洗涤液包括有Tris-HCl、乙醇、EDTA-2Na以及DTT。在第一洗涤液中，Tris-HCl的浓度为64～66mmol/L，乙醇的浓度为48～52％，DTT的浓度为0.48～0.52％(m/m)，EDTA-2Na浓度为58～62mmol/L。

第二洗涤液包括有氯化钠以及乙醇。在第二洗涤液中，氯化钠溶液的浓度为0.8～1.2M，乙醇的浓度为78～82％。

洗脱液包括有Tris-HCl、EDTA-2Na以及Carrier RNA。在洗脱液中，Tris-HCl的浓度为28～32mmol/L，pH为7.8～8.2，EDTA-2Na的浓度为2.8～3.2mmol/L，Carrier RNA的浓度为0.08～0.12μg/μL。

本发明中的该试剂盒基于该上述脱蜡油、结合液、第一洗涤液、第二洗涤液以及洗脱液的组成和和配比，能够加快对石蜡DNA的提取速度，在提高安全系数的同时，获得高浓度、高纯度的石蜡DNA。

第一实施例

本实施例提供一种从石蜡切片样本中快速提取核酸的试剂盒。

该试剂盒包括有脱蜡油、裂解液、结合液、第一洗涤液、第二洗涤液以及洗脱液。

脱腊油含有体积比为4：1的正十六烷和松节油。

裂解液中含有2％(m/m)硼氢化钠、100mmol/L Tris-HCl、50mmol/L EDTA、1％(m/m)DTT、2％(m/m)SDS、6％(v/v)Tween-20、1％(v/v)Triton X-100、2％(m/m)CTAB和0.5μg/μL Carrier RNA。

结合液含有100mmol/L Tris-HCl、50mmol/L EDTA-2Na、0.8M(NH₄)₂SO₄、4％(v/v)Nonidet P 40以及5M异硫氰酸胍。

第一洗涤液含有65mmol/L Tris-HCl、50％乙醇、0.5％(m/m)DTT以及60mmol/LEDTA-2Na。

第二洗涤液含有1M氯化钠和80％乙醇。

洗脱液含有30mmol/L Tris-HCl(pH为8)、3mmol/L EDTA-2Na以及0.1μg/μLCarrier RNA。

第二实施例

本实施例提供一种从石蜡切片样本中提取核酸的方法，其包括以下步骤：

脱除石蜡步骤：

石蜡样本取7～10片至1.5mL离心管中，然后加入0.5mL脱蜡油，剧烈涡旋10秒，短暂离心让样本浸泡到脱蜡油中，56℃水浴4分钟，剧烈涡旋20秒。

裂解蛋白步骤：

在脱蜡后的样品中加入200μL裂解液和20μL蛋白酶K，涡旋混匀，短暂离心让样品浸泡到裂解液中。将样品55℃温育60分钟。将样品10000ⅹg离心1分钟，然后转移下层裂解液至新的离心管中(上层为石蜡和脱蜡油形成的有机相)。

提取核酸步骤：

在裂解蛋白后的样品中，加入200μL结合液和200μL无水乙醇得到混合液，涡旋混匀15秒。把DNA结合柱装在收集管中，转移混合液至DNA结合柱，10000ⅹg离心30秒。倒弃滤液把DNA结合柱装回收集管中，加入500μL第一洗涤液(已用无水乙醇稀释)至DNA结合柱中，10000ⅹg离心30秒。倒弃滤液把DNA结合柱装回收集管中，加入650μL第二洗涤液(已用无水乙醇稀释)至DNA结合柱中，10000ⅹg离心30秒。倒弃滤液把DNA结合柱装回收集管中。10000ⅹg离心3分钟。再将DNA结合柱装在1.5mL离心管中，加入100μL洗脱液至DNA结合柱的膜中央，室温放置2分钟，10000ⅹg离心1分钟。丢弃DNA结合柱，把DNA保存4℃以待检测或使用，DNA长期保存于-20℃。

第一对比例

验证第一实施例提供的试剂盒中脱蜡油的成分配比。

实验方法

采用第一实施例的试剂盒按照第二实施例提供的方法，按松节油与正十六烷的不同配比设置9组对照实施例，对同一大鼠小肠石蜡包埋组织的连续切片样本进行核酸提取，每组各取5片，将依次标记好样本信息的1-9组提取的核酸样本经核酸微量测试仪(安捷伦2100生化分析仪)进行提取核酸浓度及纯度的测试，测定的浓度及纯度结果如表1所示。

表1

备注：A260为核酸最高吸收峰的吸收波长；A280是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长。A260/A280为核酸纯度的指示值，用于评估核酸样品纯度。

由表1结果分析可知，在松节油与正十六烷的配比在1：(3～6)时，提取的样本核酸浓度及纯度效果较好，有利于增强本发明试剂盒的提取组织核酸样本的效率。

第二对比例

验证第一实施例提供的试剂盒中脱腊油的脱蜡效果。

实验方法

取5份不同石蜡组织，每份石蜡组织进行连续切片10片，按照每组5片分为S组和T组。将第一实施例提供的试剂盒对T组进行核酸提取，同时对比设置一组对照实施例，对照实施例中采用二甲苯替换脱蜡油对S组样本进行核酸提取，两组均采用第二实施例提供的方法对核酸进行提取。

将S、T两组提取的核酸样本经核酸微量测试仪(安捷伦2100生化分析仪)进行提取核酸浓度以及纯度的测定，测定的浓度及纯度如表2所示。

实验结果

表2为核酸样本的浓度结果

由表2可知，S、T两组提取的核酸浓度及纯度基本相同(P>0.05)，说明采用本发明中脱蜡油对样本的脱蜡效果与二甲苯的脱蜡效果基本一致，本发明中的脱蜡油可以替代传统使用的二甲苯进行石蜡样本的脱蜡处理。

第三对比例

验证第一实施例提供的试剂盒对陈年石蜡切片样本的提取效果。

实验方法

本实施例采用12组福尔马林固定石蜡包埋的病人肺癌组织样本，12组样本组织从固定包埋开始到进行实验的保存时间分别为1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、8个月、10个月、11个月、2年、3年、4年、5年以及6年。其中，1年内的标本6个，依次编号为1～6；1～6年的标本6个，依次编号为7～12。

采用第一实施例提供的试剂盒用第二实施例提供的方法对上述12组样本(各取连续切片10片)进行核酸提取，然后利用核酸微量测试仪(安捷伦2100生化分析仪)测定12组核酸的浓度及纯度，测定的浓度及纯度如下表3所示。

实验结果

表3样本的浓度结果

从表3可知，本发明第一实施例提供的试剂盒，能够过超过6年的石蜡切片样本进行DNA提取。

第四对比例

验证第一实施例提供的试剂盒的核酸提取率。

实验方法

随机选择5份石蜡包埋组织，并对每份石蜡组织进行连续切片15片，按照每组5片分成A、B、C三组，其中，组A1～5号样本使用第一实施例提供的试剂盒以及第二实施例提供的提取方法进行核酸的提取，B、C组样本分别用天根生化科技(北京)有限公司的组织核酸提取试剂盒以及杭州博日科技有限公司的Biospin组织DNA提取试剂盒作进行核酸提取对比。

需要说明的是，天根生化科技(北京)有限公司的试剂盒提取：严格按照试剂盒(天根FFPE石蜡组织DNA提取试剂盒DP331-02)的说明书进行核酸提取。杭州博日科技有限公司的试剂盒提取：严格按照试剂盒(博日FFPE石蜡组织DNA提取试剂盒BSC24S1)的说明书进行核酸提取。

琼脂糖凝胶电泳检测

对所得15份样本基因组DNA回收产物进行琼脂糖凝胶电泳，分别取2μL上样，其中，A组泳道上样本发明第一实施例提供的试剂盒提取核酸，B组泳道上样天根生化科技(北京)有限公司的试剂盒提取核酸，C组泳道上样杭州博日科技有限公司的试剂盒提取核酸，电泳结果请参照附图1。

OD值检测

使用超微量紫外-可见光分光光度计对15份样本基因组DNA回收产物进行了OD值检测(见表4)。

表4 OD值的检测结果图

由表4所示，使用第一实施例提供的试剂盒提取对样本基因组DNA进行提取得到的DNA产物含量高且纯度良好，说明该试剂盒适用于高通量提取基因组DNA。结合电泳图1，从图1可知，本发明第一实施例提供的试剂盒所获得样本基因组DNA产物较其他试剂盒提取的产物而言，平行性好，亮度高，表明提取的基因组DNA完整性好，浓度较高，且无其它DNA污染，因此，本发明试剂盒的提取组织样本核酸的效率高于现有的试剂盒核酸的提取率。

第五对比例

验证第一实施例提供的试剂盒提取核酸的提取量。

实验方法

随机选择6份石蜡包埋组织(样本1、样本2、样本3、样本4、样本5以及样本6)，并对每份石蜡组织进行连续切片15片，按照每组5片分成A、B、C三组，其中，组A1～5号样本使用第一实施例提供的试剂盒以及第二实施例提供的提取方法进行核酸的提取，B、C组样本分别用天根生化科技(北京)有限公司的组织核酸提取试剂盒以及杭州博日科技有限公司的Biospin组织DNA提取试剂盒作进行核酸提取对比。

需要说明的是，天根生化科技(北京)有限公司的试剂盒提取：严格按照试剂盒(天根FFPE石蜡组织DNA提取试剂盒DP331-02)的说明书进行核酸提取。杭州博日科技有限公司的试剂盒提取：严格按照试剂盒(博日FFPE石蜡组织DNA提取试剂盒BSC24S1)的说明书进行核酸提取，需要说明的是，天跟以及博日的试剂盒中未采用本发明实用的脱腊油。

选择样本1中的核酸，用安捷伦2100生物分析仪检测核酸样本浓度，采用CTAB体系进行PCR检测。选择针对人β-actin基因组DNA的引物和TaqMan荧光探针，采PrimerExpress软件自行设计，由上海生物工程公司(Sangong)合成。引物序列见表5。

表5：引物和探针的序列表

引物名称	引物序列(5’-3’)
		ACTB-3-F	GCTCACCATGGATGATGATATCGC
ACTB-3-R	TAGGAATCCTTCTGACCCATGCC

表6 PCR反应体系

表7：反应程序

对分别提取的6个标本核酸，根据表6和表7所示的PCR体系，分别用荧光定量PCR检测人每个标本中β-actin基因组DNA的量，用Ct值表示，比较三种抽提方法所获得的DNA的质和量，实验结果如图2所示，图中A表示采用本发明提取核酸样本检测结果值，B、C依次表示采用天根FFPE石蜡组织DNA提取试剂盒和博日FFPE石蜡组织DNA提取试剂盒BSC24S1提取核酸样本检测结果值。

实验结果

由图2分析可知，用本发明第一实施例提供的试剂盒抽提得到的基因组DNA所扩增的β-actin的Ct值较试剂盒抽提的Ct值小，表明用第一实施例的试剂盒抽提得到的基因组DNA含量较其他两组试剂盒抽提的好。可知采用本发明能够稳定地从不同石蜡包埋组织中释放核酸，且提取的核酸浓度优于市面上的其他试剂盒提取的核酸效果。

综上，采用本发明实施例提供的试剂盒进行石蜡切片样本中提取核酸，能避免或减少在脱蜡的过程中使用有毒化学品，如二甲苯，正十六烷和松节油的配合使用具有良好脱蜡效果，无毒环保，且简化了脱蜡过冲中繁琐的洗涤步骤，松节油具有氧化后会变色的效果，便于操作人员准确吸取裂解液层进行后续核酸提取的实验步骤，该试剂盒具有能够提取数量更大、质量更高的石蜡DNA的优点。

本发明实施例还提供一种从石蜡切片样本中提取核酸的方法，该方法能够快速提取的石蜡DNA的优点。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种从石蜡切片样本中提取核酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括有脱腊油，所述脱腊油含有体积比为(3～6)：1的正十六烷和松节油。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括有裂解液、结合液、第一洗涤液、第二洗涤液以及洗脱液中的一种或多种。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述裂解液包括有硼氢化钠、Tris-HCl、EDTA、DTT、SDS、Tween-20、Triton X-100、CTAB以及Carrier RNA。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，在所述裂解液中，硼氢化钠的浓度为1.8～2.2％(m/m)，Tris-HCl的浓度为95～105mmol/L，EDTA的浓度为45～55mmol/L，DTT的浓度为0.8～1.2％(m/m)，SDS的浓度为1.8～2.2％(m/m)，Tween-20浓度为5.8～6.2％(v/v)，Triton X-100的浓度为0.8～1.2％(v/v)，CTAB的浓度为1.8～2.2％(m/m)，Carrier RNA的浓度为0.48～0.52μg/μL。

5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述结合液包括有Tris-HCl、EDTA-2Na、(NH₄)₂SO₄、Nonidet P 40以及异硫氰酸胍。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，在所述结合液中，Tris-HCl的浓度为95～105mmol/L，EDTA-2Na的浓度为48～52mmol/L，(NH₄)₂SO₄浓度为0.78～0.82M，Nonidet P40浓度为3.8～4.2％(v/v)，异硫氰酸胍浓度为4.8～5.2M。

7.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述第一洗涤液包括有Tris-HCl、乙醇、EDTA-2Na以及DTT，所述第二洗涤液包括有氯化钠和乙醇，所述洗脱液包括有Tris-HCl、EDTA-2Na以及Carrier RNA。

8.一种从石蜡切片样本中提取核酸的方法，其特征在于，其包括采用权利要求1～7任一项所述的试剂盒提取石蜡切片样本中的核酸。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在提取石蜡切片样本中的核酸之前，所述方法包括石蜡脱除步骤；

所述石蜡脱除步骤包括将石蜡切片样本浸泡于权利要求1所述的脱蜡油中，54℃～58℃水浴3～5min。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，在石蜡脱除步骤后，提取核酸之前，所述提取方法还包括裂解蛋白步骤；

所述裂解蛋白步骤包括采用蛋白酶以及权利要求3或4所述试剂盒中的裂解液对石蜡脱除后的石蜡切片样本进行裂解。