KR101728421B1 - 어묵 또는 연육 내에 포함된 어종 판별 마커 - Google Patents

어묵 또는 연육 내에 포함된 어종 판별 마커 Download PDF

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Abstract

본 발명은 연육 내에 포함된 어종을 정확하게 판별하기 위해, 서열번호 3으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 2로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 포함하는, 연육내 포함된 어종 판별을 위한 PCR 반응 조성물 및 상기 조성물을 이용한 연육내 포함된 어종의 판별방법을 제공한다.

Description

어묵 또는 연육 내에 포함된 어종 판별 마커{Markers for identitying fish species contained in surimi products}
본 발명은 어종 판별 마커에 관한 것으로서, 더 상세하게는 어묵 또는 연육내에 포함된 어종 판별용 조성물 및 방법에 관한 것이다.
어묵 또는 연육 제품(surimi products)은 널리 활용되지 않는 어종을 대상으로 전 세계적으로 많이 소비되고 있는 대표적인 음식으로 잘 알려져 있다. 가장 일반적인 예는 명태(pollack) 및 대구(cod)와 같은 흰살 생선으로 만든 모조 게살(crabmeat)을 들 수 있다. 이러한 명태는 모조 게살의 주원료로 연육 제품의 프리미엄 등급으로 알려져 있으나 어획량이 2003년 250,000 MT에서 2010년 125,000 MT으로 감소함에 따라 연육 제품 생산을 위한 새롭고 다양한 어종에 관한 연구가 진행중이고(Poowakanjana and Park, Food Chem. 138(1): 200-207. 2013) 북태평양산 대구(Merluccius productus), 청대구(Micromesistius poutassou), 임연수어(Pleurogrammus azonus), 실꼬리돔(Nemipterus sp.) 및 전갱이(Trachurus murphy)등이 연육 산업의 주원료로 주목받고 있다. 그러나 높은 수익과 수요의 증가로 많은 어종이 남획되고 있고 어종에 상관없이 다양한 어종을 대상으로 연육 제품이 제조되고 있다. 이러한 상황으로 인해 낮은 가격의 어종을 대체하여 저 품질의 제품이 제조되는 문제가 발생하고 생선 필릿에 대한 일부 연구 결과에서 제품의 라벨에 표시된 어종보다 낮은 가격의 어종이 대체되어 사용된 것으로 나타나는 등 여러 문제점이 발생하고 있다(Pinto, Marchetti et al. Fisheries Research. 170: 9-13. 2015). 이와 관련하여 대한민국 등록특허 제1532882호는 유전자와 안정동위원소의 복합적 분석에 의한 수산물 원산지 판별 방법에 대해 개시하고 있다.
그러나 상기선행기술의 경우, 수산물 판별을 위한 분석 절차가 복잡하고 생물 유전자와 동위원소를 이용하여 판별의 오류가 발생할 수 있는 문제점이 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 어묵 또는 연육 내에 포함된 어종 판별 마커를 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 일 관점에 따르면, 서열번호 3으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 2로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 포함하는, 어묵 또는 연육 내에 포함된 어종 판별을 위한 PCR 반응 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 조성물 판별 대상 연육에서 추출된 게놈 DNA를 증폭하는 DNA 증폭 단계; 상기 증폭된 DNA 산물에 대하여 변성 구배 젤 전기영동(denaturating gradient gel electrophoresis, DGGE)을 수행하는 전기영동 단계; 및 전기영동된 DNA의 밴드 패턴을 분석하는 단계를 포함하는, 어묵 또는 연육 내에 포함된 어종의 판별방법이 제공된다.
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 어묵 또는 연육내에 포함된 어종의 서열로부터 개발한 프라이머를 이용하여 어묵 또는 연육 내에 포함된 어종을 정확하게 판별할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 174 bp 서열에 의해 참고 종에 대한 계통 관계를 나타내는 그림이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 연육 샘플로부터 추출된 DNA에 대하여 수행된 PCR 산물에 대한 DGGE 프로파일을 나타내는 겔 사진이다.
용어의 정의:
본 문서에서 사용되는 "수리미(Surimi)"는 어육에 적당량의 소금(2~3%)을 첨가하여 어육의 고기갈이를 하면 염용성 단백질인 미오신(myosin)과 엑토미오신(actomyosin) 단백질이 용출하여 점도가 높은 졸상을 지칭하며 다른 말로는 고기풀이라고도 하며 어묵 등의 원료로 이용된다.
본 문서에서 사용되는 "cytochrome c oxidase I (COI)"는 미토콘드리아에 있는 유전자로 핵안에 있는 DNA 보다 진화속도가 빠르기 때문에 종을 분류할 때 자주 쓰이는 DNA 마커이다.
발명의 상세한 설명:
본 발명은 일 관점에 따르면, 서열번호 3으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 2로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 포함하는, 어묵 또는 연육 내에 포함된 어종 판별을 위한 PCR 반응 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 조성물 판별 대상 연육에서 추출된 게놈 DNA를 증폭하는 DNA 증폭 단계; 상기 증폭된 DNA 산물에 대하여 변성 구배 젤 전기영동(denaturating gradient gel electrophoresis, DGGE)을 수행하는 전기영동 단계; 및 전기영동된 DNA의 밴드 패턴을 분석하는 단계를 포함하는, 어묵 또는 연육 내에 포함된 어종의 판별방법이 제공된다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 샘플준비
본 발명에 사용된 20개의 연육 제품(surimi product)은 2015년 2월 부산에 위치한 두 곳의 시장에서 구매하였고 냉장상태로 실험실로 이송하였다. 상기 연육 제품의 원산지가 표시된 수입국은 파키스탄과 중국이었고 상기 샘플 중 일부 원재료에 대한 상세정보를 추가적으로 하기 표 1에 표시하였다.
번호 원산지 내용 상세 정보
A 수입산 80.96% -
B 파키스탄 64.81% -
C 중국 54.84% 갈치(Hairtail)
D 수입산 65.34% -
E 수입산 66.51% -
F 수입산 66.84% -
G 수입산 80.69% 흰살생선(White flesh fish)
H 수입산 - -
I 수입산 66.51% -
J 수입산 80.30% 등푸른생선 21.41%
K 수입산 72.59% 조기
L 수입산 64.65% 갈치 및 실꼬리 돔
M 수입산 64.65% 갈치 및 실꼬리 돔
N 수입산 64.65% 갈치 및 실꼬리 돔
O 수입산 62.00% -
P 수입산 64.36% -
Q 수입산 78.40% -
R 수입산 81.05% -
S 수입산 50.04% -
T 수입산 54.16% -
실시예 2: DNA 추출
본 발명의 일 실시예에 따라 구매한 연육 샘플로부터 DNA를 추출하였다. 구체적으로, 본 발명에 사용된 DNA 샘플은 상기 연육 샘플을 구매 후 건조한 샘플(200 mg)을 이용하여 제조사의 지침에 따라 QIAgen DNeasy Blood & Tissue Kit를 사용하여 3회 추출하였다. 상기 추출된 모든 DNA 샘플은 동일 샘플로 포함하였고 NanoVue(GE Healthcare, USA)을 이용하여 정량화하였으며 약 50 ng/㎕을 실험에 사용하였다.
실시예 3: 프라이머 디자인
본 발명의 일 실시예에 따라 상기 샘플의 어종의 동정을 위한 표적 유전자로 COI 유전자를 선택하여 프라이머를 디자인하였다.
구체적으로, 일반적으로 연육의 주요 성분으로 잘 알려진 실꼬리 돔(Nemipterus virgatus, KR701906), 명태(Theragra chalcogramma, AB094061), 청대구(Micromesistius poutassou, FR751401), 임연수어(Pleurogrammus azonus, AB744047), 및 전갱이(Trachurus japonicus, AP003092) 다섯 어종의 미토콘드리아 서열의 전장(whole-length)을 NCBI 사이트(http://www.ncbi.nlm.gov)에서 획득하였고 BioEdit 플랫폼 버전 7.0.9.0의 Clustal W 프로그램을 이용하여 정렬하였다(http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html, Hall 1999). 상기 어종의 미토콘드리아 전장서열의 프라이머 영역 정렬 정보를 하기 표 2에 표시하였다.
5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6
4 4 4 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
N. virgatus C A C A A A G A C A T C G G C A C C C
T. chalcogramma C A C A A A G A C A T T G G C A C C C
M. poutassou C A C A A A G A C A T T G G C A C C C
P. azonus C A C A A A G A C A T T G G C A C C C
T. japonicus C A C A A A G A C A T C G G C A C C C
5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8
3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5
4 5 6 7 8 9 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 1 2 3
N. virgatus G G C G G G T T C G G A A A C T G A C T
T. chalcogramma G G A G G C T T T G G A A A C T G A C T
M. poutassou G G C G G C T T C G G G A A C T G A C T
P. azonus G G C G G T T T C G G G A A C T G A C T
T. japonicus G G A G G C T T T G G A A A C T G A C T
상기 정렬 정보를 바탕으로 COI 유전자의 보존 영역(conserved region)을 반영하여 프라이머 3' 말단, 멜팅 온도, 이차 구조, 반응물 크기 및 대부분 어종의 증폭을 위한 GC 함량, 염기 조성을 고려하여 범용 정방향 프라이머 ShortFish-F(서열번호 1) 및 역방향 프라이머 ShortFish-R(서열번호 2)를 디자인하였다. 상기 프라이머를 포함한 본 발명에 사용된 모든 프라이머의 정보를 하기 표 3에 표시하였다.
프라이머 서열 단편크기 서열번호
ShortFish-F 5'-CACAAAGACATTGGCACCC-3' 174 bp
 1
ShortFish-R 5'-AGTCAGTTTCCGAACCCTCC-3' 2
GC-ShortFish-F 5'-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCA CAA AGA CAT TGG CAC CC-3' 253 bp 3
실시예 4: DGGE - PCR 증폭
본 발명의 일 실시예에 따라 상기 실시예 2에서 준비한 20종의 어육 제품으로부터 추출된 DNA를 주형으로 상기 디자인한 프라이머를 이용하여 DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis)-PCR 증폭을 수행 하였다.
구체적으로, DGGE를 테스트하기 위해 GC-클램프를 정방향 프라이머 ShortFish-F의 5' 말단에 부착한 GC-ShortFish-F 프라이머(서열번호 3)를 포워드 프라이머로 사용하였고, 리버스 프라이머는 ShorFish-R 프라이머(서열번호 2)를 사용하였으며(표 2 참조), 0.2 mM 농도의 dNTP 혼합물, 1.5 mM MgCl2를 함유한 1X Ex Taq 버퍼, 0.5 μM의 상기 각 프라이머, 0.5 unit TaKaRa Ex Taq(TaKaRa Shuzo, Shiga, Japan) 및 1 ㎕ 주형 DNA (50 ng/μl)가 포함된 20 ㎕ PCR 반응 볼륨을 개별적으로 증폭하였다. 또한 상기 프라이머의 특이성을 증가시키기 위해, 터치다운 PCR 방법을 사용하였고 터치다운 PCR 조건(touchdown thermocycling conditions)은 하기와 같다: 94℃에서 7분 동안 초기 변성(initial denaturation); 94℃에서 1분 동안 변성을 포함하여 35 사이클로 증폭; 52℃에서 48℃ 조건으로 1분 동안 어닐링(annealing)(어닐링 온도는 52℃에서 5 사이클마다 1℃씩 감소한 뒤 남은 사이클은 48℃로 고정됨); 72℃에서 1분 동안 확장(extension); 마지막 확장 단계(final extension step)는 7분 동안 72℃에서 완료되었다. 주형 DNA가 없는 음성 대조군(negative controls)을 각 분석에 포함시켰고 상기 증폭된 DNA 단편은 1% 아가로즈 겔에서 분리한 후 1X redsafe 핵산 염색 수용액(iNtRON, South Korea)으로 염색하고 시각화하였다.
그 결과, 모든 샘플로 부터 46 내지 52℃의 어닐링 온도 조건에서 253 bp의 DNA 반응물이 증폭되었고 모든 샘플의 174 bp 오리지널 DNA 단편은 48 내지 52℃ 사이의 어닐링 온도에서 증폭될 수 있음을 말해준다.
또한 상기 프라이머에 대한 특이성을 조사하기 위하여 28계통(families)에서 76종(species)으로 부터 참고하기 위한 152 게놈 DNA 및 서열은 수산유전자원관리센터(수산과학원, 대한민국)에서 획득하였고 상기 정보를 하기 표 4에 표시하였다.
No 학명 부위 접근 번호
1 Eptatretus stoutii COI GU440317.1
2 Himantura sp. COI JX263423.1
3 Engraulis japonicus COI JF952723.1
4 Ilisha elongata COI HM030780.1
5 Sardinops melanostictus COI JQ266230.1
6 Gadus macrocephalus COI JQ354101.1
7 Gadus chalcogrammus COI JF952737.1
8 Lophius litulon COI EU660706.1
9 Cololabis saira COI JQ354059.1
10 Sebastes fasciatus COI KC015912.1
11 Sebastes alutus COI HQ712757.1
12 Pleurogrammus monopterygius COI JQ354278.1
13 Anthias nicholsi COI JQ774959.1
14 Acanthistius patachonicus COI EU074304.1
15 Branchiostegus albus COI EU861053.1
16 Carangoides equula COI AY541645.1
17 Trachurus japonicus COI JF952880.1
18 Pagrus major COI GU207340.1
19 Chrysophrys auratus COI DQ107829.1
20 Pagrus caeruleostictus COI JN868714.1
21 Larimichthys polyactis COI HQ385794.1
22 Larimichthys croces COI FJ595214.1
23 Pseudotolithus elongatus COI KF965495.1
24 Pseudotolithus typus COI KF965520.1
25 Miichthys miiuy COI JQ738461.1
26 Micropogonias undulatus COI JQ841936.1
27 Micropogonias furnieri COI GU225148.1
28 Atrobucca sp. COI JF492920.1
29 Atractoscion sp. COI DQ107824.1
30 Trichiurus japonicus COI JN990871.1
31 Trichiurus sp. COI JX124916.1
32 Scomber scombrus COI AB120717.1
33 Paralichthys isosceles COI JQ365476.1
34 Lim및a aspera COI JX183913.1
35 Cynoglossus senegalensis COI EU513631.1
36 Cynoglossus lingua COI KF965355.1
37 Cynoglossus arel COI KF965470.1
38 Cynoglossus macrolepidotus COI KF965350.1
39 Cynoglossus bilineatus COI KF965375.1
40 Mustelus mosis COI HQ149887.1
41 Mustelus asterias COI KJ205083.1
42 Okamejei acutispina COI EU334812.1
43 Himantura gerrardi COI JF493648.1
44 Himantura astra COI DQ108157.1
45 Himantura undulata COI JX263423.1
46 Muraenesox bagio COI JN021234.1
47 Sardinella aurita COI JQ266230.1
48 Sardinella maderensis COI JQ266230.1
49 Helicolenus barathri COI DQ108056.1
50 Sebastes ciliatus COI KF930415.1
51 Platycephalus indicus COI HM180794.1
52 Lateolabrax maculatus COI JQ343911.1
53 Epinephelus septemfasciatus COI FJ594966.1
54 Ephinehelus fuscoguttatus COI HQ174861.1
55 Chloroscombrus chrysurus COI KP641366.1
56 Trachinotus anak COI KJ642220.1
57 Trachurus novaezel및iae COI EF609485.1
58 Brama brama COI EU074367.1
59 Nemipterus bipunctatus COI JQ350137.1
60 Macrospinosa cuja COI JX260908.1
61 Pseudotolithus brachygnathus COI JF494251.1
62 Pseudotolithus sp. COI DQ885031.1
63 Otolithes ruber COI JF494030.1
64 Sciaenops ocellatus COI KF461230.1
65 Trichiurus gangeticus COI FJ265828.1
66 Scomber japonicus COI JQ738502.1
67 Lepidopsetta polyxystrapolyxystra COI HQ712518.1
68 Cynoglossus monodi COI EU513629.1
69 Ephippion guttifer COI KJ093731.1
70 Lagocephalus gloveri COI JQ681796.1
71 Lagocephalus guentheri COI KF442241.1
72 Lagocephalus wheeleri COI EU595161.1
73 Takifugu chinensis COI AP009534.1
74 Takifugu pseudommus COI AP009534.1
75 Takifugu rubripes COI HM102315.1
76 Takifugu xanthopterus COI JQ681824.1
그 결과, 상기 획득한 76 종의 COI 영역중 프라이머에 해당하는 위치에서 0 내지 3개의 서로 상이한 염기가 존재하였으나 상기 상이한 염기는 3' 말단에 위치하지 않았다. 또한, 역방향 프라이머 DGGE-R을 참고 서열과 비교한 결과 유사하게 역방향 프라이머 0 내지 4개의 불일치하는 염기가 존재하였고 3' 말단의 염기는 완벽하게 일치하였다.
또한 174 bp의 짧은 서열 정보에 의해 얼마나 많은 종이 동정될 수 있는지 결정하기 위해 상기 76종의 서열을 정렬하여 MEGA 5.0 프로그램을 이용하여 계통발생학적으로 분석하였고 상기 어종의 진화적 관계(evolutionary relationships)를 나타내었다. 상기 계통도는 오직 2 계통(전갱이과의 Trachurus sp. 및 Trachiotus sp.) 및 참복과의 Takifugu sp.)의 5 어종을 제외하고 대부분 종들은 짧은 서열에 의해 서로 구별되는 것으로 나타났고 상기 계통은 각각 100%의 유사성을 가진 계통군을 구성하였다. 분석 결과, 상기 약 174 bp 서열은 92% 종분류 가능성을 나타내어 어종의 식별을 위한 새로운 유전자 마커의 가치를 말해준다(도 1).
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실시예 5: DGGE 분석
본 발명의 일 실시예에 따라 DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis) 분석을 수행 하였다.
구체적으로 상기 증폭된 20개의 PCR 반응물은 GeneAll Expin PCR SV(GeneAll Biotechnology Co., South Korea)을 이용하여 정제하였고 상기 정제된 DNA는 20 내지 50% 범위(7 M 요소 및 40% 포름아마이드를 포함하는 100% 변성 수용액)의 변성 구배(denaturing gradient)를 갖는 8%(w/v) 폴리아크릴아마이드 겔을 이용하여 DCode 돌연변이 탐지 시스템(Bio-Rad, Hercules, USA)으로 분석하였다. 전기영동 실행(electrophoretic run)은 20 V에서 10분, 1x TAE 버퍼에서 60℃ 조건으로 14시간 동안 수행하였고 상기 겔을 증류수로 세척 후 2X SYBR gold로 30분 동안 염색하였으며 Molecular Imager Gel Doc system(Bio-Rad, USA)을 이용하여 이미지를 획득하였다.
실시예 6: DGGE 밴드의 동정
본 발명의 일 실시예에 따라 상기 획득한 DGGE 밴드로부터 분류 체계의 특성을 파악하기 위해 서열분석을 수행하였다.
구체적으로, 서열 분석을 위해 선택된 밴드는 DGGE 겔로부터 절단하였고 1.5 ml 튜브에 옮긴 후 100 ㎕ 증류수에서 재부유하였으며 4℃에서 하룻밤 동안 방치하였다. 상기 추출된 DNA는 20 ㎕ PCR 반응 볼륨의 DGGE-F(GC 클램프 없는) 및 DGGE-R과 함께 재-증폭(re-amplification)을 위한 주형으로 사용하였다. 이 후 PCR 반응물의 서열 분석은 Sanger sequencing BigDye Terminator v1.1 chemistry (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 분석하였고 서열 분석을 위한 반응은 상기 정제된 PCR 반응물 1 ㎕, 5x BigDye Terminator v1.1 Sequencing buffer 2 ㎕, BigDye terminator reaction mix v1.1 0.8 ㎕, 및 0.1 pM DGGE-F 정방향 프라이머 1 ㎕을 포함하는 총 볼륨 10 ㎕을 이용하여 수행하였다. 한편 반응 온도 프로파일(reaction temperature profile)은 96℃에서 15초 동안 변성, 50℃에서 5초 동안 어닐링 및 60℃에서 2분 동안 확장의 조건으로 25 사이클 수행 후 96℃에서 2분 동안 변성단계로 진행하였다. 상기 PCR 단편은 ABI 3500 Genetic Analyzer(Applied Biosystems)를 이용하여 분리하였다.
그 결과, DGGE 밴드 패턴으로부터 각 밴드의 위치에 기반 하여 각 시료별 6 내지 15 밴드, 총 30개의 밴드라인이 동정되었고 모든 샘플로부터 분리되어 확립된 DGGE 밴드 수의 평균은 10개로 나타났다. 상기 20개의 시료 중 13개는 각각 다른 DGGE 프로파일을 나타내었고(a-h, j, o, p, r 및 s) 이 외에 7개 시료는 다른 3개의 프로파일을 나타내었다(i 및 k, l-m, q 및 t). 상기 30개의 다른 밴드로 부터 수득한 서열은 하기 알려진 어종의 16종(species) 및 6 속(genera)에 해당하고 이는 하기와 같다(도 2): Nemipterus randalli(DGGE 밴드 번호 1); Nemipterus japonicus(DGGE 밴드 번호 14 및 15); Nemipterus bipunctatus(DGGE 밴드 번호 16); Trachurus japonicus(DGGE 밴드 번호 2, 3 및 4); Oreochromis niloticus(DGGE 밴드 번호 6); Branchiostegus argentatus(DGGE 밴드 번호 7); Dactyloptena orientalis(DGGE 밴드 번호 8); Scolopsis taenioptera(DGGE 밴드 번호 9); Pennahia macrocephalus(DGGE 밴드 번호 11); Gadus chalcogrammus(DGGE 밴드 번호 12 및 13); Trichiurus lepturus(DGGE 밴드 번호 17); Selar crumenophthalmus (DGGE 밴드 번호 19, 20 및 21); Megalaspis cordyla (DGGE 밴드 번호 23 및 24); Saurida undosquamis(DGGE 밴드 번호 26); Saurida tumbil(DGGE 밴드 번호 27, 28 및 29); Trachurus sp.(DGGE 밴드 번호 5); Lutjanus sp.(DGGE 밴드 번호 10); Trichiurus sp.(DGGE 밴드 번호 18); Mene sp.(DGGE 밴드 번호 22); Decapterus sp.(DGGE 밴드 번호 25); 및 Larimichthys sp.(DGGE 밴드 번호 30). 상기 DGGE 밴드의 동정 결과를 하기 표 5에 표시하였다.
밴드 최근접 매치 상동성 크기 접근번호
1 Nemipterus randalli 100% 172 KM538438
2 Trachurus japonicus 99% 174 KC970408
3 Trachurus japonicus 98% 174 KP267655
4 Trachurus japonicus 98% 174 KP267655
5 Trachurus sp. 95% 162 KM006769
6 Oreochromis niloticus 100% 165 KT307783
7 Branchiostegus argentatus 100% 165 KP267650
8 Dactyloptena orientalis 99% 174 FJ583314
9 Scolopsis taenioptera 100% 164 KF809419
10 Lutjanus sp. 96% 166 EU600136
11 Pennahia macrocephalus 99% 165 KP722759
12 Gadus chalcogrammus 99% 174 KT321137
13 Gadus chalcogrammus 99% 174 KT321137
14 Nemipterus japonicus 99% 174 KF009634
15 Nemipterus japonicus 97% 172 KF009634
16 Nemipterus bipunctatus 97% 165 JQ350137
17 Trichiurus lepturus 99% 168 JQ681420
18 Trichiurus sp. 95% 174 JN242479
19 Selar crumenophthalmus 97% 164 JF494494
20 Selar crumenophthalmus 99% 173 JF494494
21 Selar crumenophthalmus 97% 164 JF494494
22 Mene sp. 95% 174 KJ202178
23 Megalaspis cordyla 98% 164 KR011052
24 Megalaspis cordyla 98% 174 KR011052
25 Decapterus sp. 96% 174 JX261479
26 Saurida undosquamis 99% 166 KP266852
27 Saurida tumbil 99% 172 KP267628
28 Saurida tumbil 97% 174 KM459006
29 Saurida tumbil 98% 170 KM459006
30 Larimichthys sp. 96% 160 JQ738596　

상기 결과를 통해 알 수 있듯이, 본 발명자들은 시중에서 판매되는 연육제품에 대한 DGGE PCR 분석을 통해 밴드패턴만으로도 어떤 종류의 어류가 사용되었는지 분석하는 것이 가능함을 확인할 수 있었다. 이는 어류의 COI 유전자의 보존적 부위에 대한 프라이머세트를 이용한, DGGE PCR 분석이 어묵 또는 연육 제품에 포함된 어류 종 판별에 효율적으로 사용될 수 있는 기술이 될 수 있음을 최초로 입증한 것이다.
본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
<110> Republic of Korea represented by National Fisheries Research & Development Institute <120> Markers for identitying fish species contained in surimi products <130> PD16-5367 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ShortFish-F <400> 1 cacaaagaca ttggcaccc 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ShortFish-R <400> 2 agtcagtttc cgaaccctcc 20 <210> 3 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GC-ShortFish-F <400> 3 cgcccgccgc gcgcggcggg cggggcgggg gcacgggggg cacaaagaca ttggcaccc 59

Claims (2)

  1. 서열번호 3으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 2로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 포함하는, 어묵 또는 연육 내에 포함된 어종 판별을 위한 PCR 반응 조성물.
  2. 제1항의 조성물로 판별 대상 어묵 또는 연육에서 추출된 게놈 DNA를 증폭하는 DNA 증폭 단계;
    상기 증폭된 DNA 산물에 대하여 변성 구배 젤 전기영동(denaturating gradient gel electrophoresis, DGGE)을 수행하는 전기영동 단계; 및
    전기영동된 DNA의 밴드 패턴을 분석하는 단계를 포함하는, 어묵 또는 연육 내에 포함된 어종의 판별방법.
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