CN103131774B

CN103131774B - 一种鱼糜制品中肉来源的检测方法

Info

Publication number: CN103131774B
Application number: CN201310038401.1A
Authority: CN
Inventors: 赵峰; 周德庆; 李新光
Original assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Current assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2013-01-29
Filing date: 2013-01-29
Publication date: 2014-04-02
Anticipated expiration: 2033-01-29
Also published as: CN103131774A

Abstract

本发明公开了一种鱼糜制品中肉来源的检测方法，步骤一、DNA提取；步骤二、多重PCR；步骤三、电泳检测；步骤四、结果鉴定。本发明检测成本低、检测周期短、能一次性检测出一种或多种肉类，更适合用于实际检测。

Description

一种鱼糜制品中肉来源的检测方法

技术领域

本发明涉及一种鱼糜制品中肉来源的检测方法，属于分子生物学检测领域。

背景技术

鱼糜是将鲜活的原料鱼预处理后，经采肉、漂洗、精滤、脱水、分装、冻结而成具有一定保藏期的产品。鱼糜制品是以鱼糜为主要原料，添加淀粉、调味料等调配加工的各种食品，如鱼丸、鱼糕等。近十年来，我国鱼糜制品的生产及其消费量量逐年增加，已成为重要的水产加工品种之一。在鱼糜制品的加工过程中，为改善产品的口感、提高产品产量，生产者会在鱼糜制品中添加其它肉类，较为常见的是添加鸡肉、鸭肉和猪肉。生产者添加了其它肉类后在食品包装中如不正确标注，一方面是欺瞒消费者，损害了消费者的经济利益，另一方面特定消费者对肉类的选择有倾向性，如回族不吃猪肉等。

为保护消费者的利益，需要建立一种有效的区分鱼糜制品中肉来源的检测方法，以检测鱼糜制品中是否含有鸡肉、鸭肉或猪肉。由于鱼糜制品的加工方式，肉类成分的感官性状和免疫原性物质遭到破坏，很难通过传统的方法如感官评定和免疫学方法来区分其是否添加了其它肉类成分。

随着分子生物学技术的发展，使从DNA水平上对鱼糜制品中的肉的来源鉴定成为可能。DNA的性质稳定，在鱼糜制品的加工过程中仍能保持良好的稳定性。目前，已有报道采用PCR(聚合酶链反应)方法分别对鸡肉、鸭肉或猪肉的线粒体细胞色素氧化酶亚基I基因进行扩增，经克隆、测序以及序列比对来鉴别肉的品种。但是这种方法依赖测序结果进行分析，成本较高，检测周期较长(3-5天)，而且一次只能对一种肉类品种进行鉴定。这种测试的时间和测出品种的能力很难满足实际生活的需要，因此，必须一种检测成本低、检测周期短、能一次性检测出一种或多种肉类的检测方法，但现有技术中未见报道。

发明内容

为了解决现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种检测成本低、检测周期短、能一次性检测出一种或多种肉类的鱼糜制品中肉来源的检测方法。

为达到上述目的，本发明所采用的技术手段是：

一种鱼糜制品中肉来源的检测方法，步骤一、DNA提取：用灭菌后的剪刀将鱼糜制品剪碎，称取1g鱼糜制品于15mL灭菌的离心管中，加入4mL的TE抽提液，匀浆；加入400μL10％SDS和80μL20mg/ml蛋白酶K充分混匀；将离心管置于65℃的恒温水浴槽中孵育，直至混合液消化至澄清为止；12000r/min离心30min，取上清液至新的离心管中，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇＝25∶24∶1，缓慢颠倒混匀，12000r/min离心10min；取上清液至新的离心管中，加入2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，上下颠倒数次，12000r/min离心10min；弃去乙醇，吹干，获得DNA；然后加入100μL超纯水溶解，使用超微量核酸蛋白质测定仪，将DNA浓度稀释至100ng/μL左右作为模板；

步骤二、多重PCR：多重PCR扩增采用50μL的体系，DNA模板1μL，含Mg²⁺的10×PCR缓冲液5μL，浓度为2.5mmol/L dNTPs mixture2μL，鸡肉特征引物Gg-F和Gg-R：鸭肉特征引物Ap-F和Ap-R：猪肉特征引物Ss-F和Ss-R＝2∶1∶1，所需的引物浓度均为10μmol/L，5U/μLTaqDNA聚合酶0.4μL，加超纯水补充至50μL；PCR扩增反应程序分为两部分，第一部分：94℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火40s，72℃延伸50s；以后每个循环依次降低0.5℃，直到52.5℃，共25个循环；进入第二部分，94℃变性30s，52℃退火40s，72℃延伸50s，12个循环；最后72℃延伸8min；

步骤三、电泳检测：取5μL PCR产物与1μL预染液混合，预染2～3min，于1.0％的琼脂糖凝胶上进行点样，120V条件下电泳30min，然后，采用凝胶成像系统拍照；

步骤四、结果鉴定：观察电泳结果，鸡肉、鸭肉和猪肉对应的扩增片段大小分别为187bp、333bp和515bp，如有上述大小的片段，则认为结果为阳性，样品中含用相对应的肉类成分，如无上述大小片段，则认为是阴性，样品中不含有鸡肉、鸭肉和猪肉。

进一步的，所述步骤一中TE抽提液含有1.5％CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)、0.05mol/LpH8.0的Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸)、0.7mol/L NaCl、0.01mol/L pH8.0的EDTA(乙二胺四乙酸)。

进一步的，所述步骤二中鸡肉特征引物Gg-F和Gg-R各1μL，鸭肉特征引物Ap-F和Ap-R各0.5μL，猪肉特征引物Ss-F和Ss-R各0.5μL。

进一步的，所述步骤三中的预染液为6×Loading buffer(上样缓冲液)：Genefinder核酸染料＝9∶1混合。

进一步的，所述引物的序列：鸡肉特征引物Gg-F：AGCAGGTGTTTCCTCCAT和Gg-R：GTTGCGGTCGGTAAGTAG，扩增片段187bp；鸭肉特征引物Ap-F：

CATTCCTCCTTATACTCGC和Ap-R：ATGTGGTGTTTAGGTTTCG，扩增片段333bp；猪肉特征引物Ss-F：AACCCTACTTGGCGATGA和Ss-R：GTGTTCAGGTTGCGGTCT，扩增片段515bp。

本发明的有益效果在于：检测成本低、检测周期短、能一次性检测出一种或多种肉类，更适合用于实际检测。

附图说明

下面结合附图对本发明的技术方案进行说明。

图1是本发明电泳结果示意图。

图中：M：DNA Marker，1-8：不同的鱼糜试验制品。

具体实施方式

为了便于直观理解本发明的技术方案，制备了分别含有重量比为10％鸡肉、10％鸭肉、10％猪肉、10％鸡肉和10％鸭肉、10％鸭肉和10％猪肉、10％鸡肉和10％猪肉、同时含有10％鸡肉、10％鸭肉和10％猪肉以及不含有鸡肉、鸭肉和猪肉的模拟鱼糜制品。制备过程为称取化冻后的冷冻鱼糜，按照上述比列分别加入鸡肉、鸭肉、猪肉以及两种和三种的混合物，加入重量比为3％的NaCl和重量比5％的淀粉；混匀，手工制成鱼丸；沸水中煮10min后室温冷却备用。

1、DNA提取

用灭菌后的剪刀将鱼糜制品剪碎，用电子天平称取1g鱼糜制品分别放于15mL灭菌的离心管中，加入4mL的TE抽提液(含有1.5％CTAB、0.05mol/LpH8.0的Tris-HCl、0.7mol/L NaCl、0.01mol/L pH8.0的EDTA)，匀浆；加入400μL10％SDS和80μL20mg/ml蛋白酶K上下颠倒，充分混匀；将离心管置于65℃的恒温水浴槽中孵育，直至混合液消化至澄清为止；12000r/min离心30min，取上清液至新的离心管中，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，缓慢颠倒混匀，12000r/min离心10min；取上清液至新的离心管中，加入2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，上下颠倒数次，12000r/min离心10min；弃去乙醇，吹干，获得DNA；然后加入100μL超纯水溶解，使用超微量核酸蛋白质测定仪，将DNA浓度稀释至100ng/μL左右作为模板；

2、多重PCR

多重PCR扩增采用50μL的体系，DNA模板1μL，10×PCR缓冲液(含Mg2+)5μL，dNTPsmixture(2.5mmol/L)2μL，鸡肉特征引物Gg-F和Gg-R各1μL，鸭肉特征引物Ap-F和Ap-R各0.5μL，猪肉特征引物Ss-F和Ss-R各0.5μL，上述引物浓度均为10μmol/L，所需的引物的序列如表1所示，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.4μL，加超纯水补充至50μL；PCR扩增反应程序分为两部分，第一部分：94℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火40s，72℃延伸50s；以后每个循环依次降低0.5℃，直到52.5℃，共25个循环；进入第二部分，94℃变性30s，52℃退火40s，72℃延伸50s，12个循环；最后72℃延伸8min；

3、电泳检测

取5μL PCR产物与1μL预染液(6×Loading buffer/Genefinder＝9∶1)混合，预染2～3min，于1.0％的琼脂糖凝胶上进行点样，120V条件下电泳30min，然后，采用凝胶成像系统拍照；

4、结果鉴定

如图1所示，观察电泳结果，鸡肉、鸭肉和猪肉对应的扩增片段大小分别为187bp、333bp和515bp。从图中可以看出1号样品仅有187bp的扩增片段，显示其中含有鸡肉成分；2号样品仅有333bp的扩增片段，显示其中含有鸭肉成分；3号样品仅有515bp的扩增片段，显示其中含有猪肉成分；4号样品有187bp和333bp两条扩增片段，显示其中含有鸡肉和鸭肉成分；5号样品有333bp和515bp两条扩增片段，显示其中含有鸭肉和猪肉成分；6号样品有187bp和515bp两条扩增片段，显示其中含有鸡肉和猪肉成分；7号样品有187bp、333bp和515bp三条扩增片段，显示其中含有鸡肉、鸭肉和猪肉成分；8号样品中没有扩增条带，显示其中不含鸡肉、鸭肉和猪肉成分。

表1 多重PCR扩增所需引物序列

本发明的实施例所表述的，并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

鸡肉特征引物Gg-F：AGCAGGTGTTTCCTCCAT 和Gg-R：GTTGCGGTCGGTAAGTAG

鸭肉特征引物Ap-F：CATTCCTCCTTATACTCGC和Ap-R：ATGTGGTGTTTAGGTTTCG

猪肉特征引物Ss-F：AACCCTACTTGGCGATGA和Ss-R：GTGTTCAGGTTGCGGTCT

Claims

1.一种鱼糜制品中肉来源的检测方法，其特征在于：步骤一、DNA提取：用灭菌后的剪刀将鱼糜制品剪碎，称取1g鱼糜制品于15mL灭菌的离心管中，加入4mL的TE抽提液，匀浆；加入400μL10% SDS和80μL 20mg/ml蛋白酶K充分混匀；将离心管置于65℃的恒温水浴槽中孵育，直至混合液消化至澄清为止；12000r/min 离心30min，取上清液至新的离心管中，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇=25:24:1，缓慢颠倒混匀，12000 r/min 离心10min；取上清液至新的离心管中，加入2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，上下颠倒数次，12000 r/min 离心10min；弃去乙醇，吹干，获得DNA；然后加入100μL超纯水溶解, 使用超微量核酸蛋白质测定仪，将DNA浓度稀释至100ng/μL左右作为模板；

步骤二、多重PCR：多重PCR扩增采用50μL的体系，DNA模板1μL，含Mg²⁺的10×PCR缓冲液 5μL，浓度为2.5mmol/L dNTPs mixture 2μL，鸡肉特征引物Gg-F和Gg-R：鸭肉特征引物Ap-F和Ap-R：猪肉特征引物Ss-F和Ss-R=2:1:1，所需的引物浓度均为10μmol/L，5U/μL Taq DNA聚合酶0.4μL，加超纯水补充至50μL；PCR扩增反应程序分为两部分，第一部分：94℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火40s，72℃延伸50s；以后每个循环依次降低0.5℃，直到52.5℃，共25个循环；进入第二部分，94℃变性30s，52℃退火40s，72℃延伸50s，12个循环；最后72℃延伸8min；

步骤三、电泳检测：取5μL PCR产物与1μL 预染液混合，预染2-3min，于1.0%的琼脂糖凝胶上进行点样, 120V条件下电泳30min，然后，采用凝胶成像系统拍照；

步骤四、结果鉴定：观察电泳结果，鸡肉、鸭肉和猪肉对应的扩增片段大小分别为187bp、333bp和515bp，如有上述大小的片段，则认为结果为阳性，样品中含用相对应的肉类成分，如无上述大小片段，则认为是阴性，样品中不含有鸡肉、鸭肉和猪肉；

所述引物的序列：鸡肉特征引物Gg-F：AGCAGGTGTTTCCTCCAT 和Gg-R：GTTGCGGTCGGTAAGTAG，扩增片段187bp；鸭肉特征引物Ap-F：CATTCCTCCTTATACTCGC和Ap-R：ATGTGGTGTTTAGGTTTCG，扩增片段333bp；猪肉特征引物Ss-F：AACCCTACTTGGCGATGA和Ss-R：GTGTTCAGGTTGCGGTCT，扩增片段515bp。

2.根据权利要求1所述的鱼糜制品中肉来源的检测方法，其特征在于：所述步骤一中的TE抽提液含有1.5% CTAB、0.05mol/L pH8.0的Tris-HCl、0.7mol/L NaCl、0.01mol/L pH8.0的EDTA。

3.根据权利要求1所述的鱼糜制品中肉来源的检测方法，其特征在于：所述步骤二中鸡肉特征引物Gg-F和Gg-R各1μL，鸭肉特征引物Ap-F和Ap-R各0.5μL，猪肉特征引物Ss-F和Ss-R各0.5μL。

4.根据权利要求1所述的鱼糜制品中肉来源的检测方法，其特征在于：所述步骤三中的预染液为6×Loading buffer：Genefinder核酸染料 =9:1混合。