CN113481306A - 一种使用实时荧光pcr手段快速检测13种龙利鱼源性成分的方法 - Google Patents

一种使用实时荧光pcr手段快速检测13种龙利鱼源性成分的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种使用实时荧光PCR手段快速检测13种龙利鱼源性成分的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)样品DNA的提取；(2)引物设计；(3)荧光PCR体系的构建；(4)特异性试验；(5)基因组灵敏度试验；(6)质量分数灵敏度试验。本发明引物特异性强，反应时间约为55分钟，大大节约了时间成本，龙利鱼基因组DNA灵敏度可达到10‑3ng，在与巴沙鱼粉混合的鱼肉制品中可检测，质量分数灵敏度达到1％。本研究为加强鱼肉制品的监管力度，鉴定龙利鱼真伪，打击掺假行为，保护消费者的合法权益提供了有效的技术手段，并且在鱼肉制品的快速检测方面具有良好的应用前景。

Description

一种使用实时荧光PCR手段快速检测13种龙利鱼源性成分的 方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种使用实时荧光PCR手段快速检测13种龙利鱼源性成分的方法。
背景技术
龙利鱼俗称舌鳎鱼，属舌鳎科，舌鳎属(Cynogloddus)，是舌鳎属所有鱼类的俗称，是一种生活在中国近海大型底层暖温性鱼类。龙利鱼味道鲜美、营养丰富，属于高蛋白鱼类。但其自然资源量少，出肉率偏低。据报道,仅山东半岛海域分布的舌鳎属鱼类就有短吻红舌鳎(Cynoglossus joyneri)、长吻红舌鳎(C.lighti)、宽体舌鳎(C.robustus)、窄体舌鳎(C.gracilis)、半滑舌鳎(C.semilaevis)、紫斑舌鳎(C.purpureomaculatus)和短吻三线舌鳎(C.abbreviatus)7种,均具有较高的经济价值。目前，在鱼类水产市场中，消费者对巴沙鱼和龙利鱼认知混淆，水产市场、餐饮行业将“巴沙鱼”冠名为“龙利鱼”进行销售，损害了消费者的合法权益。基于荧光PCR技术对于鱼肉真伪的鉴别，出台了对于石斑鱼等7种鱼类的检测标准方法，有学者通过荧光PCR法鉴别大西洋鲑鱼和虹鳟鱼，国家市场监督管理总局于2019年发布了《鳕鱼及其制品中裸盖鱼、油鱼和南极犬牙鱼源性成分检测BJS 201907》食品补充检验方法(2019年第9号),分别设计了鳕鱼及其制品中易混淆物种裸盖鱼(Anoplopoma fimbria)、油鱼(异鳞蛇鲭Lepidocybium flavobrunneum、棘鳞蛇鲭Ruvettuspretiosus)和南极犬牙鱼(小鳞犬牙南极鱼Dissostichus eleginoides、鳞头犬牙南极鱼Dissostichus mawsoni)成分的实时荧光PCR检测方法的特异性引物和探针，可用于鳕鱼、鳕鱼片、鳕鱼扒等生鲜或速冻鳕鱼产品的检测。但是应用荧光PCR技术对于龙利鱼源性成分进行检测的方法却未见报道。因此亟需一种高效准确的检测鱼肉制品中龙利鱼源性成分的方法。以DNA分子特异基因扩增技术为基础的实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)具有简单、快速、灵敏度高和准确性高的优点，目前已是肉制品物种源性成分鉴定普遍采用的方法。
发明内容
本发明的目的是针对现有的问题，提供了一种使用实时荧光PCR手段快速检测13种龙利鱼源性成分的方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种使用实时荧光PCR手段快速检测13种龙利鱼源性成分的方法，包括如下步骤：
(1)样品DNA的提取：
用无菌剪刀取样品25mg，捣碎成肉糜，置于DNA提取试剂盒提供的管中，按照DNA提取试剂盒的步骤进行操作；
(2)引物设计：
a.选取了半滑舌鳎(C.semilaevis)，短吻红舌鳎(C.joyneri)，长吻红舌鳎(C.lighti)，宽体舌鳎(C.robustus)，窄体舌鳎(C.gracilis)，紫斑舌鳎(C.purpureomaculatus)，短吻三线舌鳎(C.abbreviatus)，双线舌鳎(C.bilineatus)，中华舌鳎(C.sinicus)，褐斑三线舌鳎(C.trigrammus)，黑鳃舌鳎(C.roulei)，斑头舌鳎(C.puncticeps)，少鳞舌鳎(C.oligolepis)13种龙利鱼进行研究；
b.通过GenBank下载此13种龙利鱼，巴沙鱼，大西洋鳕鱼，太平洋鳕鱼，大西洋鲑鱼，鲷鱼，草鱼，鲤鱼，以及常见的肉类猪，牛，羊，鸡，鸭，鹅的16S rRNA基因序列，利用clustalx软件对此13种龙利鱼的16S rRNA基因序列进行比对，找出13种龙利鱼的相同序列，并且与巴沙鱼，大西洋鳕鱼，太平洋鳕鱼，大西洋鲑鱼，鲷鱼，草鱼，鲤鱼，猪，牛，羊，鸡，鸭，鹅的16S rRNA基因存在差异的序列，通过NCBI网站的引物设计工具Primer-BLAST和探针设计软件Primer Express 3.0设计一组13种龙利鱼的通用引物和探针，分别为上游引物、下游引物和探针引物，上游引物序列如序列表SEQ ID NO:1所示；下游引物序列如系列表SEQ IDNO:2所示；探针引物序列如序列表SEQ ID NO:3所示；其核苷酸序列为：
上游引物F：5’-AGACGAGAAGACCCTGTGGA-3’；
下游引物R：5’-ATTGCGCTGTTATCCCTGG-3’；
探针序列P：5’-(FAM)ATCTTCAGTTGGGGCGAC-3’(MGB)；
(3)荧光PCR体系的构建：
通过对引物浓度和循环数进行PCR反应程序的条件优化，确定了以下条件：
龙利鱼实时荧光PCR反应体系：10μL Premix Ex TaqTM，上下游引物、TaqMan探针各0.8μL(浓度为10μM)，提取DNA模板1μL，用灭菌水补足至总体积20μL；
PCR反应程序：95℃预变性30s；95℃15s，60℃30s，40个循环；
(4)特异性试验：
利用超微量分光光度计测定样品DNA在260nm和280nm处的吸光值A260和A280，当A260/A280比值在1.7-1.9之间，适宜于PCR扩增，利用步骤(3)设计的荧光PCR体系，分别以半滑舌鳎，短吻红舌鳎，长吻红舌鳎，宽体舌鳎，窄体舌鳎，紫斑舌鳎，短吻三线舌鳎巴，巴沙鱼，大西洋鳕鱼，大西洋鲑鱼，鲷鱼，草鱼，鲤鱼，猪，牛，羊，鸡，鸭动物的DNA为模板，利用超微量分光光度计测定上述样品DNA浓度，将DNA浓度稀释成1ng/μL，以纯水为模板作为空白对照，进行实时荧光PCR，验证引物的特异性，并对半滑舌鳎样品的扩增产物进行测序，将测序结果在NCBI中进行比对；
(5)基因组灵敏度试验：
按照步骤(1)的方法提取半滑舌鳎的DNA；利用超微量分光光度计测定半滑舌鳎样品DNA浓度，用超纯水10倍梯度稀释半滑舌鳎，半滑舌鳎DNA量选取1ng，10-1ng，10-2ng，10- 3ng，10-4ng，以纯水为模板作为空白对照，以步骤(3)中的荧光PCR反应体系进行实时荧光PCR；
(6)质量分数灵敏度试验：
取巴沙鱼和半滑舌鳎样品，置于电热恒温鼓风干燥箱中，105℃烘干，匀浆仪打磨成干粉，将半滑舌鳎和巴沙鱼干粉按照干重质量比1:9混合，再置于匀浆仪中充分打磨混合，制成含有半滑舌鳎干粉10％，1％，0.1％的巴沙鱼粉；按照步骤(1)提取上述样品的DNA；以步骤(3)中的荧光PCR反应体系进行实时荧光PCR。
进一步地，步骤(2)操作b中所述的上游引物、下游引物以及探针引物均由北京擎科生物工程有限公司合成。
本发明相比现有技术具有以下优点：
1、本发明建立了一种可以快速检测鱼肉制品中13种龙利鱼[包括：半滑舌鳎(C.semilaevis)，短吻红舌鳎(C.joyneri)，长吻红舌鳎(C.lighti)，宽体舌鳎(C.robustus)，窄体舌鳎(C.gracilis)，紫斑舌鳎(C.purpureomaculatus)，短吻三线舌鳎(C.abbreviatus)，双线舌鳎(C.bilineatus)，中华舌鳎(C.sinicus)，褐斑三线舌鳎(C.trigrammus)，黑鳃舌鳎(C.roulei)，斑头舌鳎(C.puncticeps)，少鳞舌鳎(C.oligolepis)]源性成分的TaqMan探针荧光PCR法，根据13种龙利鱼的线粒体16S rRNA序列，设计通用引物和探针，通过优化扩增反应体系进行实时双重荧光PCR进行扩增，从而达到快速检测产物的目的。此方法特异性良好，龙利鱼基因组DNA灵敏度可达到10-3ng，在与巴沙鱼粉混合的鱼肉制品中可检测，质量分数灵敏度达到1％。本方法检测特异性高、时间短、灵敏度高，效率高，一对引物和探针就可检测13种龙利鱼，基本涵盖了我国舌鳎属中的典型物种，可满足鱼肉制品中龙利鱼真伪鉴别的检测要求。填补了国内龙利鱼检测的空白。
2、本发明引物特异性强，反应时间约为55分钟，大大节约了时间成本，龙利鱼基因组DNA灵敏度可达到10-3ng，在与巴沙鱼粉混合的鱼肉制品中可检测，质量分数灵敏度达到1％。本研究为加强鱼肉制品的监管力度，鉴定龙利鱼真伪，打击掺假行为，保护消费者的合法权益提供了有效的技术手段，并且在鱼肉制品的快速检测方面具有良好的应用前景。
3、本发明的关键点和保护点为引物和探针序列，本发明最大的优势是利用一组引物和探针就可以鉴定13种龙利鱼，基本涵盖了在中国海域生存的所有舌鳎属的物种，效率高，特异性强，大大节约了时间成本。本发明中最重要的步骤为引物和探针的设计。
4、本发明利用一组引物和探针鉴定13种龙利鱼，目前未发现有其他方法能够达到此种效果。
附图说明
图1为特异性试验曲线；
图2为灵敏度试验曲线；
图3为模板含量与Ct值的相关线性图；
图4为质量分数灵敏度试验曲线。
具体实施方式
一种使用实时荧光PCR手段快速检测13种龙利鱼源性成分的方法，包括如下步骤：
(1)样品DNA的提取：
用无菌剪刀取样品25mg，捣碎成肉糜，置于DNA提取试剂盒提供的管中，按照DNA提取试剂盒的步骤进行操作；
(2)引物设计：
a.选取了半滑舌鳎(C.semilaevis)，短吻红舌鳎(C.joyneri)，长吻红舌鳎(C.lighti)，宽体舌鳎(C.robustus)，窄体舌鳎(C.gracilis)，紫斑舌鳎(C.purpureomaculatus)，短吻三线舌鳎(C.abbreviatus)，双线舌鳎(C.bilineatus)，中华舌鳎(C.sinicus)，褐斑三线舌鳎(C.trigrammus)，黑鳃舌鳎(C.roulei)，斑头舌鳎(C.puncticeps)，少鳞舌鳎(C.oligolepis)13种龙利鱼进行研究；
b.通过GenBank下载此13种龙利鱼，巴沙鱼，大西洋鳕鱼，太平洋鳕鱼，大西洋鲑鱼，鲷鱼，草鱼，鲤鱼，以及常见的肉类猪，牛，羊，鸡，鸭，鹅的16S rRNA基因序列，利用clustalx软件对此13种龙利鱼的16S rRNA基因序列进行比对，找出13种龙利鱼的相同序列，并且与巴沙鱼，大西洋鳕鱼，太平洋鳕鱼，大西洋鲑鱼，鲷鱼，草鱼，鲤鱼，猪，牛，羊，鸡，鸭，鹅的16S rRNA基因存在差异的序列，通过NCBI网站的引物设计工具Primer-BLAST和探针设计软件Primer Express 3.0设计一组13种龙利鱼的通用引物和探针，分别为上游引物、下游引物和探针引物，北京擎科生物工程有限公司合成，上游引物序列如序列表SEQ IDNO:1所示；下游引物序列如系列表SEQ IDNO:2所示；探针引物序列如序列表SEQ ID NO:3所示；其核苷酸序列为：
上游引物F：5’-AGACGAGAAGACCCTGTGGA-3’；
下游引物R：5’-ATTGCGCTGTTATCCCTGG-3’；
探针序列P：5’-(FAM)ATCTTCAGTTGGGGCGAC-3’(MGB)；
(3)荧光PCR体系的构建：
通过对引物浓度和循环数进行PCR反应程序的条件优化，确定了以下条件：
龙利鱼实时荧光PCR反应体系：10μL Premix Ex TaqTM，上下游引物、TaqMan探针各0.8μL(浓度为10μM)，提取DNA模板1μL，用灭菌水补足至总体积20μL；
PCR反应程序：95℃预变性30s；95℃15s，60℃30s，40个循环；
(4)特异性试验：
利用超微量分光光度计测定样品DNA在260nm和280nm处的吸光值A260和A280，当A260/A280比值在1.7-1.9之间，适宜于PCR扩增，利用步骤(3)设计的荧光PCR体系，分别以半滑舌鳎，短吻红舌鳎，长吻红舌鳎，宽体舌鳎，窄体舌鳎，紫斑舌鳎，短吻三线舌鳎巴，巴沙鱼，大西洋鳕鱼，大西洋鲑鱼，鲷鱼，草鱼，鲤鱼，猪，牛，羊，鸡，鸭动物的DNA为模板，利用超微量分光光度计测定上述样品DNA浓度，将DNA浓度稀释成1ng/μL，以纯水为模板作为空白对照，进行实时荧光PCR，验证引物的特异性，并对半滑舌鳎样品的扩增产物进行测序，将测序结果在NCBI中进行比对；
检测结果如图1所示，七种龙利鱼都出现了荧光曲线，其他样品没有龙利鱼鱼源性成分DNA，无荧光信号检出；将1号样品半滑舌鳎阳性样本扩增产物的测序序列在NCBI进行BLAST比对，样本序列与半滑舌鳎16S rRNA基因序列相似度大于99％，说明上述引物具有良好的特异性；
图1中的标号分别代表：1.半滑舌鳎；2.短吻红舌鳎；3.长吻红舌鳎；4.宽体舌鳎；5.窄体舌鳎；6.紫斑舌鳎；7.短吻三线舌鳎；8.巴沙鱼；9.大西洋鳕鱼；10.大西洋鲑鱼；11.鲷鱼；12.草鱼；13.鲤鱼；14.猪肉；15.牛肉；16.山羊肉；17.鸡肉；18.空白对照；
(5)基因组灵敏度试验：
按照步骤(1)的方法提取半滑舌鳎的DNA；利用超微量分光光度计测定半滑舌鳎样品DNA浓度，用超纯水10倍梯度稀释半滑舌鳎，半滑舌鳎DNA量选取1ng，10-1ng，10-2ng，10- 3ng，10-4ng，以纯水为模板作为空白对照，以步骤(3)中的荧光PCR反应体系进行实时荧光PCR；
结果显示，Ct值分别为1ng：23.70；10-1ng：27.42；10-2ng：31.04；10-3ng：34.05，灵敏度试验曲线结果如图2，模板含量与检测平均Ct值结果如图3，相关系数R2＝0.997，扩增效果达到要求；
图2中的标号分别代表：1.1ng；2.10-1ng；3.10-2ng；4.10-3ng；5.10-4ng；6.空白对照；
(6)质量分数灵敏度试验：
取巴沙鱼和半滑舌鳎样品，置于电热恒温鼓风干燥箱中，105℃烘干，匀浆仪打磨成干粉，将半滑舌鳎和巴沙鱼干粉按照干重质量比1:9混合，再置于匀浆仪中充分打磨混合，制成含有半滑舌鳎干粉10％，1％，0.1％的巴沙鱼粉；按照步骤(1)提取上述样品的DNA；以步骤(3)中的荧光PCR反应体系进行实时荧光PCR；
当半滑舌鳎质量分数≥1％时均可出现特异性扩增曲线(见图4)，Ct值分别为10％：23.40；1％：23.94；
本发明中建立的龙利鱼实时荧光PCR体系，当FAM荧光的Ct值小于35时，说明样品中含有龙利鱼源性成分。如35≤Ct值＜40，则重复一次，如再次扩增后Ct值＜40，则说明含有龙利鱼源性成分；如再次扩增后无Ct值，则说明样品中无龙利鱼源性成分；
图4中的标号分别代表：1.半滑舌鳎原粉；2.10％半滑舌鳎；3.1％半滑舌鳎；4.0.1％半滑舌鳎；5.空白对照。
Figure BDA0003206345490000081
Figure BDA0003206345490000091
序列表
<110> 李杰
<120> 一种使用实时荧光PCR手段快速检测13种龙利鱼源性成分的方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agacgagaag accctgtgga 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
attgcgctgt tatccctgg 19
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atcttcagtt ggggcgac 18

Claims (2)

1.一种使用实时荧光PCR手段快速检测13种龙利鱼源性成分的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)样品DNA的提取：
用无菌剪刀取样品25mg，捣碎成肉糜，置于DNA提取试剂盒提供的管中，按照DNA提取试剂盒的步骤进行操作；
(2)引物设计：
a.选取了半滑舌鳎，短吻红舌鳎，长吻红舌鳎，宽体舌鳎，窄体舌鳎，紫斑舌鳎，短吻三线舌鳎，双线舌鳎，中华舌鳎，褐斑三线舌鳎，黑鳃舌鳎，斑头舌鳎，少鳞舌鳎13种龙利鱼进行研究；
b.通过GenBank下载此13种龙利鱼，巴沙鱼，大西洋鳕鱼，太平洋鳕鱼，大西洋鲑鱼，鲷鱼，草鱼，鲤鱼，以及常见的肉类猪，牛，羊，鸡，鸭，鹅的16S rRNA基因序列，利用clustalx软件对此13种龙利鱼的16S rRNA基因序列进行比对，找出13种龙利鱼的相同序列，并且与巴沙鱼，大西洋鳕鱼，太平洋鳕鱼，大西洋鲑鱼，鲷鱼，草鱼，鲤鱼，猪，牛，羊，鸡，鸭，鹅的16SrRNA基因存在差异的序列，通过NCBI网站的引物设计工具Primer-BLAST和探针设计软件Primer Express 3.0设计一组13种龙利鱼的通用引物和探针，分别为上游引物、下游引物和探针引物，上游引物序列如序列表SEQ ID NO:1所示；下游引物序列如系列表SEQ ID NO:2所示；探针引物序列如序列表SEQ ID NO:3所示；其核苷酸序列为：
上游引物F：5’-AGACGAGAAGACCCTGTGGA-3’；
下游引物R：5’-ATTGCGCTGTTATCCCTGG-3’；
探针序列P：5’-(FAM)ATCTTCAGTTGGGGCGAC-3’(MGB)；
(3)荧光PCR体系的构建：
通过对引物浓度和循环数进行PCR反应程序的条件优化，确定了以下条件：
龙利鱼实时荧光PCR反应体系：10μL Premix Ex TaqTM，上下游引物、TaqMan探针各0.8μL(浓度为10μM)，提取DNA模板1μL，用灭菌水补足至总体积20μL；
PCR反应程序：95℃预变性30s；95℃15s，60℃30s，40个循环；
(4)特异性试验：
利用超微量分光光度计测定样品DNA在260nm和280nm处的吸光值A260和A280，当A260/A280比值在1.7-1.9之间，适宜于PCR扩增，利用步骤(3)设计的荧光PCR体系，分别以半滑舌鳎，短吻红舌鳎，长吻红舌鳎，宽体舌鳎，窄体舌鳎，紫斑舌鳎，短吻三线舌鳎巴，巴沙鱼，大西洋鳕鱼，大西洋鲑鱼，鲷鱼，草鱼，鲤鱼，猪，牛，羊，鸡，鸭动物的DNA为模板，利用超微量分光光度计测定上述样品DNA浓度，将DNA浓度稀释成1ng/μL，以纯水为模板作为空白对照，进行实时荧光PCR，验证引物的特异性，并对半滑舌鳎样品的扩增产物进行测序，将测序结果在NCBI中进行比对；
(5)基因组灵敏度试验：
按照步骤(1)的方法提取半滑舌鳎的DNA；利用超微量分光光度计测定半滑舌鳎样品DNA浓度，用超纯水10倍梯度稀释半滑舌鳎，半滑舌鳎DNA量选取1ng，10-1ng，10-2ng，10-3ng，10-4ng，以纯水为模板作为空白对照，以步骤(3)中的荧光PCR反应体系进行实时荧光PCR；
(6)质量分数灵敏度试验：
取巴沙鱼和半滑舌鳎样品，置于电热恒温鼓风干燥箱中，105℃烘干，匀浆仪打磨成干粉，将半滑舌鳎和巴沙鱼干粉按照干重质量比1:9混合，再置于匀浆仪中充分打磨混合，制成含有半滑舌鳎干粉10％，1％，0.1％的巴沙鱼粉；按照步骤(1)提取上述样品的DNA；以步骤(3)中的荧光PCR反应体系进行实时荧光PCR。
2.根据权利要求1所述一种使用实时荧光PCR手段快速检测13种龙利鱼源性成分的方法，其特征在于，步骤(2)操作b中所述的上游引物、下游引物以及探针引物均由北京擎科生物工程有限公司合成。
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