CN117265130A - 一种鱼粉中巴沙鱼源性成分定性和定量鉴定的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鱼粉中巴沙鱼源性成分定性和定量鉴定的方法，属于饲料原料检测技术领域。本发明根据巴沙鱼特异性荧光引物和探针结合标准曲线快速定量检测出待测鱼粉中巴沙鱼源性成分的含量，所述巴沙鱼特异性荧光引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑2所示。本发明的鉴定方法填补了饲料原料检测技术领域对该物种定性和定量检测方法的空白，准确率和灵敏度高，重复性好，最低检测限可达到0.01％，即微量掺假的水平。该方法克服了传统检测效果依赖个人经验、检测结果具有随机性、微量掺假难以识别的问题。该方法还适用于其它动物性饲料原料中巴沙鱼源性成分的定量检测。

Description

一种鱼粉中巴沙鱼源性成分定性和定量鉴定的方法

技术领域

本发明涉及饲料原料检测技术领域，特别是涉及一种鱼粉中巴沙鱼源性成分定性和定量鉴定的方法。

背景技术

鱼粉是饲料工业中不可或缺的、优质的动物性饲料原料。由于鱼粉价格昂贵，市场上掺假鱼粉泛滥，包括在鱼粉中掺入各种动、植物原料，从而降低了鱼粉的营养价值，也给鱼粉质量的判断造成了严重困扰。目前，鱼粉掺假的鉴定仍以镜检法为主，即通过在显微镜下寻找疑似掺假物的组织，依据组织特征对掺假物进行粗略识别，有时需通过物理和化学方法对识别结果进行补充判定，存在着准确率和灵敏度不高、重复性差、无法定量、依赖个人经验等问题。近年来，近红外光谱技术被开发用于识别与标准物有明显差异的物质，来鉴别掺假物，但需先建立鱼粉等原料的近红外定标模型。同时，近红外光谱的识别结果易受到如仪器类型、测量环境和装样方式等测样条件以及样品状态等因素的影响，从而影响所建模型的效果及其适用性，尚不具有普遍适用性。因此，亟需寻求一种简便、快捷、灵敏、准确的掺假鉴定方法。

应用实时荧光定量PCR检测技术，通过使用针对不同物种线粒体基因设计获得的特异性引物，对目标物种进行鉴定，已广泛应用于加工食品及中药的真伪鉴定。利用PCR技术鉴定饲料物种组成或原料掺假也有相关研究报道，如意大利研究者利用PCR技术检测牛线粒体DNA片段以检测动物源性饲料中牛源性成分并对PCR产物进行测序确认；美国也建立了运用PCR技术，快速检测动物源性饲料中牛源性成分的方法，国内也有关于饲料中牛、羊、猪、鸡、马源性成分的检测报道，但对鱼粉中动物源性掺假物的定性和定量鉴定鲜有报道。

巴沙鱼(Pangasius bocourti)属鲶科、/>鲶属鱼类，原产于湄公河流域，是东南亚国家重要的淡水养殖品种，年养殖产量约150万吨，大多用于加工成开背鱼或鱼柳，产生的鱼骨、内脏、皮肤等下脚料多用于制作下杂鱼粉，其营养价值远低于进口优质全鱼粉，但镜检形态和全鱼粉十分相似，常规方法难以识别，因此成为常见的全鱼粉掺假物。目前，国内外尚未见对饲料中巴沙鱼成分定性或定量鉴定的专利报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种鱼粉中巴沙鱼源性成分定性和定量鉴定的方法，以解决上述现有技术存在的问题。该方法简便快捷，准确性和灵敏度高，能够实现对掺假成分的定性和定量检测。为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种鱼粉中巴沙鱼源性成分定性和定量鉴定的引物对，所述引物对为SEQ IDNO：1所示的上游引物和SEQ ID NO：2所示的下游引物。

本发明还提供一种鱼粉中巴沙鱼源性成分定性和定量鉴定的方法，包括以下步骤：

以待测鱼粉DNA为模板，利用所述的引物对进行荧光定量PCR扩增；

根据荧光定量PCR扩增曲线定性或定量鉴定所述待测鱼粉中巴沙鱼源性成分。

优选的是，所述荧光定量PCR扩增的反应体系为2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix10μL，上游引物1μL，下游引物1μL，DNA模板1μL和超纯无菌水7μL。

优选的是，所述荧光定量PCR扩增的反应条件为95℃预变性1min；95℃15s，60℃40s，40个循环。

优选的是，定性鉴定的方法为：若出现荧光扩增曲线且Ct值≤34，待测鱼粉中含有巴沙鱼源性成分；若无荧光扩增曲线或Ct值≥34，待测鱼粉中不含巴沙鱼源性成分。

优选的是，定量鉴定的方法为：以巴沙鱼DNA为模板，利用所述引物对制作荧光定量标准曲线；根据所述荧光定量标准曲线，结合所述待测鱼粉DNA进行荧光定量PCR扩增得到的Ct值，计算所述待测鱼粉中巴沙鱼源性成分的含量。

本发明还提供所述的引物对在鉴定动物性饲料原料中巴沙鱼源性成分中的应用。

优选的是，所述动物性饲料原料包括鱼粉。

本发明公开了以下技术效果：

本发明通过绘制巴沙鱼源性DNA荧光定量标准曲线，再根据巴沙鱼特异性荧光引物对结合标准曲线可以快速定量检测出待测鱼粉中巴沙鱼源性成分的含量。该方法填补了饲料原料检测技术领域对该物种定性和定量检测方法的空白，准确率和灵敏度高，重复性好，最低检测限可达到0.01％，即微量掺假的水平。该方法克服了传统检测效果依赖个人经验、检测结果具有随机性、微量掺假难以识别的问题。该方法还适用于其它动物性饲料原料中巴沙鱼源性成分的定量检测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为巴沙鱼特异性引物验证荧光定量PCR扩增曲线；

图2为巴沙鱼不同DNA浓度梯度的荧光定量PCR扩增曲线；

图3为六种不同鱼粉样品荧光定量PCR扩增曲线；

图4为添加不同含量巴沙鱼粉的自制鱼粉荧光定量PCR扩增曲线。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1鉴定巴沙鱼源性物质的特异性引物设计

1、特异性引物及探针的设计

本实施例中从巴沙鱼基因组中筛选了巴沙鱼特有的序列片段(GenBank登录号：PRJNA669124)，并根据序列设计特异性扩增引物，具体引物序列为：上游引物(SEQ ID NO：1)：5’-GAGCCCTAATCTAAGCCCTAT-3’，下游引物(SEQ ID NO：2)：5’-TTGCCATTCTATGTTCACG-3’。由上海生工生物有限公司合成。

2、引物的特异性验证

选择对包括鲈形目、鳗鲡目、鲀形目、鲉形目、鲤形目、鲇形目等近50种常见海水及淡水鱼类以及虾蟹类对涉及的引物进行特异性验证，具体方法为：

2.1DNA样本提取

以市售的巴沙鱼以及其他鲈形目、鲤形目等近50种常规鱼类与虾蟹类DNA样本来源，利用动物组织DNA提取试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)提取待测样品DNA，步骤包括：取60mg经无水乙醇固定的肌肉样品于离心管中剪碎，加200μL裂解液GA以及蛋白酶K20uL振荡混匀，于56℃裂解完全；加入200μL缓冲液GB 200μL，70℃水浴7min；加入200μL无水乙醇充分振荡混匀；所得溶液加入吸附柱，10000rpm离心1min，弃废液；加入500μL缓冲液GD，10000rpm离心45sec，弃废液，加入600μL漂洗液PW漂洗两次，随后将吸附柱CB3转入干净的离心管中，滴加80μL灭菌水，室温放置3min，12500rpm离心2min，离心管中溶液即为提取DNA。

采用微量紫外分光光度计测量260nm和280nm处的吸光度A₂₆₀和A₂₈₀，以A₂₆₀/A₂₈₀的比值确定DNA的纯度并计算DNA浓度。选择质量浓度为100ng/μL的DNA进行后续操作。

将除巴沙鱼外50种常规海水与淡水鱼类DNA样品随机分成5组，每组10种鱼类，取每组10种鱼类DNA溶液2μL进行混合，获得20ul的混合鱼类DNA样品。虾蟹类选取了南美白对虾、罗氏沼虾、斑节对虾、梭子蟹、青蟹等5个样品DNA进行混合，获得虾蟹类DNA混合样品。针对对克氏原螯虾以及6组DNA混合样品进行荧光定量PCR检测。

以上述样品DNA为模板，利用上游引物(SEQ ID NO：1)以及下游引物(SEQ ID NO：2)进行实时荧光PCR扩增。扩增体系为ChamQ SYBR qPCR Master Mix(2×)10μL，5μmol/L的上游引物1μL，5μmol/L的下游引物1μL，DNA模板1μL，超纯无菌水7μL，反应总体积为20μL。扩增体系的反应液配制在冰上完成。扩增反应条件为95℃预变性1min；95℃15s，60℃40s，40个循环。针对上述样品进行荧光定量PCR检测，经对包括鲈形目、鳗鲡目、鲀形目、鲉形目、鲤形目、鲇形目等近50种常规鱼类以及虾蟹类进行检测，设计的引物具有良好的巴沙鱼源特异性(见图1)。

实施例2绘制巴沙鱼源性DNA荧光定量标准曲线

1、DNA样本提取

巴沙鱼样品DNA提取参考实施例1的方法进行提取以及检测。采用微量紫外分光光度计测量260nm和280nm处的吸光度A₂₆₀和A₂₈₀，以A₂₆₀/A₂₈₀的比值确定DNA的纯度并计算DNA浓度。选择质量浓度为100ng/μL的DNA进行后续操作。

2、巴沙鱼源性成分荧光定量标准曲线的制作

对提取的巴沙鱼DNA(质量浓度为100ng/μL)用灭菌水连续10倍稀释，使DNA含量分别达到实际样品含量的10％、1％、0.1％、0.01％、0.001％，分别以不同稀释浓度的样品DNA为模板，以实施例1设计的上下游引物进行实时荧光PCR扩增。扩增体系为ChamQ SYBR qPCRMaster Mix(2×)10μL，5μmol/L的巴沙鱼上游引物1μL，5μmol/L的巴沙鱼下游引物1μL，模板1μL，超纯无菌水7μL，反应总体积为20μL。扩增体系的反应液配制在冰上完成。扩增反应条件为95℃预变性1min；95℃15s，60℃40s，40个循环。

从图2和表1可知，当DNA质量浓度为0.01ng/μL时，荧光定量PCR的Ct值为(35.60±N/A)，Ct值>34。当DNA质量浓度为0.1ng/μL时，Ct值为(31.29±0.49)，Ct值<34，可知本实验设计的荧光定量PCR检测灵敏度可以检测到浓度在0.1ng/μL以上的DNA含量。以Lg DNA浓度为横坐标，Ct值为纵坐标作图，绘制巴沙鱼DNA的扩增标准曲线，重复3次，计算平均Ct值。得到巴沙鱼源性成分荧光定量标准曲线为：Y＝-3.5993X+27.911，其中Y为Ct值，X为Lg DNA值。

表1巴沙鱼不同DNA浓度梯度的荧光定量PCR扩增Ct值

实施例3掺假鱼粉中巴沙鱼源性成分的定性和定量鉴定

(1)定性检测试验

选择7种鱼粉样品进行定性检测试验，其中三种鱼粉样品是掺杂一定量巴沙鱼粉(掺杂鱼粉1、2)，另外四种是未掺杂巴沙鱼粉的纯鱼粉样品，两种是国产纯鱼粉(国产纯鱼粉1、2)，另外两种是进口纯鱼粉(进口纯鱼粉1、2)。对测试的6种鱼粉样品进行DNA提取以及浓度检测，利用上述引物与方法以提取的DNA为模版进行实时荧光PCR扩增，取三个技术重复。

结果如图3和表2所示，四种纯鱼粉(国产纯鱼粉1和2，进口纯鱼粉1和2)，利用本研究设计的引物进行荧光定量PCR的Ct值均在38以上，大于临界值34，部分样品甚至无Ct值，无检测出巴沙鱼成分，与实际情况相符。而两种掺杂一定含量巴沙鱼粉的掺杂鱼粉样品，荧光定量PCR的Ct值均在25以下，小于临界值34，其中掺杂样品1的Ct值为22.34±0.16，掺杂样品2的Ct值为22.50±0.17，检测出有掺杂不同含量的巴沙鱼成分，均与实际情况相符。可知本发明的检测引物可对巴沙鱼成分进行特异性检测，含巴沙鱼成分的样品可检测出信号，无巴沙鱼成分的样品则无检测信号。

表2六种不同鱼粉样品荧光定量PCR扩增Ct值

(2)定量检测试验

分别在自制鱼粉(不含巴沙鱼)掺入含量为10％、1％、0.1％、0.01％、0.001％巴沙鱼粉，充分混匀，对掺了不同含量巴沙鱼粉的自制鱼粉样品进行DNA提取以及浓度检测，利用上述引物与方法以提取的DNA为模版进行实时荧光PCR扩增，取三个技术重复。

结果如图4和表3所示，当鱼粉中掺了10％的巴沙鱼时，荧光定量PCR Ct值为22.70±0.48，明显检测出有巴沙鱼成分；当鱼粉中掺了0.001％的巴沙鱼鱼粉时，荧光定量PCR检测不出Ct值，判定是巴沙鱼含量非常低微，检测不出。而鱼粉中掺了0.01％的巴沙鱼鱼粉时，Ct值为(33.85±0.47)，Ct值<34，但也比较接近34，检测出微量的巴沙鱼，基本到达检测的临界值，最低检测限可设置为0.01％。目前有关鱼粉掺杂荧光定量的方法暂时没有，本发明为首创。且0.01％的含量已是十分低微，一般宏观物理化学方法较难检测出如此低的含量，说明本发明检测的高灵敏度。同时根据上述结果，随着掺入的巴沙鱼含量逐渐变少，荧光定量PCR的Ct值随之升高，也存在相应的比例趋势。

表3添加不同含量巴沙鱼粉的自制鱼粉荧光定量PCR扩增Ct值

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (8)

1.一种鱼粉中巴沙鱼源性成分定性和定量鉴定的引物对，其特征在于，所述引物对为SEQ ID NO：1所示的上游引物和SEQ ID NO：2所示的下游引物。

2.一种鱼粉中巴沙鱼源性成分定性和定量鉴定的方法，其特征在于，包括以下步骤：

以待测鱼粉DNA为模板，利用权利要求1所述的引物对进行荧光定量PCR扩增；

根据荧光定量PCR扩增曲线定性或定量鉴定所述待测鱼粉中巴沙鱼源性成分。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR扩增的反应体系为2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10μL，上游引物1μL，下游引物1μL，DNA模板1μL和超纯无菌水7μL。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR扩增的反应条件为95℃预变性1min；95℃15s，60℃40s，40个循环。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，定性鉴定的方法为：若出现荧光扩增曲线且Ct值≤34，待测鱼粉中含有巴沙鱼源性成分；若无荧光扩增曲线或Ct值≥34，待测鱼粉中不含巴沙鱼源性成分。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，定量鉴定的方法为：以巴沙鱼DNA为模板，利用所述引物对制作荧光定量标准曲线；根据所述荧光定量标准曲线，结合所述待测鱼粉DNA进行荧光定量PCR扩增得到的Ct值，计算所述待测鱼粉中巴沙鱼源性成分的含量。

7.如权利要求1所述的引物对在鉴定动物性饲料原料中巴沙鱼源性成分中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述动物性饲料原料包括鱼粉。