CN110878339A - 用于红薯淀粉真伪鉴别及其掺杂分析的荧光定量pcr检测方法 - Google Patents

用于红薯淀粉真伪鉴别及其掺杂分析的荧光定量pcr检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于红薯淀粉真伪鉴别及其掺杂分析的荧光定量PCR检测方法，包括如下步骤：A、从待测淀粉中提取其DNA；B、荧光定量PCR引物设计；C、荧光定量PCR反应体系和操作程序；D、鉴定分析：如果所得结果中显示有一条扩增曲线，且同时满足两个特定条件，则鉴定被测品被测品为真红薯淀粉；如果所得结果显示有多条扩增曲线，且其中一条曲线同时满足两个特定条件，则鉴定被测品为掺假红薯淀粉；如果所得结果显示有多条曲线，但是所有曲线均不能同时满足两个特定条件，则鉴定被测品为不含红薯淀粉。本发明提供的荧光定量PCR技术对于淀粉及制品中掺假检验具有快速、简单、准确、特异性好和灵敏度高特性，为食品检验分析提供有力的手段。

Description

用于红薯淀粉真伪鉴别及其掺杂分析的荧光定量PCR检测 方法
技术领域
本发明涉及食品检测技术领域一种，尤其涉及淀粉类产品的生物检测技术及应用。
背景技术
淀粉类食品一直是我们日常生活中较为常见的食品，现阶段的淀粉已经不仅仅只为人们日常所食用，更是作为一种工业原料在人类生活中应用广泛。目前常见的淀粉种类有：红薯淀粉、马铃薯淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉、苜蓿淀粉等，不同的淀粉之间理化性质都有所不同且原料的成本和加工工艺使得不同的淀粉在价格上有所差异，由于以上原因导致淀粉及制品中掺假现象越发严重。这些掺假的淀粉及制品，不仅会对人的身体健康造成巨大的影响，更是一种商业欺诈行为，严重打乱了市场秩序，所以一种能够快速准确的鉴别出淀粉及制品中掺假成分的方法是十分重要的。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种用于红薯淀粉真伪鉴别及其掺杂分析的荧光定量PCR检测方法。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。
用于红薯淀粉真伪鉴别及其掺杂分析的荧光定量PCR检测方法，包括如下步骤：
A、针对待测淀粉均呈现为干品的特点，淀粉中含有包括糖类在内的多种次生代谢产物对DNA提取造成干扰，采用具有针对性的特定提取方法从待测淀粉中提取其DNA；
B、荧光定量PCR引物设计：以序列表中SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示的人工核苷酸序列为上下游引物；以序列表中SEQ ID NO：3所示的人工核苷酸序列为探针；对待测样品进行检测；
C、根据待测品及所设计引物的特点，设置特定的荧光定量PCR反应体系和操作程序，完成荧光定量PCR；
D、鉴定分析：
D-1、如果所得结果中显示有一条扩增曲线，且同时满足如下两个条件：①曲线的起跳在15-25个循环之前；②扩增浓度数值不低于4-8；则鉴定被测品被测品为真红薯淀粉；
D-2、如果所得结果显示有多条扩增曲线，且其中一条曲线同时满足如下两个条件：①曲线的起跳在15-25个循环之前；②扩增浓度数值不低于4-8；则鉴定被测品为掺假红薯淀粉；
D-3、如果所得结果显示有多条曲线，但是所有曲线均不能同时满足如下两个条件：①曲线的起跳在15-25个循环之前；②扩增浓度数值不低于4-8；则鉴定被测品为不含红薯淀粉；
D-4、如果所得结果显示没有扩增曲线，则鉴定被测品为不含红薯淀粉。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤A中，所述从待测淀粉中提取其DNA的特定方法，包括如下步骤：
A-1、称取样品100 mg，放入研钵中，加入定量的液氮进行充分地研磨，制成样品粉末；
A-2、将缓冲液GP1放入水浴锅65 ℃中，进行预热处理，同时加入0.1%浓度体积的巯基乙醇；
A-3、将样品粉末放入经过处理的缓冲液GP1中了，快速地颠倒晃匀，混匀后将离心管迅速地放入水浴锅65 ℃中，并保持20 min，并在这段时间内不断地颠倒晃匀样品；
A-4、把700µL氯仿加入离心管中，颠倒晃匀，并在离心机上以12000转下进行离心，时间为5 min；
A-5、离心好后吸取上清液加入另一个的离心管中，同时把700 µL缓冲液GP2加入，颠倒晃匀；
A-6、将混匀好的缓冲液GP2转入吸附柱GB3，并在离心机上以12000转下离心30 s，去除上清液；
A-7、把500 µL缓冲液GD加入吸附柱GB3，并在离心机上以12000转下离心30 s，去除上清液，同时在收集管中放进吸附柱GB3；
A-8、把600 µL漂洗液PW加入吸附柱GB3，并在离心机上以12000转下离心30 s，去除上清液，同时在收集管中放进吸附柱GB3，多次重复此步骤；
A-9、将装有吸附柱GB3的收集管，放在离心机上以12000转下离心2 min，去除上清液；并将吸附柱GB3在室温下放置几分钟，确保吸附柱中的残留漂洗液PW去除；
A-10、将完全将漂洗液去除干净的吸附柱GB3放入新的离心管中，并将50-200 µL的洗脱缓冲液TE悬空滴加在吸附膜中间部位，并在室温下放置几分钟，之后在离心机上以12000转下离心2 min，收集上清液，即得。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤C中，荧光定量PCR的反应体系设置为：采用25 μL的扩增体系，其中添加2xSuperReal PreMix Probe 12.5μL、上游引物的浓度为10 μmol/L，用量为0.75 μL、下游引物的浓度为10 μmol/L，用量为0.75 μL、探针的浓度为10 μmol/L，用量为0.5μL、DNA模板为2.0 μL、ddH2O为8.5 μL；以无菌双蒸水作为空白对照。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤C中，荧光定量PCR的操作程序设置为：95℃预变性时间为15 min；95℃变性时间为3 sec，60℃退火/延伸时间为20 sec，对荧光信号进行采集，共计40个循环。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤D中，所述两个条件为：①曲线的起跳在18-22个循环之前；②扩增浓度数值不低于5-7。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤D中，所述两个条件为：①曲线的起跳在20个循环之前；②扩增浓度数值不低于6。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：
本发明首先针对待测淀粉均呈现为干品的特点，淀粉中含有包括糖类在内的多种次生代谢产物对DNA提取造成干扰，研究了具有针对性的特定提取方法从待测淀粉中提取其DNA，得到最佳提取基因组的操作方法。
尤为关键的，本发明根据通过基因序列分析探究设计了淀粉产品的引物和探针，并通过系列理论和试验研究及筛选，得到了具有高特异性、高灵敏度、易于定量分析的引物序列。
通过系列试验研究证实了本发明的方法具有高度特异性，能够准确鉴别出淀粉的品种。
通过系列试验研究证实了使用荧光定量PCR技术对待测品进行检验具有极高的灵敏度，且在掺假实验中能够准确的检验出样品掺假情况。
最后，本发明基于试验数据进一步设定了行之有效的快速判定方法，而且这些判定方法容易实现自动化分析，这是本发明的关键所在。
综上，本发明提供的荧光定量PCR技术对于淀粉及制品中掺假检验具有快速、简单、准确、特异性好和灵敏度高特性，为食品检验分析提供有力的手段。
附图说明
图1是本发明实施例中的红薯特异性检验结果，图中A为红薯基因组，B为马铃薯基因组，C组为木薯、苜蓿、玉米、芝麻、核桃、大豆、榛子、牛肉、羊肉、鸡肉、猪肉的基因组DNA。
图2是实施例中红薯灵敏度检验结果。
具体实施方式
实施例1、材料和仪器。
淀粉等各种食品原材料均购于商业超市。
实验所用的涡旋振荡器是IKA 公司生产的MS3 基本型涡旋混匀仪，离心机为Eppendoff 公司生产的小型台式离心机，核酸蛋白分析仪为Thermo 公司生产的nano droplite 型号，罗氏480 荧光定量PCR 仪，电子天平为梅特勒公司生产的ME002 型号分析天平，恒温金属浴为海东升仪器有限公司生产的6400 型恒温金属浴。
荧光PCR 试剂SuperReal 荧光定量预混试剂（探针法）（天根公司）；SYBR PremixEx Taq(RR420)(TaKaRa)；全自动DNA提取试剂盒（Thermo）；植物组织基因组提取DNA试剂盒（天根公司）；引物及探针的合成，都是从上海生工公司购买。5mol/LNaCl，异丙醇，石油醚，氨水氯仿，无水乙醇等均为国产试剂且为分析纯产品，购自北京陆桥公司。
实施例2、 DNA模板的提取方法。
淀粉及制品多为干品，其有充足的次生代谢产物，富含大量多糖等物质对DNA提取造成了很大的困扰。常规的方式很难从中提取到理想的DNA量，所以如何从淀粉及制品中高效的提取基因组是本研究的快速鉴别检验方法建立的关键。目前有研究报道了CTAB法、全自动提取仪法对淀粉及制品DNA提取方法，但为了建立更加快速、有效的检验方式，我们不断地尝试新的提取手段得到了如下的最优提取方法，为快速鉴别淀粉及制品中植物源性成分掺假提供了依据。所研方法的步骤包括：
1、称取样品100 mg，放入研钵中，加入定量的液氮进行充分地研磨，制成样品粉末。
2、将缓冲液GP1放入水浴锅65 ℃中，进行预热处理，同时加入0.1%浓度体积的巯基乙醇。
3、将样品粉末放入经过处理的缓冲液GP1中了，快速地颠倒晃匀，混匀后将离心管迅速地放入水浴锅65 ℃中，并保持20 min，并在这段时间内不断地颠倒晃匀样品。
4、把700µL氯仿加入离心管中，颠倒晃匀，并在离心机上以12000转下进行离心，时间为5 min。
5、离心好后吸取上清液加入另一个的离心管中，同时把700 µL缓冲液GP2加入，颠倒晃匀。
6、将混匀好的缓冲液GP2转入吸附柱GB3，并在离心机上以12000转下离心30 s，去除上清液。
7、把500 µL缓冲液GD加入吸附柱GB3，并在离心机上以12000转下离心30 s，去除上清液，同时在收集管中放进吸附柱GB3。
8、把600 µL漂洗液PW加入吸附柱GB3，并在离心机上以12000转下离心30 s，去除上清液，同时在收集管中放进吸附柱GB3，多次重复此步骤。
9、将装有吸附柱GB3的收集管，放在离心机上以12000转下离心2 min，去除上清液。并将吸附柱GB3在室温下放置几分钟，确保吸附柱中的残留漂洗液PW去除。
10、将完全将漂洗液去除干净的吸附柱GB3放入新的离心管中，并将50-200 µL的洗脱缓冲液TE悬空滴加在吸附膜中间部位，并在室温下放置几分钟，之后在离心机上以12000转下离心2 min，收集上清液。
采用上述方法对多种试样进行检测，提取的基因组DNA的纯度均在1.8-2.0左右，说明该提取方式能够有效的去除杂质，得到干净的基因组DNA。
实施例3、引物设计。
为了得到最适合的引物，本研究将所设计好的多种引物条带进行扩增尝试，通过对Ct值和最终扩增浓度来进行筛选，最终得到了最优的引物序列。
以序列表中SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示的人工核苷酸序列为上下游引物；以序列表中SEQ ID NO：3所示的人工核苷酸序列为探针；对待测样品进行检测。
实施例4、反应体系和主要操作程序。
(1) PCR反应体系
实验采用25 μL的扩增体系，其中添加2xSuperReal PreMix(Probe)为12.5μL、上游引物的浓度为10 μmol/L用量为0.75 μL、下游引物的浓度为10 μmol/L用量为0.75 μL、探针的浓度为10 μmol/L用量为0.5μL、DNA模板为2.0 μL、ddH2O为8.5 μL，以无菌双蒸水作为空白对照。
(2) PCR反应主要操作程序
反应程序为95 ℃预变性时间为15 min；95℃变性时间为3 sec，60℃退火/延伸时间为20 sec，对荧光信号进行采集，反应共计40个循环。
实施例5、 荧光定量PCR扩增产物的曲线
通过反应体系中荧光强度的变化，在实时荧光监测仪上进行对实验的实时监控。因为电脑与实时荧光监测仪相连接，在显示屏上扩增曲线就会显示出来。通过对曲线的分析，就可得到所需的实验结果，并规定若曲线所标示的Ct值≤35且空白对照无明显起跳时，判定为扩增成功，可进行后续实验。
实施例6、荧光定量PCR的特异性的检测
用已经筛选出的特异性红薯序列进行扩增，用来进行特异性实验。实验结果如图1所示，红薯能够很好的鉴定出来，而马玲薯虽有起跳但也在35循环以后且扩增浓度较低，故判定扩增失败，其他的基因组更无扩增曲线，所以合成的红薯引物序列能够特异性鉴定出红薯基因组。
实施例7、荧光定量PCR的灵敏度的检测
将红薯以100 mg、50 mg、40 mg、30 mg、20 mg、10 mg、5 mg比例进行称取，进而进行DNA的提取，和使用荧光定量PCR技术进行的扩增和检测，以无菌双蒸水作为空白对照，实验体系及扩增程序参见上文所述，结果在图2所述，在5 mg时候，基本没有起跳，且扩增的曲线基本是一条平线，所以判定扩增失败。在10 mg时候，其起跳的循环数已经超过35次，且扩增的浓度很低，所以判定扩增失败。所以，就本研究红薯的荧光定量PCR检测方式的灵敏度为20mg。
实施例8、判定方法的设计。
基于上述试验数据，进一步设定行之有效的快速判定方法，是本发明的关键所在。按照如下程序进行：
D-1、如果所得结果中显示有一条扩增曲线，且同时满足如下两个条件：①曲线的起跳在15-25个循环之前；②扩增浓度数值不低于4-8；则鉴定被测品被测品为真红薯淀粉；
D-2、如果所得结果显示有多条扩增曲线，且其中一条曲线同时满足如下两个条件：①曲线的起跳在20个循环之前；②扩增浓度数值不低于6；则鉴定被测品为掺假红薯淀粉；
D-3、如果所得结果显示有多条曲线，但是所有曲线均不能同时满足如下两个条件：①曲线的起跳在20个循环之前；②扩增浓度数值不低于6；则鉴定被测品为不含红薯淀粉；
D-4、如果所得结果显示没有扩增曲线，则鉴定被测品为不含红薯淀粉。
综上，由于目前市场上掺假现象、掺假手段已经十分泛滥，由于现有市场上食品性状的模糊，已经很难让人通过肉眼进行分辨，如动物源掺假中牛羊肉中加入价格相对便宜的鸭肉、鸡肉等，植物源掺假中在红薯淀粉中加入苜蓿淀粉等。这些对于传统的检验检测手段来说已经难以满足需求，目前多依靠于分子生物学手段对这类食品进行检测。荧光定量PCR在食品中植物源性成分检测中得到了广泛的应用。随着一些科研工作者更加深入的研究，灵敏度更高和特异性更好的荧光标记染料的不断推出以及数据分析软件的不断更新，荧光定量PCR在其原有的功能基础上得到了进一步完善。它的这些优点成为深加工食品真假检测的一个有力手段，为食品安全质量监测部门提供了一种更为有效的检测方法，同时本研究也为相关食品检测提供新思路，使得荧光定量PCR的应用范围更为广泛，应用前景愈加广阔。
上述描述仅作为本发明可实施的技术方案提出，不作为对其技术方案本身的单一限制条件。
序列表
<110> 河北省食品检验研究院（国家果类及农副加工产品质量监督检验中心、河北省食品安全实验室）；中国食品药品检定研究院
<120> 用于红薯淀粉真伪鉴别及其掺杂分析的荧光定量PCR检测方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
aagtatactg tactcga 17
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
gttgtcgaac atctacg 17
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
ggacttacat tcgcagtcga t 21

Claims (6)

1.用于红薯淀粉真伪鉴别及其掺杂分析的荧光定量PCR检测方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
A、针对待测淀粉均呈现为干品的特点，淀粉中含有包括糖类在内的多种次生代谢产物对DNA提取造成干扰，采用具有针对性的特定提取方法从待测淀粉中提取其DNA；
B、荧光定量PCR引物设计：以序列表中SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示的人工核苷酸序列为上下游引物；以序列表中SEQ ID NO：3所示的人工核苷酸序列为探针；对待测样品进行检测；
C、根据待测品及所设计引物的特点，设置特定的荧光定量PCR反应体系和操作程序，完成荧光定量PCR；
D、鉴定分析：
D-1、如果所得结果中显示有一条扩增曲线，且同时满足如下两个条件：①曲线的起跳在15-25个循环之前；②扩增浓度数值不低于4-8；则鉴定被测品被测品为真红薯淀粉；
D-2、如果所得结果显示有多条扩增曲线，且其中一条曲线同时满足如下两个条件：①曲线的起跳在15-25个循环之前；②扩增浓度数值不低于4-8；则鉴定被测品为掺假红薯淀粉；
D-3、如果所得结果显示有多条曲线，但是所有曲线均不能同时满足如下两个条件：①曲线的起跳在15-25个循环之前；②扩增浓度数值不低于4-8；则鉴定被测品为不含红薯淀粉；
D-4、如果所得结果显示没有扩增曲线，则鉴定被测品为不含红薯淀粉。
2.根据权利要求1所述的用于红薯淀粉真伪鉴别及其掺杂分析的荧光定量PCR检测方法，其特征在于：步骤A中，所述从待测淀粉中提取其DNA的特定方法，包括如下步骤：
A-1、称取样品100 mg，放入研钵中，加入定量的液氮进行充分地研磨，制成样品粉末；
A-2、将缓冲液GP1放入水浴锅65 ℃中，进行预热处理，同时加入0.1%浓度体积的巯基乙醇；
A-3、将样品粉末放入经过处理的缓冲液GP1中了，快速地颠倒晃匀，混匀后将离心管迅速地放入水浴锅65 ℃中，并保持20 min，并在这段时间内不断地颠倒晃匀样品；
A-4、把700µL氯仿加入离心管中，颠倒晃匀，并在离心机上以12000转下进行离心，时间为5 min；
A-5、离心好后吸取上清液加入另一个的离心管中，同时把700 µL缓冲液GP2加入，颠倒晃匀；
A-6、将混匀好的缓冲液GP2转入吸附柱GB3，并在离心机上以12000转下离心30 s，去除上清液；
A-7、把500 µL缓冲液GD加入吸附柱GB3，并在离心机上以12000转下离心30 s，去除上清液，同时在收集管中放进吸附柱GB3；
A-8、把600 µL漂洗液PW加入吸附柱GB3，并在离心机上以12000转下离心30 s，去除上清液，同时在收集管中放进吸附柱GB3，多次重复此步骤；
A-9、将装有吸附柱GB3的收集管，放在离心机上以12000转下离心2 min，去除上清液；并将吸附柱GB3在室温下放置几分钟，确保吸附柱中的残留漂洗液PW去除；
A-10、将完全将漂洗液去除干净的吸附柱GB3放入新的离心管中，并将50-200 µL的洗脱缓冲液TE悬空滴加在吸附膜中间部位，并在室温下放置几分钟，之后在离心机上以12000转下离心2 min，收集上清液，即得。
3.根据权利要求1所述的用于红薯淀粉真伪鉴别及其掺杂分析的荧光定量PCR检测方法，其特征在于：步骤C中，荧光定量PCR的反应体系设置为：采用25 μL的扩增体系，其中添加2xSuperReal PreMix Probe 12.5μL、上游引物的浓度为10 μmol/L，用量为0.75 μL、下游引物的浓度为10 μmol/L，用量为0.75 μL、探针的浓度为10 μmol/L，用量为0.5μL、DNA模板为2.0 μL、ddH2O为8.5 μL；以无菌双蒸水作为空白对照。
4.根据权利要求1所述的用于红薯淀粉真伪鉴别及其掺杂分析的荧光定量PCR检测方法，其特征在于：步骤C中，荧光定量PCR的操作程序设置为：95 ℃预变性时间为15 min；95℃变性时间为3 sec，60℃退火/延伸时间为20 sec，对荧光信号进行采集，共计40个循环。
5.根据权利要求1所述的用于红薯淀粉真伪鉴别及其掺杂分析的荧光定量PCR检测方法，其特征在于：步骤D中，所述两个条件为：①曲线的起跳在18-22个循环之前；②扩增浓度数值不低于5-7。
6.根据权利要求1所述的用于红薯淀粉真伪鉴别及其掺杂分析的荧光定量PCR检测方法，其特征在于：步骤D中，所述两个条件为：①曲线的起跳在20个循环之前；②扩增浓度数值不低于6。
CN201910886603.9A 2019-09-19 2019-09-19 用于红薯淀粉真伪鉴别及其掺杂分析的荧光定量pcr检测方法 Pending CN110878339A (zh)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN104593521A (zh) * 2015-03-03 2015-05-06 河北省食品检验研究院 加工食品中红薯植物源性成分鉴别用hda引物及其应用
CN106701909A (zh) * 2015-11-18 2017-05-24 中国检验检疫科学研究院 用于红薯源性成分检测的引物探针及方法和试剂盒

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