CN103805703A - 质谱法鉴别肉制品中动物源性成份 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测肉制品中动物源性的引物系统。该引物系统包括一对扩增引物和6条延伸引物，其中，扩增引物对序列选自SEQ ID No：1-2，延伸引物序列分别选自SEQ ID No：3-8。基于该引物系统所制备的产品，能鉴别肉制品中猪、牛、羊、鸡、鸭、兔源性成分。使用该产品，可以实现对肉制品来源进行鉴定，在打击食品掺假伪造、审核食品标签、保障消费者知情权等方面有重要作用。

Description

质谱法鉴别肉制品中动物源性成份

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种用于鉴定肉制品中动物源性成分的检测方法及产品，具体而言是利用PCR技术、单碱基延伸技术和质谱技术，对猪、牛、羊、鸡、鸭、兔源性成分进行检测的方法及相应的试剂盒。

背景技术

肉制品是人类饮食中的重要食品，其含有优质蛋白和多种必须氨基酸，具有很高的营养价值。随着人们饮食结构的不断改变，增加了对肉类食品的需求，市场上出现了很多以次充好、假冒牛肉和羊肉的现象，例如，常见的使用鸡鸭猪肉充当羊肉，选用猪兔肉冒充牛肉，这严重损害了消费者的财务和健康状况。

另外，由于疯牛病、猪牛口蹄疫、禽流感等疾病的发病与流行，导致在特定时期内猪牛羊肉以及鸡鸭肉滞销。在该特定时期内，如果食品监管不力，容易发生不法商贩将滞销肉充当其它肉制品的事件。因此，需要严格限制食品中的动物源性成分。

此外，我国是一个多民族组成的国家，宗教习惯使人们的饮食有一定差异，对肉制品的选择具有一定的倾向性。例如：回族不吃猪肉。如果清真食品中掺有猪肉，会影响回族消费者的宗教信仰。同时，一些患病人群如高血压、脂肪肝等患者对肉类的选择具有一定特殊性。因此，食品中动物源性成分的鉴别已成为人们特别关注的问题。对肉制品中生物种属的鉴定在打击食品掺假伪造、审核食品标签、保障消费者知情权等方面有重要作用。

为了保护消费者的利益和进出口贸易的公平，对肉制品进行检测也具有一定的社会和经济意义。传统的肉制品检测采用形态学、免疫学方法，仅对生鲜肉具有一定的鉴别作用。但对经过加工处理的熟肉制品，由于其感官性状、蛋白质成分和其它免疫源性物质被破坏，使得传统的方法很难进行准确的肉类品种鉴定，给肉制品的交易和进口带来了极大的不便。

中国专利申请200710175520.6、“鸡肉、牛肉、猪肉和马肉多重PCR快速检测试剂盒及其应用”，该方法能够快速鉴别动物源性成分，但难以对肉制品中微量成分进行准确鉴定，且需要进行电泳凝胶判断结果，导致不够经济实用。

中国专利申请2012101870313、“特定肉制品的LAMP法检测试剂盒及检测方法”公开了一种特定肉制品的LAMP法检测试剂盒，其包括五组相互独立的A1-A5型反应液，该五组反应液可分别检测牦牛肉、鸡肉、猪肉、兔肉和羊肉。然而，该方法需要对每组反应液设置2个梯度的扩增引物体系，同时每组涉及一组外引物和内引物以及一组环引物对，共计6种引物，且没有各组体系之间没有通用引物，因此导致整个过程设计繁琐、且引物之间相互干扰，从而从一定程度上影响了检测准确性。另外，该申请的实施例中只能同时检测两种肉制品，并不能同时检测两种以上的肉源。

中国专利申请200810243974.7、“一种利用微卫星标记技术鉴别肉制品中源性成分的方法”，涉及PCR法，通过设计特异性引物，进行PCR，根据扩增产物的大小及有无鉴定肉制品中动物源性成分。该方法过程需要进行大量的凝胶电泳，分析其凝胶图谱，整个过程较为繁琐，仍然停留在传统PCR检测技术。

发明内容

本发明原理在于：提供了一种联合PCR技术、单碱基延伸技术和质谱检测技术，鉴定肉制品中动物源性成分的检测方案。其中：使用一对通用引物进行PCR扩增；在单碱基延伸过程中，对PCR的纯化产物进行多重单碱基延伸，延伸引物延伸一个核苷酸；单碱基延伸产生由延伸引物和延伸产物组成的待检混合物，以质谱对待检混合物进行检测，通过质谱峰确定待检混合物中各物质分子量，并与预先计算的各延伸引物和延伸产物的理论分子量进行比对，从而确定待检混合物是否包含特定的物质。

因此，本发明第一个目的是提供一种鉴定肉制品中动物源性成分的引物系统或引物组，其序列如表1所示。

其中，各位点对应的延伸引物及延伸产物分子量如表2所示。

在一个实施方案中，上述PCR扩增引物序列为核心序列，其在5'端可包括保护碱基序列，优选5-15个碱基。在一个具体实施方案中，保护碱基序列选自在5'段加入10bp的tag（ACGTTGGATG），例如，PCR引物SEQ ID NO:1在5'段加入10bp的tag（ACGTTGGATG）后即为SEQ ID NO:9：5'-ACGTTGGATGCAAACTGGGATTAGATACCCCACTAT-3’。在另一个具体实施方案中，延伸引物的5'端也可以增加作为接头的碱基序列。

CAAACTGGGATTAGATACCCCACTAT

本发明第二个目的是提供了由上述引物系统所制备的用于鉴定肉制品中动物源性成分的产品。

在一个实施方案中，该产品为检测试剂盒，包括：

（1）用于PCR的反应试剂，包括：PCR引物，耐高温的DNA聚合酶，dNTPs，PCR反应缓冲液；

（2）用于PCR产物纯化的试剂；

（3）用于单碱基延伸反应的试剂，包括：延伸引物，耐高温的单碱基延伸酶，ddNTPs，延伸反应缓冲液。

在一个具体实施方案中，该试剂盒还可包括：阴性质控品，阳性质控品，纯化用树脂，点样及质谱检测用靶片，外切酶，基因组DNA提取试剂等试剂。

在另一个具体实施方案中，用于PCR产物纯化的试剂：碱性磷酸酶，或碱性磷酸酶和外切酶ExoI，或电泳凝胶回收试剂，或PCR产物纯化柱。其中当包括碱性磷酸酶和外切酶ExoI的纯化试剂时，所使用的PCR引物无需包括保护碱基。

本发明第三个目的是使用上述引物、产品或试剂盒来鉴定肉制品中动物源性成分的方法，包括如下步骤：

（1）PCR反应：使用通用PCR引物，对待测模板进行扩增，得到PCR产物；

（2）PCR产物纯化：对步骤（1）得到的PCR产物进行纯化，以减少对后续反应的干扰；

（3）单碱基延伸：使用6条特异性的延伸引物，在一个反应体系中，对步骤（2）得到的纯化后PCR产物进行多重单碱基延伸，延伸引物延伸一个核苷酸，该核苷酸与模板互补配对；

（4）延伸产物纯化：对步骤（3）得到的延伸产物进行纯化，以获得高纯的延伸产物，避免盐离子等杂质对后续检测的影响；

（5）质谱仪检测：将步骤（4）得到的纯化产物点在含有基质的靶片上，放入质谱仪进行检测。

在一个实施方案中，步骤2的纯化过程可以选自碱性磷酸酶消化、碱性磷酸酶和外切酶ExoI消化、切胶纯化、PCR纯化柱过柱等。在一个具体实施方案中，当使用碱性磷酸酶消化、或碱性磷酸酶和外切酶ExoI消化进行纯化后，进行高温酶失活处理。

本发明第四个目的是提供前述试剂盒在鉴定肉制品中动物源性成分的用途。

有益效果

本发明优点和效果如下：

1.敏感：本发明综合了PCR反应、单碱基延伸、质谱检测等技术为一体，既可通过PCR技术放大检测模板，又可通过质谱技术检测微量样本，综合了两种技术的优点，远远优于单独使用PCR检测的方法，因此它的检测灵敏度很高。

2.特异：单碱基延伸又称为“微测序”，使用特异性探针对DNA分子进行识别，具有测序技术的高准确性，特异性好、假阳性低等特点；特别的，不同于测序技术延伸数百个碱基，该技术仅延伸单个碱基，出错概率更低；

3.简便安全：操作简单、安全、自动化程度高、防污染；

4.快速：速度快、高通量，可在5-6小时内完成数百个样本的检测。

5.检测结果准确且稳定：本发明建立了同时检测多种肉制品的质谱图谱标准系统，通过该系统，可以同时对三种及以上的混合型肉制品同时进行准确检测来源。

6.抗干扰能力强：由于本发明是使用质谱图谱检测各种肉源性成分，而激光质谱检测核酸具有极强的分辨率和灵敏度（最高分辨率达到9Da），各种成分的质谱峰值彼此存在足够的分辨区间、且通过计算机程序判读，因此即使同时存在6种肉源性成分，结果彼此之间也不会相互干扰（如5361.5Da为羊源性成分、5410.6Da为牛源性成分、5504.6Da为猪源性成分、6019.8Da为鸡源性成分、6108Da为鸭源性成分、6325.1Da为兔源性成分，彼此最小区分度为49.1Da，远远超过最高分辨率）。相反，传统PCR扩增后凝胶电泳检测，其各种扩增成分的电泳凝胶带如果区分度过低，将导致在凝胶结果上难以分辨。

原理与定义

本发明提供了一种联合PCR、单碱基延伸和质谱检测等技术，鉴定肉制品中动物源性成分的检测方案。其原理在于：使用通用PCR引物，对待测模板进行扩增，得到PCR产物。在单碱基延伸步骤中，对上一步PCR的产物依次进行纯化和多重单碱基延伸。其中，延伸引物共6条，分别对应6种物种，反应时可以延伸一个核苷酸，该核苷酸与模板互补配对（如模板为核苷酸A，将在对应的延伸引物上延伸T核苷酸）。在单碱基延伸步骤中，采用ddNTP代替dNTP，因此，在延伸一个碱基后，延伸引物将终止延伸。在质谱检测过程中，单碱基延伸产物在脱盐纯化后，点至含基质的靶片，并在真空环境中被激光激发，通过飞行管至检测器。不同物质通过飞行管的时间与它们的分子量呈负相关，即分子量越大，飞行速度越慢，到达检测器的时间越晚。

术语“保护碱基”，指在PCR引物的5'端额外增加的碱基。由于保护碱基的序列使得PCR引物（即核心引物）的分子量增大，可以避免反应剩余的PCR引物进入质谱检测窗口，以避免干扰检测效果。

术语“碱性磷酸酶消化”，其作用是降解PCR反应后体系中残余dNTP，其原理是使dNTP的5'-P末端转换成5'-OH末端，从而失去与引物结合使引物延伸的能力，避免了对下一步单碱基延伸的影响。

术语“外切酶ExoI消化”，其作用是从单链DNA的一端开始按序催化水解组成DNA的dNTP之间3,5-磷酸二酯键，使单链DNA最终水解为dNTP。在本技术方案中用于降解PCR反应后残余的PCR引物。由于外切酶可以将单链的PCR引物切除，并不会在检测窗口中出现，因此使用该外切酶时，所使用的PCR引物无需包括保护碱基。

术语“单碱基延伸”，又被称之为微测序（mini sequence），指在体系中加入延伸引物和ddNTP，ddNTP与延伸引物的3'端连接形成延伸产物（即引物延伸了一个碱基）。由于“ddNTP”与普通dNTP不同的是，在脱氧核糖的3'位置缺少一个羟基，不能同后续的ddNTP形成磷酸二酯键，因而，延伸引物仅连接一个ddNTP，因此称之为单碱基延伸。单碱基延伸与测序过程非常相似，测序体系中加入的是dNTP和ddNTP的混合物，测序引物连接dNTP后将继续延伸，只有连接ddNTP后，方终止延伸，因此测序产生的是长短不一的核苷酸片段的混合物；单碱基延伸体系中加入只有ddNTP，延伸引物只能连接一个ddNTP，并终止延伸，因此单碱基延伸产生的是延伸引物仅延伸一个碱基的核苷酸片段。

术语“检测产品”，包括：检测试剂、检测芯片、检测载体，以及检测试剂盒等。

术语“ddNTP”是一种特殊的核苷酸，本技术方案共采用四种，它们之间存在分子量差异，如ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP的分子量分别是271.2Da、247.2Da、287.2Da、327.1Da（其中ddTTP是修饰后的分子量），质谱检测核酸的最小灵敏度大约是9Da。

术语“纯化”，指用于减少待检体系内其他物质对后续反应的影响的处理步骤。本发明的PCR产物纯化有两种方式：一是分离杂质并丢弃，二是使杂质失去活性。其中，切胶纯化、过纯化柱等都是通过电泳、纯化柱等分离杂质，并回收相对较纯的PCR产物，可以认为是第一种纯化方式，该方式一般耗时，操作复杂，特别是样本量大时；碱性磷酸酶的作用是降解（亦称“消化”）dNTP，使之不能继续作为DNA聚合酶或单碱基延伸酶的底物参与PCR或单碱基延伸反应，从而不干扰后续反应，可以认为是第二种纯化方式。应当指出的是，单独的外切酶ExoI不起纯化作用，当它与碱性磷酸酶混合使用时，其作用是预先将单链DNA（在反应完成后的PCR产物体系中，主要是剩余的PCR引物）降解成dNTP，再由碱性磷酸酶使dNTP继续降解。由于PCR引物被降解，不会进入最后的质谱检测步骤，因此，如果计划纯化步骤中增加ExoI外切酶处理，那么无需使用具有保护碱基的PCR引物。此外，在单碱基延伸步骤之前，由于外切酶和碱性磷酸酶都通过高温失活，其不会降解在单碱基延伸步骤中加入的单链的延伸引物、ddNTP等，因此避免对后续实验产生影响。

术语“检测窗口”，指可用于质谱检测核苷酸分子量的范围，通常涉及引物的设计参考范围。为了避免不同延伸引物及产物之间由于分子量接近而存在干扰，从而可在一个相对宽阔的检测窗口，如4000-9000Da，实现对多个物种的检测。

附图说明

图1为实施例四中，对羊肉的检测结果。

图2为实施例四中，对牛肉的检测结果。

图3为实施例四中，对猪肉的检测结果。

图4为实施例四中，对鸡肉的检测结果。

图5为实施例四中，对鸭肉的检测结果。

图6为实施例四中，对兔肉的检测结果。

图7为实施例四中，羊、牛、猪、鸡、鸭、兔源性成分标准质谱结果图。

图8A为实施例五中，牛、猪、鸡源性成分质谱结果图。

图8B为实施例五中，羊、猪、鸡、鸭源性成分质谱结果图。

图8C为实施例五中，牛、羊、猪、鸡、鸭、兔源性成分质谱结果图。

图8D为实施例五中，阴性样本质谱结果图。

图9为对照实施例一中，A、B、C、D组样本检测结果电泳图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例一：引物设计及合成。

针对猪、牛、羊、鸡、鸭、兔设计通用PCR引物核心序列（SEQ ID No：1至SEQ ID No：2）和特异性延伸引物核心序列（SEQ ID No：3至SEQ ID No：8）。

其中，为了避免PCR引物进入质谱仪检测窗口而干扰检测效果，每条PCR引物的5'端可以在核心序列（SEQ ID No：1至SEQ ID No：2）的基础上增加一定数目的碱基，常见如10bp的tag（ACGTTGGATG），以使PCR引物的分子量增大，从而超出质谱仪检测窗口。

相关引物在生工生物工程（上海）有限公司进行合成。

以下检测过程参照毅新兴业（北京）科技有限公司的《肉制品鉴别试剂盒（飞行时间质谱法）说明书》（以下简称“说明书”）进行操作。

实施例二：标准肉制品中基因组DNA的提取。

在市场上购买猪、牛、羊、鸡、鸭、兔成体组织（如前腿或后腿）各一块，选取适量的组织内部肌肉组织。采用商业化的核酸提取试剂盒（如QIAGEN公司的DNeasy Blood andTissue kit）提取肌肉组织中基因组DNA。提取混合肉品DNA，步骤如下：

A.取混合肉品4g，常温条件下研磨至肉粉末状，将肉粉末置于10ml离心管中，加入1ml的STE液体，1ml的体积比10%SDS液体，150μl的20mg/ml蛋白酶K,在56℃水浴1-3h；

B.加入到5ml酚-氯仿-异戊醇的混合液中，混匀后，用10000rpm离心机进行离心4min；其中酚-氯仿-异戊醇混合液的体积比为酚25：氯仿24：异戊醇1；

C.吸取离心的上层取DNA，加入到5ml氯仿-异戊醇混合液中，用10000rpm离心机进行离心3min；其中氯仿-异戊醇混合液的体积比为氯仿24：异戊醇1；

D.吸取离心的上层取DNA，加入1ml的5mol/l NaCl和9ml无水乙醇的混合液中混匀后，用10000rpm离心机进行离心3min,弃乙醇；弃乙醇的方法就是倾倒离心管中的上清液，而保留离心管中的的沉淀物；

E.将弃乙醇的余物加入5ml的体积比70%乙醇之中，用10000rpm离心机进行离心1min,弃乙醇；

F.完全去除乙醇后，加入1ml灭菌蒸馏水，获得混合肉品的DNA模板备用；

H.对于提取后的基因组DNA，在2-8℃保存不应超过一周，-20℃保存不应超过两年，-80℃可长期保存，应避免反复冻融，并置于冰盒中进行运输。

实施例三：标准生物实验。

使用ABI9700型PCR仪，按说明书对提取的基因组DNA进行检验。

试剂盒中用于PCR、PCR产物纯化和单碱基延伸的组分为：

序号	组分名称	主要成分	规格
				1	PCR混合物	dNTPs、MgCl2、PCR引物	360ul/管x1管
2	PCR酶	Taq酶	24ul/管x1管
				3	SAP酶混合物	SAP酶	24ul/管x1管
4	延伸引物混合液	延伸引物	24ul/管x1管
				5	延伸酶混合物	iPLEX酶、ddNTPs	24ul/管x1管

按说明书，具体操作方法如下：

1.PCR扩增

1.1在PCR配液区，按照待检样品数（含阳性质控品、阴性对照、空白对照）准备200ulPCR反应管，并在管上标记样本编号；

1.2从试剂盒中取出PCR混合物、PCR酶，使其自然解冻，涡旋振荡使其充分混匀，瞬时离心至管底；

1.3根据样本数目，按下表的比例取出PCR引物混合液和PCR反应液，置于一个离心管中混匀，按每PCR反应管加入16ul混合物进行分装。由于分装过程中，移液器吸头残留等因素可能造成不足以分装出所需的份数，建议适当放大混合物的配制体积。例如有10份待测样品时，可按10.5-11份样品配制混合物。

组分名称	单反应体积
		PCR混合物	15ul
PCR酶	1ul
		合计	16ul

1.4在PCR扩增区内向每管混合物中加入4ul待测样品，使每份PCR反应体系总体积为20ul。其中，阴性对照为纯化水，空白对照为不加模板。

1.5将PCR反应管置于PCR扩增仪中，按下表的程序进行PCR扩增反应。

2.SAP酶消化

PCR后，依次取5ul PCR产物至新管，每管加入SAP酶混合物1ul，然后将PCR反应管置于PCR扩增仪中，执行下表程序。

温度	时间（分）	循环数
			37	45	1
85	15	1

3.延伸

3.1在PCR配液区，根据样本数目，按下表的比例取出延伸引物混合液和延伸酶混合物，置于一个离心管中混匀。由于分装过程中，移液器吸头残留等因素可能造成不足以分装出所需的份数，建议适当放大混合物的配制体积。例如有10份酶切产物时，可按10.5-11份样品配制混合物。

组分名称	单反应体积
		延伸引物混合液	1ul
延伸酶混合物	1ul

合计

2ul

3.2在PCR扩增区，按每管酶切产物加入2ul混合物进行分装。

3.3将PCR反应管置于PCR扩增仪中，按下表的程序进行延伸反应。

4.纯化

在PCR扩增区向每管延伸产物中加入16ul纯化水，6mg树脂，颠倒混匀30分钟。

5.点样

使用微量移液器，吸取1ul纯化产物，点样至靶片。

实施例四：上机检测及标准结果判读。

使用毅新兴业（北京）科技有限公司生产的Clin-TOF型飞行时间质谱仪对点样后的靶片进行检测和结果判断。

如前述表2所示，6条延伸引物及它们根据各自基因型产生的延伸产物具有不同的分子量，这些分子量对应各自的质谱峰，若在某分子量处出现质谱峰，则判断为存在与该分子量对应的物质（延伸引物或产物）：

判断标准：

SEQ ID No：3延伸产物，如果在5361.5Da处出峰，说明待测样品中含有羊源性成分。如果在5361.5Da处不出峰，说明不含羊源性成分。

SEQ ID No：4延伸产物，如果在5410.6Da处出峰，说明待测样品中含有牛源性成分。如果在5410.6Da处不出峰，说明不含牛源性成分。

SEQ ID No：5延伸产物，如果在5504.6Da处出峰，说明待测样品中含有猪源性成分。如果在5504.6Da处不出峰，说明不含猪源性成分。

SEQ ID No：6延伸产物，如果在6019.8Da处出峰，说明待测样品中含有鸡源性成分。如果在6019.8Da处不出峰，说明不含鸡源性成分。

SEQ ID No：7延伸产物，如果在6108Da处出峰，说明待测样品中含有鸭源性成分。如果在6108Da处不出峰，说明不含鸭源性成分。

SEQ ID No：8延伸产物，如果在6325.1Da处出峰，说明待测样品中含有兔源性成分。如果在6325.1Da处不出峰，说明不含兔源性成分。

质谱结果如图1-6所示。

图1为序列表中SEQ ID No：3延伸产物的结果。该产物在5361.5Da处出峰，说明待测样品中含有羊源性成分。

图2为序列表中SEQ ID No：4延伸产物的结果。该产物在5410.6Da处出峰，说明待测样品中含有牛源性成分。

图3为序列表中SEQ ID No：5延伸产物的结果。该产物在5504.6Da处出峰，说明待测样品中含有猪源性成分。

图4为序列表中SEQ ID No：6延伸产物的结果。该产物在6019.8Da处出峰，说明待测样品中含有鸡源性成分。

图5为序列表中SEQ ID No：7延伸产物的结果。该产物在6108Da处出峰，说明待测样品中含有鸭源性成分。

图6为序列表中SEQ ID No：8延伸产物的结果。该产物在6325.1Da处出峰，说明待测样品中含有兔源性成分。

将图1-6的各种目的峰值曲线汇总成一张图片，从而得到羊、牛、猪、鸡、鸭、兔源性成分标准质谱结果图，即图7。

实施例五多种肉源性成分的检测

根据下表，将固体混合样品用粉碎机粉碎成粉末，取25mg为检测样品。

其中A组是使用猪鸡肉充当牛肉的情形；

B组是选用猪鸡鸭肉充当羊肉的情形；

C组是同时存在羊、牛、猪、鸡、鸭、兔肉的情形

根据实施例1-3的方法，对实验组A-C和对照组D分别进行PCR扩增、单碱基延伸以及质谱检测，所得的质谱数据通过质谱所带的数据分析软件（Typer4.0）自动判读校正后，其结果如图8A-D所示。其中，

图8A显示A组的峰值为5504.6Da、5410.6Da、6019.8Da，将其与实施例4所建立的质谱标准图7进行比较，判断A组成分为猪、鸡、牛肉成分；

图8B显示B组的峰值为5361.5Da、5504.6Da、6019.8Da、6108Da，将其与实施例4所建立的质谱标准图7进行比较，判断B组成分为羊、猪、鸡、鸭肉成分；

图8C显示C组的峰值为5361.5Da、5410.6Da、5504.6Da、6019.8Da、6108Da、6325.1Da，将其与实施例4所建立的质谱标准图7进行比较，判断C组成分为牛、羊、猪、鸡、鸭、兔肉成分；

图8D显示只有延伸引物峰5114.4Da、5123.4Da、5257.4Da、5692.7Da、5860.8Da、6078Da，未出现产物峰值，表明D组中不含有上述任一种肉源性成分。

对照实施例一：

根据中国专利申请2007101755206的方法，对下表肉制品混合组进行多重PCR扩增检测，

1、混合肉品DNA提取方法根据本发明实施二进行。

2、多重PCR反应

以提取的待检样品的基因组为模板按以下比例进行多重PCR反应：检测鸡肉、牛肉、猪肉的Common-F引物终浓度为15pmol/μL，Common-R的引物终浓度为15pmol/μL，鸡肉、牛肉、猪肉特异性反向引物终浓度分别为0.015pmol/μL；Mg2+浓度为1.5mmol/L；dNTP0.2mmol/L；10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)；50mmol/LKCl；Taq DNA聚合酶2U；用双蒸水补足体积至30μL。待检样品模板基因组分别为25ng，用无菌水补足体积至30μL样品。

多重PCR反应在ABI2720中进行，具体的参数条件如下：95℃预变性5min；95℃30s，70℃10s，60℃30s，72℃30s，10个循环；95℃30s，60℃30s，72℃30s，25个循环；72℃延伸7min。

3、PCR扩增产物的鉴定

用1×TAE缓冲液配置成2.5％的琼脂糖凝胶溶液，微波炉加热使琼脂糖完全溶解后加入Golden view(5mg/mL)至终浓度为0.5μg/mL，倒胶然后取适量待电泳的PCR产物与1/6体积的电泳上样液(0.25％溴酚蓝；0.25％二甲苯青FF；40％蔗糖)混匀，将PCR产物加到上样槽中，在120V/cm电压下进行恒压电泳。当样品电泳至适当的位置后，在紫外凝胶成像系统(Bio-Rad，Gel Doc2000)观察结果并拍照记录。电泳后扩增的目的片段为鸡肉239bp、牛肉292bp、猪肉412bp。有以上片段则认为检验出阳性结果，无此片段则认为检测结果为阴性。

4、PCR扩增产物的序列鉴定

利用DNA回收试剂盒(大连宝生物公司)从琼脂糖凝胶中回收 PCR产物进行克隆和(PGEM-Tvector)和DNA序列测定。DNA序列测定由上海联合基因公司完成。

结果如图9所示。

编号A显示A组的泳道出现239bp、292bp、412bp，判断A组成分为猪、鸡、牛肉成分；

编号B显示B组的泳道出现239bp、412bp，判断B组成分为鸡、猪肉成分；

编号C显示C组的泳道出现239bp、292bp，判断C组成分为鸡、牛肉成分；

编号D显示该泳道为空白，表明D组中不含有上述任一种肉源性成分。

其中，图9的组A结果与实施例五的图8A完全一致。

由于中国专利申请2007101755206并没有公开羊肉、鸭肉、兔肉的引物，因此无法判断该申请能否同时检测猪、鸡、牛、羊、鸭、兔肉源成分。但从图9的组A和图8A的结果能判断，本申请的质谱检测方法能够完全同时检测多种肉源成分，且不会出现多重引物扩增中难以避免的相互干扰的问题。

Claims (10)

1.一种检测肉制品中动物源性的引物系统，其特征在于该引物系统包括一对扩增引物和6条延伸引物，其中，扩增引物对序列选自SEQ ID No：1-2，延伸引物序列分别选自SEQ ID No：3-8，并且所述延伸引物分别对应于羊、牛、猪、鸡、鸭、兔。 

2.权利要求1的引物系统，其中扩增引物序列为核心序列，其在5'端可包括保护5-15个碱基序列，优选为10bp的tag：ACGTTGGATG。 

3.权利要求1的引物系统，其中延伸引物5'端可增加作为接头的碱基序列，其中优选为1-15个碱基，更优选1-3个碱基。 

4.由权利要求1至3的引物系统所制备的用于鉴定肉制品中动物源性成分的检测产品，其中所述动物源性成分为羊、牛、猪、鸡、鸭、兔。 

5.权利要求4的检测产品，其中产品为检测试剂盒，包括： 

（1）用于PCR的反应试剂，包括：上述扩增引物对，耐高温的DNA聚合酶，dNTPs，PCR反应缓冲液； 

（2）用于PCR产物纯化的试剂； 

（3）用于单碱基延伸反应的试剂，包括：延伸引物，耐高温的单碱基延伸酶，ddNTPs，延伸反应缓冲液。 

6.权利要求5的检测产品，其中试剂盒还可包括：阴性质控品，阳性质控品，纯化用树脂，点样及质谱检测用靶片，外切酶，基因组DNA提取试剂等试剂；和/或 

用于PCR产物纯化的试剂选自碱性磷酸酶，或碱性磷酸酶和外切酶ExoI，或电泳凝胶回收试剂，或PCR产物纯化柱。 

7.使用权利要求1-3的引物系统，或权利要求4-6的产品来检测肉制品中动物源性成分的方法，包括： 

（1）PCR扩增：使用通用PCR引物进行扩增，得到PCR产物； 

（2）PCR产物纯化：对步骤（1）得到的PCR产物进行纯化，以减少对后续反应的干扰； 

（3）单碱基延伸：使用6条特异性的延伸引物，在一个反应体系中，对步骤（2）得到的纯化后PCR产物进行多重单碱基延伸，延伸引物延伸一个核苷酸； 

（4）延伸产物纯化：对步骤（3）得到的延伸产物进行纯化，以获得高纯的延伸产物，避免盐离子等杂质对后续检测的影响； 

（5）质谱仪检测：将步骤（4）得到的纯化产物点在含有基质的靶片上，放入质谱仪进 行检测。

8.权利要求7的方法，其中步骤2的纯化过程可以选自碱性磷酸酶消化、碱性磷酸酶和外切酶ExoI消化、切胶纯化、PCR纯化柱过柱等。 

9.权利要求1-3的引物系统，或权利要求4-6的产品，在鉴定肉制品中动物源性成分的用途。 

10.权利要求9的用途，其中所述动物源性成分为羊、牛、猪、鸡、鸭、兔。 

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