JP2006061152A - 酵母及びカビ検出用のプライマー、酵母及びカビの検出方法、及び酵母及びカビ検出用キット - Google Patents
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Abstract
【解決手段】下記(i)及び(ii)のプライマーからなるプライマー対を、酵母及びカビ検出用のプライマー対として使用して、各種製品に存在する酵母やカビを検出する:(i)塩基配列(5'-GCCATGCGTGTCTAAGTATAAG-3')又はその特定の変異塩基配列、及び(ii)塩基配列(5'-TAGGGGAGAGATTTGAATGAAC-3')又はその特定の変異塩基配列。
【選択図】なし
Description
J. Antibact. Antifung. Agents Vol.27, No. 12, 1999, p.803〜809 Journal of Food Protection, Vol. 67, No. 2, 2004, p.357-364
項1. 配列番号1で示される塩基配列、又は該塩基配列において、第1〜12位の塩基の3個以下が置換、及び/又は5'末端側に10個以下の塩基が付加されている塩基配列からなる、酵母及びカビ検出用プライマー。
項2. 配列番号2で示される塩基配列、又は該塩基配列において、第1〜12位の塩基の3個以下が置換、及び/又は5'末端側に10個以下の塩基が付加されている塩基配列からなる、酵母及びカビ検出用プライマー。
項3. 項1に記載のプライマー及び項2に記載のプライマーからなる、酵母及びカビ検出用のプライマー対。
項4. 下記(i)及び(ii)のプライマーからなる項3に記載の酵母及びカビ検出用のプライマー対:
(i)配列番号1で示される塩基配列からなるプライマー、及び
(ii)配列番号2で示される塩基配列からなるプライマー。
項5. 検出対象となる酵母及びカビが、サッカロマイセス・ショレビッシェ、ピキア・アノマラ、カンディダ・ファマタ、デバリオマイセス・ハンセニイ、ジグロサッカロマイセス・ロウキシ、カンディダ・インターメディア、クラビスポラ・ルジタニエ、クルイベロマイセス・ラクティス、シゾサッカロマイセス・ポンブ、ピキア・メンブラニファシエンス、ペニシリウム・オブラタム、ペニシリウム・サブロサム、アスペルギルス・ニガー、フサリウム・クルークウェレンス、ジェオトリカム・カンディダム、アルターナリア・アルタネータ、アウレオバシディウム・プルランス、クラドストリウム・クラドスポリオイドス、ユウロチウム・ハーバリオラム、及びタラロマイセス・バシリスポラスよりなる群から選択される少なくとも1種である、項3又は4に記載の酵母及びカビ検出用プライマー対。
項6. 検査対象物中の酵母及びカビを検出する方法であって、
(1)検査対象物に含まれるDNAを抽出する工程、
(2)前記工程(1)抽出されたDNAを鋳型として、請求項3乃至5のいずれかに記載のプライマー対を用いてPCRを行なう工程、及び
(3)増幅されたDNA断片を検出する工程、を含有する検出方法。
項7. 検査対象物が食品である、項6に記載の判定方法。
項8. 項3乃至5のいずれかに記載のプライマー対を含有する、酵母及びカビ検出用キット。
本発明の酵母及びカビの検出用プライマーは、植物又は動物の18SrRNA遺伝子や細菌の16SrRNA遺伝子とはハイブリダイズすることなく、酵母及びカビの18SrRNA遺伝子に対して特異的にハイブリダイズできるものである。このような特性により、本発明のプライマーは、通常のPCRに供されることにより、酵母及びカビの18SrRNA遺伝子を検出可能に増幅するが、同じ条件のPCRに供されることにより植物及び動物の18SrRNA遺伝子を検出可能に増幅しないプライマーである。
(a)配列番号1で示される塩基配列、又は
(b)配列番号1で示される塩基配列において、第1〜12位にある塩基の内3個以下の塩基が置換、及び/又は5'末端側に10個以下の塩基が付加されている塩基配列。
(c)配列番号2で示される塩基配列、又は
(d)配列番号2で示される塩基配列において、第1〜12位にある塩基の内3個以下の塩基が置換、及び/又は5'末端側に10個以下の塩基が付加されている塩基配列。
また、本発明は、プライマー1及びプライマー2から構成される「酵母及びカビ検出用のプライマー対」を使用して、検査対象物中の酵母及びカビを検出する方法を提供する。本発明に係る酵母及びカビの検出方法は、下記工程(1)〜(3)を含有することを特徴とするものである。
(1)検査対象物に含まれるDNAを抽出する工程、
(2)前記工程(1)抽出されたDNAを鋳型として、上記酵母及びカビ検出用のプライマー対を用いてPCRを行なう工程、及び
(3)増幅されたDNA断片の有無を検出する工程。
本判定方法における検査対象物は、酵母及びカビの存在の判定が必要とされるものであれば、その種類については特に制限されない。また、当該検査対象物の形態についても、液状、固形状、半固形状等の何れであってもよい。好ましくは液状又は半固形状の形態のものである。液状又は半固形状の形態のものは酵母及びカビの生育に適しているので、これらの形態の検査対象物における酵母及びカビの存在を判定することは極めて重要である。
工程(1)では、検査対象物に含まれるDNAの抽出を行なう。
工程(2)では、前記工程(1)抽出されたDNAを鋳型として、上記酵母及びカビ検出用のプライマー対を用いてPCRを行なう。当該PCRの条件は、目的DNA断片を検出可能な程度に増幅することを限度として特に制限されず、使用する装置等に応じて適宜設定することができる。使用されるPCR装置としては、例えば、ブロックタイプ、リアルタイムPCRタイプ等の市販の装置が挙げられる。迅速にDNAを増幅するためにはキャピラリータイプのリアルタイムPCR装置を用いることが好ましい。
<反応液>例えば、Takara Ex TaqTMR-PCR Version (Takara Bio社製)に付属のPCR反応液
<PCRサイクル条件>
2本鎖DNAの熱変性条件:95℃で5秒間、
プライマーの一本鎖DNAへのアニーリング条件:54℃で10秒間、
DNA伸長条件:72℃で20秒間、
サイクル回数:35サイクル程度。
工程(3)では、増幅されたDNA断片を検出する。増幅されたDNA断片を検出する方法は、特に制限されず、公知のDNA断片検出方法を使用できる。例えば、PCR産物をアガロースゲル電気泳動により分離し、エチジウムブロマイド、サイバーグリーンI等の核酸染色剤で核酸染色することにより、DNA断片を検出することができる。また、前記工程(2)において、リアルタイムPCR装置を用いてPCRを行なう場合は、該装置の検出システムにより自動的に短時間で増幅されたDNAの有無が確認される。例えば、PCR反応液中にサイバーグリーンIを添加した場合では、サイバーグリーンIが二本鎖DNAに結合したときに発する蛍光値から増幅産物量をサイクル毎にモニター可能であり、更に、PCR後に融解曲線分析を行なうことによりPCR産物が目的のDNA断片であるかどうかを確認できる。判断が困難な場合は、増幅産物の大きさをアガロースゲル電気泳動により確認すればよい。
本発明の酵母及びカビ検出用キットは、前記する検査対象物中の酵母及びカビの検出方法に用いられるキットであり、上記酵母及びカビ検出用のプライマー対を含有するものである。本発明の酵母及びカビ検出用キットにおいて、上記酵母及びカビ検出用のプライマー対は、プライマー1とプライマー2の混合物であってもよく、またこれらのプライマーが別個に収容されていてもよい。当該酵母及びカビ検出用キットには、上記酵母及びカビ検出用のプライマー対の他に、PCRやPCR増幅DNA断片を検出するのに必要な試薬類を更に含んでいてもよい。
下記実験により、配列番号1で示される塩基配列からなるDNAプライマーと、配列番号2で示される塩基配列からなるDNAプライマーとのプライマー対(Y18r230)の各生物の由来のDNAに対する反応性を調べた。
1. プライマーの合成
配列番号1で示される塩基配列からなるDNAプライマー、及び配列番号2で示される塩基配列からなるDNAプライマーをDNA合成機により調製した。
酵母及びカビ由来DNAの調製
表1に示す各菌株をYPD培地を用いて培養した。なお、これらの酵母及びカビ(糸状菌)は、食品汚染の代表的な原因菌である。培養して得られた酵母については、GenTLE Kit(Takara Bio社製)を用いてDNA抽出を行なった。また、培養して得られた糸状菌については、培養液にガラスビーズ液を添加し、99℃程度で1〜15分間程度加熱した後、冷却し、次いでマルチビーズショッカー等で破砕した後、GenTLE Kitを用いてDNAの抽出を行なった。得られた各DNA溶液中のDNA量を測定し、各酵母及びカビ由来のDNAの濃度を1ng/μLに調節して、被験DNA溶液とした。
表1に示す各細菌株を、それぞれの細菌に適合する培地で培養した。培養して得られた各細菌について、公知の方法(アルカリSDS法)を用いてDNA抽出を行なった。得られた各DNA溶液中のDNA量を測定し、各細菌由来のDNAの濃度を200pg/μL程度に調節して、被験DNA溶液とした。
コスモバイオ社から購入したダイズ、トウモロコシ及びコムギのDNAを用いて、被験DNA溶液を調製した。ダイズ及びトウモロコシ由来のDNAについては、DNA濃度を3ng/μL程度に調節して、被験DNA溶液とした。また、コムギ由来のDNAについては、DNA濃度を8ng/μL程度に調節して、被験DNA溶液とした。また、メロン、ミカン、ブドウ、リンゴ及びキウイから、ISOPLANT II kit(ニッポンジーン社製)を用いてDNA抽出して、抽出されたDNA濃度をそれぞれ3ng/μL程度に調節して、被験DNA溶液とした。
ヒトMCF-7細胞(大日本製薬社製)からDNeasy Tissue Mini Kit(キアゲン社)を用いてヒトDNAを抽出した。得られたDNA溶液中のDNA量を測定し、DNAの濃度を3ng/μL程度に調節して、被験DNA溶液とした。ウシ及びニワトリ由来の精製DNAはCeMines社から購入し、ブタ由来のDNAはGeneScan社から購入した。ウシ、ニワトリ及びブタ由来のDNAを用いて、各DNAの濃度3ng/μL程度の被験DNA溶液を調製した。
上記各被験DNA溶液1μLをPCR反応用キットであるTakara Ex TaqTMR-PCR Version (Takara Bio社、Otsu、Japan)の説明書に従って、総量20μLのPCR反応液を調製した。即ち、2μLの10×R-PCR Buffer(Mg2+free)、0.16μLの250mM Mg2+Solution for R-PCR、0.4μLのdNTP Mixture(各10mM)、0.2μLのTaKara EX TaqTM R-PCR(5 units/μL)、0.8μLの0.125%SYBRTMGreenI (Fmc Bioproducts社、Rockland、USA)、1 μLのDNAプライマー液(配列番号1のDNAプライマー及び配列番号2のDNAプライマーを各々5μM含有)及び16.44μLの蒸留水を含む19μLの溶液に、被験DNA溶液1μLを加えて総量20μLにしたPCR反応液を調製した。
得られた結果を表1に示す。表中+は電気泳動によりバンドが検出されたことを示し、マイナスはバンドが検出されなかったことを示す。表1に示す結果から、配列番号1のプライマーと配列番号2のプライマーとのセットを用いたPCRにより、食品汚染の代表的な原因菌である19種の酵母及びカビの18SrRNA遺伝子に由来するDNA断片を特異的に増幅できることが判明した。また、他の細菌類や、植物、動物に由来するDNAを増幅しないことも判明した。以上の結果から、本発明の酵母及びカビ検出用のプライマー対を使用することにより、食品を初めとする検査対象物から、酵母及びカビを分離培養することなく一度のPCRで酵母及びカビの存在を判定可能であることが明らかとなった。
特許文献1に開示されているプライマー対(B2F:5'-ACTTTCGATGGTAGGATAG-3'、及びB4R:5'-TGATCGTCTTCGATCCCCTA-3')(以下、「プライマー対(B2FB4R)」と記す)によるカビ由来DNA及び植物由来DNAの検出の可否について、検討するため、下記の試験を行った。
酵母及びカビに汚染されていないことを前もって確認済みの市販の乳酸菌飲料に、指標菌として酵母Clavispora lusitaniae NBRC 10059株と、糸状菌Talaromyces bacillisporus NBRC 8397株を、それぞれ食品1mL当たり1×101 , 1×102 , 1×103, 1×104 cfu程度となるように添加したもの、及び無添加のものを調製した。
酵母及びカビに汚染されていないことを前もって確認済みの市販の乳酸菌飲料と発酵乳に代表的な食品汚染酵母であるClavispora lusitaniae NBRC 10059株を指標菌として、各々食品300ml当たり4、70、480cfu程度となるように添加したもの及び、無添加のものを調製した。それぞれ食品重量と等量(300ml)のYPD液体培地(クロラムフェニコール100μg / mL入り)を加え、25℃で20時間、振蘯培養した。
Claims (8)
- 配列番号1で示される塩基配列、又は該塩基配列において、第1〜12位の塩基の3個以下が置換、及び/又は5'末端側に10個以下の塩基が付加されている塩基配列からな
る、酵母及びカビ検出用プライマー。 - 配列番号2で示される塩基配列、又は該塩基配列において、第1〜12位の塩基の3個以下が置換、及び/又は5'末端側に10個以下の塩基が付加されている塩基配列からな
る、酵母及びカビ検出用プライマー。 - 請求項1に記載のプライマー、及び請求項2に記載のプライマーからなる、酵母及びカビ検出用のプライマー対。
- 下記(i)及び(ii)のプライマーからなる請求項3に記載の酵母及びカビ検出用のプライ
マー対:
(i)配列番号1で示される塩基配列からなるプライマー、及び
(ii)配列番号2で示される塩基配列からなるプライマー。 - 検出対象となる酵母及びカビが、サッカロマイセス・ショレビッシェ、ピキア・アノマラ、カンディダ・ファマタ、デバリオマイセス・ハンセニイ、ジグロサッカロマイセス・ロウキシ、カンディダ・インターメディア、クラビスポラ・ルジタニエ、クルイベロマイセス・ラクティス、シゾサッカロマイセス・ポンブ、ピキア・メンブラニファシエンス、ペニシリウム・オブラタム、ペニシリウム・サブロサム、アスペルギルス・ニガー、フサリウム・クルークウェレンス、ジェオトリカム・カンディダム、アルターナリア・アルタネータ、アウレオバシディウム・プルランス、クラドストリウム・クラドスポリオイドス、ユウロチウム・ハーバリオラム、及びタラロマイセス・バシリスポラスよりなる群から選択される少なくとも1種である、請求項3又は4に記載の酵母及びカビ検出用プライマー対。
- 検査対象物中の酵母及びカビを検出する方法であって、
(1)検査対象物に含まれるDNAを抽出する工程、
(2)前記工程(1)抽出されたDNAを鋳型として、請求項3乃至5のいずれかに記載のプライマー対を用いてPCRを行なう工程、及び
(3)増幅されたDNA断片を検出する工程、を含有する検出方法。 - 検査対象物が食品である、請求項6に記載の判定方法。
- 請求項3乃至5のいずれかに記載のプライマー対を含有する、酵母及びカビ検出用キット。
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