CN102899394A - 特定肉制品的lamp法检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明特定肉制品的LAMP法检测试剂盒及检测方法涉及一种用环介导等温扩增（LAMP）技术快速检测肉品中是否含有某种被测定肉的技术。试剂盒中包括五组相互独立的A型反应液，即反应液A-1、A-2、A-3、A-4、A-5，还包括能与该五组相互独立A型反应液分别反应的反应液B；以及用该试剂盒分别检测牦牛肉、鸡肉、猪肉、兔肉、羊肉的方法。优点：本试剂盒根据牦牛、鸡、猪、兔、羊五种肉类的基因分别设计了特异性的两种内引物、两种外引物和两种环引物。使用本发明可快速的对某种肉类或其多种肉混合物制品进行某种肉有无的检测，由于检测速度快，适合作为肉制品掺假的治法工具在基层推广。
Description
技术领域
本发明属于食品生物技术领域，涉及一种用环介导等温扩增（LAMP）技术快速检测肉品中是否含有某种被测定肉的试剂盒，并涉及一种使用该种试剂盒快速检测是否含有被测定肉的方法。
背景技术
肉制品市场上出现很多低价值的普通肉类掺杂或是替代营养价值和价格都较高的肉类行为，以次充好，对消费者财务和健康都会有损害。尤其是若掺入猪肉，对于回族消费者的宗教信仰都会有影响。因此有必要寻找一种简单快速的方法鉴定肉制品是否有指定的肉和是否有指定不应该有的肉，为鉴定是否有掺假行为提供科学依据。
肉种类鉴别方法可以分为形态学、理化学、免疫学和分子生物学。市场上很多的熟肉制品经过粉碎、添加香料和烘烤等处理后，采用传统的形态学和理化学的方法很难进行准确的肉类品种鉴定。由于肉制品在加工过程中易导致蛋白质变性，使得应用抗体特异性的ELISA法鉴定肉类品种的可靠性和稳定性较差。目前对于肉类品种的鉴定采用基于核酸特异性的PCR法较为广泛，但是基于PCR技术需要精密的扩增仪器，而且产物的鉴定是通过凝胶电泳来观察，不适于在现场快速检测，在基层推广难度较高。目前采用LAMP法鉴定肉类仅在生鲜肉基础上，对于经过加工处理后的肉制品用LAMP检测法测定是否含有某种待测定肉类品种未见报道。
公开号为CN101591713B的中国专利《一种小鹅瘟病毒LAMP检测试剂盒》公开号为和CN101225447B的中国专利《一种新城瘟病毒LAMP检测试剂盒》分别公开了用LAMP方法检测病毒的方法，没有对肉类的检测。
中国专利申请201010226683.4《一种鉴别羊肉和鸭肉的PCR-RELP方法》，中国专利申请 2007101755520.6《鸡肉、牛肉、猪肉和马肉多重PCR快速检测试剂盒及其应用》，都是基于PCR技术，需要精密的扩增仪器，而且产物的鉴定是通过凝胶电泳来观察，不适于在现场快速检测，在基层推广难度较高。
发明内容
本发明的目的就在于克服上述检测技术的缺陷，提供一种用LAMP法快速检测指定肉类品种的试剂盒，及其采用荧光染料法，能用肉眼观察显色的快速检测方法，可用于检测肉制品是否有掺假行为；还提供LAMP法检测牦牛肉、鸡肉、猪肉、兔肉、羊肉的引物。
本发明的试剂盒技术方案是：
特定肉制品的LAMP法检测试剂盒，包括五组相互独立的A型反应液，该五组相互独立的A型反应液是检测牦牛肉的反应液A-1、检测鸡肉的反应液A-2、检测猪肉的反应液A-3、检测兔肉的反应液A-4或检测羊肉的反应液A-5，还包括能与该五组相互独立A型反应液分别反应的反应液B；各反应液的成分和配合比如下：
（1）检测牦牛肉的反应液A-1：每管23.000 μl的组成及配合比如下，
2.500 μl 的10×Lamp buffer、
1.000 μl 的Bst DNA聚合酶8U/μl、
3.500 μl 的10mM dNTP、
1.000 μl的20μM牦牛肉的内引物1：
GGTAACTTGTTCCGTTGATCAAATTTTTTTAAAGACTAGACCTACAAGTCA、
1.000 μl的20μM牦牛肉的内引物2：
TAGGGATAACAGCGCAATCCTTTTTATGTCCTGATCCAACATCG、
0.125 μl的20μM牦牛肉的外引物1：AAAAAATCCTCCGAACGATT、
0.125 μl的20μM牦牛肉的外引物2：GATAGCGGTTGCACCATC、
0.500 μl的20μM牦牛肉的环引物1：GGATCAATGAGCGATAGAGTGATT、
0.500 μl的20μM牦牛肉的环引物2：TAAGAGTCCATATCGACAATAGGGT、
4.000 μl 的25mM MgCl2 、
4.000 μl 的5M甜菜碱、
余量为灭菌蒸馏水；
其中，10×Lamp buffer含有200mM三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐/ pH 8.8、 100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1%曲拉通X-100；
（2）检测鸡肉的反应液A-2：每管23.000 μl的组成及配合比如下，
2.500 μl 的10×Lamp buffer、
1.000 μl 的Bst DNA聚合酶8U/μl、
3.500 μl 的10mM dNTP、
1.000 μl的20μM鸡肉的内引物1：
TGCTCGTAGTTCTCAGGCGGATTTTTCCCACTATGCCTAGCCCTA、
1.000 μl的20μM鸡肉的内引物2：
AACTCTAAGGACTTGGCGGTGCTTTTGGTGGTTGGGTGAATCGTG、
0.125 μl的20μM鸡肉的外引物1：AAAGCTAGGACCCAAACTGG、
0.125 μl的20μM鸡肉的外引物2：GGTATGTAGGCTGTGCTGG、
0.500 μl的20μM鸡肉的环引物1：TGTGTGATGGGAGGTATCTAGATT、
0.500 μl的20μM鸡肉的环引物2：CCCAAACCCACCTAGAGGAG、
4.000 μl 的25mM MgCl2 、
4.000 μl 的5M甜菜碱、
余量为灭菌蒸馏水；
其中，10×Lamp buffer含有200mM三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐/ pH 8.8、 100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1%曲拉通X-100；
（3）检测猪肉的反应液A-3：每管23.000 μl的组成及配合比如下，
2.500 μl 的10×Lamp buffer、
1.000 μl 的Bst DNA聚合酶8U/μl、
3.500 μl 的10mM dNTP、
1.000 μl的20μM猪肉的内引物1：
CAGGCTCCTCTAGGTGGATGTTTTTCGCAACTGCCTAAAACTC、
1.000 μl的20μM猪肉的内引物2：
TCGATAAACCCCGATAGACCTTTTTTTAGGGTTTGCTGAAGATGG、
0.125 μl的20μM猪肉的外引物1：CAAAACTATTCGCCAGAGTAC、
0.125 μl的20μM猪肉的外引物2：ATTGTGCTTACTATTGTTCCTT、
0.500 μl的20μM猪肉的环引物1：AGCACCGCCAAGTCCTTT、
0.500 μl的20μM猪肉的环引物2：CCAACCCTTGCCAATTCAGCCTAT、
4.000 μl 的25mM MgCl2 、
4.000 μl 的5M甜菜碱、
余量为灭菌蒸馏水；
其中，10×Lamp buffer含有200mM三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐/ pH 8.8、 100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1%曲拉通X-100；
（4）检测兔肉的反应液A-4：每管23.000 μl的组成及配合比如下，
2.500 μl 的10×Lamp buffer、
1.000 μl 的Bst DNA聚合酶8U/μl、
3.500 μl 的10mM dNTP、
1.000 μl的20μM兔肉的内引物1：
GGAAGGCTATGTCAGGAGCCTTTTTATAATTGGAGGCTTCGGGA、
1.000 μl的20μM兔肉的内引物2：
CATTCCTTCTTCTACTAGCCTCCTTTTTGGTGGATAAACAGTTCAGC、
0.125 μl的20μM兔肉的外引物1：ACATGCCTTTGTAATAATCTTCT、
0.125 μl的20μM兔肉的外引物2：GCATGTGCAAGATTACCG、
0.500 μl的20μM兔肉的环引物1：TGACCGAACAGGGGGACT、
0.500 μl的20μM兔肉的环引物2：AGTAGAAGCTGGGGCGGGGA、
4.000 μl 的25mM MgCl2 、
4.000 μl 的5M甜菜碱、
余量为灭菌蒸馏水；
其中，10×Lamp buffer含有200mM三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐/ pH 8.8、 100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1%曲拉通X-100；
（5）检测羊肉的反应液A-5：每管23.000 μl的组成及配合比如下，
2.500 μl 的10×Lamp buffer、
1.000 μl 的Bst DNA聚合酶8U/μl、
3.500 μl 的10mM dNTP、
1.000 μl的20μM羊肉的内引物1：
ATGTGGTTATAGCCCCTAGACATAATTTTCCGGTTTTATCCACTAACAGAA、
1.000 μl的20μM羊肉的内引物2：
TATGCGCCCTCACCCAAAATTTTTTTACTATTATGAGGCCGAGTT、
0.125 μl的20μM羊肉的外引物1：AGCAGGCATCTTCCTACT、
0.125 μl的20μM羊肉的外引物2：GGGGTTGATTAATTCCGATTG、
0.500 μl的20μM羊肉的环引物1：GTTATTTAAACCGGTTAG、
0.500 μl的20μM羊肉的环引物2：AATTATCGCTTTCTCTACATCCAGC、
4.000 μl 的25mM MgCl2 、
4.000 μl 的5M甜菜碱、
余量为灭菌蒸馏水；
其中，10×Lamp buffer含有200mM三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐/ pH 8.8、 100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1%曲拉通X-100；
（6）反应液B：1000×的荧光染料 SYBR Green Ⅰ。
用上述五组相互独立的A型反应液----检测牦牛肉的反应液A-1、检测鸡肉的反应液A-2、检测猪肉的反应液A-3、检测兔肉的反应液A-4、检测羊肉的反应液A-5，和反应液B对待检测肉品进行检测是否含有牦牛肉、鸡肉、猪肉、兔肉、羊肉的LAMP法检测方法如下：
特定肉制品的LAMP法检测试剂盒的检测方法，其步骤包括：
（1）肉品中DNA的提取：
A．取肉品0.100g，常温条件下研磨至肉粉末状，将肉粉末置于1.500ml离心管中，加入500.000 μl的 STE液体，20.000μl的体积比10%SDS液体，15.000 μl 的20mg/ml蛋白酶K ,在56℃ 水浴1-3h；
B.加入到500.000μl 酚-氯仿-异戊醇的混合液中，混匀后，用10000rpm离心机进行离心4min；其中 酚-氯仿-异戊醇混合液的体积比为酚25：氯仿24：异戊醇1；
C.吸取离心的上层取DNA，加入到500.000 μl氯仿-异戊醇混合液中，用10000rpm离心机进行离心3min；其中氯仿-异戊醇混合液的体积比为氯仿24：异戊醇1；
D. 吸取离心的上层取DNA，加入50.000 μl的 5mol/l NaCl和1000.000 μl无水乙醇的混合液中混匀后，用10000rpm离心机进行离心3min,弃乙醇；弃乙醇的方法就是倾倒离心管中的上清液，而保留离心管中的的沉淀物；
E．将弃乙醇的余物加入500.000 μl的体积比 70%乙醇之中，用10000rpm离心机进行离心1min,弃乙醇；
F．完全去除乙醇后，加入100.000μl 灭菌蒸馏水，获得肉品的DNA模板备用；
（2）用LAMP法即环介导等温法扩增DNA：
在装有23.000 μl检测牦牛肉的反应液A-1、或23.000 μl检测鸡肉的反应液A-2、或23.000 μl检测猪肉的反应液A-3、或23.000 μl检测兔肉的反应液A-4、或23.000 μl检测羊肉的反应液A-5的每一个反应管中分别都加入2.000 μl 待检肉品的DNA模板，于65℃恒温水浴锅中60min后，再置于80℃恒温水浴锅中5min，获得检测牦牛肉的反应液A-1肉品的扩增DNA产物、检测鸡肉的反应液A-2肉品的扩增DNA产物、检测猪肉的反应液A-3肉品的扩增DNA产物、检测兔肉的反应液A-4肉品的扩增DNA产物或检测羊肉的反应液A-5肉品的扩增DNA产物；
（3）对肉品的扩增DNA产物的显色检测：
采用荧光染料法检测，常温状态下，在上述检测牦牛肉的反应液A-1肉品的扩增DNA产物、或检测鸡肉的反应液A-2肉品的扩增DNA产物、或检测猪肉的反应液A-3肉品的扩增DNA产物、或检测兔肉的反应液A-4肉品的扩增DNA产物、或检测羊肉的反应液A-5肉品的扩增DNA产物中，分别加入1.000 μl反应液B进行常温显色反应，反应后直接用肉眼观察显色，
有检测牦牛肉的反应液A-1肉品的扩增DNA产物的液体颜色若为绿色则说明含有牦牛肉，颜色若为黄色则说明没有牦牛肉；
有检测鸡肉的反应液A-2肉品的扩增DNA产物的液体颜色若为绿色则说明含有鸡肉，颜色若为黄色则说明没有鸡肉；
有检测猪肉的反应液A-3肉品的扩增DNA产物的液体颜色若为绿色则说明含有猪肉；颜色若为黄色则说明没有猪肉。
有检测兔肉的反应液A-4肉品的扩增DNA产物的液体颜色若为绿色则说明含有兔肉，颜色若为黄色则说明没有兔肉；
有检测羊肉的反应液A-5肉品的扩增DNA产物的液体颜色若为绿色则说明含有羊肉；颜色若为黄色则说明没有羊肉。
本发明还提供LAMP法检测牦牛肉、鸡肉、猪肉、兔肉、羊肉的引物，利用这些引物，可改变相互独立的A型反应液中的试剂，制成不同于本发明的相互独立的A型反应液，与反应液进行反应，检测牦牛肉、鸡肉、猪肉、兔肉、羊肉。这些引物的组成如下：
（1）特定肉制品的LAMP法检测试剂盒中的牦牛肉引物，包括六种引物如下，
牦牛肉的内引物1：
GGTAACTTGTTCCGTTGATCAAATTTTTTTAAAGACTAGACCTACAAGTCA、
牦牛肉的内引物2：TAGGGATAACAGCGCAATCCTTTTTATGTCCTGATCCAACATCG、
牦牛肉的外引物1：AAAAAATCCTCCGAACGATT、
牦牛肉的外引物2：GATAGCGGTTGCACCATC、
牦牛肉的环引物1：GGATCAATGAGCGATAGAGTGATT、
牦牛肉的环引物2：TAAGAGTCCATATCGACAATAGGGT。
（2）特定肉制品的LAMP法检测试剂盒中的鸡肉引物，包括六种引物如下，
鸡肉的内引物1：TGCTCGTAGTTCTCAGGCGGATTTTTCCCACTATGCCTAGCCCTA、
鸡肉的内引物2：AACTCTAAGGACTTGGCGGTGCTTTTGGTGGTTGGGTGAATCGTG、
鸡肉的外引物1：AAAGCTAGGACCCAAACTGG、
鸡肉的外引物2：GGTATGTAGGCTGTGCTGG、
鸡肉的环引物1：TGTGTGATGGGAGGTATCTAGATT、
鸡肉的环引物2：CCCAAACCCACCTAGAGGAG。
（3）特定肉制品的LAMP法检测试剂盒中的猪肉引物，包括六种引物如下，
猪肉的内引物1：CAGGCTCCTCTAGGTGGATGTTTTTCGCAACTGCCTAAAACTC、
猪肉的内引物2：TCGATAAACCCCGATAGACCTTTTTTTAGGGTTTGCTGAAGATGG、
猪肉的外引物1：CAAAACTATTCGCCAGAGTAC、
猪肉的外引物2：ATTGTGCTTACTATTGTTCCTT、
猪肉的环引物1：AGCACCGCCAAGTCCTTT、
猪肉的环引物2：CCAACCCTTGCCAATTCAGCCTAT。
（4）特定肉制品的LAMP法检测试剂盒中的兔肉引物，包括六种引物如下，
兔肉的内引物1：GGAAGGCTATGTCAGGAGCCTTTTTATAATTGGAGGCTTCGGGA、
兔肉的内引物2：CATTCCTTCTTCTACTAGCCTCCTTTTTGGTGGATAAACAGTTCAGC、
兔肉的外引物1：ACATGCCTTTGTAATAATCTTCT、
兔肉的外引物2：GCATGTGCAAGATTACCG、
兔肉的环引物1：TGACCGAACAGGGGGACT、
兔肉的环引物2：AGTAGAAGCTGGGGCGGGGA。
（5）特定肉制品的LAMP法检测试剂盒中的羊肉引物，包括六种引物如下，
羊肉的内引物1：
ATGTGGTTATAGCCCCTAGACATAATTTTCCGGTTTTATCCACTAACAGAA、
羊肉的内引物2：TATGCGCCCTCACCCAAAATTTTTTTACTATTATGAGGCCGAGTT、
羊肉的外引物1：AGCAGGCATCTTCCTACT、
羊肉的外引物2：GGGGTTGATTAATTCCGATTG、
羊肉的环引物1：GTTATTTAAACCGGTTAG、
羊肉的环引物2：AATTATCGCTTTCTCTACATCCAGC。
本发明的优点：公开号为CN101591713B和CN101225447B的中国专利了用LAMP方法检测两种病毒分别的两种内引物和两种外引物，这些引物不能用于LAMP方法检测肉类。
本发明提供了LAMP方法检测牦牛肉的两种内引物和两种外引物，而且还提供了两种环引物，用检测牦牛肉的反应液A-1和反应液B组成LAMP方法检测被检物品中是否有牦牛肉；
本发明提供了LAMP方法检测鸡肉的两种内引物和两种外引物，而且还提供了两种环引物，用检测鸡肉的反应液A-2和反应液B组成LAMP方法检测被检物品中是否有鸡肉；
本发明提供了LAMP方法检测猪肉的两种内引物和两种外引物，而且还提供了两种环引物，用检测猪肉的反应液A-3和反应液B组成LAMP方法检测被检物品中是否有猪肉。
本发明提供了LAMP方法检测兔肉的两种内引物和两种外引物，而且还提供了两种环引物，用检测兔肉的反应液A-4和反应液B组成LAMP方法检测被检物品中是否有兔肉。
本发明提供了LAMP方法检测羊肉的两种内引物和两种外引物，而且还提供了两种环引物，用检测羊肉的反应液A-5和反应液B组成LAMP方法检测被检物品中是否有羊肉。
本试剂盒根据牦牛、鸡、猪、兔和羊五种肉类的基因保守区的6个序列分别设计了特异性的两种内引物、两种外引物和两种环引物。环引物的作用是提高反应液A与反应液B的反应速度，使用本发明可快速的对某种肉类进行有无的检测。本发明的环引物对检测反应起到促进LAMP扩增效率的作用，并且反应的灵敏度较高，并且特异性较好，具有准确、快捷和简便的特点，对产物鉴定的方法更为直观快速，适合作为肉制品掺假的治法工具在基层推广。
目前采用LAMP法鉴定肉类仅在生鲜肉基础上，对于经过加工处理后的肉制品LAMP检测法未见报道。而且本发明与这些生鲜肉LAMP检测的区别是用了不同的内引物和外引物，而且还用了环引物。环状引物的作用机理是通过与茎环结构杂交，启动链置换DNA的合成，虽然内引物和环状引物都能和茎环结构杂交，但是它们的反应机制是不同的。因此，茎环DNA能与内引物杂交结合，和与环状引物杂交结合，从而加快了反应速度，适合作为肉制品掺假的治法工具在基层推广。
具体实施方式
下述的实施例用于进一步说明本发明，但不作为本发明内容的限止。
实施例1，检测是否有牦牛肉的LAMP法检测试剂盒以及检测是否有牦牛肉的方法
一、制备试剂盒
［1］检测牦牛肉的反应液A-1：每管23.000 μl的组成及配合比如下，
2.500 μl 的10×Lamp buffer、
1.000 μl 的Bst DNA聚合酶8U/μl、
3.500 μl 的10mM dNTP、
1.000 μl的20μM牦牛肉的内引物1：
GGTAACTTGTTCCGTTGATCAAATTTTTTTAAAGACTAGACCTACAAGTCA、
1.000 μl的20μM牦牛肉的内引物2：
TAGGGATAACAGCGCAATCCTTTTTATGTCCTGATCCAACATCG、
0.125 μl的20μM牦牛肉的外引物1：AAAAAATCCTCCGAACGATT、
0.125 μl的20μM牦牛肉的外引物2：GATAGCGGTTGCACCATC、
0.500 μl的20μM牦牛肉的环引物1：GGATCAATGAGCGATAGAGTGATT、
0.500 μl的20μM牦牛肉的环引物2：TAAGAGTCCATATCGACAATAGGGT、
4.000 μl 的25mM MgCl2 、
4.000 μl 的5M甜菜碱、
余量为灭菌蒸馏水；
其中，10×Lamp buffer含有200mM三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐/ pH 8.8、 100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1%曲拉通X-100；
［2］反应液B：1000×的荧光染料 SYBR Green Ⅰ。
二、检测待检肉品中是否有牦牛肉
（1）肉品中DNA的提取：
A．取肉品0.100g，常温条件下研磨至肉粉末状，将肉粉末置于1.500ml离心管中，加入500.000 μl的 STE液体，20.000μl的体积比10%SDS液体，15.000 μl 的20mg/ml蛋白酶K ,在56℃ 水浴1-3h；
B.加入到500.000μl 酚-氯仿-异戊醇的混合液中，混匀后，用10000rpm离心机进行离心4min；其中 酚-氯仿-异戊醇混合液的体积比为酚25：氯仿24：异戊醇1；
C.吸取离心的上层取DNA，加入到500.000 μl氯仿-异戊醇混合液中，用10000rpm离心机进行离心3min；其中氯仿-异戊醇混合液的体积比为氯仿24：异戊醇1；
D. 吸取离心的上层取DNA，加入50.000 μl的 5mol/l NaCl和1000.000 μl无水乙醇的混合液中混匀后，用10000rpm离心机进行离心3min,弃乙醇；弃乙醇的方法就是倾倒离心管中的上清液，而保留离心管中的的沉淀物；
E．将弃乙醇的余物加入500.000 μl的体积比 70%乙醇之中，用10000rpm离心机进行离心1min,弃乙醇；
F．完全去除乙醇后，加入100.000μl 灭菌蒸馏水，获得肉品的DNA模板备用；
（2）用LAMP法即环介导等温法扩增DNA：
在装有23.000 μl检测牦牛肉的反应液A-1的反应管中加入2.000 μl 待检肉品的DNA模板，于65℃恒温水浴锅中60min后，再置于80℃恒温水浴锅中5min，获得检测牦牛肉的反应液A-1肉品的扩增DNA产物；
（3）对肉品的扩增DNA产物的显色检测是否有牦牛肉：
采用荧光染料法检测，常温状态下，在上述检测牦牛肉的反应液A-1肉品的扩增DNA产物加入1.000 μl反应液B进行常温显色反应，反应后直接用肉眼观察；
有检测牦牛肉的反应液A-1肉品的扩增DNA产物的液体颜色若为绿色则说明含有牦牛肉，颜色若为黄色则说明没有牦牛肉。
实施例2，检测是否有鸡肉的LAMP法检测试剂盒以及检测是否有鸡肉的方法
一、制备试剂盒
［1］检测鸡肉的反应液A-2：每管23.000 μl的组成及配合比如下，
2.500 μl 的10×Lamp buffer、
1.000 μl 的Bst DNA聚合酶8U/μl、
3.500 μl 的10mM dNTP、
1.000 μl的20μM鸡肉的内引物1：
TGCTCGTAGTTCTCAGGCGGATTTTTCCCACTATGCCTAGCCCTA、
1.000 μl的20μM鸡肉的内引物2：
AACTCTAAGGACTTGGCGGTGCTTTTGGTGGTTGGGTGAATCGTG、
0.125 μl的20μM鸡肉的外引物1：AAAGCTAGGACCCAAACTGG、
0.125 μl的20μM鸡肉的外引物2：GGTATGTAGGCTGTGCTGG、
0.500 μl的20μM鸡肉的环引物1：TGTGTGATGGGAGGTATCTAGATT、
0.500 μl的20μM鸡肉的环引物2：CCCAAACCCACCTAGAGGAG、
4.000 μl 的25mM MgCl2 、
4.000 μl 的5M甜菜碱、
余量为灭菌蒸馏水；
其中，10×Lamp buffer含有200mM三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐/ pH 8.8、 100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1%曲拉通X-100；
［2］反应液B：1000×的荧光染料 SYBR Green Ⅰ。
二、检测待检肉品中是否有鸡肉
（1）肉品中DNA的提取：
A．取肉品0.100g，常温条件下研磨至肉粉末状，将肉粉末置于1.500ml离心管中，加入500.000 μl的 STE液体，20.000μl的体积比10%SDS液体，15.000 μl 的20mg/ml蛋白酶K ,在56℃ 水浴1-3h；
B.加入到500.000μl 酚-氯仿-异戊醇的混合液中，混匀后，用10000rpm离心机进行离心4min；其中 酚-氯仿-异戊醇混合液的体积比为酚25：氯仿24：异戊醇1；
C.吸取离心的上层取DNA，加入到500.000 μl氯仿-异戊醇混合液中，用10000rpm离心机进行离心3min；其中氯仿-异戊醇混合液的体积比为氯仿24：异戊醇1；
D. 吸取离心的上层取DNA，加入50.000 μl的 5mol/l NaCl和1000.000 μl无水乙醇的混合液中混匀后，用10000rpm离心机进行离心3min,弃乙醇；弃乙醇的方法就是倾倒离心管中的上清液，而保留离心管中的的沉淀物；
E．将弃乙醇的余物加入500.000 μl的体积比 70%乙醇之中，用10000rpm离心机进行离心1min,弃乙醇；
F．完全去除乙醇后，加入100.000μl 灭菌蒸馏水，获得肉品的DNA模板备用；
（2）用LAMP法即环介导等温法扩增DNA：
在装有23.000 μl检测鸡肉的反应液A-2加入2.000 μl 待检肉品的DNA模板，于65℃恒温水浴锅中60min后，再置于80℃恒温水浴锅中5min，获得检测鸡肉的反应液A-2肉品的扩增DNA产物肉品的扩增DNA产物；
（3）对肉品的扩增DNA产物的显色检测是否有鸡肉：
采用荧光染料法检测，常温状态下，在上述检测鸡肉的反应液A-2肉品的扩增DNA产物加入1.000 μl反应液B进行常温显色反应，反应后直接用肉眼观察；
有检测鸡肉的反应液A-2肉品的扩增DNA产物的液体颜色若为绿色则说明含有鸡肉，颜色若为黄色则说明没有鸡肉。
实施例3，检测是否有猪肉的LAMP法检测试剂盒以及检测是否有猪肉的方法
一、制备试剂盒
［1］检测猪肉的反应液A-3：每管23.000 μl的组成及配合比如下，
2.500 μl 的10×Lamp buffer、
1.000 μl 的Bst DNA聚合酶8U/μl、
3.500 μl 的10mM dNTP、
1.000 μl的20μM猪肉的内引物1：
CAGGCTCCTCTAGGTGGATGTTTTTCGCAACTGCCTAAAACTC、
1.000 μl的20μM猪肉的内引物2：
TCGATAAACCCCGATAGACCTTTTTTTAGGGTTTGCTGAAGATGG、
0.125 μl的20μM猪肉的外引物1：CAAAACTATTCGCCAGAGTAC、
0.125 μl的20μM猪肉的外引物2：ATTGTGCTTACTATTGTTCCTT、
0.500 μl的20μM猪肉的环引物1：AGCACCGCCAAGTCCTTT、
0.500 μl的20μM猪肉的环引物2：CCAACCCTTGCCAATTCAGCCTAT、
4.000 μl 的25mM MgCl2 、
4.000 μl 的5M甜菜碱、
余量为灭菌蒸馏水；
其中，10×Lamp buffer含有200mM三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐/ pH 8.8、 100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1%曲拉通X-100；
［2］反应液B：1000×的荧光染料 SYBR Green Ⅰ。
二、检测待检肉品中是否有猪肉
（1）肉品中DNA的提取：
A．取肉品0.100g，常温条件下研磨至肉粉末状，将肉粉末置于1.500ml离心管中，加入500.000 μl的 STE液体，20.000μl的体积比10%SDS液体，15.000 μl 的20mg/ml蛋白酶K ,在56℃ 水浴1-3h；
B.加入到500.000μl 酚-氯仿-异戊醇的混合液中，混匀后，用10000rpm离心机进行离心4min；其中 酚-氯仿-异戊醇混合液的体积比为酚25：氯仿24：异戊醇1；
C.吸取离心的上层取DNA，加入到500.000 μl氯仿-异戊醇混合液中，用10000rpm离心机进行离心3min；其中氯仿-异戊醇混合液的体积比为氯仿24：异戊醇1；
D. 吸取离心的上层取DNA，加入50.000 μl的 5mol/l NaCl和1000.000 μl无水乙醇的混合液中混匀后，用10000rpm离心机进行离心3min,弃乙醇；弃乙醇的方法就是倾倒离心管中的上清液，而保留离心管中的的沉淀物；
E．将弃乙醇的余物加入500.000 μl的体积比 70%乙醇之中，用10000rpm离心机进行离心1min,弃乙醇；
F．完全去除乙醇后，加入100.000μl 灭菌蒸馏水，获得肉品的DNA模板备用；
（2）用LAMP法即环介导等温法扩增DNA：
在装有23.000 μl检测猪肉的反应液A-3的反应管中加入2.000 μl 待检肉品的DNA模板，于65℃恒温水浴锅中60min后，再置于80℃恒温水浴锅中5min，获得检测猪肉的反应液A-3肉品的扩增DNA产物；
（3）对肉品的扩增DNA产物的显色检测是否有猪肉：
采用荧光染料法检测，常温状态下，在上述检测猪肉的反应液A-3肉品的扩增DNA产物中加入1.000 μl反应液B进行常温显色反应，反应后直接用肉眼观察；
有检测猪肉的反应液A-3肉品的扩增DNA产物的液体颜色若为绿色则说明含有猪肉；颜色若为黄色则说明没有猪肉。
实施例4，检测是否有兔肉的LAMP法检测试剂盒以及检测是否有兔肉的方法
一、制备试剂盒
［1］检测兔肉的反应液A-4：每管23.000 μl的组成及配合比如下，
2.500 μl 的10×Lamp buffer、
1.000 μl 的Bst DNA聚合酶8U/μl、
3.500 μl 的10mM dNTP、
1.000 μl的20μM兔肉的内引物1：
GGAAGGCTATGTCAGGAGCCTTTTTATAATTGGAGGCTTCGGGA、
1.000 μl的20μM兔肉的内引物2：
CATTCCTTCTTCTACTAGCCTCCTTTTTGGTGGATAAACAGTTCAGC、
0.125 μl的20μM兔肉的外引物1：ACATGCCTTTGTAATAATCTTCT、
0.125 μl的20μM兔肉的外引物2：GCATGTGCAAGATTACCG、
0.500 μl的20μM兔肉的环引物1：TGACCGAACAGGGGGACT、
0.500 μl的20μM兔肉的环引物2：AGTAGAAGCTGGGGCGGGGA、
4.000 μl 的25mM MgCl2 、
4.000 μl 的5M甜菜碱、
余量为灭菌蒸馏水；
其中，10×Lamp buffer含有200mM三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐/ pH 8.8、 100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1%曲拉通X-100；
［2］反应液B：1000×的荧光染料 SYBR Green Ⅰ。
二、检测待检肉品中是否有兔肉
（1）肉品中DNA的提取：
A．取肉品0.100g，常温条件下研磨至肉粉末状，将肉粉末置于1.500ml离心管中，加入500.000 μl的 STE液体，20.000μl的体积比10%SDS液体，15.000 μl 的20mg/ml蛋白酶K ,在56℃ 水浴1-3h；
B.加入到500.000μl 酚-氯仿-异戊醇的混合液中，混匀后，用10000rpm离心机进行离心4min；其中 酚-氯仿-异戊醇混合液的体积比为酚25：氯仿24：异戊醇1；
C.吸取离心的上层取DNA，加入到500.000 μl氯仿-异戊醇混合液中，用10000rpm离心机进行离心3min；其中氯仿-异戊醇混合液的体积比为氯仿24：异戊醇1；
D. 吸取离心的上层取DNA，加入50.000 μl的 5mol/l NaCl和1000.000 μl无水乙醇的混合液中混匀后，用10000rpm离心机进行离心3min,弃乙醇；弃乙醇的方法就是倾倒离心管中的上清液，而保留离心管中的的沉淀物；
E．将弃乙醇的余物加入500.000 μl的体积比 70%乙醇之中，用10000rpm离心机进行离心1min,弃乙醇；
F．完全去除乙醇后，加入100.000μl 灭菌蒸馏水，获得肉品的DNA模板备用；
（2）用LAMP法即环介导等温法扩增DNA：
在装有23.000 μl检测兔肉的反应液A-4的反应管中加入2.000 μl 待检肉品的DNA模板，于65℃恒温水浴锅中60min后，再置于80℃恒温水浴锅中5min，获得检测兔肉的反应液A-4肉品的扩增DNA产物；
（3）对肉品的扩增DNA产物的显色检测是否有兔肉：
采用荧光染料法检测，常温状态下，在上述检测检测兔肉的反应液A-4肉品的扩增DNA产物中加入1.000 μl反应液B进行常温显色反应，反应后直接用肉眼观察；
有检测兔肉的反应液A-4肉品的扩增DNA产物的液体颜色若为绿色则说明含有兔肉；颜色若为黄色则说明没有兔肉。
实施例5，检测是否有羊肉的LAMP法检测试剂盒以及检测是否有羊肉的方法
一、制备试剂盒
［1］检测羊肉的反应液A-5：每管23.000 μl的组成及配合比如下，
2.500 μl 的10×Lamp buffer、
1.000 μl 的Bst DNA聚合酶8U/μl、
3.500 μl 的10mM dNTP、
1.000 μl的20μM羊肉的内引物1：
ATGTGGTTATAGCCCCTAGACATAATTTTCCGGTTTTATCCACTAACAGAA、
1.000 μl的20μM羊肉的内引物2：
TATGCGCCCTCACCCAAAATTTTTTTACTATTATGAGGCCGAGTT、
0.125 μl的20μM羊肉的外引物1：AGCAGGCATCTTCCTACT、
0.125 μl的20μM羊肉的外引物2：GGGGTTGATTAATTCCGATTG、
0.500 μl的20μM羊肉的环引物1：GTTATTTAAACCGGTTAG、
0.500 μl的20μM羊肉的环引物2：AATTATCGCTTTCTCTACATCCAGC、
4.000 μl 的25mM MgCl2 、
4.000 μl 的5M甜菜碱、
余量为灭菌蒸馏水；
其中，10×Lamp buffer含有200mM三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐/ pH 8.8、 100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1%曲拉通X-100；
［2］反应液B：1000×的荧光染料 SYBR Green Ⅰ。
二、检测待检肉品中是否有羊肉
（1）肉品中DNA的提取：
A．取肉品0.100g，常温条件下研磨至肉粉末状，将肉粉末置于1.500ml离心管中，加入500.000 μl的 STE液体，20.000μl的体积比10%SDS液体，15.000 μl 的20mg/ml蛋白酶K ,在56℃ 水浴1-3h；
B.加入到500.000μl 酚-氯仿-异戊醇的混合液中，混匀后，用10000rpm离心机进行离心4min；其中 酚-氯仿-异戊醇混合液的体积比为酚25：氯仿24：异戊醇1；
C.吸取离心的上层取DNA，加入到500.000 μl氯仿-异戊醇混合液中，用10000rpm离心机进行离心3min；其中氯仿-异戊醇混合液的体积比为氯仿24：异戊醇1；
D. 吸取离心的上层取DNA，加入50.000 μl的 5mol/l NaCl和1000.000 μl无水乙醇的混合液中混匀后，用10000rpm离心机进行离心3min,弃乙醇；弃乙醇的方法就是倾倒离心管中的上清液，而保留离心管中的的沉淀物；
E．将弃乙醇的余物加入500.000 μl的体积比 70%乙醇之中，用10000rpm离心机进行离心1min,弃乙醇；
F．完全去除乙醇后，加入100.000μl 灭菌蒸馏水，获得肉品的DNA模板备用；
（2）用LAMP法即环介导等温法扩增DNA：
在装有23.000 μl检测羊肉的反应液A-5的反应管中加入2.000 μl 待检肉品的DNA模板，于65℃恒温水浴锅中60min后，再置于80℃恒温水浴锅中5min，获得检测羊肉的反应液A-5肉品的扩增DNA产物；
（3）对肉品的扩增DNA产物的显色检测是否有羊肉：
采用荧光染料法检测，常温状态下，在上述检测检测羊肉的反应液A-5肉品的扩增DNA产物中加入1.000 μl反应液B进行常温显色反应，反应后直接用肉眼观察；
有检测羊肉的反应液A-5肉品的扩增DNA产物的液体颜色若为绿色则说明含有羊肉；颜色若为黄色则说明没有羊肉。
实施例6、特定肉制品的LAMP法检测试剂盒中的牦牛肉引物，包括六种引物如下，
牦牛肉的内引物1：
GGTAACTTGTTCCGTTGATCAAATTTTTTTAAAGACTAGACCTACAAGTCA、
牦牛肉的内引物2：TAGGGATAACAGCGCAATCCTTTTTATGTCCTGATCCAACATCG、
牦牛肉的外引物1：AAAAAATCCTCCGAACGATT、
牦牛肉的外引物2：GATAGCGGTTGCACCATC、
牦牛肉的环引物1：GGATCAATGAGCGATAGAGTGATT、
牦牛肉的环引物2：TAAGAGTCCATATCGACAATAGGGT。
实施例7、特定肉制品的LAMP法检测试剂盒中的鸡肉引物，包括六种引物如下，
鸡肉的内引物1：TGCTCGTAGTTCTCAGGCGGATTTTTCCCACTATGCCTAGCCCTA、
鸡肉的内引物2：AACTCTAAGGACTTGGCGGTGCTTTTGGTGGTTGGGTGAATCGTG、
鸡肉的外引物1：AAAGCTAGGACCCAAACTGG、
鸡肉的外引物2：GGTATGTAGGCTGTGCTGG、
鸡肉的环引物1：TGTGTGATGGGAGGTATCTAGATT、
鸡肉的环引物2：CCCAAACCCACCTAGAGGAG。
实施例8、特定肉制品的LAMP法检测试剂盒中的猪肉引物，包括六种引物如下，
猪肉的内引物1：CAGGCTCCTCTAGGTGGATGTTTTTCGCAACTGCCTAAAACTC、
猪肉的内引物2：TCGATAAACCCCGATAGACCTTTTTTTAGGGTTTGCTGAAGATGG、
猪肉的外引物1：CAAAACTATTCGCCAGAGTAC、
猪肉的外引物2：ATTGTGCTTACTATTGTTCCTT、
猪肉的环引物1：AGCACCGCCAAGTCCTTT、
猪肉的环引物2：CCAACCCTTGCCAATTCAGCCTAT。
实施例9、特定肉制品的LAMP法检测试剂盒中的兔肉引物，包括六种引物如下，
兔肉的内引物1：GGAAGGCTATGTCAGGAGCCTTTTTATAATTGGAGGCTTCGGGA、
兔肉的内引物2：CATTCCTTCTTCTACTAGCCTCCTTTTTGGTGGATAAACAGTTCAGC、
兔肉的外引物1：ACATGCCTTTGTAATAATCTTCT、
兔肉的外引物2：GCATGTGCAAGATTACCG、
兔肉的环引物1：TGACCGAACAGGGGGACT、
兔肉的环引物2：AGTAGAAGCTGGGGCGGGGA。
实施例10、特定肉制品的LAMP法检测试剂盒中的羊肉引物，包括六种引物如下，
羊肉的内引物1：
ATGTGGTTATAGCCCCTAGACATAATTTTCCGGTTTTATCCACTAACAGAA、
羊肉的内引物2：TATGCGCCCTCACCCAAAATTTTTTTACTATTATGAGGCCGAGTT、
羊肉的外引物1：AGCAGGCATCTTCCTACT、
羊肉的外引物2：GGGGTTGATTAATTCCGATTG、
羊肉的环引物1：GTTATTTAAACCGGTTAG、
羊肉的环引物2：AATTATCGCTTTCTCTACATCCAGC。
<110> 西南民族大学 唐善虎
<120> 特定肉制品的LAMP法检测试剂盒及检测方法
<130> 发文序号：201207300773470
<140> 中国专利申请号201210187031.3
<141> 2012-06-08
<160> 30
<210> 1
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 牦牛肉的内引物1
<222> （1）…（51）
<400> 1
GGTAACTTGTTCCGTTGATCAAATTTTTTTAAAGACTAGACCTACAAGTCA
<210> 2
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 牦牛肉的内引物2
<222> （1）…（44）
<400> 2
TAGGGATAACAGCGCAATCCTTTTTATGTCCTGATCCAACATCG
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 牦牛肉的外引物1
<222> （1）…（20）
<400> 3
AAAAAATCCTCCGAACGATT
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 牦牛肉的外引物2
<222> （1）…（18）
<400> 4
GATAGCGGTTGCACCATC
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 牦牛肉的环引物1
<222> （1）…（24）
<400> 5
GGATCAATGAGCGATAGAGTGATT
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 牦牛肉的环引物2
<222> （1）…（25）
<400> 6
TAAGAGTCCATATCGACAATAGGGT
<210> 7
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 鸡肉的内引物1
<222> （1）…（45）
<400> 7
TGCTCGTAGTTCTCAGGCGGATTTTTCCCACTATGCCTAGCCCTA
<210> 8
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 鸡肉的内引物2
<222> （1）…（45）
<400> 8
AACTCTAAGGACTTGGCGGTGCTTTT5GGTGGTTGGGTGAATCGTG
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 鸡肉的外引物1
<222> （1）…（20）
<400> 9
AAAGCTAGGACCCAAACTGG
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 鸡肉的外引物2
<222> （1）…（19）
<400> 10
GGTATGTAGGCTGTGCTGG
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 鸡肉的环引物1
<222> （1）…（24）
<400> 11
TGTGTGATGGGAGGTATCTAGATT
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 鸡肉的环引物2
<222> （1）…（20）
<400> 12
CCCAAACCCACCTAGAGGAG
<210> 13
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 猪肉的内引物1
<222> （1）…（43）
<400> 13
CAGGCTCCTCTAGGTGGATGTTTTTCGCAACTGCCTAAAACTC
<210> 14
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 猪肉的内引物2
<222> （1）…（45）
<400> 14
TCGATAAACCCCGATAGACCTTTTTTTAGGGTTTGCTGAAGATGG
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 猪肉的外引物1
<222> （1）…（21）
<400> 15
CAAAACTATTCGCCAGAGTAC
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 猪肉的外引物2
<222> （1）…（22）
<400> 16
ATTGTGCTTACTATTGTTCCTT
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 猪肉的环引物1
<222> （1）…（18）
<400> 17
AGCACCGCCAAGTCCTTT
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 猪肉的环引物2
<222> （1）…（24）
<400> 18
CCAACCCTTGCCAATTCAGCCTAT
<210> 19
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 兔肉的内引物1
<222> （1）…（44）
<400> 19
GGAAGGCTATGTCAGGAGCCTTTTTATAATTGGAGGCTTCGGGA
<210> 20
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 兔肉的内引物2
<222> （1）…（47）
<400> 20
CATTCCTTCTTCTACTAGCCTCCTTTTTGGTGGATAAACAGTTCAGC
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 兔肉的外引物1
<222> （1）…（23）
<400> 21
ACATGCCTTTGTAATAATCTTCT
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 兔肉的外引物2
<222> （1）…（18）
<400> 22
GCATGTGCAAGATTACCG
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 兔肉的环引物1
<222> （1）…（18）
<400> 23
TGACCGAACAGGGGGACT
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 兔肉的环引物2
<222> （1）…（20）
<400> 24
AGTAGAAGCTGGGGCGGGGA
<210> 25
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 羊肉的内引物1
<222> （1）…（51）
<400> 25
ATGTGGTTATAGCCCCTAGACATAATTTTCCGGTTTTATCCACTAACAGAA
<210> 26
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 羊肉的内引物2
<222> （1）…（45）
<400> 26
TATGCGCCCTCACCCAAAATTTTTTTACTATTATGAGGCCGAGTT
<210> 27
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 羊肉的外引物1
<222> （1）…（18）
<400> 27
AGCAGGCATCTTCCTACT
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 羊肉的内引物2
<222> （1）…（21）
<400> 28
GGGGTTGATTAATTCCGATTG
<210> 29
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 羊肉的环引物1
<222> （1）…（18）
<400> 29
GTTATTTAAACCGGTTAG
<210> 30
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 羊肉的环引物2
<222> （1）…（25）
<400> 30
AATTATCGCTTTCTCTACATCCAGC
Claims (7)
1.特定肉制品的LAMP法检测试剂盒，包括五组相互独立的A型反应液，该五组相互独立的A型反应液是检测牦牛肉的反应液A-1、检测鸡肉的反应液A-2、检测猪肉的反应液A-3、检测兔肉的反应液A-4或检测羊肉的反应液A-5，还包括能与该五组相互独立A型反应液分别反应的反应液B；各反应液的成分和配合比如下：
（1）检测牦牛肉的反应液A-1：每管23.000 μl的组成及配合比如下，
2.500 μl 的10×Lamp buffer、
1.000 μl 的Bst DNA聚合酶8U/μl、
3.500 μl 的10mM dNTP、
1.000 μl的20μM牦牛肉的内引物1：
GGTAACTTGTTCCGTTGATCAAATT-TTTT-TAAAGACTAGACCTACAAGTCA、
1.000 μl的20μM牦牛肉的内引物2：
TAGGGATAACAGCGCAATCCT-TTTT-ATGTCCTGATCCAACATCG、
0.125 μl的20μM牦牛肉的外引物1：AAAAAATCCTCCGAACGATT、
0.125 μl的20μM牦牛肉的内引物2：GATAGCGGTTGCACCATC、
0.500 μl的20μM牦牛肉的环引物1：GGATCAATGAGCGATAGAGTGATT、
0.500 μl的20μM牦牛肉的环引物2：TAAGAGTCCATATCGACAATAGGGT、
4.000 μl 的25mM MgCl2 、
4.000 μl 的5M甜菜碱、
余量为灭菌蒸馏水；
其中，10×Lamp buffer含有200mM三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐/ pH 8.8、 100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1%曲拉通X-100；
（2）检测鸡肉的反应液A-2：每管23.000 μl的组成及配合比如下，
2.500 μl 的10×Lamp buffer、
1.000 μl 的Bst DNA聚合酶8U/μl、
3.500 μl 的10mM dNTP、
1.000 μl的20μM鸡肉的内引物1：
TGCTCGTAGTTCTCAGGCGGAT-TTTT-CCCACTATGCCTAGCCCTA、
1.000 μl的20μM鸡肉的内引物2：
AACTCTAAGGACTTGGCGGTGC-TTTT-GGTGGTTGGGTGAATCGTG、
0.125 μl的20μM鸡肉的外引物1：AAAGCTAGGACCCAAACTGG、
0.125 μl的20μM鸡肉的内引物2：GGTATGTAGGCTGTGCTGG、
0.500 μl的20μM鸡肉的环引物1：TGTGTGATGGGAGGTATCTAGATT、
0.500 μl的20μM鸡肉的环引物2：CCCAAACCCACCTAGAGGAG、
4.000 μl 的25mM MgCl2 、
4.000 μl 的5M甜菜碱、
余量为灭菌蒸馏水；
其中，10×Lamp buffer含有200mM三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐/ pH 8.8、 100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1%曲拉通X-100；
（3）检测猪肉的反应液A-3：每管23.000 μl的组成及配合比如下，
2.500 μl 的10×Lamp buffer、
1.000 μl 的Bst DNA聚合酶8U/μl、
3.500 μl 的10mM dNTP、
1.000 μl的20μM猪肉的内引物1：
CAGGCTCCTCTAGGTGGATG-TTTT-TCGCAACTGCCTAAAACTC、
1.000 μl的20μM猪肉的内引物2：
TCGATAAACCCCGATAGACCTT-TTTT-TAGGGTTTGCTGAAGATGG、
0.125 μl的20μM猪肉的外引物1：CAAAACTATTCGCCAGAGTAC、
0.125 μl的20μM猪肉的内引物2：ATTGTGCTTACTATTGTTCCTT、
0.500 μl的20μM猪肉的环引物1：AGCACCGCCAAGTCCTTT、
0.500 μl的20μM猪肉的环引物2：CCAACCCTTGCCAATTCAGCCTAT、
4.000 μl 的25mM MgCl2 、
4.000 μl 的5M甜菜碱、
余量为灭菌蒸馏水；
其中，10×Lamp buffer含有200mM三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐/ pH 8.8、 100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1%曲拉通X-100；
（4）检测兔肉的反应液A-4：每管23.000 μl的组成及配合比如下，
2.500 μl 的10×Lamp buffer、
1.000 μl 的Bst DNA聚合酶8U/μl、
3.500 μl 的10mM dNTP、
1.000 μl的20μM兔肉的内引物1：
GGAAGGCTATGTCAGGAGCC-TTTT-TATAATTGGAGGCTTCGGGA、
1.000 μl的20μM兔肉的内引物2：
CATTCCTTCTTCTACTAGCCTCCT-TTTT-GGTGGATAAACAGTTCAGC、
0.125 μl的20μM兔肉的外引物1：ACATGCCTTTGTAATAATCTTCT、
0.125 μl的20μM兔肉的内引物2：GCATGTGCAAGATTACCG、
0.500 μl的20μM兔肉的环引物1：TGACCGAACAGGGGGACT、
0.500 μl的20μM兔肉的环引物2：AGTAGAAGCTGGGGCGGGGA、
4.000 μl 的25mM MgCl2 、
4.000 μl 的5M甜菜碱、
余量为灭菌蒸馏水；
其中，10×Lamp buffer含有200mM三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐/ pH 8.8、 100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1%曲拉通X-100；
（5）检测羊肉的反应液A-5：每管23.000 μl的组成及配合比如下，
2.500 μl 的10×Lamp buffer、
1.000 μl 的Bst DNA聚合酶8U/μl、
3.500 μl 的10mM dNTP、
1.000 μl的20μM羊肉的内引物1：
ATGTGGTTATAGCCCCTAGACATAA-TTTT-CCGGTTTTATCCACTAACAGAA、
1.000 μl的20μM羊肉的内引物2：
TATGCGCCCTCACCCAAAAT-TTTT-TTACTATTATGAGGCCGAGTT、
0.125 μl的20μM羊肉的外引物1：AGCAGGCATCTTCCTACT、
0.125 μl的20μM羊肉的内引物2：GGGGTTGATTAATTCCGATTG、
0.500 μl的20μM羊肉的环引物1：GTTATTTAAACCGGTTAG、
0.500 μl的20μM羊肉的环引物2：AATTATCGCTT TCTCTACATC CAGC、
4.000 μl 的25mM MgCl2 、
4.000 μl 的5M甜菜碱、
余量为灭菌蒸馏水；
其中，10×Lamp buffer含有200mM三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐/ pH 8.8、 100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1%曲拉通X-100；
（6）反应液B：1000×的荧光染料 SYBR Green Ⅰ。
2.根据权利要求1所述的特定肉制品的LAMP法检测试剂盒的检测方法，其步骤包括：
（1）肉品中DNA的提取：
A．取肉品0.100g，常温条件下研磨至肉粉末状，将肉粉末置于1.500ml离心管中，加入500.000 μl的 STE液体，20.000μl的体积比10%SDS液体，15.000 μl 的20mg/ml蛋白酶K ,在56℃ 水浴1-3h；
B.加入到500.000μl 酚-氯仿-异戊醇的混合液中，混匀后，用10000rpm离心机进行离心4min；其中 酚-氯仿-异戊醇混合液的体积比为酚25：氯仿24：异戊醇1；
C.吸取离心的上层取DNA，加入到500.000 μl氯仿-异戊醇混合液中，用10000rpm离心机进行离心3min；其中氯仿-异戊醇混合液的体积比为氯仿24：异戊醇1；
D. 吸取离心的上层取DNA，加入50.000 μl的 5mol/l NaCl和1000.000 μl无水乙醇的混合液中混匀后，用10000rpm离心机进行离心3min,弃乙醇；弃乙醇的方法就是倾倒离心管中的上清液，而保留离心管中的的沉淀物；
E．将弃乙醇的余物加入500.000 μl的体积比 70%乙醇之中，用10000rpm离心机进行离心1min,弃乙醇；
F．完全去除乙醇后，加入100.000μl 灭菌蒸馏水，获得肉品的DNA模板备用；
（2）用LAMP法即环介导等温法扩增DNA：
在装有23.000 μl检测牦牛肉的反应液A-1、或23.000 μl检测鸡肉的反应液A-2、或23.000 μl检测猪肉的反应液A-3、或23.000 μl检测兔肉的反应液A-4、或23.000 μl检测羊肉的反应液A-5的每一个反应管中分别都加入2.000 μl 待检肉品的DNA模板，于65℃恒温水浴锅中60min后，再置于80℃恒温水浴锅中5min，获得检测牦牛肉的反应液A-1肉品的扩增DNA产物、检测鸡肉的反应液A-2肉品的扩增DNA产物、检测猪肉的反应液A-3肉品的扩增DNA产物、检测兔肉的反应液A-4肉品的扩增DNA产物或检测羊肉的反应液A-5肉品的扩增DNA产物；
（3）对肉品的扩增DNA产物的显色检测：
采用荧光染料法检测，常温状态下，在上述检测牦牛肉的反应液A-1肉品的扩增DNA产物、或检测鸡肉的反应液A-2肉品的扩增DNA产物、或检测猪肉的反应液A-3肉品的扩增DNA产物、或检测兔肉的反应液A-4肉品的扩增DNA产物、或检测羊肉的反应液A-5肉品的扩增DNA产物中，分别加入1.000 μl反应液B进行常温显色反应，反应后直接用肉眼观察变色；
有检测牦牛肉的反应液A-1肉品的扩增DNA产物的液体颜色若为绿色则说明含有牦牛肉，颜色若为黄色则说明没有牦牛肉；
有检测鸡肉的反应液A-2肉品的扩增DNA产物的液体颜色若为绿色则说明含有鸡肉，颜色若为黄色则说明没有鸡肉；
有检测猪肉的反应液A-3肉品的扩增DNA产物的液体颜色若为绿色则说明含有猪肉；颜色若为黄色则说明没有猪肉；
有检测兔肉的反应液A-4肉品的扩增DNA产物的液体颜色若为绿色则说明含有兔肉，颜色若为黄色则说明没有兔肉；
有检测羊肉的反应液A-5肉品的扩增DNA产物的液体颜色若为绿色则说明含有羊肉；颜色若为黄色则说明没有羊肉。
3.根据权利要求1所述的特定肉制品的LAMP法检测试剂盒中的牦牛肉引物，包括六种引物如下，
牦牛肉的内引物1：GGTAACTTGTTCCGTTGATCAAATT-TTTT-TAAAGACTAGACCTACAAGTCA、
牦牛肉的内引物2：TAGGGATAACAGCGCAATCCT-TTTT-ATGTCCTGATCCAACATCG、
牦牛肉的外引物1：AAAAAATCCTCCGAACGATT、
牦牛肉的内引物2：GATAGCGGTTGCACCATC、
牦牛肉的环引物1：GGATCAATGAGCGATAGAGTGATT、
牦牛肉的环引物2：TAAGAGTCCATATCGACAATAGGGT。
4.根据权利要求1所述的特定肉制品的LAMP法检测试剂盒中的鸡肉引物，包括六种引物如下，
鸡肉的内引物1：TGCTCGTAGTTCTCAGGCGGAT-TTTT-CCCACTATGCCTAGCCCTA、
鸡肉的内引物2：AACTCTAAGGACTTGGCGGTGC-TTTT-GGTGGTTGGGTGAATCGTG、
鸡肉的外引物1：AAAGCTAGGACCCAAACTGG、
鸡肉的内引物2：GGTATGTAGGCTGTGCTGG、
鸡肉的环引物1：TGTGTGATGGGAGGTATCTAGATT、
鸡肉的环引物2：CCCAAACCCACCTAGAGGAG。
5.根据权利要求1所述的特定肉制品的LAMP法检测试剂盒中的猪肉引物，包括六种引物如下，
猪肉的内引物1：CAGGCTCCTCTAGGTGGATG-TTTT-TCGCAACTGCCTAAAACTC、
猪肉的内引物2：TCGATAAACCCCGATAGACCTT-TTTT-TAGGGTTTGCTGAAGATGG、
猪肉的外引物1：CAAAACTATTCGCCAGAGTAC、
猪肉的内引物2：ATTGTGCTTACTATTGTTCCTT、
猪肉的环引物1：AGCACCGCCAAGTCCTTT、
猪肉的环引物2：CCAACCCTTGCCAATTCAGCCTAT。
6.根据权利要求1所述的特定肉制品的LAMP法检测试剂盒中的兔肉引物，包括六种引物如下，
兔肉的内引物1：GGAAGGCTATGTCAGGAGCC-TTTT-TATAATTGGAGGCTTCGGGA、
兔肉的内引物2：CATTCCTTCTTCTACTAGCCTCCT-TTTT-GGTGGATAAACAGTTCAGC、
兔肉的外引物1：ACATGCCTTTGTAATAATCTTCT、
兔肉的内引物2：GCATGTGCAAGATTACCG、
兔肉的环引物1：TGACCGAACAGGGGGACT、
兔肉的环引物2：AGTAGAAGCTGGGGCGGGGA。
7.根据权利要求1所述的特定肉制品的LAMP法检测试剂盒中的羊肉引物，包括六种引物如下，
羊肉的内引物1：ATGTGGTTATAGCCCCTAGACATAA-TTTT-CCGGTTTTATCCACTAACAGAA、
羊肉的内引物2：TATGCGCCCTCACCCAAAAT-TTTT-TTACTATTATGAGGCCGAGTT、
羊肉的外引物1：AGCAGGCATCTTCCTACT、
羊肉的内引物2：GGGGTTGATTAATTCCGATTG、
羊肉的环引物1：GTTATTTAAACCGGTTAG、
羊肉的环引物2：AATTATCGCTT TCTCTACATC CAGC。
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