CN116024353B - 一种牦牛肉的鉴别方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种环介导等温扩增结合显色剂羟基萘酚蓝鉴别牦牛肉的方法及其应用。包括以下引物：上游外引物F3、下游外引物B3、上游内引物FIP和下游内引物BIP。本发明以显色剂羟基萘酚蓝加入至LAMP体系出现颜色变化从而判定阳性与阴性，进而判断是否含有牦牛源性成分；本发明将环介导等温扩增结合显色剂羟基萘酚蓝对牦牛肉具有高度敏感性和特异性，可检测到1pg/μL的牦牛DNA样本，充分保证阳性样品的检出率。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种环介导等温扩增结合显色剂羟基萘酚蓝(hydroxy naphthol blue,HNB)鉴别牦牛肉的方法及其应用。
背景技术
牦牛是青藏高原上特有的畜种，牦牛肉具有绿色天然、高蛋白、低脂肪含矿物质丰富等优点，具有极高的营养价值，牦牛肉含蛋白22.52％，较其它肉的蛋白质都高，而脂肪仅为3.15％，较其它肉中脂肪含量都低，且矿物质元素含量丰富，含有K、Na、Mg、Ca、Zn、Fe等元素，氨基酸结构比例更与人体相近，对增强人体免疫力有显著作用但牦牛产量有限，市场需求大，大量不法商家为了牟取利益，以其他肉源冒充牦牛肉欺骗消费者，因此建立一种牦牛源性成分快速检测的方法，对打击牦牛肉掺假行为十分重要的意义。
早在上个世纪，不同种类动物的源性成分快速检测鉴别方法被大量研究人员报道。就动物源性肉制品的成分检测来说，当前的最常用、最有效的检测方法有免疫学方法、光谱法、色谱法、常规PCR、基因芯片技术、DNA杂交技术、荧光PCR等。而PCR快速鉴定方法因其具有快捷简便易操作等优点被广泛应用。不管是常规PCR法或是实时荧光PCR法，都需要较为复杂的操作步骤、较长的反应时间和较为昂贵的实验仪器。
环介导等温扩增技术(LAMP)是基于核酸扩增的分子诊断技术，但区别于其他的传统的方法，其核心技术是使用了一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)和2对引物(也可以是3对引物)对特定DNA进行核酸扩增。Bst DNA聚合酶来源于嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶的一部分，由大肠杆菌(E.coli)菌株产生，因其含有来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)DNA聚合酶的基因(该基因缺失了5′→3′外切核酸酶结构域)，同时将麦芽糖结合蛋白(maltose-binding protein,MBP)基因与该基因融合表达。它具有5′→3′DNA聚合酶活性，但不具有5′→3′外切核酸酶活性。因此，与其他DNA聚合酶相比，Bst DNA聚合酶有较强的热稳定性、链置换活性及聚合酶活性，因此更适用于等温扩增中，由于DNA复性以及延伸的温度是恒定的，所以在恒温条件下，如63℃孵育45～60min，即可以完成核酸扩增反应，反应结束后能够直接通过肉眼观察结果，通过观察是否具有白色焦磷酸镁沉淀，从而进行判断。
目前应用于牦牛源性的快速诊断方法较多，但是这些方法大多操作复杂、成本较高、耗时长，难以在基层普及且不适用于现场快速检测。而LAMP以其特有的高敏感性和特异性的优势，已被广泛应用于多种动物源性成分的快速检测研究中，因其成本低廉，操作简便，更适用于现场快速检测，但现今并未广泛推广，究其原因是受限于LAMP结果的判定：通过浊度检测法和琼脂糖凝胶电泳检测法进行结果判定，其需要专门的场所和仪器，多数基层场所不具备此条件或经费，因此，亟需一种灵敏度高、特异性强的鉴别牦牛肉的方法。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种环介导等温扩增结合显色剂羟基萘酚蓝(hydroxy naphthol blue，HNB)鉴别牦牛肉的方法及其应用。本发明以显色剂羟基萘酚蓝加入至LAMP体系出现颜色变化从而判定阳性与阴性，进而判断是否含有牦牛源性成分；本发明将环介导等温扩增结合显色剂羟基萘酚蓝对牦牛肉具有高度敏感性和特异性，可检测到1pg/μL的牦牛DNA样本，充分保证阳性样品的检出率；本发明的方法具有可视化、快速、成本低及操作技术要求低等优点。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
第一目的，本发明提供了一种应用环介导等温扩增检测牦牛肉的检测引物组，包括以下引物：
上游外引物F3：TCGGCACAAATTTAGTCGA；
下游外引物B3：GAATTTTGTCTGCGTCTGA；
上游内引物FIP：TGGAAAGCGAAGAATCGGGTATGGATTTGAGGTGGGTT；
下游内引物BIP：ATTACAGCAATTGCCATAGTCCAGGAGATTCCTGTTGGATTGT。
本发明对牦牛肉的线粒体cytb(cytochrome)基因设计2条外引物和2条内引物，该引物组灵敏度高，特异性强，可以有效扩增牦牛肉的DNA，有效对牦牛源性成分进行检测，且引物之间无非特异性扩增引发的假阳性结果。
优选地，所述检测引物组还包括两条环引物，分别为FLP和BLP；
FLP：GAGTCATCTGTTTCGTTGGGAG；
BLP：ACCTACTATTCCTCCACGAAACA。
上述两条环引物可以缩短体系的反应时间，使得本发明设计的检测引物组可以特异性识别牦牛肉靶序列上的6个独立区域，避免了反复升降温的耗时过程，可实现恒温条件下的连续快速扩增，具有操作简单、快速、特异性强的特点。
作为本发明所述检测引物组的优选实施方式，所述上游外引物F3、所述下游外引物B3、所述上游内引物FIP和所述下游内引物BIP的浓度比为1:1:(1～4):(1～4)。
当上游外引物F3、下游外引物B3、上游内引物FIP和下游内引物BIP采用上述浓度比时，可以较好地提高体系扩增的效率，缩短牦牛肉鉴定的时间。
优选地，所述上游外引物F3、所述下游外引物B3、所述上游内引物FIP和所述下游内引物BIP的浓度比为1:1:3:3。
第二目的，本发明提供了一种牦牛肉的鉴别方法，包括以下步骤：
1)获取待测样品的DNA；
2)以步骤1)提取的DNA为模板，加入上述检测引物组中的引物和羟基萘酚蓝进行环介导等温扩增，获得扩增结果；
3)根据所述扩增结果获得鉴定结果：如果可以实现特异性扩增，则待测样品为牦牛肉。
本发明建立一种牦牛肉的鉴别方法，将环介导等温扩增结合显色剂羟基萘酚蓝(即为LAMP-HNB法)以提高牦牛肉制品牦牛成分的检测灵敏度和特异性，可检测到1pg/μL的牦牛DNA样本，充分保证阳性样品的检出率。
本发明在LAMP体系中加入羟基萘酚蓝HNB，再进行等温扩增，当DNA双链合成后，从dNTP中析出的焦磷酸根离子与镁离子生成焦磷酸镁沉淀，失去镁离子的羟基萘酚蓝HNB就变成了天蓝色，故反应后含有牦牛源性成分的阳性样品管呈天蓝色，而不含牦牛源性成分的阴性样品管会呈现紫罗兰色，因此，在LAMP体系中应用羟基萘酚蓝HNB可使检测结果具有的可视性。
在此需要说明的是，本发明选择羟基萘酚蓝HNB并不是任意的，当染料选择钙黄绿素时，可能是由于锰离子的抑制，钙黄绿素与DNA的相互作用引起钙黄绿素灵敏度的降低；当染料选择SYBR Green I时，产物会形成气溶胶，引起产物或后续LAMP反应的污染，从而易造成假阳性。
如果羟基萘酚蓝HNB进入LAMP体系在扩增反应后添加，则需要打开反应体系，这就造成气溶胶对样品造成污染，以致测定结果出现假阳性，判定错误的结果。
作为本发明所述牦牛肉的鉴别方法的优选实施方式，所述环介导等温扩增的反应体系为：
上游外引物F3 400mM、下游外引物B3 400mM、上游内引物FIP 400mM～1600mM、下游内引物BIP 400mM～1600mM、DNTP 0.2～1.4mM、MgSO4 2～6mM、Bst DNA聚合酶8～10U和羟基萘酚蓝HNB 0.05～0.25mM。
当环介导等温扩增的反应体系采用上述组分及浓度时，可以较好地提高体系的扩增效率，显色效果较佳，有助于鉴定牦牛肉。
优选地，所述环介导等温扩增的反应体系为：
上游外引物F3 400mM、下游外引物B3 400mM、上游内引物FIP 800mM～1600mM、下游内引物BIP 800mM～1600mM、DNTP 0.8～1.0mM、MgSO4 3～5mM、Bst DNA聚合酶8～10U和羟基萘酚蓝HNB 0.1～0.2mM；
作为本发明所述牦牛肉的鉴别方法的优选实施方式，所述环介导等温扩增的反应体系为：
400mM的上游外引物F3和下游外引物各1μL、1200mM的上游内引物FIP和下游内引物BIP各2μL、1.0mM的DNTP 2.5μL、5mM的MgSO4 3μL、8U的Bst DNA聚合酶1μL、0.15mM的羟基萘酚蓝HNB 1.5μL和10×Buffer 2.5μL，加去离子水至25μL体系。在本发明中，1μl LAMP反应体系加入0.32U/μL的Bst DNA聚合酶，25μl LAMP反应体系加入8U的Bst DNA聚合酶。
本发明采用上述组分及含量作为最佳反应体系，通过加入显色剂羟基萘酚蓝至LAMP体系出现颜色变化从而判定阳性与阴性，进而判断是否含有牦牛源性成分；本发明将环介导等温扩增结合显色剂羟基萘酚蓝对牦牛肉具有高度敏感性和特异性，可检测到1pg/μL的牦牛DNA样本，充分保证阳性样品的检出率。
作为本发明所述牦牛肉的鉴别方法的优选实施方式，所述环介导等温扩增的反应温度为59～65℃，优选地，所述环介导等温扩增的反应温度为59～62℃。
采用上述反应温度可以较好地提高反应体系的扩增效率，颜色变化明显，当反应温度超过63℃时，扩增效率明显降低，颜色变化不及反应温度为59～62℃。
作为本发明所述牦牛肉的鉴别方法的优选实施方式，利用显色检测环介导等温扩增反应产物是否实现特异性扩增，如果颜色为天蓝色时，则待测样品为含有牦牛源性成分的阳性样品，如果为颜色为紫罗兰色，则待测样品为不含牦牛源性成分的阴性样品。
作为本发明所述牦牛肉的鉴别方法的优选实施方式，所述待测样品的DNA的浓度为1pg/μl～10ng/μl。
当待测样品浓度用量为10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、时均有天蓝色出现，1pg/μL时依然能显现天蓝色与阴性样品所区分，LAMP-HNB法最低检测限为1pg/μL，可见LAMP-HNB法用于检测牦牛源性的灵敏度较高。
第三目的，本发明提供上述检测引物组联合羟基萘酚蓝在鉴别牦牛肉中的应用。
第四目的，本发明提供一种检测牦牛肉的试剂盒，包括环介导等温扩增试剂、检测引物组及羟基萘酚蓝；
所述检测引物组包括以下引物：
上游外引物F3：TCGGCACAAATTTAGTCGA；
下游外引物B3：GAATTTTGTCTGCGTCTGA；
上游内引物FIP：TGGAAAGCGAAGAATCGGGTATGGATTTGAGGTGGGTT；
下游内引物BIP：ATTACAGCAATTGCCATAGTCCAGGAGATTCCTGTTGGATTGT。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明筛选得到的引物组灵敏度高，特异性强，建立的检测方法具有准确率高，检测时间短，结果可实时观测等优点；本发明以显色剂羟基萘酚蓝加入至LAMP体系出现颜色变化从而判定阳性与阴性，进而判断是否含有牦牛源性成分；本发明将环介导等温扩增结合显色剂羟基萘酚蓝对牦牛肉具有高度敏感性和特异性，可检测到1pg/μL的牦牛DNA样本，充分保证阳性样品的检出率。
附图说明
图1为检测引物组设计；
图2为牦牛、黄牛、水牛cytb基因比对结果图；
图3为检测引物组确认结果图；
图4为不同工作浓度的羟基萘酚蓝HNB的显色结果图；
图5为不同浓度的MgSO4对鉴别牦牛肉的影响结果图；
图6为不同浓度的dNTP对鉴别牦牛肉的影响结果图；
图7为不同浓度的Bst DNA聚合酶对鉴别牦牛肉的影响结果图；
图8为外引物和内引物不同浓度比例对鉴别牦牛肉的影响结果图；
图9为不同反应温度对鉴别牦牛肉的影响结果图；
图10为本发明的鉴别方法(LAMP-HNB法)的特异性和敏感性试验结果图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
在以下实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中，选自的鸡、猪、羊、黄牛动物组织均购自当地等农贸市场。
羟基萘酚蓝(HNB)购自建阳生物公司，无核酶水(RNase-free水)购自biosharp。
本发明提供了一种应用环介导等温扩增检测牦牛肉的检测引物组，包括以下引物(5'-3')：
上游外引物F3：TCGGCACAAATTTAGTCGA(SEQ ID NO:1)；
下游外引物B3：GAATTTTGTCTGCGTCTGA(SEQ ID NO:2)；
上游内引物FIP：TGGAAAGCGAAGAATCGGGTATGGATTTGAGGTGGGTT(SEQ ID NO:3)；
下游内引物BIP：ATTACAGCAATTGCCATAGTCCAGGAGATTCCTGTTGGATTGT(SEQ ID NO:4)；
环引物LF：GAGTCATCTGTTTCGTTGGGAG(SEQ ID NO:5)；
环引物LB：ACCTACTATTCCTCCACGAAACA(SEQ ID NO:6)。
所述引物组根据GenBank数据库中牦牛、黄牛和水牛的线粒体基因序列(KM280688.1、MH714783.1和MT182644.1)，通过BLAST在线比对软件进行分析，利用LAMP引物在线设计软件PrimerExplorerVersion5设计了牦牛LAMP检测引物组。牦牛源性成分的LAMP扩增引物设计，见图1。扩增片段和黄牛、水牛片段序列比对后，设计的引物序列有多个碱基位点差异，表明该扩增片段特异性较好，序列比对信息见图2。
为了确定设计的牦牛源性LAMP引物组能否在反应体系中进行扩增，我们进行了牦牛源性LAMP荧光染料反应，在LAMP反应体系中加入EvaGreen荧光染料，来确认牦牛源性LAMP检测引物组有效性。反应体系为25μL，终浓度反应物含10xPCR缓冲液2.5μL，dNTP浓度为1.4mmol/L，FIP、BIP浓度为1.6μmol/L，F3、B3浓度0.2μmol/L，LF、LB浓度为0.8μmol/L，MgSO4浓度为8mmol/L，Bst DNA聚合酶为8U，EvaGreen荧光染料1.25μL，牦牛核酸5μL，以无核酶水作为阴性对照，ddH2O补足体系至25μL。荧光PCR反应条件：40个循环，60℃30S，60℃60s，在60℃60s时候收集荧光。结果图3所示。
在引物设计的基础上，以pMD-cytb重组质粒为扩增模板，对LAMP反应体系条件进行优化。
DNA的提取步骤包括：
准确称取0.1g待测样品于玻璃匀浆器中，加入800μLTE溶液，匀浆15min；吸出200μL匀浆液，加入800μL动物裂解液[5mol/L异硫氰酸胍，0.05mol/LTris-HCl(pH＝6.4)，0.02mol/LEDTA(pH＝8.0)，1.3％TritonX-100]，65℃水浴2h；冷却后加入5μL，20mg/mlRNAase，混匀后室温反应5min；加入1ml酚-氯仿-异戊醇(25：24：1，V/V/V)，12000r/m离心15min；取上清液，加入等体积氯仿-异戊醇(24：1，V/V)，12000r/m离心15min；取上清液，加入1/10体积乙酸钠(pH＝5.2)及等体积异丙醇，-20℃沉淀30min；12000r/m离心15min，弃上清液，加入500μL70％乙醇溶液，颠倒混匀，12000r/m离心，1min；弃上清液，加入500μL70％乙醇溶液，颠倒混匀洗涤DNA，12000r/min离心1min；空干后加100μL灭菌去离子水溶解，-20℃保存，最终获得样品DNA提取液。用超微量分光光度计测定DNA浓度。
在引物设计的基础上，对LAMP反应体系中相关因素逐一进行优化。进行优化之前的LAMP反应体系中相关因素的原始浓度与体系内的加入量如表1所示。
表1
| 试剂 | 浓度 | 用量(μL) |
| 10×Buffer | － | 2.5 |
| DNTP | 10mmol/L | 2.5 |
| MgSO4 | 100mmol/L | 3 |
| FIP | 10μmol/L | 2 |
| BIP | 10μmol/L | 2 |
| F3 | 10μmol/L | 1 |
| B3 | 10μmol/L | 1 |
| Bst DNA聚合酶 | 8000U/mL | 1.2 |
| 羟基萘酚蓝HNB | 2.5mmol/L | 1.5 |
| ddH2O | － | 3.3 |
| 样品DNA提取液 | － | 5 |
注：共25μL，进行实际操作时，先预混多个样，后用无核酸酶水，补足到25μL，然后一次性取体系液与DNA提取液做显色反应。
本发明建立的牦牛肉的鉴别方法(LAMP-HNB法)的最优体系(25μl)如下：
表2
注：共25μL，进行实际操作时，先预混多个样，后用无核酸酶水，补足到25μL，然后一次性取体系液与DNA提取液做显色反应。
LAMP-HNB扩增反应条件为：将上述反应体系混匀后用封口膜密封管口，恒温水浴锅中62℃温育1h。反应完成后，将样品置于自然光下目视以判断结果。
实施例1、不同工作浓度的羟基萘酚蓝HNB对鉴别牦牛肉的影响
本实施例用无核酶水配制2.5mmol/L储存浓度的羟基萘酚蓝HNB于-30℃保存备用，使用时用无核酶水稀释到工作浓度。从0.05、0.1、0.15、0.2、0.25mM各浓度中选取与阴性对照颜色对比明显的浓度作为工作浓度，分别进行等温扩增反应后(体系中其余的组分及含量如表2所示)，自然光下肉眼观察结果，HNB浓度不影响LAMP的扩增，但颜色变化随着浓度的升高发生显著变化。当羟基萘酚蓝HNB浓度较低时，显色较淡，当羟基萘酚蓝HNB浓度较高时，显色较深，当羟基萘酚蓝HNB浓度为0.15mM显色最优，如图4所示。
实施例2、不同浓度的MgSO4对鉴别牦牛肉的影响
Mg2+浓度较低时，LAMP不能进行扩增反应；浓度较高会导致扩增效率降低，且颜色变化没有差异，不能通过颜色变化直接对LAMP反应进行有效鉴定。在25μl LAMP反应体系中，分别加入2mM、3mM、4mM、5mM、6mM的MgSO4(25mmol/L)，进行等温扩增反应后(体系中其余的组分及含量如表2所示)，自然光下肉眼观察结果。结果表明加入5mM的MgSO4，平行两组中显示天蓝色较为明显，其他浓度的MgSO4显色相对较差，MgSO4浓度越大，结果越容易显紫罗兰色，出现假阴性，如图5所示。
实施例3、不同浓度的dNTP对鉴别牦牛肉的影响
dNTP浓度过低会降低LAMP体系的扩增效率，过高会导致LAMP反应体系中pH变化不明显，没有颜色的明显变化而不能达到更好的鉴定效果。在25μlLAMP反应体系中，分别加入0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM、1.0mM、1.2mM、1.4mM的dNTP(10mmol/L)，进行等温扩增反应后(体系中其余的组分及含量如表2所示)，自然光下肉眼观察结果，结果表明加入0.8-1.0mM的dNTP，平行两组中显示天蓝色较为明显，其他浓度的dNTP显色相对较差，dNTP浓度越小，结果越容易显紫罗兰色，出现假阴性，如图6所示。
实施例4、不同浓度的Bst DNA聚合酶对鉴别牦牛肉的影响
Bst DNA聚合酶是LAMP反应体系中较为昂贵的试剂之一，为了降低检测成本，筛选出最低但能实现LAMP反应的聚合酶浓度，从而筛选出用较低的检测成本就能达到快速检测目的的体系。在25μl LAMP反应体系中，分别加入6U、8U、10U的dNTP，进行等温扩增反应后(体系中其余的组分及含量如表2所示)，自然光下肉眼观察结果，结果表明加入0.32U/μL(8U)的Bst DNA，显色效果最佳，即在25μL LAMP检测体系中1μL的Bst DNA聚合酶(8U，μL)是支持反应进行的最少量。其他浓度的Bst DNA聚合酶显色相对较差，Bst DNA聚合酶浓度越小，结果越容易显紫罗兰色，出现假阴性，参考图7所示。
实施例5、不同浓度的引物对鉴别牦牛肉的影响
上、下游外引物(F3/B3)浓度对LAMP反应扩增并无影响，上、下游内引物(BIP/FIP)的浓度较低时不能进行LAMP扩增，浓度升高会提高LAMP的扩增效率，但浓度过高会导致颜色变化差异不显著，不能进行有效的颜色显示鉴定。在25μl LAMP反应体系中，分别加入外引物(B3/F3)与内引物(BIP/FIP)浓度比为400nM:400nM、400nM:800nM、400nM:1200nM、400nM:1600nM的10μmol/L引物，进行等温扩增反应后(体系中其余的组分及含量如表2所示)，自然光下肉眼观察结果，扩增结果表明加入外引物：内引物＝400nM:1200nM时显色最优，其他浓度比的外引物(B3/F3)与内引物(BIP/FIP)显色相对较差，内引物(BIP/FIP)浓度越小，结果越容易显紫罗兰色，出现假阴性，参考图8所示。最终筛选出最佳的牦牛肉的鉴别方法(LAMP-HNB法)的最优体系(25μl)。
实施例6、不同反应温度对鉴别牦牛肉的影响
一般情况下，LAMP反应温度由Bst DNA聚合酶的最适温度决定，本款酶推荐的使用温度为60-65℃，在此温度范围内酶的活性具有最优的扩增效率。将配制好25μl LAMP反应体系的反应管分别置于59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃恒温条件下反应1h，自然光下肉眼观察结果，扩增结果显示在温度为59-62℃时Bst DNA聚合酶均可以提高扩增效率，颜色变化明显，超过63℃时，扩增效率明显降低，颜色变化不明显，选择将牦牛源性成分LAMP快速检测反应的程序温度设置为62℃，参考图9所示。。
试验例一、本发明的鉴别方法(LAMP-HNB法)的特异性和敏感性试验
1、LAMP检测方法的特异性实验：
按上述方法建立的LAMP体系(表2)，分别以黄牛、黄牛2号、猪、羊、羊2号、鸡的核酸DNA样本为模板进行LAMP-HNB扩增反应，与牦牛肉DNA模板LAMP-HNB扩增反应作对比，进行显色反应，自然光下肉眼观察试验结果，评价LAMP-HNB方法的特异性。其中阳性对照是指使用确定的牦牛肉提取的核酸测定的结果。阴性对照是指使用无核酸酶水替代样本做的处理。
2、LAMP显色检测方法的敏感性试验：
按上述方法建立的LAMP体系(表2)，以牦牛的DNA为模板，将浓度为10ng/μL的牦牛核酸DNA做系列稀释，稀释为10ng/μl、1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl五个梯度。各梯度牦牛核酸DNA进行LAMP-HNB扩增反应，进行显色反应，自然光下肉眼观察试验结果评价LAMP-HNB方法的敏感性。
结果如图10所示。LAMP-HNB反应体系只能对牦牛进行有效扩增，出现典型的天蓝色，而不能对其他动物源性成分进行扩增，其他动物源性成分均呈现紫罗兰色，表明该LAMP-HNB显色反应体系检测牦牛源性的特异性较好。当牦牛DNA浓度用量为10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、时均有天蓝色出现，1pg/μL时依然能显现天蓝色与阴性样品所区分，LAMP-HNB法最低检测限为1pg/μL，可见LAMP-HNB法用于检测牦牛源性的灵敏度较高。
本发明建立了一种牦牛肉的鉴别方法(LAMP-HNB法)，优选了LAMP反应体系各个因素，LAMP-HNB方法具有高度敏感性和特异性，可检测到1pg/μL的牦牛核酸样本，充分保证阳性样品的检出率。牦牛源性LAMP-HNB法对实验条件、所需仪器的要求不高，配合使用显色剂羟基萘酚蓝HNB，既快速又简便，非常适用于在实验技术、条件相对落后的基层实验室、现场检测和养殖场等地方使用，同时为快速检测牦牛源性成分方法的传播提供了技术支撑。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (5)
1.一种牦牛肉的鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)获取待测样品的DNA；
2)以步骤1)提取的DNA为模板，加入检测引物组中的引物和羟基萘酚蓝进行环介导等温扩增，获得扩增结果；
3)根据所述扩增结果获得鉴定结果：如果可以实现特异性扩增，则待测样品为牦牛肉；
所述检测引物组包括以下引物：
上游外引物F3：TCGGCACAAATTTAGTCGA；
下游外引物B3：GAATTTTGTCTGCGTCTGA；
上游内引物FIP：TGGAAAGCGAAGAATCGGGTATGGATTTGAGGTGGGTT；
下游内引物BIP：ATTACAGCAATTGCCATAGTCCAGGAGATTCCTGTTGGATTGT；
所述环介导等温扩增的反应体系为：
400mM的上游外引物F3和下游外引物、1200mM的上游内引物FIP和下游内引物BIP、1.0mM的DNTP、5mM的MgSO4、8U的Bst DNA聚合酶、0.15mM的羟基萘酚蓝HNB和10×Buffer和去离子水。
2.如权利要求1所述的牦牛肉的鉴别方法，其特征在于，所述环介导等温扩增的反应温度为59～65℃。
3.如权利要求2所述的牦牛肉的鉴别方法，其特征在于，所述环介导等温扩增的反应温度为59～62℃。
4.如权利要求1所述的牦牛肉的鉴别方法，其特征在于，利用显色检测环介导等温扩增反应产物是否实现特异性扩增，如果颜色为天蓝色时，则待测样品为含有牦牛源性成分的阳性样品，如果为颜色为紫罗兰色，则待测样品为不含牦牛源性成分的阴性样品。
5.如权利要求1所述的牦牛肉的鉴别方法，其特征在于，所述待测样品的DNA的浓度为1pg/μl～10ng/μl。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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