CN109680073A - 一种肉或肉制品中猪源性成分实时荧光定量pcr检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种肉与肉制品中猪源性成分实时荧光检测方法。该方法可检测扩增过程中的荧光信号，不需要普通PCR检测方法所用的电泳，节省检测时间，实时观察检测结果。同时在检测过程中加入扩增内标、阳性对照来避免检测结果假阴性，加入阴性对照、空白对照来避免检测结果假阳性，从多个方面来保障检测结果的准确性。该技术对于提高动物源性食品安全监管水平，确保食品质量安全，保障广大人民群众的身体健康和生活质量，维护社会稳定和经济发展都具有积极作用。

Description

一种肉或肉制品中猪源性成分实时荧光定量PCR检测方法

技术领域

本发明属于生物技术检测领域，涉及肉或肉制品中动物源性成分的检测方法，特别是肉 或肉制品中猪源性成分的检测方法。

背景技术

随着我国经济的快速发展，动物源性商品的消费量在不断增加，经常会遇到不法商家为 追逐经济利益在食品加工过程中对动物源性原料以次充好、掺杂使假等欺诈甚至违法行为。 因此，建立一种快速、准确的动物源性成分鉴别的方法对于提高动物源性食品安全监管水平， 确保食品质量安全，保障广大人民群众的身体健康和生活质量，维护社会稳定和经济发展都 具有积极作用。

在肉制品加工过程中会加入各种原料，采用各种方法加工，在这些过程中会产生很多抑 制PCR反应的物质，从而导致假阴性的产生。另外由于反应体系中存在抑制剂，PCR仪器故 障，反应体系错误，聚合酶失活等原因也会造成的假阴性结果。本发明在检测体系中加入了 人工构建的扩增内标(internal amplification control，IAC)，IAC是添加到PCR反应体系中和 目标基因非同源的但可以同时扩增的一段人工构建的DNA序列，可以用来指示假阴性现象。 如果反应体系中加入扩增内标，无论在反应体系中有无目标基因出现，扩增内标的信号总会 出现，如果扩增内标无信号说明PCR反应失败，因此加入IAC可以有效的解决假阴性的现象。

在DNA提取的过程中由于操作失误造成的DNA的丢失，也会造成结果的假阴性，为了 解决这一问题，本发明在检测猪源性成分的同时另外增加一对引物，检测提取的DNA是否 丢失，该引物能够扩增所有脊椎动物的DNA样品，只要能提取到DNA，该引物就能扩增出PCR产物，避免了提过过程中DNA的丢失。

另外由于操作的失误可能造成样品之间的污染，DNA、PCR产物气溶胶污染等，这些污 染可能造成检测结果假阳性，因此在本发明在PCR检测的过程中设置了阴性对照，空白对照。 阴性对照扩增模板DNA来源于非猪源性成分的样品，用来提示是否存在样品污染。空白对 照为PCR检测体系中不加模板DNA，用来提示是否存在DNA、PCR产物气溶胶污染。

发明内容

本发明的目的在于针对肉与肉制品中猪源性成分PCR检测假阳性、假阴性结果现象，提 供一种肉或肉制品中猪源性成分实时荧光定量PCR检测方法，具体步骤如下：

(1)肉或肉制品中基因组DNA的提取；

(2)以肉或肉制品中提取的基因组DNA作为模板，进行实时荧光定量PCR反应；

(3)根据荧光信号判断肉或肉制品中是否含有猪源性成分。

1.其中肉或肉制品指的是猪肉，牛肉，羊肉，鸡肉，鸭肉，鹅肉，兔肉，驴肉，马肉，鹿肉，牦牛肉，狗肉，鱼肉中的一种或多种的混合。

2.采用的基因组DNA的提取方法为常规的蛋白酶K消化，苯酚抽提，乙醇沉淀的方法或商 品化DNA提取试剂盒或其他相似的方法。

3.提取待检测肉或肉制品中的基因组DNA的同时还需要提取已知纯猪肉或肉制品和已知 非猪肉或肉制品(牛肉，羊肉，鸡肉，鸭肉，鹅肉，兔肉，驴肉，马肉，鹿肉，牦牛肉，狗肉，鱼肉的一种或多种的混合)作为对照样品。

4.实时荧光定量PCR检测方法所用的引物和探针如下：

猪源性成分实时荧光定量PCR检测所用引物为SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2，探针为 SEQ ID NO 3，5′端JOE标记，3′端BHQ1标记；在猪源性成分实时荧光定量PCR反应体系中扩增内标所用引物SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2，探针为SEQ ID NO 4，5′端FAM标记， 3′端BHQ1标记。脊椎动物源性成分实时荧光定量PCR检测所用通用引物为SEQ ID NO 5和 SEQID NO 6，探针为SEQ ID NO 7，5′端CY5标记，3′端BHQ1标记；在脊椎动物源性成分 实时荧光定量PCR反应体系中扩增内标所用引物SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6，探针为SEQ ID NO4，5′端FAM标记，3′端BHQ1标记。

5.每个样品同时进行2种荧光定量PCR反应体系，反应体系如下：

第一种为猪源性成分实时荧光定量PCR检测，25μL反应体系：肉或肉制品中提取的基 因组DNA模板(200ng·μL^-1)2.5μL，扩增内标质粒pMD18-T-SUS-CDV(20ng·μL^-1)2.5μL，引物SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2(10μmol·L^-1)各0.5μL，探针SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4(10μmol·L^-1)0.5μL，Rox Reference Dye II 0.5μL，Premix Ex Taq(2×)12.5μL，补水至25μL。反应程序：预变性95℃，30s；变性95℃，5s；退火65℃，34s；重复40个循环。

第二种为脊椎动物源性成分实时荧光定量PCR检测，25μL反应体系：肉或肉制品中提 取的基因组DNA模板(200ng·μL^-1)2.5μL，扩增内标质粒pMD18-T-COM-CDV(20ng·μL^-1)2.5μL，引物SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6(10μmol·L^-1)各0.5μL，探针SEQ ID NO 7和 SEQID NO 4(10μmol·L^-1)0.5μL，Rox Reference Dye II 0.5μL，Premix Ex Taq(2×)12.5μL，补水至25μL。反应程序：预变性95℃，30s；变性95℃，5s；退火65℃，34s；重复40 个循环。

6.除待检样品外还要设置非猪源性DNA的阴性对照(已知非猪肉或肉制品中提取的DNA)， 无模板的空白对照，标准猪源性成分DNA的阳性对照(已知纯猪肉或肉制品中提取的DNA)。

7.结果的判断标准如下：

a.非猪源性DNA阴性对照：第一种猪源性成分实时荧光定量PCR检测无JOE荧光信号，FAM荧光信号检出且Ct值＜35；第二种脊椎动物源性成分实时荧光定量PCR检测CY5 荧光信号检出且Ct值＜35，FAM荧光信号检出且Ct值＜35。

b.空白对照：第一种猪源性成分实时荧光定量PCR检测无JOE荧光信号，FAM荧光信号检出且Ct值＜35；第二种脊椎动物源性成分实时荧光定量PCR检测无CY5荧光信号检出，FAM荧光信号检出且Ct值＜35。

c.标准猪源性成分阳性对照：第一种猪源性成分实时荧光定量PCR检测JOE荧光信号 检出且Ct值＜35，FAM荧光信号检出且Ct值＜35；第二种脊椎动物源性成分实时荧光定量 PCR检测CY5荧光信号检出且Ct值＜35，FAM荧光信号检出且Ct值＜35。

d.待检样品第一种猪源性成分实时荧光定量PCR检测FAM荧光信号检出且Ct值＜35， 第二种脊椎动物源性成分实时荧光定量PCR检测CY5荧光信号检出且Ct值＜35，FAM荧光 信号检出且Ct值＜35。

在a-d满足上述结果的前提下判断待检样品中有无猪源性成分，待检样品第一种猪源性 成分实时荧光定量PCR检测中如果没有JOE荧光信号说明没有猪源性成分；如果JOE荧光 信号检出且Ct值＜35说明含有猪源性成分；如果JOE荧光信号检出但Ct值≥35视为没有猪 源性成分。如果a-d不满足上述结果时，应重新进行检测。

本发明提供一种肉与肉制品中猪源性成分实时荧光检测方法。该方法可检测扩增过程中 的荧光信号，不需要普通PCR检测方法所用的电泳，节省检测时间，实时观察检测结果。同 时在检测过程中加入扩增内标、阳性对照来避免检测结果假阴性，加入阴性对照、空白对照 来避免检测结果假阳性，从多个方面来保障检测结果的准确性。该技术对于提高动物源性食 品安全监管水平，确保食品质量安全，保障广大人民群众的身体健康和生活质量，维护社会 稳定和经济发展都具有积极作用。

附图说明

图1为以猪肉样品、牛肉样品、羊肉样品、鸡肉样品、鸭肉样品、鹅肉样品、兔肉样品、 驴肉样品、马肉样品、鹿肉样品、牦牛肉样品、狗肉样品、鱼肉样品的基因组DNA为模板，采用引物SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2，探针SEQ ID NO 3进行real-time PCR扩增的曲线。其 中编号1为猪肉样品，2-15分别为牛肉样品、羊肉样品、鸡肉样品、鸭肉样品、鹅肉样品、兔 肉样品、驴肉样品、马肉样品、鹿肉样品、牦牛肉样品、狗肉样品、鱼肉样品，阴性对照。

图2为以猪肉样品、牛肉样品、羊肉样品、鸡肉样品、鸭肉样品、鹅肉样品、兔肉样品、 驴肉样品、马肉样品、鹿肉样品、牦牛肉样品、狗肉样品、鱼肉样品的基因组DNA为模板，采用引物SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6，探针SEQ ID NO 7进行real-time PCR扩增的曲线。其 中编号1-14分别为猪肉样品、牛肉样品、羊肉样品、鸡肉样品、鸭肉样品、鹅肉样品、兔肉样品、驴肉样品、马肉样品、鹿肉样品、牦牛肉样品、狗肉样品、鱼肉样品，15为阴性对照。

图3为标准猪源性成分阳性对照实时荧光定量PCR检测结果，其中编号1为第一种猪源性 成分实时荧光定量PCR检测时FAM荧光信号检出且Ct值＜35；编号2为第二种脊椎动物源性成 分实时荧光定量PCR检测时FAM荧光信号检出且Ct值＜35；编号3为第一种猪源性成分实时荧 光定量PCR检测时JOE荧光信号检出且Ct值＜35；编号4为第二种脊椎动物源性成分实时荧光定 量PCR检测时CY5荧光信号检出且Ct值＜35。

具体实施方式

实施例1：肉与肉制品中基因组DNA的提取

采集明确已知成分的猪肉样品，牛肉样品，羊肉样品，鸡肉样品，鸭肉样品，鹅肉样品， 兔肉样品，驴肉样品，马肉样品，鹿肉样品，牦牛肉样品，狗肉样品，鱼肉样品。按照血液/ 细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)说明提取肉与肉制品中基因组 DNA。

实施例2：猪特异性核酸序列的选取和引物、探针设计

通过对各种动物的基因序列进行比较分析及大量的PCR试验筛选验证，确定检测猪源性 成分的特异性引物和探针为：SEQ ID NO 1 5′-cacacaatgggaataaattg-3′；SEQ IDNO 2 5′-gtcagtcatggttctcta-3′；SEQ ID NO 3 JOE 5′-ccttcaagcagtgcagccttac-3′BHQ1。结果如附图1所 示，说明设计的引物和探针具有高度的特异性。

同样确定检测脊椎动物源性成分通用引物和探针为：SEQ ID NO 5 5′-ctgctaaacaatccaataaac-3′；SEQ ID NO 6 5′-gaggtctccattactaataga-3′；SEQ ID NO 7CY5-5′-taacctcttgtctcttcggctgatg-3′-BHQ2。结果如附图2所示，说明设计的引物和探针具有高 度的特异性。

实施例3：扩增内标质粒的构建

选择犬瘟热病毒核衣壳蛋白基因作为靶基因，设计上游引物：CDV-F 5′-cattgttacaagatctcgac-3′，下游引物：CDV-R 5′-agttaatttagggccgtt-3′，该引物对能扩增出犬瘟 热病毒核衣壳蛋白基因79bp片段，然后在CDV-F和CDV-R外侧分别加入猪源性成分real-time PCR检测引物SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2，形成引物SEQ ID NO 1-CDV-F 5′-cacacaatgggaataaattgcattgttac-3′和SEQ ID NO 2-CDV-R 5′-gtcagtcatggttctcta_agttaatttagggccg -3′引物。以79bp的PCR产物为模板，以SEQ ID NO 1-CDV-F和SEQ ID NO2-CDV-R为引 物，扩增PCR产物长度为104bp，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，采用普通琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒回收DNA片段，将DNA片段连接至pMD18-T Simple Vector，构建与猪源性成分 real-time PCR检测具有相同引物的扩增内标pMD18-T-SUS-CDV质粒，然后转化DH5α感受 态细胞，涂布LB/Amp/X-Gal/IPTG培养基平板(Amp 0.1mg·mL^-1，X-Gal 0.04mg·mL^-1，IPTG 0.024mg·mL^-1)，挑选白色菌落进行采用引物SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2进行PCR鉴定。 含有pMD18-T-SUS-CDV质粒的阳性克隆接种LB液体培养基(Amp 0.1mg/mL)，37℃培养 过夜，采用质粒小提试剂盒提取质粒，TE溶解后用Nanodrop测定DNA浓度，计算质粒的拷 贝数，分装后-70℃保存备用。

同理构建与动物源性总成分real-time PCR检测具有相同引物的扩增内标pMD18-T-COM-CDV质粒。

设计扩增内标质粒探针SEQ ID NO：4 FAM-5′-accgaccaatctaacgagtctatcc-3′-BHQ1

实施例4：实时荧光定量PCR检测

以肉制品中基因组DNA作为模板，进行实时荧光定量PCR反应，同时设置非猪源性DNA 的阴性对照，无模板的空白对照，标准猪源性成分DNA的阳性对照。

猪源性成分实时荧光定量PCR检测所用引物为SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2，探针为 SEQ ID NO 3，5′端JOE标记，3′端BHQ1标记；在猪源性成分实时荧光定量PCR反应体系中扩增内标所用引物SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2，探针为SEQ ID NO 4，5′端FAM标记， 3′端BHQ1标记。25μL实时荧光定量PCR检测反应体系：肉或肉制品中提取的基因组DNA 模板(200ng·μL^-1)2.5μL，扩增内标质粒pMD18-T-SUS-CDV(20ng·μL^-1)2.5μL，引物SEQ ID NO1和SEQ ID NO 2(10μmol·L^-1)各0.5μL，探针SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4(10 μmol·L^-1)0.5μL，Rox Reference Dye II 0.5μL，Premix Ex Taq(2×)12.5μL，补水至25μL。 反应程序：预变性95℃，30s；变性95℃，5s；退火65℃，34s；重复40个循环。

脊椎动物源性成分实时荧光定量PCR检测所用通用引物为SEQ ID NO 5和SEQ IDNO 6，探针为SEQ ID NO 7；在脊椎动物源性成分实时荧光定量PCR反应体系中扩增内标所用 引物SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6，探针为SEQ ID NO 4。25μL实时荧光定量PCR检测反应体系：肉或肉制品中提取的基因组DNA模板(200ng·μL^-1)2.5μL，扩增内标质粒 pMD18-T-COM-CDV(20ng·μL^-1)2.5μL，引物SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6(10μmol·L^-1) 各0.5μL，探针SEQ ID NO 7和SEQ ID NO 4(10μmol·L^-1)0.5μL，Rox Reference Dye II 0.5 μL，Premix Ex Taq(2×)12.5μL，补水至25μL。反应程序：预变性95℃，30s；变性95℃， 5s；退火65℃，34s；重复40个循环。

除待检样品外还要设置非猪源性DNA的阴性对照(已知非猪肉或肉制品中提取的DNA)， 无模板的空白对照，标准猪源性成分DNA的阳性对照(已知纯猪肉或肉制品中提取的DNA)。 实施例5判断标准

a.非猪源性DNA阴性对照：第一种猪源性成分实时荧光定量PCR检测无JOE荧光信号，FAM荧光信号检出且Ct值＜35；第二种脊椎动物源性成分实时荧光定量PCR检测 CY5荧光信号检出且Ct值＜35，FAM荧光信号检出且Ct值＜35。

b.空白对照：第一种猪源性成分实时荧光定量PCR检测无JOE荧光信号，FAM荧光信号检出且Ct值＜35；第二种脊椎动物源性成分实时荧光定量PCR检测无CY5荧光信号 检出，FAM荧光信号检出且Ct值＜35。

c.标准猪源性成分阳性对照：第一种猪源性成分实时荧光定量PCR检测JOE荧光信号 检出且Ct值＜35，FAM荧光信号检出且Ct值＜35；第二种脊椎动物源性成分实时荧光定量PCR检测CY5荧光信号检出且Ct值＜35，FAM荧光信号检出且Ct值＜35。

d.待检样品第一种猪源性成分实时荧光定量PCR检测FAM荧光信号检出且Ct值＜35， 第二种脊椎动物源性成分实时荧光定量PCR检测CY5荧光信号检出且Ct值＜35，FAM 荧光信号检出且Ct值＜35。

在a-d满足上述结果的前提下判断待检样品中有无猪源性成分，待检样品第一种猪源性 成分实时荧光定量PCR检测中如果没有JOE荧光信号说明没有猪源性成分；如果JOE荧光 信号检出且Ct值＜35说明含有猪源性成分；如果JOE荧光信号检出但Ct值≥35视为没有猪 源性成分。如果a-d不满足上述结果时，应重新进行检测。

Claims (8)

1.一种肉或肉制品中猪源性成分实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)肉或肉制品中基因组DNA的提取；

(2)以肉或肉制品中提取的基因组DNA作为模板，进行实时荧光定量PCR反应；

(3)根据荧光信号判断肉或肉制品中是否含有猪源性成分。

2.如权利要求1所述肉或肉制品中猪源性成分实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于步骤(1)中所述的肉或肉制品为猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉、兔肉、驴肉、马肉、鹿肉、牦牛肉、狗肉、鱼肉中的一种或多种的混合。

3.如权利要求1所述肉或肉制品中猪源性成分实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于步骤(1)中所述的肉或肉制品中基因组DNA的提取方法可采用常规的蛋白酶K消化，苯酚抽提，乙醇沉淀的方法或商品化DNA提取试剂盒或其他相似的方法。

4.如权利要求1所述肉或肉制品中猪源性成分实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于步骤(1)中所述的肉或肉制品中基因组DNA的提取时除提取待检测肉或肉制品中的基因组DNA以外，还需要提取已知纯猪肉或肉制品和已知非猪肉或肉制品(牛肉、羊肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉、兔肉、驴肉、马肉、鹿肉、牦牛肉、狗肉、鱼肉的一种或多种的混合)作为对照样品。

5.如权利要求1所述肉或肉制品中猪源性成分实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于步骤(2)中所用的引物和探针如下：

猪源性成分实时荧光定量PCR检测所用引物为SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2，探针为SEQID NO 3，5′端JOE标记，3′端BHQ1标记；在猪源性成分实时荧光定量PCR反应体系中扩增内标所用引物SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2，探针为SEQ ID NO 4，5′端FAM标记，3′端BHQ1标记。脊椎动物源性成分实时荧光定量PCR检测所用通用引物为SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6，探针为SEQ ID NO 7，5′端CY5标记，3′端BHQ1标记；在脊椎动物源性成分实时荧光定量PCR反应体系中扩增内标所用引物SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6，探针为SEQ ID NO 4。

6.如权利要求1所述肉或肉制品中猪源性成分实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于步骤(2)中每个样品同时进行2种荧光定量PCR反应体系

第一种为猪源性成分实时荧光定量PCR检测，25μL反应体系：肉或肉制品中提取的基因组DNA模板(200ng·μL^-1)2.5μL，扩增内标质粒pMD18-T-SUS-CDV(20ng·μL^-1)2.5μL，引物SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2(10μmol·L^-1)各0.5μL，探针SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4(10μmol·L^-1)0.5μL，Rox Reference Dye II 0.5μL，Premix Ex Taq(2×)12.5μL，补水至25μL。反应程序：预变性95℃，30s；变性95℃，5s；退火65℃，34s；重复40个循环。

第二种为脊椎动物源性成分实时荧光定量PCR检测，25μL反应体系：肉或肉制品中提取的基因组DNA模板(200ng·μL^-1)2.5μL，扩增内标质粒pMD18-T-COM-CDV(20ng·μL^-1)2.5μL，引物SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6(10μmol·L^-1)各0.5μL，探针SEQ ID NO 7和SEQ ID NO4(10μmol·L^-1)0.5μL，Rox Reference Dye II 0.5μL，Premix Ex Taq(2×)12.5μL，补水至25μL。反应程序：预变性95℃，30s；变性95℃，5s；退火65℃，34s；重复40个循环。

7.如权利要求1所述肉或肉制品中猪源性成分实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于步骤(2)中除待检样品外还要设置非猪源性DNA的阴性对照(已知非猪肉或肉制品中提取的DNA)，无模板的空白对照，标准猪源性成分DNA的阳性对照(已知纯猪肉或肉制品中提取的DNA)。

8.如权利要求1所述肉或肉制品中猪源性成分实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于步骤(3)判断标准如下：

a.非猪源性DNA阴性对照：第一种猪源性成分实时荧光定量PCR检测无JOE荧光信号，FAM荧光信号检出且Ct值＜35；第二种脊椎动物源性成分实时荧光定量PCR检测CY5荧光信号检出且Ct值＜35，FAM荧光信号检出且Ct值＜35。

b.空白对照：第一种猪源性成分实时荧光定量PCR检测无JOE荧光信号，FAM荧光信号检出且Ct值＜35；第二种脊椎动物源性成分实时荧光定量PCR检测无CY5荧光信号检出，FAM荧光信号检出且Ct值＜35。

c.标准猪源性成分阳性对照：第一种猪源性成分实时荧光定量PCR检测JOE荧光信号检出且Ct值＜35，FAM荧光信号检出且Ct值＜35；第二种脊椎动物源性成分实时荧光定量PCR检测CY5荧光信号检出且Ct值＜35，FAM荧光信号检出且Ct值＜35。

d.待检样品第一种猪源性成分实时荧光定量PCR检测FAM荧光信号检出且Ct值＜35，第二种脊椎动物源性成分实时荧光定量PCR检测CY5荧光信号检出且Ct值＜35，FAM荧光信号检出且Ct值＜35。

在a-d满足上述结果的前提下判断待检样品中有无猪源性成分，待检样品第一种猪源性成分实时荧光定量PCR检测中如果没有JOE荧光信号说明没有猪源性成分；如果JOE荧光信号检出且Ct值＜35说明含有猪源性成分；如果JOE荧光信号检出但Ct值≥35视为没有猪源性成分。如果a-d不满足上述结果时，应重新进行检测。