CN105779642B

CN105779642B - 一种用于鉴别宽额鲈成分的实时荧光pcr引物和探针、试剂盒及检测方法

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Publication number: CN105779642B
Application number: CN201610348433.5A
Authority: CN
Inventors: 陈双雅; 林双庆; 彭小莉; 刘棠; 王嘉鹤; 张永祥
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2016-05-24
Filing date: 2016-05-24
Publication date: 2019-04-09
Anticipated expiration: 2036-05-24
Also published as: CN105779642A

Abstract

本发明提出了一种用于鉴别宽额鲈成分的实时荧光PCR引物和探针、试剂盒及检测方法。所述引物序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；所述探针序列如SEQ ID NO：3所示，其5’端标记报告荧光染料FAM，3’端标记淬灭荧光染料TAMRA。本发明还保护了用于宽额鲈成分鉴别的实时荧光PCR检测方法。该方法具有操作简单、检测时间短、特异性强、灵敏度高、重现性好等优点，适用于加工鱼肉制品中宽额鲈成分的鉴定，能较好地解决宽额鲈制品错误标签和以次充好的问题。

Description

一种用于鉴别宽额鲈成分的实时荧光PCR引物和探针、试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及食品质量控制领域，尤其涉及一种用于鉴别宽额鲈成分的实时荧光PCR检测引物和探针及方法。

背景技术

宽额鲈（Promicrops lanceolatus）俗称龙胆，隶属鲈形目，鮨科，主要分布于东南亚、澳大利亚海域及我国南海诸岛、海南岛、台湾附近海域。宽额鲈是我国名贵的食用石斑鱼，由于其价格昂贵，市场上一些不法商贩用低价石斑鱼或其他鱼种冒充它们以牟取利益。由于个体巨大，宽额鲈常常被加工成鱼肉片或者鱼块甚至鱼糜制品出售，这些加工制品从外观上已经不能看出用来加工的原料鱼的种类，需要通过形态以外的方法来确认鉴别。

经查阅国内外文献，国内外学者对宽额鲈的研究较少，基本集中在系统发育学研究方面。丁少雄等2006年用16SrDNA部分序列探讨了包括宽额鲈在内的中国近海30种石斑鱼的分子系统进化关系（动物学报，2006,52,504-513）；庄轩等2006年用细胞色素b基因部分片段研究了包括宽额鲈在内的中国近海石斑鱼类的系统进化关系（中国科学C辑生命科学，2006,36,27-34）。对宽额鲈进行物种DNA鉴别的应用研究更少，尚未见用于鱼肉制品中宽额鲈成分特异性检测的实时荧光PCR方法报道。2012年Chen等（Food Control，2012：108–112）建立了实时荧光PCR检测石斑鱼成分的方法，该方法虽能检测待测样品中是否含有石斑鱼成分，但不能具体鉴定出是哪种石斑鱼。上述研究成果均不能解决加工鱼肉制品用其他鱼种冒充宽额鲈的问题。

随着美国、欧盟和我国关于水产品标识管理相关的政策法规和措施的出台，要求对产品标签信息进行验证，从而对鱼肉制品的错误标签和以次充好进行监管，因此市场和形势都需要准确、快速、特异的鱼类物种鉴别方法。目前急需一种能较好地解决宽额鲈制品的错误标签和以次充好问题的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一组对鱼肉制品中宽额鲈鱼源性成分进行快速鉴别的引物和探针，以及一种鱼肉制品中宽额鲈成分的实时荧光PCR检测方法，该方法对市场上相关产品的食品安全监测和执法都具有重要意义。

为实现上述目的，本发明提供一种宽额鲈成分检测用的特异性寡核苷酸引物和Taqman探针，所述引物序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；所述Taqman探针序列如SEQID NO：3 所示，探针的5’端标记报告荧光染料，所述报告荧光染料为FAM，探针的3’端标记淬灭荧光染料，所述淬灭荧光染料为TAMRA。引物和探针序列如下：

SEQ ID NO：1：5’- gttggttacgtccttccc - 3’

SEQ ID NO：2：5’- cgggtaagggtagcgttgtct - 3’

SEQ ID NO：3：FAM - 5’- cacagtcattaccaacctcctctc - 3’- TAMARA

本发明的寡核苷酸引物和探针是根据宽额鲈和其他鱼种的细胞色素氧化酶亚基I（COI）基因序列具有差异性的特点而设计的。本发明的发明人通过大量筛选工作确定了本发明的特异性寡核苷酸引物和探针序列，建立了稳定的实时荧光PCR扩增体系和扩增条件，从而能特异、灵敏地从样品中鉴定宽额鲈成分。上述文献中的方法均不能用于加工鱼肉制品中宽额鲈成分的鉴别。

本发明的另一方面，提供一种宽额鲈成分荧光PCR检测试剂盒，其包括所述的引物和Taqman探针。所述试剂盒中还可包括用于实时荧光PCR反应的试剂，如（但不限于）：实时荧光PCR预混液或Taq酶、PCR缓冲液等。所述试剂盒中还可包括阳性对照和阴性对照。其中，阳性对照为宽额鲈DNA；阴性对照可以选择非宽额鲈鱼类DNA，包括其他科目的鱼类DNA样品或其他动物组织的DNA样品。此外，所述试剂盒中还可包括试剂盒使用说明书。

本发明还提供所述实时荧光PCR引物和探针、所述实时荧光PCR检测试剂盒用于鉴别宽额鲈成分的用途。

本发明还提供一种用于宽额鲈成分鉴别的实时荧光PCR检测方法，其中所述实时荧光PCR方法为Taqman荧光探针法，其特征在于，使用了所述的引物和探针，或所述试剂盒中的引物和探针进行实时荧光PCR扩增的步骤。

进一步：

从样品中提取DNA为模板；

利用所述引物和探针，或所述试剂盒中的引物和探针，进行实时荧光PCR扩增；

结果分析并判断。

进一步：所述实时荧光PCR扩增的反应体系为25 μL，即在0.2 mL的PCR反应管中加入2×PCR Taqman实时荧光PCR预混液12.5 μL，10 μmol/L上游引物1 μL，10 μmol/L下游引物1 μL，10 μmol/L探针1 μL，样品基因组DNA 5 μL，双蒸水4.5 μL。

进一步：所述实时荧光PCR扩增的反应条件为：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，64 ℃30 s，共35个循环。

进一步：所述结果分析并判断是：根据实时荧光PCR反应中的典型特征曲线与对应的阈值大小判断是否检出宽额鲈成分。

如被检样品有典型特征扩增曲线且Ct 值＜35，则判定结果为阳性；如Ct值≥35，则判定结果为阴性。

本发明的其他方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

本发明所述方法可以从宽额鲈含量为0.1 %（w/w）的样品中快速检测出宽额鲈成分。

本发明即采用Taqman探针实时荧光PCR检测方法进行鱼肉制品中宽额鲈成分的鉴定。

本发明选用的线粒体COI基因是进行物种鉴定的优良目标基因。由于COI基因有足够的变异，分辨率比16SrRNA基因高，更适合鉴别亲缘关系较为密切的物种，尤其适用于低价石斑鱼冒充高价值石斑鱼的鉴别。

本发明人根据Genbank中的线粒体COI基因序列，设计了多套针对宽额鲈的特异性引物和Taqman探针，并从引物和探针浓度、退火温度和退火时间等荧光PCR参数进行了优化。筛选出了能有效从鱼肉制品中将宽额鲈和其他石斑鱼以及其他物种鉴别开的特异性实时荧光PCR方法。

本发明的主要优点在于：

（1）本发明提出的引物和探针特异性好，宽额鲈样品呈现特异性扩增，其他鱼类样品不能特异扩增。

（2）本发明采用Taqman实时荧光PCR方法来进行宽额鲈成分的鉴定，运用了PCR扩增的高效性、探针杂交的特异性和荧光检测的快速和敏感性。此外，实时荧光PCR检测方法采用完全闭管检测，无需PCR后处理，避免了交叉污染和假阳性现象发生。

因此，本发明所述方法具有操作简单、检测时间短、特异性强、灵敏度高、重现性好等优点，尤其适用于加工鱼肉制品的宽额鲈成分检测，能较好地解决宽额鲈制品的错误标签和以次充好问题。

附图说明

图1是宽额鲈成分实时荧光PCR检测方法的特异性试验结果图。

图2是宽额鲈成分实时荧光PCR检测方法的灵敏度试验结果图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：宽额鲈成分实时荧光PCR检测方法的特异性试验

（一）待测样品

宽额鲈、青石斑鱼、云纹石斑鱼、棕点石斑鱼、豹纹鰓棘鲈、斑鰓棘鲈、驼背鲈、点带石斑鱼、赤点石斑鱼、玳瑁石斑鱼、鳜鱼、花鲢、草鱼、鲫鱼、黑鱼、鲶鱼、罗非鱼、大口黑鲈、红姑鱼、花鲈、黄鳍金枪鱼、三文鱼、真鳕、黄姑鱼、皮氏叫姑鱼、大黄鱼、金线鱼、真鲷、二长棘鲷、横带髭鲷、黄鳍鲷、黑鳍鲷、花尾胡椒鲷、条石鲷、大目鲷、尖嘴魟、条纹斑竹鲨、日本单鳍电鳐、犁头鳐、四指马鲅、鹦嘴鱼、鳗鱼、带鱼、路氏双髻鲨、鼠鲨、青鲨、猪肉、驴肉、牛肉、马肉、鹿肉、羊肉、兔肉、鸭肉、鹅肉、鸡肉、鸽子肉、鹌鹑肉。

（二）检测方法

（1）DNA提取

采用商业化DNA提取试剂盒，如德国QIAGEN公司的Qiagen DNeasy Blood &Tissue Kit (Spin-Column Protocol)或其他试剂盒提取样品DNA。将提取的样品DNA保存于-20 ℃备用。

（2）16S rRNA 基因PCR扩增检测样品DNA质量

以提取的样品DNA为模板，PCR扩增16S rRNA 基因，以确保所提取的DNA质量满足PCR 扩增要求。

所用16S rRNA 基因扩增引物序列为：

5’- CGCCTGTTTATCAAAAACAT -3’ (SEQ ID NO:4) ；

5’- CCGGTCTGAACTCAGATCACGT -3’ (SEQ ID NO:5)。

PCR扩增体系为25 µL：2×PCR 预混液（广州东盛生物科技有限公司）12.5 µL，10µmol/L引物各1 µL，2.5到25.0 ng/µL模板DNA 1 µL，双蒸水补足体积。

PCR扩增条件为：94℃ 2min；94℃ 30s，52℃ 40s，72℃ 60s，35个循环；72℃10min。PCR扩增在PCR仪（Biorad）上进行。

PCR扩增结束后，取10 µL PCR 产物，加10×上样缓冲液1 µL点样进行电泳，琼脂糖凝胶浓度为1.5％。凝胶成像系统观察电泳图谱。若样品产生572 bp条带，说明所提取的DNA质量适合于PCR 扩增；若样品未产生572 bp条带，说明所提取的DNA质量不行，应重新进行DNA提取，直至PCR扩增产生572 bp条带。

（3）Taqman实时荧光PCR反应检测宽额鲈成分

引物序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，Taqman探针序列为SEQ ID NO：3，探针的5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记荧光淬灭基团TAMRA。引物和探针由TAKARA公司合成。

实时荧光PCR反应体系为25 µL：2×PCR Taqman实时荧光PCR预混液 (Fast StartUniversal PCR Master Mix）(Roche公司)12.5 µL；上下游引物（10 μmol/L）各1 µL；探针(10 µmol/L) 1 µL；DNA模板5 µL，双蒸水4.5 µL。

按照上述体系，分别对提取的样品DNA进行实时荧光PCR反应。

实时荧光PCR反应参数为95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，64 ℃ 30 s，共35个循环。

实时荧光PCR扩增反应及结果分析在Stratagene Mx3005P 实时荧光PCR仪（Agilent公司）上进行。

（三）实验结果

以提取的样品DNA为模板，扩增16S rRNA基因，均产生572 bp的扩增条带，表明所有样品抽提的DNA质量满足PCR扩增的要求。

用宽额鲈特异性引物和探针对本实验抽提的所有样品DNA进行Taqman实时荧光PCR反应，实验结果如图1所示，其中，具有典型荧光扩增曲线的为宽额鲈；无典型荧光扩增曲线的为其他鱼肉样品（青石斑鱼、云纹石斑鱼、棕点石斑鱼、豹纹鰓棘鲈、斑鰓棘鲈、驼背鲈、点带石斑鱼、赤点石斑鱼、玳瑁石斑鱼、鳜鱼、花鲢、草鱼、鲫鱼、黑鱼、鲶鱼、罗非鱼、大口黑鲈、红姑鱼、花鲈、黄鳍金枪鱼、三文鱼、真鳕、黄姑鱼、皮氏叫姑鱼、大黄鱼、金线鱼、真鲷、二长棘鲷、横带髭鲷、黄鳍鲷、黑鳍鲷、花尾胡椒鲷、条石鲷、大目鲷、尖嘴魟、条纹斑竹鲨、日本单鳍电鳐、犁头鳐、四指马鲅、鹦嘴鱼、鳗鱼、带鱼、路氏双髻鲨、鼠鲨、青鲨）、其他动物样品（猪肉、驴肉、牛肉、马肉、鹿肉、羊肉、兔肉、鸭肉、鹅肉、鸡肉、鸽子肉、鹌鹑肉）和空白对照（双蒸水）。宽额鲈样品出现典型的荧光扩增曲线，表现为阳性结果，其他样品和空白对照（双蒸水）均未出现扩增，表现为阴性结果。充分说明所设计的引物和探针对宽额鲈表现出良好特异性。

实施例2 宽额鲈成分实时荧光PCR检测方法的灵敏度试验

将宽额鲈鱼肉组织分别与草鱼鱼肉组织混合，配制成宽额鲈相对百分含量（w/w）为10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%和0%的鱼肉组织样品，在制备过程中充分搅匀两种鱼肉组织，保证各相对百分含量的准确性。采用本发明实施例1所述的实时荧光方法，根据实施例1所述的结果判定标准对扩增结果进行判定。

试验结果如图2所示，其中，各扩增曲线分别对应宽额鲈相对百分含量（w/w）为10%、5%、1%、0.5%、0.1 %、0.05%、0.01 %和0%的鱼类组织样品以及空白对照（双蒸水）。结果显示，宽额鲈含量分别为10 %、5%、1 %、0.5%和0.1 %的鱼肉样品有明显特异的扩增曲线，而宽额鲈含量0.05%、0.01 %和0%的鱼肉样品和空白对照均没有扩增。结果表明建立的实时荧光PCR方法可从宽额鲈含量为0.1 %的混合鱼肉样品中成功检测出宽额鲈成分。检测方法具有较高的灵敏度，满足日常检测的要求。

实施例3 实际样品检测结果

选取实际检测样品，样品来源为商业途径采购的鱼肉制品。

采用本发明实施例1 所述方法，检测待测样品中是否含有宽额鲈成分。

样品名称及结果如表1。

由以上检测结果可见，运用本标准方法检测实际样品共30 份。其中检测鱼块、鱼片样品16份，检出含有宽额鲈成分样品6 份；检测含宽额鲈成分的鱼糜、鱼丸6份，检出含有宽额鲈成分样品6份；检测鱼肠、火腿肠等食品8份，未检测出含有宽额鲈成分。以上检测结果均与样品标识相符。由实际应用结果可见，本方法检测食品中宽额鲈具有很好适用性、良好的稳定性，特异性，可以有效地定性鉴定宽额鲈产品，满足食品鉴伪的需求。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 双雅, 陈

<120> 一种用于鉴别宽额鲈成分的实时荧光 PCR引物和探针、试剂盒及检测方法

<130> P14354

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gttggttacg tccttccc 18

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

cgggtaaggg tagcgttgtc t 21

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

cacagtcatt accaacctcc tctc 24

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

cgcctgttta tcaaaaacat 20

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

ccggtctgaa ctcagatcac gt 22

Claims

1.一种用于鉴别待检样品中是否含有宽额鲈成分的实时荧光PCR引物和探针，其特征在于，所述引物序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；所述探针序列如SEQ ID NO：3 所示，其5’端标记报告荧光染料FAM，3’端标记淬灭荧光染料TAMRA。

2.一种用于鉴别待检样品中是否含有宽额鲈成分的实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述引物和探针的试剂盒。

3.权利要求1所述实时荧光PCR引物和探针、权利要求2所述实时荧光PCR检测试剂盒用于鉴别宽额鲈成分的用途。

4.一种用于宽额鲈成分鉴别的实时荧光PCR检测方法，其中所述实时荧光PCR方法为Taqman荧光探针法，其特征在于，使用了权利要求1的引物和探针，或权利要求2试剂盒中的引物和探针进行实时荧光PCR扩增的步骤。

5.权利要求4所述用于宽额鲈成分鉴别的实时荧光PCR检测方法，其特征在于：

从样品中提取DNA为模板；

利用权利要求1的引物和探针，或权利要求2试剂盒中的引物和探针，进行实时荧光PCR扩增；

结果分析并判断。

6.权利要求4或5用于宽额鲈成分鉴别的实时荧光PCR检测方法，其特征在于：所述实时荧光PCR扩增的反应体系为25 μL，即在0.2 mL的PCR反应管中加入2×PCR Taqman实时荧光PCR预混液12.5 μL，10 μmol/L上游引物1 μL，10 μmol/L下游引物1 μL，10 μmol/L探针1 μL，样品基因组DNA 5 μL，双蒸水4.5 μL。

7.权利要求4或5所述用于宽额鲈成分鉴别的实时荧光PCR检测方法，其特征在于：所述实时荧光PCR扩增的反应条件为：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，64 ℃ 30 s，共35个循环。

8.权利要求5所述用于宽额鲈成分鉴别的实时荧光PCR检测方法，其特征在于：所述结果分析并判断是样品出现典型的特异性扩增曲线，且Ct值＜35，即判断为检出宽额鲈成分；如果样品Ct值≥35，则判断为未检出宽额鲈成分。