CN109652565B - 一种鉴别绿海龟和玳瑁制品的扩增引物及其应用和鉴别方法 - Google Patents

一种鉴别绿海龟和玳瑁制品的扩增引物及其应用和鉴别方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及物种分子鉴别技术领域，公开了一种鉴别绿海龟和玳瑁制品的扩增引物及其应用和鉴别方法。本发明所述扩增引物具有如SEQ ID NO:1‑2所示序列。本发明的扩增引物和方法用于特异性地鉴定出绿海龟(C.mydas)和玳瑁(E.imbricata)，该方法耗时短，操作简便，特异性强，可以鉴别海龟类制品等无法从形态学上加以识别的海龟类等物种，为海龟类鉴定提供技术支撑，并为打击海龟类动物非法贸易(海龟类工艺品、非法制品)提供物种鉴定技术支撑。

Description

一种鉴别绿海龟和玳瑁制品的扩增引物及其应用和鉴别方法
技术领域
本发明涉及物种分子鉴别技术领域，具体涉及一种鉴别绿海龟和玳瑁制品的扩增引物及其应用和鉴别方法。
背景技术
DNA条形码(DNA barcoding)是生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的且易扩增的DNA片段。DNA条形码技术是简单的机械重复，只要经过简单培训，上手很快，并且会弥补形态学鉴定特征因趋同和变异导致物种鉴定的不准确性。DNA条形码在新物种或隐存种的发现工作方面做出很大贡献，对于濒危物种的鉴定，可以为保护生物多样性做出了巨大的贡献。
世界现存海龟仅有2科（海龟科和棱皮龟科）6属7种，即绿海龟（Chelonia mydas）、蠵龟（Caretta caretta）、太平洋丽龟（Lepidochelys olivacea）、大西洋丽龟（Lepidochelys kempii）、玳瑁（Eretmochelys imbricata）、平背海龟（Natator depressus）和棱皮龟（Dermochelys coriacea），所有海龟列入CITES公约附录I名录，主要分布于太平洋、大西洋和印度洋的海域。我国有2科5属5种，即绿海龟、蠵龟、玳瑁、太平洋丽龟和棱皮龟，主要分布于黄海、东海及南海海域。
所有海龟种类都具有重要的经济价值，国内外都有过猎的现象存在，越来越多的海龟类艺术品出现，越来越多的不法商贩铤而走险，将海龟动物捕杀并肢解，那么何如鉴定肢解部位、工艺品属于哪个物种是在量刑之前首要完成的工作。
正确认识和区分物种，特别是对那些具有保护意义的种类，分类鉴定工作就显得尤其重要。但是物种性别和发育阶段、隐存种、表型可塑性和遗传多样性等多方面，都会影响传统物形态鉴定方法的结果。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种鉴别绿海龟和玳瑁制品的扩增引物及其应用，使其能够同时扩增绿海龟和玳瑁制品的DNA，并可实现鉴别的目的；
本发明的另外一个目的在于提供利用上述扩增引物进行鉴别绿海龟和玳瑁制品的方法，使的所述方法仅用一对引物就可实现鉴别目的。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种鉴别绿海龟和玳瑁制品的扩增引物，具有如SEQ ID NO:1-2所示序列。
本发明所述扩增引物通过选择绿海龟和玳瑁的特异性片段，并经人为优化选择，使得该扩增引物能够同时扩增出绿海龟和玳瑁的DNA条形码目的片段，PCR产物碱基数均为1111bp，具体序列如SEQ ID NO:3-4所示（依次为绿海龟和玳瑁）。
本发明依据上述扩增引物建立绿海龟和玳瑁制品的分子生物学鉴别方法，包括：
步骤1、提取待测样品的DNA；
步骤2、采用上述技术方案所述扩增引物进行PCR扩增；
步骤3、扩增结果与绿海龟和玳瑁的单倍型DNA条形码（COX1DNA）比对，获得鉴别结果。
其中，所述PCR扩增的反应体系如下：
浓度10ng/ml的模板DNA 1μL，2×Taq MasterMix 12.5μL，10μ mol/L正向和反向引物各1μL，ddH2O 10.5μL。
所述PCR扩增的反应程序如下：
94°C预变性5min；
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE001
72°C延伸10min。
本发明根据海龟COX1DNA基因片段的通用引物对初步形态分类的两种海龟进行PCR扩增测序，并通过Seqman编辑，人为调整优化，经Genbank中BLAST同源性比对，确认为GenBank中两种海龟的目的序列，应用clustalx软件手动设计了包含本发明所述引物在内的2对PCR引物，经过PCR验证，只有本发明所述扩增引物可同时扩增两种海龟目的片段，而另外一对PCR引物无法扩增目的序列。
基于上述技术效果，本发明提出了所述扩增引物在鉴别绿海龟制品和玳瑁制品中的应用或在制备鉴别绿海龟制品和玳瑁制品的试剂盒中的应用。
其中，所述绿海龟制品和玳瑁制品包括龟壳和/或龟肉；其中，龟肉也包括龟皮；
由以上技术方案可知，本发明的扩增引物和方法用于特异性地鉴定出绿海龟(C. mydas)和玳瑁(E.imbricata)，该方法耗时短，操作简便，特异性强，可以鉴别海龟类制品等无法从形态学上加以识别的海龟类等物种，为海龟类鉴定提供技术支撑，并为打击海龟类动物非法贸易（海龟类工艺品、非法制品）提供物种鉴定技术支撑。
附图说明
图1所示为绿海龟和玳瑁的单倍型DNA条形码序列；其中，序列为了方便查看将其分为两行；数字应当竖着看表示碱基位点，每一竖列指的是一个变异位点的突变情况；C. mydas_1-7分别指的是绿海龟的7种单倍型，E. imbricata_1-2指的是玳瑁的两种单倍型；“.”表示与C. mydas_1对应位置的碱基相同；
图2所示为采用本发明扩增引物的玳瑁(E. imbricata)PCR扩增产物图谱，M：DNAmarker；1-7：样品编号；
图3所示为采用本发明扩增引物的绿海龟(C. mydas)PCR扩增产物图谱，M：DNAmarker；1-7：样品编号；
图4所示为采用对照扩增引物的绿海龟(C. mydas)以及玳瑁(E. imbricata)PCR扩增产物图谱；其中，M：DNA marker；1-5：绿海龟样品编号；6-10：玳瑁样品编号。
具体实施方式
本发明公开了一种鉴别绿海龟和玳瑁制品的扩增引物及其应用和鉴别方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述扩增引物及其应用和鉴别方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的扩增引物及其应用和鉴别方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
以下就本发明所提供的一种鉴别绿海龟和玳瑁制品的扩增引物及其应用和鉴别方法做进一步说明。
实施例1：两种扩增引物的对比
本发明根据海龟COX1DNA基因片段的通用引物对初步形态分类的两种海龟进行PCR扩增测序，并通过Seqman编辑，人为调整优化，经Genbank中BLAST同源性比对，确认为GenBank中两种海龟的目的序列，应用clustalx软件手动设计了包含本发明所述引物在内的2对PCR引物：
本发明扩增引物：SEQ ID NO:1-2所示；
对比扩增引物：SEQ ID NO:5-6所示；
上述两对扩增引物均经clustalx软件，在目的片段一致、全部符合引物设计规则下手动设计；
将2种海龟类样品（龟壳）进行DNA提取（根据GeneMark公司Genomic DNAPurification Kit试剂盒使用说明书方法进行），然后按照如下反应体系和程序进行PCR扩增，两对引物扩增结果分别见图2-4。
PCR扩增的反应体系如下：
浓度10ng/ml的模板DNA 1μL，2×Taq MasterMix 12.5μL，10μ mol/L正向和反向引物各1μL，ddH2O 10.5μL。
所述PCR扩增的反应程序如下：
94°C预变性5min；
94°C变性30s；45°C退火30s ；72°C延伸1min；共33个循环；
72°C延伸10min。
由图2和图3结果可知，采用本发明扩增引物均能够扩增出绿海龟和玳瑁的COX1DNA基因片段，检出PCR产物大小为1100-1200bp，结合图1绿海龟和玳瑁的单倍型DNA条形码序列即可鉴别海龟是绿海龟还是玳瑁。
而根据图4结果可知，其只扩增出250bp左右的条带，但与1400bp左右的COX1 基因大小相差过大，故对比扩增引物无法扩增出海龟的COX1 DNA基因片段，遗传信息不完整，无法用于鉴别。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 海南热带海洋学院
<120> 一种鉴别绿海龟和玳瑁制品的扩增引物及其应用和鉴别方法
<130> MP1832909
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cagcccaygc httyatyata 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgytgdggga agaadgtta 19
<210> 3
<211> 1111
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cagcccaygc httyatyata atcttcttca tagtttttgc aattataatt ggtggcttcg 60
gaaattgact tgttccccta ataattggcg caccagacat agcatttcca cgtataaata 120
acataagctt ttgactccta cccccttcac tactactact tctagcatca tcaggaattg 180
aagcaggcgc aggtacaggt tgaacagtat atcccccatt agccggaaac ctggctcacg 240
ccggtgcttc cgtagaccta actatcttct ccctccacct agccggcgta tcttcaatct 300
taggtgccat caacttcatt accacagcaa tcaacataaa atcccccgcc atatcacaat 360
accaaacacc cttatttgta tgatccgtac taatcacagc catcctatta ctactttcac 420
tgccagtact cgccgcaggc attaccatac tacttacaga ccgaaatcta aatacaacct 480
tcttcgaccc ttcaggggga ggagacccaa tcctatacca acacctattc tgattttttg 540
gccaccctga agtatacatc ctaatccttc caggatttgg tataatctct cacatcgtta 600
cctactatgc cggtaaaaaa gaaccattcg gctacatagg aatagtttga gcaatgatat 660
ccattggctt cctaggcttt attgtatgag cccatcacat atttactgta ggaatagacg 720
tagacacacg agcttacttt acatccgcaa caataatcat tgcaattcca acaggagtaa 780
aagtatttag ctgattagcc accctacacg gaggaataat caaatgagat gccgccatac 840
tctgagctct aggcttcatt ttcctcttta ctattggtgg acttacaggc atcgtattag 900
ccaactcatc cttagacatc gtactacacg acacttacta tgtagtagca catttccact 960
atgttctctc aataggagcc gtattcgcca tcatagcagg atttacccac tgattccctc 1020
ttttcacagg atattcacta caccaaacct gagcaaaagt acacttcgga gtactgcgta 1080
caggagttaa tataachttc ttccchcarc a 1111
<210> 4
<211> 1111
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cagcccaygc httyatyata atcttgttta tggtagttcc aattataatt ggtggcttcg 60
gaaattgact tgttccccta ataattggcg caccagacat agcatttcca cgtataaata 120
acataagctt ttgactccta cccccttcac tactactact tctagcatca tcaggaattg 180
aagcaggcgc aggtacaggt tgaacagtat atcccccatt agccggaaac ctggctcacg 240
ccggtgcttc cgtagaccta actatcttct ccctccacct agccggcgta tcttcaatct 300
taggtgccat caacttcatt accacagcaa tcaacataaa atcccccgcc atatcacaat 360
accaaacacc cttatttgta tgatccgtac taatcacagc cgtcctatta ctactttcac 420
tgccagtact cgccgcaggc attaccatac tacttacaga ccgaaatcta aatacaacct 480
tcttcgaccc ttcaggggga ggagacccaa tcctatacca acacctattc tgattttttg 540
gccaccctga agtatacatc ctaatccttc caggatttgg tataatctct cacatcgtta 600
cctactatgc cggtaaaaaa gaaccattcg gctacatagg aatagtttga gcaatgatat 660
ccattggctt cctaggcttt attgtatgag cccatcacat atttactgta ggaatagacg 720
tagacacacg agcttacttt acatccgcaa caataatcat tgcaattcca acaggagtaa 780
aagtatttag ctgattagcc accctacacg gaggaataat caaatgagat gccgccatac 840
tctgagctct aggcttcatt ttcctcttta ctattggtgg acttacaggc atcgtattag 900
ccaactcatc cttagacatc gtactacacg acacttacta tgtagtagca catttccact 960
atgttctctc aataggagcc gtattcgcca tcatagcagg atttacccac tgattccctc 1020
ttttcacagg atattcacta caccaaacct gagcaaaagt acatttcgga gtaatttcag 1080
ccggcgttaa cataachttc ttccchcarc a 1111
<210> 5
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggcacyctat acytma 16
<210> 6
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gwacrtgrgc tggtt 15

Claims (3)

1.一种鉴别绿海龟和玳瑁制品的方法，其特征在于，包括：
步骤1、提取待测样品的DNA；
步骤2、采用具有如SEQ ID NO:1-2所示序列的扩增引物进行PCR扩增；
步骤3、扩增结果与绿海龟和玳瑁的单倍型DNA条形码比对，获得鉴别结果；
所述绿海龟和玳瑁的单倍型DNA条形码如下所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
其中，序列为了方便查看将其分为两行；数字应当竖着看表示碱基位点，每一竖列指的是一个变异位点的突变情况；C. mydas_1- C. mydas_7分别指的是绿海龟的7种单倍型，E. imbricata_1- E. imbricata_2指的是玳瑁的两种单倍型；“.”表示与C. mydas1对应位置的碱基相同。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系如下：
浓度10ng/mL的模板DNA 1μL，2×Taq MasterMix 12.5 μL，10 μmol/L正向和反向引物各1μL，ddH2O 10.5μL。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序如下：
94°C预变性5min；
Figure 501705DEST_PATH_IMAGE003
72°C延伸10min。
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