CN102373283B

CN102373283B - 用于石斑鱼成分鉴别的引物、试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN102373283B
Application number: CN2011103569398A
Authority: CN
Inventors: 陈双雅; 陈伟玲; 徐敦明; 周昱; 王嘉鹤
Original assignee: INSPECTION AND QUARANTINE CENTER OF XIAMEN ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU
Current assignee: INSPECTION AND QUARANTINE CENTER OF XIAMEN ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU
Priority date: 2011-11-11
Filing date: 2011-11-11
Publication date: 2013-05-08
Anticipated expiration: 2031-11-11
Also published as: CN102373283A

Abstract

本发明公开了一种用于石斑鱼成分鉴别的特异性寡核苷酸引物、PCR检测试剂盒和检测方法，所述引物对由正向引物Grof和反向引物Gror组成，其核苷酸序列见SEQIDNo.1和SEQIDNo.2。本发明具有引物特异性好，检测方法快速准确的特点，为进出口鱼类食品安全提供了保证。

Description

用于石斑鱼成分鉴别的引物、试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及用于石斑鱼成分鉴别的特异性寡核苷酸引物，包含本发明的寡核苷酸引物的PCR检测试剂盒，以及用于石斑鱼成分鉴别的检测方法，属于生物技术领域。

背景技术

随着经济的发展和人们生活水平的进步，近些年名优鱼类的消费发展极为迅猛，由于不同品种鱼类的价值差异巨大，错误标签和以次充好等现象越来越多。为保护消费者权益，需要确定产品所用鱼类的真实性和种类，建立一种可靠而简便的鱼类物种鉴定方法。

传统的形态学鉴定方法适合整条鱼的品种鉴定，依赖于鱼的整体形态，一旦进行了加工，如鱼片、鱼糜等，鱼种的形态鉴定将变得很困难。基于DNA的检测方法由于其特异性和高稳定性，在鱼类的物种鉴定中起到了越来越重要的作用。目前在物种鉴定领域应用最广泛的DNA的检测方法包括DNA序列分析、物种特异性PCR、实时荧光PCR、RFLP等。

石斑鱼泛指鲈形目鮨科石斑鱼亚科里的各属鱼类，中国主要为石斑鱼属，部分石斑鱼亦可见于鳃棘鲈属、驼背鲈属等其他属。石斑鱼价格昂贵，经济价值高。制假售假、以次充好的现象频频发生。

国内外学者对石斑鱼物种鉴定的研究较少，Trotta等2005年发表了利用实时荧光PCR进行石斑鱼鉴伪的方法（J Agric Food Chem, 2005, 53, 2039-2045）。陈双雅等2011年发表了应用PCR-RFLP方法鉴定石斑鱼不同品种的方法（色谱，2011, 29, 677-680）。

本申请发明人设计特异性寡核苷酸引物，通过PCR技术建立了石斑鱼成分的检测方法，PCR反应结束后根据特异性扩增DNA片段的位置判定实验样品是否为石斑鱼。

发明内容

本发明的一个目的在于，提供了一种用于石斑鱼成分鉴别的特异性寡核苷酸引物。

本发明的另一个目的在于，提供了一种用于石斑鱼成分鉴别的试剂盒。

本发明的再一个目的在于，提供了一种用于石斑鱼成分鉴别的PCR检测方法。

为了达到上述目的，本发明的技术方案是：

一种用于石斑鱼成分鉴别的特异性寡核苷酸引物，本发明通过分析已报道的石斑鱼16S核糖体核糖核酸（16S ribosomal RNA，16S rRNA）基因序列设计，由正向引物Grof和反向引物Gror组成，所述正向引物的碱基序列SEQ ID No.1和所述反向引物的碱基序列SEQ ID No.2如下。使用本发明的引物对，能够特异、灵敏地扩增出目的片段。

SEQ ID No.1：5’- TgCCCTgTgACTATATgTT -3’

SEQ ID No.2：5’- gTACATTCAgTCCTTgC -3’。

一种用于石斑鱼成分鉴别的PCR检测试剂盒，含有权利要求1所述引物的试剂盒。

一种用于石斑鱼成分鉴别的PCR检测方法，包括如下步骤：

（1）根据上述引物的核苷酸序列信息合成引物Grof和Gror，将上述引物分别配制成浓度为10 μmol/L的溶液作为试剂盒，备用。

（2）提取鱼的肌肉组织的基因组DNA溶液备用。

（3）以样品基因组DNA为模板，利用所述的特异性寡核苷酸引物Grof和Gror进行PCR扩增，反应结束后凝胶电泳检测扩增产物，根据是否出现323 bp的特异性PCR扩增条带判定结果。

所述的PCR反应体系为25 μL，即在0.2 mL的PCR反应管中加入2.5μL 10×PCR 缓冲液2.5 μL MgCl₂（25 mmol/L），2.5 μL dNTP（2.5 mmol/L），0.2 μL DNA聚合酶（5 U/μL），1 μL Grof（10 μmol/L），1 μL Gror（10 μmol/L），1 μL 基因组DNA，14.3 μL超纯水。反应条件为：95 ℃，5 min；94 ℃ 1 min，60 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，共40个循环；72 ℃ 延伸7 min。

所述的判定结果是根据电泳出现323 bp的特异性PCR扩增条带作为检出石斑鱼成分的结论。

本发明的有益效果为：本发明根据石斑鱼16S rRNA基因序列设计特异性寡核苷酸引物，利用PCR方法鉴别石斑鱼成分；本发明检测方法能够快速准确地判断样品是否有石斑鱼成分，为食品安全提供了保证。本发明具有特异性好、检测方法快速简便、准确性高、灵敏度高的特点。

附图说明

图1是本发明PCR检测10种石斑鱼的试验结果；1－10依次为斑鳃棘鲈（Plectropomus maculatus）、豹纹鳃棘鲈（Plectropomus leopardus）、驼背鲈（Cromileptes altivelis）、宽额鲈（Promicrops lanceolatus）、玳瑁石斑鱼（Epinephelus quoyanus）、赤点石斑鱼（Epinephelus akaara）、云纹石斑鱼（Epinephelus moara）、棕点石斑鱼（Epinephelus fuscoguttatus）、点带石斑鱼（Epinephelus coioides）和青石斑鱼（Epinephelus awoara）的PCR产物电泳结果，均产生323 bp条带；

图2是本发明石斑鱼成分 PCR检测方法的灵敏度试验结果。1－7依次为石斑鱼含量分别为10 %、 5 %、1 %、0.5 %、0.1 %、0.05 %和0.01%的鱼肉样品的PCR检测结果。

具体实施方式

1. 首先进行引物的设计：

本实施例的用于鉴别石斑鱼成分PCR检测方法的引物，根据石斑鱼16S基因序列（Genebank序列号JF750749、JF750750、JF750751、JF750752、JF750753、JF750756、JF750755、JF750757），采用引物设计软件Primer 5.0设计而成。引物由正向引物Grof和反向引物Gror组成，其中正向引物Grof的序列SEQ ID No.1和反向引物Gror的序列SEQ ID No.2如下：

SEQ ID No.1：5’- TgCCCTgTgACTATATgTT -3’

SEQ ID No.2：5’- gTACATTCAgTCCTTgC -3’。

2. 其次是引物的合成：

根据上述核苷酸序列信息由TAKARA公司合成引物Grof和Gror。将上述引物分别配制成浓度为10 μmol/L的溶液作为试剂盒，备用。

3. 再是基因组DNA的提取（现有技术）：

1）取鱼的肌肉组织剪碎后，用液氮充分研磨混匀。从中取约25 mg置于灭菌的1.5 mL离心管中，按照QIAGEN DNeasy血液和组织DNA提取试剂盒制备样品的基因组DNA溶液。

2）加入180 μL ATL缓冲液和20 μL蛋白酶K，漩涡混匀，56 ℃水浴约1 h，并不断摇动，至组织完全消化。

3）加入200 μL AL缓冲液，漩涡混匀。加入200 μL 无水乙醇，再次混匀。

4）将离心管中的溶液转移至置于2 mL收集管中的DNeasy Mini spin column柱中，12 000 rpm离心1 min，弃收集管和管中的离心液体。

5)将spin column柱套在新的2 mL收集管中，加入500 μL AW1缓冲液，12 000 rpm离心1 min，弃收集管和管中的离心液体。

6）将spin column柱套在新的2 mL收集管中，加入500 μL AW2缓冲液，12 000 rpm离心3 min，弃收集管和管中的离心液体。

7）将spin column柱置于新的1.5 mL离心管中，加入100 μL 65 ℃预热的AE缓冲液溶解DNA，室温静置2 min。

8）12 000 rpm离心2 min。离心管中的液体即为提取的DNA模板。检测DNA浓度及质量（DNA浓度不低于0.05 mg/L），- 20 ℃保存备用。

4. 再是PCR扩增：

1）PCR反应体系和反应条件

以上述提取的基因组DNA为模板，进行PCR反应。

PCR反应体系为25 μL，即在0.2 mL的PCR反应管中加入2.5μL 10×PCR 缓冲液，2.5 μL MgCl₂（25 mmol/L），2.5 μL dNTP（2.5 mmol/L），0.2 μL DNA聚合酶（5 U/μL），1 μL Grof（10 μmol/L），1 μL Gror（10 μmol/L），1 μL 基因组DNA，14.3 μL超纯水。

将样品管放入PTC-200 PCR仪（美国Bio-Rad公司），设置反应条件为：95 ℃，5 min；94 ℃ 1 min，60 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，共40个循环；72 ℃ 延伸7 min。

2）PCR扩增产物的电泳检测

用1×TAE电泳缓冲液制备1~1.5 %的琼脂糖凝胶。取10 μL PCR扩增产物与1μL 10×上样缓冲液混合后，在凝胶板上的孔中点样。用100 bp的DNA Marker做分子量标记。设置电压（3V/cm~5V/cm），电泳时间为50 min~60 min。用凝胶成像仪（Alpha Imager EP）拍照记录。

采用上述正向引物Grof和反向引物Gror特异性PCR扩增的石斑鱼16S基因片段长度为323 bp，根据样品是否产生323 bp的PCR扩增条带判定样品中是否含有石斑鱼成分。

3）用于石斑鱼成分鉴别的PCR方法的特异性确定

取不同品种石斑鱼10份，其他常见鱼类30份，按上述方法分别提取基因组DNA，并进行PCR扩增，凝胶电泳检测结果。结果显示10个石斑鱼品种均特异性产生323 bp 的扩增条带，检测结果如图1所示。其他30种鱼中均未产生323 bp 的扩增条带。表明建立的PCR方法具有良好的特异性，可用于石斑鱼成分的检测。

4）用于石斑鱼成分鉴别的PCR方法的灵敏度确定

将青石斑鱼组织与花鲈组织混合，配制成青石斑鱼相对百分含量（w/w）为10 %、5 %、1 %、0.5 %、0.1 %、0.05 %、0.01 %的鱼类组织样品，按实施例2方法分别提取基因组DNA，再按实施例3的方法进行PCR扩增，凝胶电泳检测结果。检测结果如图2所示。表明建立的PCR方法可从石斑鱼含量为0.05 %的样品中成功检测出石斑鱼。具有较高的灵敏度，符合检测的要求。

Claims

1.一种用于石斑鱼成分鉴别的特异性寡核苷酸引物对，由正向引物Grof和反向引物Gror组成，所述正向引物的碱基序列为SEQ ID No.1，所述反向引物的碱基序列为SEQ ID No.2。

2.一种用于石斑鱼成分鉴别的PCR检测试剂盒，其特征在于：含有权利要求1所述引物的试剂盒。

3.一种用于石斑鱼成分鉴别的PCR检测方法，其特征在于：以样品基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的特异性寡核苷酸引物进行PCR扩增，反应结束后凝胶电泳检测扩增产物，根据是否出现323 bp的特异性PCR扩增条带判定结果。

4.如权利要求3所述的一种用于石斑鱼成分鉴别的PCR检测方法，其特征在于：所述的PCR反应体系为25 μL，即在0.2 mL的PCR反应管中加入2.5μL 10×PCR 缓冲液，2.5 μL 浓度为25 mmol/L的MgCl₂，2.5 μL浓度为2.5 mmol/L的dNTP，0.2 μL浓度为5 U/μL的DNA聚合酶，1 μL浓度为 10 μmol/L的Grof，1 μL 浓度为10 μmol/L 的Gror，1 μL 基因组DNA，14.3 μL超纯水；反应条件为：95 ℃，5 min；94 ℃ 1 min，60 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，共40个循环；72 ℃ 延伸7 min。

5.如权利要求3所述的一种用于石斑鱼成分鉴别的PCR检测方法，其特征在于：所述的判定结果是根据电泳出现323 bp的特异性PCR扩增条带作为检出石斑鱼成分的结论。