CN103290105A - 一种猪源性成分实时荧光pcr检测方法及引物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种猪源性成分实时荧光PCR检测方法，包括以下步骤：设计猪特异性引物、内参照GCG-R基因的外部引物和内部引物；PCR扩增内参照GCG-R基因中长度为270bp的基因片段；用DEPC水将基因片段稀释10倍；提取样本中的DNA；采用猪特异性引物、内部引物和稀释后的基因片段对DNA进行猪源性成分实时荧光PCR检测。本发明还公开了一种猪源性成分实时荧光PCR检测方法采用的引物，包括猪特异性引物、外部引物和内部引物。本发明通过引入内参照GCG基因模板及其引物，能够准确、有效、快捷地检测猪源性成分，检测结果准确可靠。与现有鉴定技术相比，本发明可以实现对肉食品中是否含有猪源性成分进行准确、快捷的鉴别。
Description
技术领域
本发明涉及涉及动物物种和动物源性成分鉴定，具体涉及猪源性成分检测，特别涉及一种猪源性成分实时荧光PCR检测方法及引物。
背景技术
随着现代社会对肉制品需求量的不断增大，肉制品的掺杂、掺假行为，动物疫病蔓延，宗教对肉制品的禁忌以及珍稀动物保护等问题，已受到当前社会热切关注。畜禽肌肉种属鉴别与分析技术是打击违法违规行为的科学依据，同时也是保护珍稀动物的有力保障。
目前，主要的动物源性成分检测方法以分子生物学方法最为准确和灵敏。在国内外，已经出现了常见物种的检测试剂盒。但是试剂盒使用的是PCR-SSR，其灵敏度较低，且容易出现假阴性结果。现在发展到实时荧光PCR熔解曲线法，以其快速、灵敏、特异性好等特点成为了鉴别猪源性成分的一种重要方法。SYBRGreen I实时荧光PCR(聚合酶链式反应；Polymerase Chain Reaction)是近年来发展起来的新技术，其中SYBR Green I是一种特异结合双链DAN的染料，结合双链DNA后荧光增强1000倍左右，且对DNA双链结构具有稳定作用，适合于检测PCR扩增产物，能对PCR扩增产物进行连续的检测。而且因不需凝胶电泳检查结果，避免了溴化乙锭(EB)对环境污染和对人体的危害。由于其具有以上的优点，目前该技术已被广泛地应用到很多领域。
线粒体DNA是高等动物唯一的核外遗传物质。以线粒体DNA作为检测的标记基因，具有基因组中无间隔序列，无组织特异性，种内遗传稳定，种间差异明显，具有较高的拷贝数，易于获取等优势。从含量上看，在所有组织细胞中均含有大量线粒体，故可获得大量mtDNA。目前，线粒体DNA序列已广泛应用于物种的遗传分化、群体遗传结构、物种进化、饲料成分监督等领域。因此，使用mtDNA分子标记鉴别畜禽肉食品及饲料动物源性成分与使用核DNA相比，具有灵敏度高、精确度好、快速、降解小、稳定易操作等优势。
采用传统的实时荧光PCR检测方法进行猪源性成分检测，存在以下问题：由于食品中的添加剂(如氯化钠、油脂等)和其它有机物，都会抑制PCR反应，这些抑制剂在抽提DNA过程中，无法避免地进入DNA溶液中，从而可能抑制PCR反应过程，降低PCR扩增效率，造成假阴性的结果，影响检测判断，导致检测结果不够准确。
发明内容
本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种能够准确、有效、快捷地检测猪源性成分的猪源性成分实时荧光PCR检测方法及引物。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
本发明所述猪源性成分实时荧光PCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)设计引物：设计只能扩增猪DNA模板的猪特异性引物，序列如下：
上游引物P1：CTATCCCAGGACGACTAAA，
下游引物P2：TTGTGGCATACCATTGAG；
设计PCR反应体系中内参照GCG-R基因的模板及其外部引物，所述外部引物序列如下：
上游引物P3：TTCCTAGCACTGCCCAACA，
下游引物P4：GACTGGAAACTTTCCACTTG；
设计内参照GCG-R基因的内部引物，扩增产物的长度为125bp，所述内部引物序列如下：
上游引物P5：GCAACTGCTCCTTACCAATGAAA，
下游引物P6：CAGAATGTCAGGCG-RTTCAGATAT；
(2)PCR扩增内参照GCG-R基因中长度为270bp的基因片段；
(3)用DEPC水将步骤(2)所得到的基因片段稀释10倍；
(4)提取样本中的DNA；
(5)采用步骤(1)设计的猪特异性引物、内部引物和步骤(3)中稀释后的基因片段对步骤(4)的DNA进行猪源性成分实时荧光PCR检测。
所述步骤(2)的PCR扩增过程中，PCR扩增反应体系共20μL，其中包括2×PCR Master Mix10μL，引物P3、P4各1μL，猪基因组DNA模板1μL，余量为DEPC水；PCR扩增反应程序为：①预变性95℃3min，②然后95℃30sec，60℃30sec，③72℃延伸1min，35循环，④72℃延伸8min，⑤12℃保存。
所述步骤(3)中，用DEPC水稀释基因片段的方法为：将所述基因片段取出10μL加入90μLDEPC水。
所述步骤(4)中，提取样本中的DNA包括如下步骤：
①取样品0.2g于1.5mL EP管中，用剪刀将肌肉组织剪碎，并加入SDS缓冲溶液500μL，充分震荡摇匀；
②在每个样品中加入16μL的蛋白酶K，60℃水浴消化5h后，加入165μL预热的6mol/mLNaCl溶液，充分混合；
③将样品放在冰上，加入氯仿500μL，将离心管用手摇动10min；
④在4℃、11000r/mm的高速冷冻离心机中离心10min后取出；
⑤离心管中分为3层，上面的水相用移液枪小心转移到另一无菌的离心管中，编号，加入低温处理的无水乙醇直至加满为止，轻轻上下晃动，直到DNA析出，再置于冰上20min；
⑥再在4℃、14000r/min的高速冷冻离心机中离心10min，取出，倒掉上层液体，再加人70％无水乙醇用手指弹起在底部的DNA，进行充分洗涤；
⑦重复洗涤一次，将离心管倒置干燥约2h；
⑧加入100μL灭菌超纯水，保存于4℃的冰箱，完成DNA提取。
所述步骤(5)的猪源性成分实时荧光PCR检测过程中，猪源性成分实时荧光PCR检测反应体系共20μL，其中包括2×SYBR Green PCR Master Mix10μL，引物P1、P2各1μL，引物P5、P6各0.8μL，稀释10倍后的内参照GCG-R基因DNA模板1μL，待检样品DNA模板1μL，余量为DEPC水；猪源性成分实时荧光PCR检测的反应程序为：①预变性95℃2min，②然后95℃30sec，退火60℃30sec，重复35个循环，③以每2秒升高0.2℃的速度，从60℃升至95℃，获得产物的特异性熔解峰。
所述猪源性成分实时荧光PCR检测包括以下三方面检验内容：
(1)特异性检验：以猪、羊、兔、鸡、狗、牛的DNA为模板，利用检测猪源性成分的特异性引物，进行实时荧光PCR检测；
(2)灵敏度检验：将提取的猪DNA模板稀释至含量为原模板量的1％、0.01％、0.001％、0.0001％猪成分样品，进行实时荧光PCR扩增反应；
(3)准确性验证：用猪特异性引物扩增猪、牛、羊、鸡、鸭、兔、狗混合的基因组DNA，DNA产物用于测序检验。
本发明所述猪源性成分实时荧光PCR检测方法采用的引物，包括以下引物：
(1)只能扩增猪DNA模板的猪特异性引物，序列如下：
上游引物P1：CTATCCCAGGACGACTAAA，
下游引物P2：TTGTGGCATACCATTGAG；
(2)内参照GCG-R基因的外部引物，序列如下：
上游引物P3：TTCCTAGCACTGCCCAACA，
下游引物P4：GACTGGAAACTTTCCACTTG；
(3)内参照GCG-R基因的内部引物，序列如下：
上游引物P5：GCAACTGCTCCTTACCAATGAAA，
下游引物P6：CAGAATGTCAGGCG-RTTCAGATAT。
本发明的有益效果在于：
与现有鉴定技术相比，本发明的优势在于：可以实现对食用性动物产品、非食用性动物产品、动物源性饲料及饲料添加剂进行精确的物种鉴定；利用本发明的引物及反应体系，运用SYBR Green I实时荧光PCR熔解曲线法和内参照法，能准确地检测猪源性成分；检测灵敏度和速度都大大提高；此外，一些疫病经过猪传播，通过此方法能很好检测出猪源性成分，从而控制这些疾病病原的传播。
附图说明
图1是为不同材料抽提的基因组DNA的电泳检测图；
图2是本发明所述猪源性成分实时荧光PCR检测方法的特异性实验图；
图3是本发明所述猪源性成分实时荧光PCR检测方法的灵敏性实验图。
图中：A-猪电泳图；B-牛电泳图；C-羊电泳图；D-鸡电泳图；E-鸭电泳图；F-兔电泳图；G-狗电泳图，IPC-GCG峰；1-猪熔解曲线峰；2-牛熔解曲线峰；3-羊熔解曲线峰；4-鸡熔解曲线峰；5-鸭熔解曲线峰；6-兔熔解曲线峰；7-狗熔解曲线峰；8-空白对照；11-含1％猪DNA；12-含0.01％猪DNA；13-含0.001％猪DNA；14-含0.0001％猪DNA。
具体实施方式
下面通过较佳实施例对本发明作进一步具体描述，下述实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围：
实施例：
采用以下步骤进行对猪、羊、兔、鸡、狗、牛的检测验证实验：
(1)采用酚-氯仿方法进行DNA提取猪、牛、羊、鸡、鸭、兔、狗的基因组DNA，电泳检测结果见图1所示；提取的基因组DNA经测定其OD260/OD280值均为1.8左右，说明DNA的纯度和浓度均符合PCR的扩增要求。
(2)实时荧光PCR检测方法特异性引物的设计：
比较GeneBank中公布的各种动物线粒体基因序列，依据其物种保守序列设计出鉴别检测猪源性成分的荧光PCR特异性引物(只能扩增出猪DNA限制性片段，而扩增不出其他动物DNA限制性片段)和内参照基因GCG-R的外部引物和内部引物，引物分别如下：
①只能扩增猪DNA的猪特异性引物，序列如下：
上游引物P1：CTATCCCAGGACGACTAAA，
下游引物P2：TTGTGGCATACCATTGAG；
②内参照GCG-R基因的外部引物，序列如下：
上游引物P3：TTCCTAGCACTGCCCAACA，
下游引物P4：GACTGGAAACTTTCCACTTG；
③内参照GCG-R基因的内部引物，扩增产物的长度为125bp，内部引物的序列如下：
上游引物P5：GCAACTGCTCCTTACCAATGAAA，
下游引物P6：CAGAATGTCAGGCG-RTTCAGATAT。
(3)PCR扩增内参照GCG-R基因中长度为270bp的基因片段：
(3.1)PCR扩增反应体系共20μL，其中包括2×PCR Master Mix10μL，引物P3、P4各1μL，猪基因组DNA模板1μL，余量为DEPC水；
(3.2)PCR扩增反应程序为：预变性95℃3min；然后95℃30s，60℃30s；72℃延伸1min，35循环；72℃延伸8min；12℃保存。
(4)将扩增出来的内参照GCG-R基因270bp的片段270bp，用DEPC水稀释10倍，备用；稀释方法为：用DEPC水稀释基因片段的方法为：将所述基因片段取出10μL加入90μL DEPC水。
(5)按以下步骤提取样本中的DNA：
①取样品0.2g于1.5mL EP管中，用剪刀将肌肉组织剪碎，并加入SDS缓冲溶液500μL，充分震荡摇匀；
②在每个样品中加入16μL的蛋白酶K，60℃水浴消化5h后，加入165μL预热的6mol/mLNaCl溶液，充分混合；
③将样品放在冰上，加入氯仿500μL，将离心管用手摇动10min；
④在4℃、11000r/min的高速冷冻离心机中离心10min后取出；
⑤离心管中分为3层，上面的水相用移液枪小心转移到另一无菌的离心管中，编号，加入低温处理的无水乙醇直至加满为止，轻轻上下晃动，直到DNA析出，再置于冰上20min；
⑥再在4℃、14000r/min的高速冷冻离心机中离心10min，取出，倒掉上层液体，再加人70％无水乙醇用手指弹起在底部的DNA，进行充分洗涤；
⑦重复洗涤一次，将离心管倒置干燥约2h；
⑧加入100μL灭菌超纯水，保存于4℃的冰箱，完成DNA提取。
(6)采用步骤(2)设计的猪特异性引物、内部引物和步骤(4)中稀释后的基因片段对步骤(5)的DNA进行猪源性成分实时荧光PCR检测：
(6.1)猪源性成分实时荧光PCR检测反应体系共20μL，其中包括2×SYBRGreen PCR Master Mix10μL，引物P1、P2各1μL，引物P5、P6各0.8μL，稀释10倍后的内参照GCG-R基因DNA模板1μL，待检样品DNA模板1μL，余量为DEPC水；
(6.2)猪源性成分实时荧光PCR检测的反应程序为：①预变性95℃2min，②然后95℃30sec，退火60℃30sec，重复35个循环，③以每2秒升高0.2℃的速度，从60℃升至95℃，获得产物的特异性熔解峰。
(7)引物特异性检验：
以猪、羊、兔、鸡、狗、牛的DNA为模板，利用检测猪源性成分的特异性引物，进行实时荧光PCR检测。如图2所示，从扩增产物的熔解曲线峰来看，只能从含有猪DNA的样品中才有在79.2℃的特异性熔解曲线峰，然而，在每个样品中都有在75℃的特异性熔解曲线峰，说明所有在食品中提取的DNA中都不含PCR抑制剂。
(8)灵敏度检验：
如图3所示，将提取的猪DNA模板稀释至含量为原模板量的1％、0.01％、0.001％、0.0001％猪成分样品，进行实时荧光PCR扩增反应，熔解曲线分析结果表明实时荧光PCR可以达到的检测最低线为0.001％，而0.0001％则无荧光曲线，即灵敏度为0.001％。
(9)引物准确性验证：
用猪特异性引物扩增猪、牛、羊、鸡、鸭、兔、狗的混合基因组DNA，将DNA产物用于测序检验，测序结果与GeneBank中序列比对，符合度100％。
如序列表所示，该序列长度为245bp，与GenBank中序列比较分析表明，与猪线粒体DNA的CO I基因区段序列完全一致，符合率达到100％。
Claims (7)
1.一种猪源性成分实时荧光PCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)设计引物：设计只能扩增猪DNA模板的猪特异性引物，序列如下：
上游引物P1：CTATCCCAGGACGACTAAA，
下游引物P2：TTGTGGCATACCATTGAG；
设计PCR反应体系中内参照GCG-R基因的模板及其外部引物，所述外部引物序列如下：
上游引物P3：TTCCTAGCACTGCCCAACA，
下游引物P4：GACTGGAAACTTTCCACTTG；
设计内参照GCG-R基因的内部引物，扩增产物的长度为125bp，所述内部引物序列如下：
上游引物P5：GCAACTGCTCCTTACCAATGAAA，
下游引物P6：CAGAATGTCAGGCG-RTTCAGATAT；
(2)PCR扩增内参照GCG-R基因中长度为270bp的基因片段；
(3)用DEPC水将步骤(2)所得到的基因片段稀释10倍；
(4)提取样本中的DNA；
(5)采用步骤(1)设计的猪特异性引物、内部引物和步骤(3)中稀释后的基因片段对步骤(4)的DNA进行猪源性成分实时荧光PCR检测。
2.根据权利要求1所述的猪源性成分实时荧光PCR检测方法，其特征在于：所述步骤(2)的PCR扩增过程中，PCR扩增反应体系共20μL，其中包括2×PCR Master Mix10μL，引物P3、P4各1μL，猪基因组DNA模板1μL，余量为DEPC水；PCR扩增反应程序为：①预变性95℃3min，②然后95℃30sec，60℃30sec，③72℃延伸1min，35循环，④72℃延伸8min，⑤12℃保存。
3.根据权利要求1所述的猪源性成分实时荧光PCR检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中，用DEPC水稀释基因片段的方法为：将所述基因片段取出10μL加入90μLDEPC水。
4.根据权利要求1所述的猪源性成分实时荧光PCR检测方法，其特征在于：所述步骤(4)中，提取样本中的DNA包括如下步骤：
①取样品0.2g于1.5mL EP管中，用剪刀将肌肉组织剪碎，并加入SDS缓冲溶液500μL，充分震荡摇匀；
②在每个样品中加入16μL的蛋白酶K，60℃水浴消化5h后，加入165μL预热的6mol/mLNaCl溶液，充分混合；
③将样品放在冰上，加入氯仿500μL，将离心管用手摇动10min；
④在4℃、11000r/min的高速冷冻离心机中离心10min后取出；
⑤离心管中分为3层，上面的水相用移液枪小心转移到另一无菌的离心管中，编号，加入低温处理的无水乙醇直至加满为止，轻轻上下晃动，直到DNA析出，再置于冰上20min；
⑥再在4℃、14000r/min的高速冷冻离心机中离心10min，取出，倒掉上层液体，再加人70％无水乙醇用手指弹起在底部的DNA，进行充分洗涤；
⑦重复洗涤一次，将离心管倒置干燥约2h；
⑧加入100μL灭菌超纯水，保存于4℃的冰箱，完成DNA提取。
5.根据权利要求1所述的猪源性成分实时荧光PCR检测方法，其特征在于：所述步骤(5)的猪源性成分实时荧光PCR检测过程中，猪源性成分实时荧光PCR检测反应体系共20μL，其中包括2×SYBR Green PCR Master Mix10μL，引物P1、P2各1μL，引物P5、P6各0.8μL，稀释10倍后的内参照GCG-R基因DNA模板1μL，待检样品DNA模板1μL，余量为DEPC水；猪源性成分实时荧光PCR检测的反应程序为：①预变性95℃2min，②然后95℃30sec，退火60℃30sec，重复35个循环，③以每2秒升高0.2℃的速度，从60℃升至95℃，获得产物的特异性熔解峰。
6.根据权利要求1所述的猪源性成分实时荧光PCR检测方法，其特征在于：所述猪源性成分实时荧光PCR检测包括以下三方面检验内容：
(1)特异性检验：以猪、羊、兔、鸡、狗、牛的DNA为模板，利用检测猪源性成分的特异性引物，进行实时荧光PCR检测；
(2)灵敏度检验：将提取的猪DNA模板稀释至含量为原模板量的1％、0.01％、0.001％、0.0001％猪成分样品，进行实时荧光PCR扩增反应；
(3)准确性验证：用猪特异性引物扩增猪、牛、羊、鸡、鸭、兔、狗混合的基因组DNA，DNA产物用于测序检验。
7.一种猪源性成分实时荧光PCR检测方法采用的引物，其特征在于：包括以下引物：
(1)只能扩增猪DNA模板的猪特异性引物，序列如下：
上游引物P1：CTATCCCAGGACGACTAAA，
下游引物P2：TTGTGGCATACCATTGAG；
(2)内参照GCG-R基因的外部引物，序列如下：
上游引物P3：TTCCTAGCACTGCCCAACA，
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上游引物P5：GCAACTGCTCCTTACCAATGAAA，
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| C53 | Correction of patent of invention or patent application | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Zhu Li Inventor after: Gao Fei Inventor after: Pu Qiang Inventor after: Shen Jing Inventor after: Zhang Shunhua Inventor after: Li Xuemei Inventor after: Shen Linyuan Inventor after: Luo Jia Inventor after: Li Xuewei Inventor after: Du Jingjing Inventor before: Gao Fei Inventor before: Jiang Xiaobing Inventor before: Zhu Li Inventor before: Shen Jing Inventor before: Li Xuemei Inventor before: Zhang Shunhua Inventor before: Li Xuewei Inventor before: Li Xuejie Inventor before: Shen Linyuan Inventor before: Lei Huaigang |
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| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: GAO FEI ZHU LI SHEN JING LI XUEMEI ZHANG SHUNHUA LI XUEWEI LI XUEJIE SHEN LIN LEI HUAIGANG JIANG XIAOBING TO: ZHU LI PU QIANG SHEN JING ZHANG SHUNHUA LI XUEMEI SHEN LIN LUO JIA LI XUEWEI DU JINGJING GAO FEI |
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20130911 |