CN109457034A

CN109457034A - 一种基因Gcg在检测火鸡源性成分中的应用及其试剂盒

Info

Publication number: CN109457034A
Application number: CN201811384131.9A
Authority: CN
Inventors: 商颖; 许文涛; 葛长荣; 黄昆仑; 廖国周
Original assignee: Kunming University of Science and Technology
Current assignee: Kunming University of Science and Technology
Priority date: 2018-11-20
Filing date: 2018-11-20
Publication date: 2019-03-12

Abstract

本发明公开一种基因Gcg在检测火鸡源性成分中的应用及其试剂盒，筛选出一个火鸡通用基因Gcg，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其位于火鸡基因组染色体上，单拷贝易定量，在火鸡基因组中拷贝数恒定，不存在等位基因变异，以该基因为靶序列，引入特异性引物和探针作为试剂盒，可快速、灵敏地检测食品中的火鸡源性成分，灵敏度高，特异性强，操作简单、成本低廉，反应结果易于观察，非常适用于现场实时检测，在动物源性食品监督与精准检测肉制品掺假方面应用前景广阔。

Description

一种基因Gcg在检测火鸡源性成分中的应用及其试剂盒

技术领域

本发明涉及生物物种鉴定和PCR检测技术领域，具体的说涉及一种用于检测火鸡成分的内标准基因及其应用。

背景技术

随着社会经济和产品技术加工的发展，很多食品被非法添加各种化学原料、添加剂、激素等，甚至很多商家为谋求高额利益进行食品掺假行为或直接以次充好，这严重危害了消费者的利益和身体健康，因此对食品种类的准确鉴定至关重要。

火鸡作为国外传统节日的主食，是一种高蛋白、低脂肪的超级营养食物，蛋白质含量高达30%，与家鸡相比，火鸡的肉质略粗一些，但营养价值较高。在中国人的营养元素组成中，主要缺乏的就是蛋白质指标，而火鸡的引入恰恰可以弥补这一缺陷。在美国，由火鸡肉和其他肉类混合制成的肉类加工品已经被广大消费者接受。而美国正扩大中国市场，使火鸡肉和其他肉类混合制成的肉类加工品更多地出现在中国消费者的餐桌上，我国火鸡的饲养数量也逐渐上升。

然而越来越多的商家为获取高额利益，用激素和抗体喂养禽类，使其加速增长，饲养过程中在禽饲料中添加禽成分存在传播禽流感的风险，影响畜禽健康生产，威胁畜牧业安全。更有不法商家用便宜的肉制品甚至蛋白制品掺假火鸡肉，以谋取暴力等。而火鸡肉污染可能引发严重食品安全问题，利用火鸡的内标准基因和分子技术检测火鸡肉掺假是一种有效的检测手段。

目前，内标准基因已被广泛地用于鉴别食品掺假，但如何筛选出合适的内标准基因显得尤为重要。目前国内外的肉制品掺假检测技术多是针对线粒体上的基因设计特异引物来进行实时荧光定量PCR扩增，由于线粒体基因为多拷贝基因，其检测灵敏度高，但同时在区分由于销售、运输等过程所产生的无意识交叉污染与有意识的非法添加时存在困扰。另外，高拷贝数线粒体DNA的浓度无法和基因组DNA的浓度相对应，因此无法对样品进行精确定量分析，同时由于线粒体基因同源性极高，难以通过普通PCR实现定性检测。因此，该方法只能借助荧光定量PCR实现肉类掺假的筛选鉴别。若要鉴别低浓度的无意交叉污染和有意非法添加并明确掺假比例实现快速筛查，则要选择染色体上的低拷贝基因作为肉类内标准基因。

发明内容

本发明的目的是提供一种基因Gcg在检测火鸡源性成分中的应用，以基因Gcg作为内标准基因，该内标准基因Gcg在食品或饲料中的火鸡成分鉴定中的应用，基因Gcg的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供一种用于检测火鸡源性成分的试剂盒，以基因Gcg为靶基因建立的试剂盒，包括基因Gcg的特异性引物，采用PCR方法检测内标准基因Gcg的特异性引物，特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，本发明提供上述特异性引物在检测火鸡源性成分中的应用。

所述试剂盒还包括探针，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明是以Gcg基因作为内标准基因在检测火鸡源性成分中的应用，首次在染色体上筛选出火鸡源性内标准基因，且拷贝数为单拷贝。内标准基因的选择一般要求拷贝数低且稳定，一般动物内标准基因常选择在线粒体上，这样的基因拷贝数多，不易于定量。本发明选择染色体上的基因做为内标准基因，其拷贝数地易于定量，相比于线粒体上的基因，突变率更低。本发明采取southern杂交的方式，进行拷贝数的鉴定，Xba 1和 BamH 1酶切的DNA片段中均出现两条条带，将火鸡特异性片段在Ensembl基因信息数据库中比对，除了存在于染色体7号上外，该片段中的39 bp片段在1号染色体上也存在，因此southern杂交出现两条条带。但所需要的完整的目的片段只存在于火鸡的7号染色体上，进而确定了目标Gcg基因的拷贝数为单拷贝。

基于本发明确定的用于检测食品及饲料中火鸡源成分的内标准基因Gcg，本发明设计了用于检测该基因的定性PCR和定量PCR的引物和/或探针，建立了检测火鸡源性成分的相应PCR方法，该方法费时少，特异性好，灵敏度高，操作简单，不需要专业人员操作，结果易于观察，非常适于基层食品监督检验使用。

附图说明

图1为基因同源性分析；

图2为火鸡的Southern杂交结果（图中1-Xba 1酶切火鸡基因组DNA；2- BamH 1酶切火鸡基因组DNA）。

图3为Gcg基因的定性PCR验证特异性（泳道1-23，图1-驴；2-鸭；3-羊；4-野鸡；5-猪；6-牛；7-火鸡；8-马；9-普通家鸡；10-乌鸡；11-鹅；12-狗；13-兔；14-鼠；15-鱼；16-牦牛；17-水牛；18-骆驼；19-貂；20-鹿；21-人；22-猴；23-阴性；M-DNA Marker DL 2000）；

图4为Gcg基因的定量PCR验证特异性（其中1是火鸡）；

图5为Gcg基因的荧光定量PCR扩增曲线（其中1为100ng/μL，2为10ng/μL，3为1ng/μL，4为0.1ng/μL，5为0.01ng/μL，6为阴性，每个浓度做三个平行）；

图6为Gcg基因的荧光定量PCR标准曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制，在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

猪(Sus scrofa),牛(Bos taurus)，羊(Ovis aries)，普通家鸡(Gallus gallus)，野鸡（Phasianuscolchicus），火鸡（Meleagris gallopavo），乌鸡(Gallus domesticus brisson)，鸭(Anas platyrhynchos)，鹅(Goose calicivirus),狗(Canis lupus familiaris)，兔(Oryctolagus cuniculus)，牦牛(Bos mutus)，黄鱼（Pseudosciaena polyactis）为超市购买；马(Equus caballus)，驴(Equus asinus)为北京农贸市场购买；老鼠(Mus musculus)由中国农业大学食品安全与分子生物学实验室提供。水牛(Bubalus bubalis)，貂(Martes zibellina)，骆驼(Camelus ferus)，鹿(Cervus)由天津出入境检验局的李宗梦博士提供；猴(Macaca fascicularis)由中国农业科学院动物所提供；人(Homo sapiens)胎盘组织由空军总医院提供。

实施例1 火鸡源通用内标准基因Gcg的筛选

通过搜索GenBank中关于火鸡的基因信息，对基因信息进行BLASTn和DNAman软件同源性、特异性分析，筛选出Gcg基因，位于火鸡基因组染色体7号上，由图1所示，经BLASTn序列同源性分析，此Gcg基因片段在数据库中基因同源性最低；将火鸡的Gcg基因片段与非火鸡物种DNA序列进行多序列特异性分析，具有较高的火鸡源特异性；最后通过对序列进行整合，确定最终的特异性目标基因Glucagon（Gcg）基因可以作为内标准基因；该Gcg基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例2 火鸡源性成分通用内标准基因的验证

1、针对实施例1筛选的内部基因Gcg，通过Primer Express 3.0设计软件（美国生命技术公司）针对Gcg基因设计PCR及定量PCR引物和探针：

Gcg-F: CTTTTATCAGGTTTTTTTTTTGTTTTTTG，SEQ ID No. 2；

Gcg-R: TGATATCACTTGTGAAGGTGCCAT，SEQ ID No. 3；

Gcg-P: CTTTAATGGCTGAAGAAATGGG，SEQ ID No. 4，其5' 端标记FAM荧光基团和3' 端标记TAMRA荧光基团。

定性PCR检测，使用Gcg-F/R引物对，其PCR扩增产物目的片段长度为198 bp；定量PCR检测，使用Gcg-F/R引物对结合Gcg-P荧光探针；Southern杂交，使用Gcg-F/R引物对，用扩增产物作为杂交探针进行拷贝数检测。

2、火鸡Gcg基因的拷贝数分析

采取southern杂交的方法，对筛选的Gcg基因在火鸡基因组DNA中的拷贝数进行鉴定；结合Ensembl基因信息数据库数据，确定了Gcg基因的拷贝数为单拷贝。

理想的内标准基因在相应的物种中应该拷贝数恒定并不存在等位基因变异。为了鉴定Gcg基因在火鸡中的拷贝数，本发明将一对引物Gcg-F/R扩增一段198 bp DNA片段，该片段作为探针用于Southern blot。用Xba 1和BamH 1分别切割火鸡的基因组DNA，然后和198 bp DNA片段杂交，由图2可知Xba 1和BamH 1酶切的DNA片段中均出现两条条带。

将火鸡特异的基因片段在Ensembl基因信息数据库中比对，除了存在于染色体7号上外，该片段中的39 bp片段在1号染色体上也存在，因此southern杂交出现两条条带，且所需要的完整的火鸡特异性片段只存在于火鸡的7号染色体上，所以该片段在火鸡中为单拷贝。

3、火鸡Gcg基因的特异性鉴定及其等位基因变异的分析

利用设计的引物对Gcg-F/R对1种火鸡物种和21种非火鸡物种（猪、牛、普通家鸡、羊、马、驴、鸭、鹅、狗、野鸡、兔、鼠、鱼、乌鸡、牦牛、水牛、骆驼、貂、鹿、猴、人）进行定性PCR扩增，定性PCR反应体系如表1所示，用2%的琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳分析，PCR扩增反应程序：95ºC预变性5min；95ºC预变性30s， 60ºC预变性45s， 72ºC预变性1min，35个循环；72ºC延伸10min；同时进行定量PCR分析，定量PCR反应体系如表2所示，反应程序：95ºC预变性10min；95ºC预变性15s，60ºC预变性1min，40个循环；60 ºC采集信号。

结果表明，只有火鸡物种能扩增出198 bp的片段，符合所设计引物对应的片段大小，而其它21种非火鸡物种均无特异性扩增条带，由图3所示，用引物Gcg-F/R和探针Gcg-P进行定量PCR对该22种物种进行检测，只有火鸡物种能检测到信号，而21种非火鸡物种没有检测到信号，图4所示，这表明该基因以及对应的引物可以用来特异性地检测火鸡及火鸡源性成分。

表1 定性PCR反应体系

表2 定量PCR反应体系

4、定量PCR灵敏度验证

为了评定荧光定量PCR的灵敏性，将火鸡的基因组DNA浓度10倍稀释7个梯度，分别为50ng/μL，5ng/μL，0.5ng/μL，0.05ng/μL，5pg/μL，0.5pg/μL，0.05pg/μL，进行荧光定量PCR，扩增曲线如图5，取5个点绘制标准曲线，得到的标准曲线如图6所示，当DNA模板浓度最低至10pg时，能检测到荧光信号，因此，该荧光定量体系的检测限是10pg DNA，也就是8个拷贝数，同时给出了关于Cq值与基因组浓度的对数之间线性方程，线性方程为：y = -3.115x +14.936，R² = 0.994，y代表Cq值，x代表基因组浓度的对数值，R²代表线性相关系数。根据R²值可知火鸡基因组DNA的拷贝数和Ct值间具有良好的线性关系，由前面拷贝数鉴定可Gcg基因在火鸡均为单拷贝，由此可推测，该基因和定量 PCR体系也适合用于火鸡的定量检测，其检测限为8个拷贝数。

5、鸡肉加工品检测

为验证内标准基因Gcg以及建立的定量PCR检测技术在实际样品检测过程中的准确性，对市售10种鸡肉加工制品进行检测，测结果显示只有火鸡肉加工品能收集到荧光信号，如表3所示，9种家鸡肉、乌鸡肉和野鸡肉加工品在核酸提取完全的情况下没收集到荧光信号，表明基于Gcg基因建立的火鸡定量检测体系在种间区分方面具有特异性，表明本发明建立的荧光定量PCR方法可以用于实际样品的检测。

表3 鸡肉加工品和混合肉检测结果

序列表

<110> 昆明理工大学

<120> 一种基因Gcg在检测火鸡源性成分中的应用及其试剂盒

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1179

<212> DNA

<213> 火鸡(Gcg)

<400> 1

atctcaggat cctcaaggct ttccatagtt ccagaagaga gaatagcaga tctttctaca 60

actgctgcat atcacttcaa aatataaaag gcaatgaaaa tgaaaagtat ttattttatt 120

gctggactct ttttaatgat agttcaaggc agctggcaaa atcctcttca ggatacagag 180

gagaaatcaa gatcattcaa agcttcccag tctgaaccat tagatgaatc taggcagctg 240

aatgaagtaa agcgtcattc acaaggcacg ttcaccagtg actacagcaa atacttggac 300

agcagacgag ctcaggattt tgtgcaatgg ttaatgagca ctaaaagaaa tggccaacaa 360

ggacaggagg acaaagagaa tgatgaattc ccggaccagc tatcaagcaa tgcaatttcc 420

aagcgtcatt ctgaatttga gagacatgct gaaggcacct acaccagtga tatcacctct 480

tatttggaag gccaagctgc caaagaattc atcgcttggt tagtgaatgg acgaggaaga 540

agagatttcc cagaaaaagc tttaatggct gaagaaatgg gccgaagaca cgcagatggc 600

actttcacaa gtgatatcaa caaaatcctg gatgatatgg ctgccaaaga gttcctaaaa 660

tggctgatta acacaaaagt tacccaaaga gaccttctgg gagaatatca gtaagaatgc 720

aggataaaaa tgggataaat gaagatcttc actgcctgaa ttgccagcta tgaagagatt 780

ctggaatcta tattgtcatt tacattgggt gtaacaaagc tatgtcacct tgcatgccag 840

gaaataattg tagtttcatt taatgttgcc aaaggattat atatggaata cctattatct 900

aaggggtggt tatcaaaata gctttaagat tatgaaagtt ccacttcttt atattttcca 960

cgtatttgga ctgaaataac tccatttata tttacttatg aaattatttt tctaaaaatt 1020

gatttatgca cgcaaatgat tcaatcacca gttattatgt aggggttggc agctgcaaat 1080

gtctgaaaag tgaatatccc tgttgaaacc tttgttataa aaaggctaag ctttaaggat 1140

attaaataat agccttataa ataaattttt tcaagcttc 1179

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

cttttatcag gttttttttt tgttttttg 29

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

tgatatcact tgtgaaggtg ccat 24

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

ctttaatggc tgaagaaatg gg 22

Claims

1.一种基因Gcg在检测火鸡源性成分中的应用，基因Gcg的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种用于检测火鸡源性成分的试剂盒，其特征在于，包括Gcg的特异性引物，特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

3.根据权利要求2所述用于检测火鸡源性成分的试剂盒，其特征在于，还包括探针，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。