CN110904245A

CN110904245A - 一种利用CACA基因鉴定猪肉成分的TaqMan荧光定量PCR方法及其应用

Info

Publication number: CN110904245A
Application number: CN201911335942.4A
Authority: CN
Inventors: 张丽; 严钰澳; 刘彦; 刘婷; 覃瑞; 方莹; 王海英
Original assignee: South Central University for Nationalities
Current assignee: South Central Minzu University
Priority date: 2019-12-23
Filing date: 2019-12-23
Publication date: 2020-03-24
Anticipated expiration: 2039-12-23
Also published as: CN110904245B

Abstract

本发明公开一种鉴定猪肉成分的TaqMan荧光定量PCR方法及其应用，通过基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR技术，利用猪细胞核中的单拷贝基因CACA作为标记基因，建立具有特异性强、灵敏度高的猪肉成分检测的方法。本发明建立的方法可以准确区分猪与其他13种动物和5种植物，对6种市场上的肉制品进行实际检测，可准确判断出是否含有猪源性成分。本发明建立的猪特异性实时荧光定量PCR检测方法可以为混合肉制品中猪源性成分的定性、定量检测提供技术参考。

Description

一种利用CACA基因鉴定猪肉成分的TaqMan荧光定量PCR方法及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种鉴定食品中猪肉成分的荧光定量PCR方法及其应用。

背景技术

猪(Sus scrofa)是全球最广泛的哺乳动物物种之一。属于动物界、脊索动物门、哺乳纲、偶蹄目、猪科、猪属，比啮齿目更接近灵长类动物。根据不同的地理区域可以将猪这一物种分类为16个以上的不同亚种，而家猪作为猪的一个亚种，是猪肉的主要来源，是一种重要的经济动物，例如在湖北省监利县的监利猪、湖北省当阳市的清平猪、湖北省恩施市的黑猪等。但现国内市场上销售的家猪大多利用杜洛克猪、长白猪、大白猪这三种进口猪，通过杂交模式生产三元杂交商品猪为主，所以现在已经无法以传统的方法，例如：通过骨骼、外部比例、毛发及颜色、行为、地理位置的方法来区分不同品种的猪。

许多经过加工、冷冻、冷藏的食品从外观上很难辨别肉类成分，在没有明确标签的情况下，为了经济效益，将商业价值低的肉制品冒充或是掺入价值高的肉制品中，会对消费者进行误导，甚至是欺骗消费者。在某些情况下，部分人群摄入猪肉会导致食物过敏；也有许多人出于宗教信仰，拒绝食用猪肉。因此，由于健康、宗教、过敏或其他方面因素的影响，肉类产品的真实性正逐渐成为消费者、研究人员和肉制品行业关注的主要问题

通常，在现有技术中对于物种的鉴定采用蛋白质鉴定方法或DNA条形码技术。蛋白质鉴定方法是鉴定物种的一种相对成熟及有效的方法，包括电泳、色谱和免疫学检测。基于蛋白质的酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)是免疫学鉴定的一种方法，ELISA是基于抗原抗体特异性反应和酶与底物专一性反应，在肉制品的检测中，可通过肉眼观察反应产物颜色来判断成分物种来源。目前可以通过此方法检测的物种包括牛、猪、马、绵羊、鱼、家禽等。但是，蛋白质检测方法却具有以下限制性：1、不易检测腌制食品和深度加工的食品，因为大部分蛋白质会在动物死亡后或高温、高压等深度加工后发生变性，从而改变其抗原性；2、不适合混合肉制品的检测，因为目前的抗体特异性不显著，可能对不同的动物蛋白质有交叉反应，所以无法通过检测混合肉制品中的蛋白质来推断动物物种来源。

DNA条形码技术也是物种鉴定的方法之一，其方法是利用线粒体基因中编码细胞色素c氧化酶亚基I基因(cytochrome c oxidase subunit 1,COI)的短核酸序列、线粒体中D环区域或者是12S rRNA上的核酸序列。通过对不同物种中的这些核酸序列进行测序和序列比对分析，找到一些具有物种特异性的位点，作为该物种的DNA条形码。目前，已被广泛应用于鉴定鸟类、水生动物、昆虫和哺乳动物。然而，目前对于食品中猪肉成分的检测，大多数都是使用线粒体DNA来鉴定，如猪肉的12S rRNA，猪肉细胞色素c上的基因，线粒体中D环区域上的核苷酸序列。由于不同细胞中线粒体数量不同，线粒体DNA拷贝数在不同组织也会有所不同，因此并不适合进行定量检测。

由此可见，如何获得一种能够代表猪的基因组拷贝数和细胞数DNA分子标记，进而达到对肉制品中的猪肉成分进行精确鉴定和定量检测，是目前急需解决的问题。

发明内容

为了解决现有技术中的问题，发明人通过多次，反复的实验和摸索获得了能够代表猪的基因组拷贝数和细胞数DNA分子标记，设计出灵敏度高，特异性好的扩增引物并摸索出适合该引物的扩增体系和程序，建立能精确鉴定和定量检测肉制品中猪肉成分的TaqMan荧光定量PCR方法。

在一个实施方式中，本发明提供一种鉴定猪肉成分的TaqMan荧光定量PCR方法，其特征在于，所述鉴定方法为上游引物CACAF21，下游引物CACAR162和探针CACAP69扩增猪基因组DNA，所述上游引物CACAF21的序列如SEQ ID NO.1，所述下游引物CACAR162的序列如SEQ ID NO.2，所述荧光探针CACAP69的序列如SEQ ID NO.3。优选的，所述引物也可以以猪特异性基因(GenBank登录号XM_021097549)为扩增靶标，扩增获得鉴定猪肉成分的分子标记。

在一个实施方式中，本发明提供一种鉴定猪肉成分的引物和探针，其特征在于，所述引物为上游引物CACAF21和下游引物CACAR162，所述上游引物CACAF21的序列如SEQ IDNO.1，所述下游引物CACAR162的序列如SEQ ID NO.2，所述荧光探针CACAP69的序列如SEQID NO.3。所述引物和探针的具体序列为

CACAF21：CAGCCACTTCCCAGGATACC；

CACAR162：CCACTGTCCAACACTCGCAC；

CACAP69：ACGCCCTCACTCCAGAACCAGCC。

在一个实施方式中，本发明提供一种鉴定猪肉成分的分子标记在鉴定食品或肉制品中猪肉成分中的用途。

在一个实施方式中，本发明提供一种鉴定猪肉成分的引物在鉴定食品或肉制品中猪肉成分中的用途。

在一个实施方式中，本发明提供一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求2所述的鉴定猪肉成分的引物。优选的，所述上游引物CACAF21的序列如SEQ ID NO.1，所述下游引物CACAR162的序列如SEQ ID NO.2，所述荧光探针CACAP69的序列如SEQ ID NO.3。所述引物的具体序列为

CACAF21：CAGCCACTTCCCAGGATACC；

CACAR162：CCACTGTCCAACACTCGCAC；

CACAP69：ACGCCCTCACTCCAGAACCAGCC。

在一个实施方式中，本发明提供一种鉴定猪肉成分的分子标记在制备鉴定食品或肉制品中猪肉成分的试剂盒中的用途。

在一个实施方式中，本发明提供一种鉴定猪肉成分的引物在制备鉴定食品或肉制品中猪肉成分的试剂盒中的用途。

在一个实施方式中，本发明提供一种鉴定猪肉成分的方法，其特征在于，所述方法的步骤为：

1)提取待鉴定样本的基因组DNA；

2)采用权利要求2的引物对步骤1)中提取的基因组DNA进行扩增；

3)出现特异性扩增的样本，含有猪肉成分。

优选的，所述步骤2)采用TaqMan荧光定量PCR进行扩增，所述荧光定量PCR的反应体系为：DNA模板1μL，Hieff qPCR TaqMan Probe Master Mix 10μL，10μM正、反向引物各0.4μL，10μM探针0.2μL，ddH₂O补足至20μL。

进一步优选的，所述步骤2)采用荧光定量PCR进行扩增，所述荧光定量PCR的反应条件为：95℃预变性1min；95℃变性10s，60℃退火和延伸1min，40个循环；

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、建立了一种基于核酸的检测方法。相比于蛋白质检测，DNA不会受到高温及复杂加工条件的影响，也不会受到混合肉制品的影响，在同种动物同种组织易得到相同检测结果，较为可靠。

2、检测靶标为核基因组中的单拷贝基因，单拷贝基因在动物细胞核中单一存在，该基因可代表猪的基因组拷贝数和细胞数，比现在诸多基于线粒体基因的物种检测，更具定量检测性。

3、建立的定量检测方法仅需观察扩增曲线及Ct值，而无需进行繁琐的凝胶电泳实验，也避免PCR产物开盖过程中造成的污染。操作简便，时间成本较低，特别适合相关检测部门对食品成分检测及对市场上的混合肉成分抽检。

4、本研究建立的基于Taqman探针的荧光定量方法，较染料法特异性更强。

5、本研究建立的猪肉物种特异性PCR检测方法维护肉制品市场有着重要意义，提高一些宗教信仰者还有对猪肉过敏患者对整个肉制品市场标签的信任程度，降低肉制品行业因为错误标签引起的各类问题。

6、本发明为进一步深入研究探索Ct值与更多更复杂混合肉制品中猪肉成分确切含量之间的关系提供了基础。

附图说明

图1 18S rDNA引物对21份动物基因组DNA荧光定量扩增结果，图A为18s rDNA引物对鹅、驴、牛、鱿鱼、骆驼、虾、鸡、扇贝、鼠、鱼、狗、鸭、羊的实时荧光定量PCR扩增结果。图B为18s rDNA引物对黄陂土猪、中粮猪、黑猪(公)、恩施土猪、双汇猪、黑猪(母)、野猪、杂交野猪的实时荧光定量PCR扩增结果。

图2 6对引物对猪基因组DNA的实时荧光定量PCR扩增结果。图A为扩增曲线，图B为熔点曲线；

图3CACAF21-CACAR162-CACAP69引物探针对8个品种的猪实时荧光定量PCR扩增结果；

图4CACAF21-CACAR162-CACAP69引物探针对5种植物和13种其他动物实时荧光定量PCR扩增结果，图A为CACAF21-CACAR162-CACAP69引物对鼠、鸡、鸭、鹅、狗、羊、牛、鱼、驴、鱿鱼、扇贝、虾、骆驼13种动物的实时荧光定量PCR扩增结果；图B为CACAF21-CACAR162引物对大豆、烟草、玉米、芝麻、拟南芥等5种植物的实时荧光定量PCR扩增结果；

图5猪基因组DNA浓度梯度稀释实时荧光定量PCR扩增曲线；

图6猪基因组DNA浓度梯度稀释实时荧光定量PCR扩增绘制标准曲线；

图718s rDNA引物对6种肉制品实时荧光定量扩增结果图；

图8CACAF21-CACAR162-CACAP69引物探针对6种肉制品实时荧光定量扩增结果图，1-6号分别为牛肉春卷、超市散装牛肉丸、市售牛肉水饺、超市散装鱼丸、市售品牌鱼丸和市售品牌虾饺。

具体实施方式

为了更好的理解本发明的技术方案，下面结合实施例详细描述本发明提供的技术方案。

实施例1DNA提取及可扩增性实验

1.实验材料

1.1动物材料

进行实验的8个不同品种的猪(Sus scrofa)(恩施黑猪(公)、恩施黑猪(母)、恩施土猪、黄陂土猪、双汇猪肉、中粮猪肉、野猪、杂交野猪)。其他13种不同动物的材料分别有：牛(Bovine)，羊(Caprinae)，驴(Equus asinus)，骆驼(Camelus bactrianus)，鸡(Gallusdomesticus)，鸭(Anatinae)，狗(Canis lupus familiaris)，鼠(Muroidea)，鱼(Piscium)，鱿鱼(Todarodespacificus)，虾(Fenneropenaeuschinensis)，扇贝(Patinopectenyessoensis)，鹅(Ansercygnoidesorientalis)。

1.2酶与试剂

Hieff qPCR SYBR Green Master Mix(实时荧光定量PCR扩增预混和溶液)购自上海翊圣生物技术有限公司，货号为11201ES03。

氯仿、异戊醇、乙醇、NaCl为国产分析纯，均购于国药集团化学试剂有限责任公司，Tris、EDTA、CTAB、SDS等购于Sigma-Aldrich。

本实验所需要的引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3实验仪器

实时荧光定量PCR仪：CFX Connect(BIO-RAD)；

超微量紫外分光光度计：NanoPhotometer-N80(Implen)；

其它仪器包括：恒温水浴锅、离心机、涡旋仪、超纯水仪等。

2.实验方法

2.1动物基因组DNA的提取

动物基因组DNA采用手提法，具体操作如下：

1、称取1-2g待测样本剔除动物组织中的结缔组织和脂肪，将其剪成小碎片，放入研钵。

2、缓慢向研钵中加入液氮，迅速研磨，直至样品磨成细小的粉末状为止。

3、取50mg粉末转入1.5mL灭菌离心管中。

4、加入400μL已预热到55℃的DNA提取液，用悬臂式搅拌器快速搅拌10-15sec，再用漩涡混合器混匀30sec。

5、再加入8μL蛋白酶K，用手掌式离心机离心10sec，旋涡式混合器混匀30sec，将离心管转入65℃水浴，温育2h，温育过程中每隔10min颠倒混匀数次。

6、加入300μL NaCl，在漩涡混合器上高速混合30sec，用离心机10000rpm离心30min，取上清液于新的1.5mL离心管中。

7、加入等体积的异丙醇，用旋涡式混合器颠倒混匀约30sec后，置于-20℃冰箱1h。

8、取出离心管后，用离心机10000rpm离心15min，弃上清液。

9、取500μL70％乙醇洗涤沉淀，静置30min，再用离心机离心1min后倒掉乙醇，干燥后将其溶于100μL ddH₂O中。

10、将提取好的DNA，放于4℃冰箱储存，若要长期存放放置于-20℃冰箱。

2.2实时荧光定量PCR扩增

以1.1中所述的动物材料的基因组DNA为模板，用18S rDNA引物对动物基因组DNA用实时荧光定量PCR方法进行扩增，根据扩增曲线和熔点曲线判断所提取的基因组DNA的可扩增性。引物信息和扩增片段大小见表1所示：

表1 18S rDNA引物信息和扩增片段大小

实时荧光定量PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火和延伸30s，40个循环；65-95℃每隔0.5℃读板一次，16℃保温。

实时荧光定量PCR反应体系为：DNA模板1μL，Hieff qPCR SYBR Green Master Mix10μL，10μM正、反向引物各0.4μL，ddH₂O补足至20μL。

3.实验结果

3.1动物基因组DNA浓度

用超微量紫外分光光度计测定所提取的动物基因组浓度的大小及纯度，测定结果见表2，由表可知所提取的动物基因组DNA的浓度和纯度都满足扩增要求。

表2不同样品DNA浓度测定结果

3.2动物基因组DNA可扩增性

利用引物18S rDNA F、18S rDNA R对提取的动物基因组DNA进行实时荧光定量PCR扩增，熔点曲线中的熔链温度及扩增曲线中的Ct值结果如图1、表3。这表明提取的13种其他动物、8种猪肉的基因组DNA对引物18S rDNA F、18S rDNA R均有扩增，另外，Ct值均小于36，表明所有样品基因组DNA浓度和纯度满足实时荧光定量PCR扩增要求，具有可扩增性。

表3 21份动物基因组DNA实时荧光定量PCR扩增结果

实施例2特异性扩增猪源成分的引物筛选

1.实验材料

1.1猪基因组DNA

1.2酶与试剂

分子生物学试剂，Hieff qPCR SYBR Green Master Mix(实时荧光定量PCR扩增预混和溶液)购自上海翊圣生物技术有限公司，货号为11201ES03。

PCR引物由武汉生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3实验仪器

实时荧光定量PCR仪：CFX Connect(BIO-RAD)；

超微量紫外分光光度计：NanoPhotometer-N80(Implen)；

2.实验方法

2.1引物的设计

以通过Blast分析比对得到的猪特异性基因(GenBank登录号XM_021097549)为扩增靶标，设计引物。引物如表4所示，可组成6对引物组合，分别是CACAF21-CACAR162，CACAF21-CACAR172，CACAF61-CACAR162，CACAF61-CACAR172、CACAF679-CACAR813、CACAF679-CACAR817。

表4所设计的引物序列及扩增片段长度

2.2实时荧光定量PCR

将猪的基因组DNA利用6对不同引物组合进行实时荧光定量PCR扩增，实时荧光定量PCR扩增的方法与实施例1中的方法相同。

3.实验结果

如表5，图2所示，引物CACAF21-CACAR172和CACAF61-CACAR172扩增曲线平行性不好，CACAF679-CACAR817扩增Ct值较高且平行性差，引物CACAF61-CACAR162熔链温度不一致。引物CACAF21-CACAR162对猪基因组DNA的扩增结果中扩增曲线典型、平行性好、信号强，熔点曲线峰锋利且单一。因此引物CACAF21-CACAR162为最佳引物组合。用SYBR Green方法筛选出最佳引物组合，为其设计了TaqMan探针有助于进一步提高检测方法的特异性。

表5所设计的六对引物实时荧光定量PCR扩增结果

实施例3特异性扩增猪源成分的引物CACAF21-CACAR162-CACAP69的种内与种间特性分析

1、实验材料

8个不同品种的猪(Sus scrofa)(野猪、杂交野猪、恩施黑猪(公)、恩施黑猪(母)、恩施土猪、黄陂土猪、双汇猪肉、中粮猪肉)。其他18种不同动植物的材料分别有：牛(Bovine)，羊(Caprinae)，驴(Equus asinus)，骆驼(Camelus bactrianus)，鸡(Gallusdomesticus)，鸭(Anatinae)，狗(Canis lupus familiaris)，鼠(Muroidea)，鱼(Piscium)，鱿鱼(Todarodes pacificus)，虾(Fenneropenaeus chinensis)，扇贝(Patinopectenyessoensis)，鹅(Anser cygnoides orientalis)，大豆(Glycine max)，芝麻(Sesamumindicum)，玉米(Zea mays)，拟南芥(Arabidopsis thaliana)，烟草(Nicotiana tabacum)。

2、实验方法

2.1、植物基因组DNA的提取

植物基因组DNA采用QIANGEN公司的DNA小量提取试剂盒DNeasy Plant Mini Kit(货号69104)，具体操作如下：

1、粉碎样品，取样100mg。

2、加入400μL bufferAP1和4μL RNaseA。涡旋混匀。65℃水浴10分钟。期间混匀2-3次。

3、加入130μL buffer AP2。混匀。冰上放置5分钟。14000rpm离心5min

4、将裂解液转入QIAshredder Mini spin coLumn，用自带的2mL离心管作为收集管。14000rpm离心2min

5、将收集液转入一个新的自备的离心管，加1.5倍体积的BufferAP3/E。吹打混匀。

6、取650μL混合液到DNeasy Mini spin column(柱子最多承受650μL的体积，因此混合液需离心两次)，用自带的2mL离心管作为收集管。8000rpm离心1min，对剩余的样品同样操作。

7、将柱子置于新的2mL离心管，用500μL buffer AW洗脱，8000rpm离心1min，弃洗脱液。

8、再用500μL buffer AW洗脱，14000rpm离心2min，弃洗脱液。

9、将柱子置于新的1.5或2mL离心管中，加入100μL洗脱液Buffer AE。室温放置5min。14000rpm离心1min。重复步骤9。

2.2、动物基因组DNA提取

提取方法与实施例1中的方法相同。

2.3、实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR引物采用CACAF21-CACAR162-CACAP69。

实时荧光定量PCR反应条件为：95℃预变性1min；95℃变性10s，60℃退火和延伸1min，40个循环；

实时荧光定量PCR反应体系为：DNA模板1μL，Hieff qPCR TaqMan Probe MasterMix 10μL，10μM正、反向引物各0.4μL，10μM探针0.2μL，ddH₂O补足至20μL。

3.结果分析

如图3和表6所示，利用本发明的引物探针组合对8种猪肉基因组DNA进行实时荧光定量PCR扩增，均有扩增。表明本发明公布的基因片段及检测方法在猪中具有较好的物种内稳定性。

如图4所示，选取18种其他动植物，利用本发明的引物探针组合对这18份基因组DNA进行实时荧光定量PCR扩增，均无任何扩增，表明本发明公布的基因片段及检测方法中具有较好的物种间特异性。

表6猪的基因组DNA对CACAF21-CACAR162-CACAP69的扩增情况

实施例4特异性扩增猪源成分的引物CACAF21-CACAR162-CACAP69的检测灵敏度分析

1.猪肉基因组DNA。提取方法与实施例1中的方法相同。

2.将猪肉基因组DNA用水梯度稀释至20ng/μL，4ng/μL,0.8ng/μL,0.16ng/μL,0.032ng/μL，0.0064ng/μL利用本发明的引物探针组合进行实时荧光定量PCR扩增，实时荧光定量PCR扩增引物探针采用CACAF21-CACAR162-CACAP69，扩增的方法条件与实施例3的方法相同。

3.结果分析：

梯度稀释的DNA扩增曲线如图5所示，扩增Ct值如表7所示，可检测到的模板DNA浓度低至0.032ng/μL，表明该方法灵敏度良好。根据梯度稀释的扩增曲线(图6A)绘制标准曲线(图6B)，以引物探针组合CACAF21-CACAR162-CACAP69构建的荧光定量PCR检测反应体系中，模板DNA浓度在20ng/μL-0.032ng/μL存在良好的线性关系(y＝-3.508x+30.032，R²＝0.997)，表明该方法可以用于准确的定量检测中。

表7市场猪基因组DNA浓度梯度稀释实时荧光定量PCR扩增结果

实施例5特异性扩增猪源成分的引物探针CACAF21-CACAR162-CACAP69对于实际样品中猪肉成分的检测

1.实验材料

1.1动物样品

市售牛肉水饺、市售牛肉春卷、市售品牌虾饺、市售品牌鱼丸和超市散装鱼丸、超市散装牛肉丸。

1.2酶与试剂

Hieff qPCR TaqMan Probe Master Mix(探针法实时荧光定量PCR扩增预混和溶液)购自上海翊圣生物技术有限公司，货号为11205ES03。

氯仿、异戊醇、乙醇、NaCl为国产分析纯均购于国药集团化学试剂有限责任公司，Tris、EDTA、CTAB、SDS等购于Sigma-Aldrich。

本实验所需要的各种引物由武汉生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3实验仪器

荧光定量PCR仪：CFX Connect(BIO-RAD)；

超微量紫外分光光度计：NanoPhotometer-N80(Implen)；

2.实验方法

2.1动物基因组DNA的提取

动物基因组DNA采用手提法，具体操作如下：

3、取50mg粉末转入1.5mL灭菌离心管中。

7、加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，用旋涡式混合器颠倒混匀约30sec后，置于-20℃冰箱1h。

8、取出离心管后，用离心机10000rpm离心15min，弃上清液。

9、取500μL无水乙醇洗涤沉淀，静置30min，再用离心机离心1min后倒掉乙醇，干燥后将其溶于100μL ddH₂O中。

2.2实时荧光定量PCR扩增

以上述2.1步骤中提取的基因组DNA为模板，以18S rDNA引物进行荧光定量PCR，以ddH₂O为空白对照，证明提取的基因组DNA的可扩增性。18S rDNA引物参见表1所示。

以猪特异性的引物探针组合CACAF21-CACAR162-CACAP69进行荧光定量PCR扩增，以ddH₂O为空白对照，检测样品中是否含有猪源性成分。扩增引物信息和扩增片段大小见表8所示：

表8引物信息和扩增片段大小

3.实验结果

3.1提取的基因组DNA的可扩增性

对市售牛肉丸、市售牛肉水饺、市售牛肉春卷、市售品牌鱼丸和超市散装鱼丸、超市散装牛肉丸提取得到的6份基因组DNA以18S rDNA引物进行实时荧光定量PCR的扩增结果如表9、图7所示，均有扩增曲线出现。表明从这些样品中提取得到了可进行荧光定量PCR扩增的基因组DNA。

以引物探针组合CACAF21-CACAR162-CACAP69对提取得到的6份基因组DNA进行实时荧光定量PCR的扩增，结果如表10、图8所示，1-6号分别对应市售牛肉春卷、超市散装牛肉丸、市售牛肉水饺、超市散装鱼丸、市售品牌鱼丸和市售品牌虾饺，除市售品牌虾饺外，其他均对引物探针组合CACAF21-CACAR162-CACAP69有扩增，且Ct值小于36，因此认为含有猪源性成分。实验结果表明，本发明的基于猪特异性序列的引物组合能够准确鉴定出样品中的猪成分。

表9六种肉制品实时荧光定量PCR扩增结果

表10六种肉制品实时荧光定量PCR扩增结果

以上所述仅为本发明的具体实施方案的详细描述，并不以此限制本发明，凡在本发明的设计思路上所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中南民族大学

<120> 一种利用CACA基因鉴定猪肉成分的TaqMan荧光定量PCR方法及其应用

<130> 9

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

CAGCCACTTC CCAGGATACC 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

CCACTGTCCA ACACTCGCAC 20

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ACGCCCTCAC TCCAGAACCA GCC 23

Claims

1.一种鉴定猪肉成分的分子标记，其特征在于，所述分子标记由上游引物CACAF21，下游引物CACAR162和TaqMan探针CACAP69扩增猪基因组DNA获得，所述上游引物CACAF21的序列如SEQ ID NO.1，所述下游引物CACAR162的序列如SEQ ID NO.2，所述TaqMan探针的序列如SEQ ID NO.3。

2.一种鉴定猪肉成分的引物和探针，其特征在于，所述引物为上游引物CACAF21，下游引物CACAR162和TaqMan探针CACAP69，所述上游引物CACAF21的序列如SEQ ID NO.1，所述下游引物CACAR162的序列如SEQ ID NO.2，所述TaqMan探针的序列如SEQ ID NO.3。

3.权利要求1所述的鉴定猪肉成分的分子标记在鉴定食品或肉制品中猪肉成分中的用途。

4.权利要求2所述的鉴定猪肉成分的引物和探针在鉴定食品或肉制品中猪肉成分中的用途。

5.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求2所述的鉴定猪肉成分的引物和探针。

6.权利要求1所述的鉴定猪肉成分的分子标记在制备鉴定食品或肉制品中猪肉成分的试剂盒中的用途。

7.权利要求2所述的鉴定猪肉成分的引物和探针在制备鉴定食品或肉制品中猪肉成分的试剂盒中的用途。

8.一种鉴定猪肉成分的方法，其特征在于，所述方法的步骤为：

1)提取待鉴定样本的基因组DNA；

2)采用权利要求2的引物和探针对步骤1)中提取的基因组DNA进行扩增；

3)出现特异性扩增的样本，含有猪肉成分。

9.根据权利要求8的方法，其特征在于，所述步骤2)采用荧光定量PCR进行扩增，所述荧光定量PCR的反应体系为：DNA模板1μL，qPCR TaqMan Probe Master Mix 10μL，10μM正、反向引物各0.4μL，10μM探针0.2μL，ddH₂O补足至20μL。

10.根据权利要求8-9任意一项的引物，其特征在于，所述步骤2)采用荧光定量PCR进行扩增，所述荧光定量PCR的反应条件为：95℃预变性1min；95℃变性10s，60℃退火和延伸1min，40个循环。