JP5980127B2 - ストレプトアビジン結合磁性粒子及びその製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、ストレプトアビジン結合磁性粒子及びその製造方法、該ストレプトアビジン結合磁性粒子を用いて製造される蛋白質結合磁性粒子及びその製造方法、測定対象成分の測定方法、並びに、測定対象成分の測定用試薬に関する。

診断薬では、ホルモン・癌マーカー・感染症マーカー等の検査対象物質を検出するために固相担体として磁性粒子がしばしば用いられる。このような測定系においては、抗体または抗原（一次プローブ）等が磁性粒子上に結合され、検体中の測定対象物質と結合した後、さらに蛍光物質や化学発光基質、酵素などで標識された二次プローブと結合することにより、定性または定量的に測定対象物質が検出される。

また、近年においては、疾病の早期発見、検査の高精度化、高感度・微量マーカーへの対応等により検査の高感度化が求められている。さらに患者サービスを目的とした検査結果の迅速出力、検査センター化に伴う大量処理化などにより、検査の迅速性も求められるようになってきている。

そこで、このような磁性粒子を用いた測定系における高感度化・迅速化を実現する手段として、一次プローブおよび二次プローブを液相中で反応させ、次に磁性粒子上に結合させる方法がよく用いられる。代表的な例では一次プローブにビオチンを結合させたビオチン標識一次プローブを、試料中の測定対象成分、及び、二次プローブと反応させて、ビオチン標識一次プローブ−測定対象成分−二次プローブからなる複合体を形成させ、次いで、アビジン結合磁性粒子を作用させて、アビジン−ビオチン相互作用により、磁性粒子上に当該複合体を結合させる方法がある。

このようなアビジン結合磁性粒子においては、アビジンと同じ性質を持つストレプトアビジンを用いたストレプトアビジン結合磁性粒子の方がより有用である。ストレプトアビジンはアビジンと同様にビオチンと非常に強く結合し、アビジンよりも変性に強いという特性がある。また、等電点はアビジンが塩基性であるのに対して、ストレプトアビジンは弱酸性または中性であるため、他の蛋白質との非特異的結合が少ないという利点が知られている。このストレプトアビジンを利用したストレプトアビジン結合磁性粒子は多くの用途で利用されている。

しかしながら、磁性粒子上に結合できるストレプトアビジンの量は限られており、１テストあたりの試薬に必要とされるビオチン結合能を得るためには大量のストレプトアビジン結合磁性粒子を用いらなければならず、製造コストがかかる等の問題点があった。さらに、ストレプトアビジン結合磁性粒子を用いる測定においても以下のような問題点があった。
(1)磁性粒子は静置条件下で沈殿してしまうため使用時には分散させる必要があるが、粒子量が多いと分散させるのに時間と労力がかかる
(2)粒子量が多いと磁石で容器の片側に寄せた際にその体積が大きくなり、B/F分離及び洗浄時に内部に閉じ込められた反応液を洗浄する効率が低下する
(3)測定対象成分を検出する際に磁性粒子量が多いと磁性粒子そのものの着色による濁度が増加し、例えば化学発光や蛍光による検出では光学的な遮蔽によりその感度が低下する。

また、ストレプトアビジン結合磁性粒子の量を抑え、ビオチン結合能を必要最小限とした状態においては、検体中に存在するビオチン（ビタミンH）と競合することにより測定における反応が阻害され、正確な検査値を得ることができない可能性が生じる。ビオチンはサプリメントとしての服用、薬剤としての投与があり、しばしばこのような問題が指摘されている。

一方で、この解決手段としていくつかの方法が提案されてきた。一つは、磁性粒子重量あたりの表面積を大きくするため、粒子の粒径を小さくする方法がある。しかしながら、粒径を小さくすると、磁石で粒子を回収する時間が大幅に長くなったり、洗浄工程における洗浄液の吐出・吸引操作で粒子が流れやすくなったりする等の問題がある。特許文献１には検体中の検出対象物質を分離する方法において、温度応答性高分子により表面が修飾された磁性粒子を用いて、平均粒径50〜1,000 nmの磁性粒子においても温度応答性高分子による粒子凝集により、水溶液中から磁性粒子を回収する方法が記載されている。このような粒子は磁性粒子が小さくなることによる反応におけるメリットがある一方、粒子表面が温度応答性高分子により覆われていることによる非特異吸着があり、また凝集させるために特殊な条件下におきかえる工程があった。

また、不溶性担体の表面積を大きくするため多孔質化する方法も提案されている。例えば、特許文献２には磁性粒子の外層に多孔質の層を化学的に形成させる方法が記載されているが、この方法では、抗原と抗体との免疫反応やDNA同士またはDNAとRNAとのハイブリダイゼーションにおいて、表面積あたりの結合能は向上するものの、孔内の反応効率が悪く、期待された性能を得ることは難しかった。

特開２００９−２８７１１号公報 特開２００６−３０７１２６号公報

本発明の目的は、ビオチン結合能の高いストレプトアビジン結合磁性粒子及びその製造方法を提供することにある。また、本発明の別の目的は、ビオチン結合能の高いストレプトアビジン結合磁性粒子を用いて製造される蛋白質結合磁性粒子及びその製造方法、測定対象成分の測定方法、並びに、測定対象成分の測定用試薬を提供することにある。

本発明者らは本課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、表面にアミノ基を有する磁性粒子を含む懸濁液に、ストレプトアビジン存在下にグルタルアルデヒドを添加し、磁性粒子を、ストレプトアビジン及びグルタルアルデヒドと反応させることにより、ビオチン結合能の高いストレプトアビジン結合磁性粒子が得られる、という知見を見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、以下の［１］〜［１２］に関する。

［１］ 磁性粒子上に、ストレプトアビジンどうしが架橋されている構造を有することを特徴とする、ストレプトアビジン結合磁性粒子。
［２］ 以下の工程を含む方法により製造される、［１］記載のストレプトアビジン結合磁性粒子。
（１）表面にアミノ基を有する磁性粒子を含む懸濁液を調製する工程；及び、
（２）工程（１）で調製した懸濁液に、ストレプトアビジン存在下にグルタルアルデヒドを添加し、磁性粒子を、ストレプトアビジン及びグルタルアルデヒドと反応させる工程。
［３］ さらに、以下の工程（３）を含む方法により製造される、［２］記載のストレプトアビジン結合磁性粒子。
（３）工程（２）で調製したストレプトアビジン結合磁性粒子と還元剤とを反応させる工程。
［４］ ［１］〜［３］のいずれかに記載のストレプトアビジン結合磁性粒子と、ビオチン化蛋白質とを用いて製造される、蛋白質結合磁性粒子。
［５］ ［４］記載の蛋白質結合磁性粒子を用いることを特徴とする、試料中の測定対象成分の測定方法。
［６］ ［１］〜［３］のいずれかに記載のストレプトアビジン結合磁性粒子と、ビオチン化蛋白質とを用いることを特徴とする、試料中の測定対象成分の測定方法。

［７］ ［４］記載の蛋白質結合磁性粒子を含むことを特徴とする、試料中の測定対象成分の測定用試薬。
［８］ ［１］〜［３］のいずれかに記載のストレプトアビジン結合磁性粒子、及び、ビオチン化蛋白質を含むことを特徴とする、試料中の測定対象成分の測定用試薬。

［９］ 以下の工程を含むことを特徴とする、ストレプトアビジン結合磁性粒子の製造方法。
（１）表面にアミノ基を有する磁性粒子を含む懸濁液を調製する工程；及び、
（２）工程（１）で調製した懸濁液に、ストレプトアビジン存在下にグルタルアルデヒドを添加し、磁性粒子を、ストレプトアビジン及びグルタルアルデヒドと反応させる工程。
［１０］ さらに、以下の工程（３）を含む、［９］記載の製造方法。
（３）工程（２）で調製したストレプトアビジン結合磁性粒子と還元剤とを反応させる工程。

［１１］ 以下の工程を含むことを特徴とする、蛋白質結合磁性粒子の製造方法。
（１）表面にアミノ基を有する磁性粒子を含む懸濁液を調製する工程；
（２）工程（１）で調製した懸濁液に、ストレプトアビジン存在下にグルタルアルデヒドを添加し、ストレプトアビジン結合磁性粒子を調製する工程；及び、
（３）工程（２）で調製したストレプトアビジン結合粒子と、ビオチン化蛋白質とを反応させる工程。
［１２］ 以下の工程を含むことを特徴とする、蛋白質結合磁性粒子の製造方法。
（１）表面にアミノ基を有する磁性粒子を含む懸濁液を調製する工程；
（２）工程（１）で調製した懸濁液に、ストレプトアビジン存在下にグルタルアルデヒドを添加し、ストレプトアビジン結合磁性粒子を調製する工程；
（３）工程（２）で調製したストレプトアビジン結合磁性粒子と還元剤とを反応させる工程；及び、
（４）工程（３）で調製したストレプトアビジン結合磁性粒子と、ビオチン化蛋白質とを反応させる工程。

本発明により、ビオチン結合能の高いストレプトアビジン結合磁性粒子及びその製造方法、当該ストレプトアビジン結合磁性粒子を用いて製造される蛋白質結合磁性粒子及びその製造方法、測定対象成分の測定方法、並びに、測定対象成分の測定用試薬が提供される。本発明の製造方法により製造されるストレプトアビジン結合磁性粒子、及び、蛋白質結合磁性粒子、並びに、本発明の測定対象成分の測定方法、及び、測定対象成分の測定用試薬は、臨床診断上、有用である。

本発明のストレプトアビジン結合磁性粒子と、市販のストレプトアビジン結合磁性粒子における、磁性粒子上のストレプトアビジンの構造を表すSDS-PAGEの泳動像である。レーン１は分子量マーカーを、レーン２はストレプトアビンを、レーン３はビオチン結合能が2.61 pmol/mm²のストレプトアビジン結合磁性粒子を、レーン４はビオチン結合能が4.95 pmol/mm²のストレプトアビジン結合磁性粒子を、レーン５はビオチン結合能が6.76 pmol/mm²のストレプトアビジン結合磁性粒子を、レーン６は市販のストレプトアビジン結合磁性粒子Dynabeads T1（ダイナル社製）を、レーン７は市販のストレプトアビジン結合磁性粒子BE-M08/10（メルク社製）を表す。バンドＡは単量体を、バンドＢは二量体を、バンドＣは三量体を、バンドＤは四量体を、バンドＥは高次架橋体を表す。 本発明のストレプトアビジン結合磁性粒子の分散性を示す写真である。上は、静置した状態のストレプトアビジン結合磁性粒子を、下は、転倒混和25回後のストレプトアビジン結合磁性粒子の分散状態を表す。

１．ストレプトアビジン結合磁性粒子
本発明のストレプトアビジン結合磁性粒子は、磁性粒子上に、ストレプトアビジンどうしが架橋されている構造を有することを特徴とする。ストレプトアビジンは四量体構造を取っており、単量体どうしは非共有結合により結合している。本発明のストレプトアビジン結合磁性粒子においては、磁性粒子上で、この四量体構造のストレプトアビジンどうしがグルタルアルデヒドを介して共有結合し、架橋構造を取っている。ストレプトアビジンは、グルタルアルデヒドを介して磁性粒子のアミノ基と結合している。より詳細には、四量体構造のストレプトアビジンのうちの一部が、グルタルアルデヒドを介して磁性粒子のアミノ基と結合している。このストレプトアビジンの架橋構造は、例えばストレプトアビジン結合磁性粒子を1%のSDS溶液に置換し、60℃で1時間処理することによって、磁性粒子上に結合していたストレプトアビジンのサブユニット間結合を解離させ、SDS-PAGE（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）、ゲル濾過HPLC等により確認することができる。SDS-PAGEは、電気泳動により蛋白質を大きさに依存して分離する方法であり、試料をSDSで変性させた後、変性した蛋白質をポリアクリルアミドゲル電気泳動に供して、得られた泳動像から、蛋白質の分離、同定を行う方法である。SDS-PAGEとしては、ストレプトアビジンの架橋構造を確認できる方法であれば特に制限はなく、例えばバイオ実験イラストレイテッド５（細胞工学別冊 秀潤社）に記載されている方法等が挙げられる。

SDS-PAGEにおいて、四量体構造のストレプトアビジンは、SDS存在下での変性処理により、その四量体構造がほどかれる。もしも磁性粒子上のストレプトアビジンどうしが架橋構造を取っていないのであれば、SDS存在下での変性処理により得られる分解物は、ストレプトアビジン由来の単量体のみとなる。一方、磁性粒子上のストレプトアビジンどうしが架橋構造を取っているのであれば、SDS存在下での変性処理により、ストレプトアビジン由来の単量体に加え、ストレプトアビジンの架橋構造に関わった二量体、三量体、さらには高次の多量体が得られることになる。従って、SDS-PAGEにより、ストレプトアビジン由来の単量体、二量体、三量体、及び、高次の多量体に起因するバンドが見られる場合には、磁性粒子上に、ストレプトアビジンの架橋構造が形成されていることになる。

本発明のストレプトアビジン結合磁性粒子は、磁性粒子上にストレプトアビジンどうしが架橋されている構造を有しているため、ビオチン結合能が高い。本発明のストレプトアビジン結合磁性粒子の粒子あたりのビオチン結合能は、通常、0.5〜10 pmol/mm²であり、2〜9 pmol/mm²が好ましく、4〜8 pmol/mm²が特に好ましい。本発明のストレプトアビジン結合磁性粒子は、また、分散性が良いという優れた性質を有する。ストレプトアビジン結合磁性粒子の分散性は、例えばキュベットに保存し、沈降させた状態のストレプトアビジン結合磁性粒子を転倒混和させた後のキュベット内の状態を目視で確認すること等で、評価することができる。

本発明のストレプトアビジン結合磁性粒子における、粒子あたりのビオチン結合能は、ビオチン結合能を測定し得る方法であれば、いかなる方法によっても測定することができ、例えば一定量の蛍光標識されたビオチンを一定量のストレプトアビジン結合磁性粒子と反応させ、磁石でストレプトアビジン結合磁性粒子を収集した後に、一定量の上清を採取し、採取された上清の蛍光強度を測定し、得られた測定値を、予め作成された蛍光強度とビオチン濃度との関係を示す検量線に照らし合わせることにより算出することができる。

本発明のストレプトアビジン結合磁性粒子において、ストレプトアビジンは、天然由来のものでも、遺伝子組み換え体でもよいが、遺伝子組み換え体が好ましい。

本発明のストレプトアビジン結合磁性粒子において、ストレプトアビジンが固定される磁性粒子は、表面にアミノ基を有する磁性粒子である。本発明における表面にアミノ基を有する磁性粒子は、本発明のストレプトアビジン結合磁性粒子を製造し得るものであれば特に制限はない。本発明における、表面にアミノ基を有する磁性粒子の粒子構造としては、例えば粒子の内部に磁性体を含有し、外層が有機ポリマーなどから成るコア・シェル構造の磁性粒子、外層を含まず磁性体が有機ポリマーに不均一に分散した構造の磁性粒子、磁性体のみから成るクラスター状の磁性粒子等が挙げられる。表面にアミノ基を有する磁性粒子の具体例（市販品）としては、例えばアミノ基タイプEstapor磁性粒子（メルク社製）等が挙げられる。

磁性粒子中に含まれる磁性体は、残留磁化が少なく、超常磁性の磁性体微粒子が好ましく、例えば四三酸化鉄(Fe₃O₄)、γ−重三二酸化鉄(γ-Fe₂O₃)等の各種フェライト、鉄、マンガン、コバルト、クロムなどの金属またはこれら金属の合金等が用いられる。

有機ポリマーと磁性体から成る磁性粒子中の磁性体の含有量は、磁性粒子全体の重量に占める割合が10重量%以上であるのが好ましく、30〜60重量%であることがより好ましい。

磁性粒子の形状としては、例えば球状、針状等が挙げられ、球状が好ましい。磁性粒子の粒径は、例えば0.1〜5μm等が挙げられ、好ましくは0.5〜3μmである。

２．ストレプトアビジン結合磁性粒子の製造方法
本発明のストレプトアビジン結合磁性粒子の製造方法は、以下の工程を含有する製造方法である。
（１）表面にアミノ基を有する磁性粒子を含む懸濁液を調製する工程；及び、
（２）工程（１）で調製した懸濁液に、ストレプトアビジン存在下にグルタルアルデヒドを添加し、磁性粒子を、ストレプトアビジン及びグルタルアルデヒドと反応させる工程。

本発明の製造方法を用いることにより、本発明のストレプトアビジン結合磁性粒子を製造することができる。
（１）磁性粒子含有懸濁液を調製する工程
表面にアミノ基を有する磁性粒子を含む懸濁液は、表面にアミノ基を有する磁性粒子を水性媒体に添加することにより、又は、水性媒体に表面にアミノ基を有する磁性粒子を添加することにより調製することができる。表面にアミノ基を有する磁性粒子としては、例えば前述の、表面にアミノ基を有する磁性粒子等が挙げられる。水性媒体としては、表面にアミノ基を有する磁性粒子を懸濁し得る水性媒体であれば特に制限はなく、例えば蒸留水、精製水、緩衝液等が挙げられる。水性媒体のpHは、通常pH4.5〜7であり、pH5〜6が好ましい。水性媒体として緩衝液を用いる場合には、設定するpHに応じた緩衝剤を用いることが望ましい。緩衝液に用いる緩衝剤としては、例えば、酢酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、グッドの緩衝剤等が挙げられる。

グッドの緩衝剤としては、例えば２−モルホリノエタンスルホン酸(MES)、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン(Bis-Tris)、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）(PIPES)、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸(ACES)、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸(MOPSO)、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸(BES)、３−モルホリノプロパンスルホン酸(MOPS)、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−アミノエタンスルホン酸(TES)、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸(HEPES)、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸(DIPSO)、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸(TAPSO)等が挙げられる。

また、水性媒体中に懸濁される表面にアミノ基を有する磁性粒子は、事前に洗浄されたものでもよい。表面にアミノ基を有する磁性粒子の洗浄は、例えば表面にアミノ基を有する磁性粒子を容器内で分散液に添加し、表面にアミノ基を有する磁性粒子を分散させた後、磁石により表面にアミノ基を有する磁性粒子を収集し、容器内に残った分散液を吸引して除去することにより行うことができる。分散液としては、例えば界面活性剤を含む水溶液等が挙げられる。分散液のpHとしては、通常pH4.5〜7であり、pH5〜6が好ましい。水溶液に使用される水性媒体としては、例えば前述の水性媒体等が挙げられる。界面活性剤としては、は、磁性粒子を分散し得るものであれば特に制限はなく、例えば陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤等が挙げられる。界面活性剤の分散液中の濃度は、磁性粒子を分散し得る濃度であれば特に制限はなく、例えば0.01〜5.0%である。

（２）磁性粒子と、グルタルアルデヒド及びストレプトアビジンとの反応工程
工程（２）は、工程（１）で調製された表面にアミノ基を有する磁性粒子を含む懸濁液に、ストレプトアビジン存在下にグルタルアルデヒドを添加し、磁性粒子を、ストレプトアビジン及びグルタルアルデヒドと反応させ、磁性粒子上に、ストレプトアビジンが架橋された構造を形成させる工程である。ストレプトアビジンが架橋された構造は、ストレプトアビジンどうしが、グルタルアルデヒドを介して共有結合することにより形成される。ここで、グルタルアルデヒドをストレプトアビジン存在下に添加するとは、グルタルアルデヒドを添加する際にストレプトアビジンが存在することを意味し、ストレプトアビジンを磁性粒子の懸濁液に添加した後にグルタルアルデヒドを連続的に添加する場合や、グルタルアルデヒドとストレプトアビジンとを同時に磁性粒子の懸濁液に添加する場合も包含する。

添加されるグルタルアルデヒドの量は、本発明のストレプトアビジン結合磁性粒子を製造し得る量であれば特に制限はなく、通常、磁性粒子100 mgに対して0.1〜1.0 mgであり、0.35〜0.6 mgが好ましい。
添加されるストレプトアビジンの量は、本発明のストレプトアビジン結合磁性粒子を製造し得る量であれば特に制限はなく、通常、磁性粒子100 mgに対して0.2〜25 mgであり、10〜15 mgが好ましい。

反応液中の磁性粒子の濃度は、本発明のストレプトアビジン結合磁性粒子を製造し得る濃度であれば特に制限はなく、通常、20〜80 mg/mLであり、40〜60 mg/mLが好ましい。

反応温度は、通常、0〜40℃で、27.5〜37.5℃が好ましく、35℃が特に好ましい。反応時間は、通常4〜24時間であり、8〜20時間が好ましく、18時間が特に好ましい。

工程（２）で得られた反応混合物そのものも、本発明のストレプトアビジン結合磁性粒子として使用することができるが、工程（２）で得られた反応混合物中の磁性粒子を磁石により収集し、磁性粒子以外の溶液を除去した後、洗浄液により洗浄して得られる磁性粒子も、本発明のストレプトアビジン結合磁性粒子として使用することができる。洗浄液としては、本発明のストレプトアビジン結合磁性粒子以外の物質を洗浄し得る洗浄液であれば特に制限はなく、例えば前述の水性媒体等が挙げられる。また、蛋白質や防腐剤を含む水性媒体も洗浄液として使用することができる。蛋白質としては、例えば牛血清アルブミン(BSA)等が挙げられる。防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム等が挙げられる。また、洗浄された磁性粒子は、保存用溶液に懸濁されて保存され得る。保存用溶液としては、本発明のストレプトアビジン結合磁性粒子を安定に保存し得る溶液であれば特に制限はなく、例えば中性から弱酸性の緩衝液中に、牛血清アルブミン(BSA)等の蛋白質を含む水溶液等が挙げられる。

本発明のストレプトアビジン結合磁性粒子の製造方法は、工程（２）の後に、さらに還元反応工程を含んでもよい。該還元反応工程は、工程（２）で調製したストレプトアビジン結合磁性粒子と還元剤との反応の工程である。工程（２）により、磁性粒子上に架橋構造のストレプトアビジンが形成されるが、形成された架橋構造のストレプトアビジンはシッフ塩基（イミン）を含むため、このシッフ塩基（イミン）を還元剤により還元することにより、より安定な架橋構造とすることができる。

還元反応工程におけるストレプトアビジン結合磁性粒子として、工程（２）の反応混合物そのものを用いても、洗浄された磁性粒子を用いてもよい。ストレプトアビジン結合磁性粒子と還元剤との反応に用いられる溶媒は、還元反応を進行させ得る溶媒であれば特に制限はなく、例えば前述の分散液等が挙げられる。また、有機溶媒を含む分散液も還元反応における溶媒として用いることができる。有機溶媒としては、水に可溶性で、還元反応を進行させ得る有機溶媒であれば特に制限はなく、例えばメタノール、エタノール、テトラヒドロフラン等が挙げられる。還元剤としては、シッフ塩基（イミン）を還元し、架橋構造を保持し得る還元剤であれば特に制限はなく、例えばボラン系の還元剤等が挙げられる。ボラン系の還元剤としては、例えば２−ピコリンボラン、水素化ホウ素ナトリウム等が挙げられる。還元剤の添加量は、通常、磁性粒子の0.0001〜0.1 (w/w)%であり、0.0005〜0.05 (w/w)%が好ましく、0.001 (w/w)%が特に好ましい。

還元反応の反応温度は、通常30〜50℃であり、35〜45℃が好ましく、40℃が特に好ましい。還元反応の反応時間は、通常2日間〜10日間であり、5日間〜8日間が好ましく、6日間が特に好ましい。

還元反応後、磁性粒子は磁石により、磁性粒子以外の溶液成分と分離することができる。分離された磁性粒子は、例えば前述の分散液又は希釈した保存用溶液により洗浄され、さらに、保存用溶液中に懸濁されて保存することができる。保存用溶液としては、本発明のストレプトアビジン結合磁性粒子を安定に保存し得る溶液であれば特に制限はなく、例えば前述の保存用溶液等が挙げられる。

３．蛋白質結合磁性粒子の製造方法
本発明の蛋白質結合磁性粒子は、本発明のストレプトアビジン結合磁性粒子と、ビオチン化蛋白質とを用いて製造される。磁性粒子上のストレプトアビジンと蛋白質に結合するビオチンとの相互作用により、蛋白質が磁性粒子上に結合する。

本発明の蛋白質結合磁性粒子は、例えば以下の工程を含む方法により製造することができる。本発明の蛋白質結合磁性粒子の製造方法の具体的態様を以下に示す。
・蛋白質結合磁性粒子の製造方法１
（１）表面にアミノ基を有する磁性粒子を含む懸濁液を調製する工程；
（２）工程（１）で調製した懸濁液に、ストレプトアビジン存在下にグルタルアルデヒドを添加し、ストレプトアビジン結合磁性粒子を調製する工程；及び、
（３）工程（２）で調製したストレプトアビジン結合粒子と、ビオチン化蛋白質とを反応させる工程。

・蛋白質結合磁性粒子の製造方法２
（１）表面にアミノ基を有する磁性粒子を含む懸濁液を調製する工程；
（２）工程（１）で調製した懸濁液に、ストレプトアビジン存在下にグルタルアルデヒドを添加し、ストレプトアビジン結合磁性粒子を調製する工程；
（３）工程（２）で調製したストレプトアビジン結合磁性粒子と還元剤とを反応させる工程；及び、
（４）工程（３）で調製したストレプトアビジン結合磁性粒子と、ビオチン化蛋白質とを反応させる工程。

ストレプトアビジン結合磁性粒子と、ビオチン化蛋白質との反応は、蛋白質が磁性粒子上に結合する条件であれば如何なる条件でもよい。反応温度は、通常25〜50℃であり、30〜40℃が好ましい。反応時間は、通常30分間〜24時間であり、2〜18時間が好ましい。

蛋白質としては、測定対象成分に結合する抗体、抗原抗体反応において測定対象成分と競合する競合物質等が挙げられる。競合物質としては、例えば測定対象成分や、測定対象成分に結合する抗体が認識するエピトープを含む物質等が挙げられる。蛋白質の具体例としては、IgG、抗IgG抗体、IgM、抗IgM抗体、IgA、抗IgA抗体、IgE、抗IgE抗体、アポ蛋白AI、抗アポ蛋白AI抗体、アポ蛋白AII、抗アポ蛋白AII抗体、アポ蛋白B、抗アポ蛋白B抗体、アポ蛋白E、抗アポ蛋白E抗体、リウマチファクター、抗リウマチファクター抗体、D-ダイマー、抗D-ダイマー抗体、酸化LDL、抗酸化LDL抗体、糖化LDL、抗糖化LDL抗体、グリコアルブミン、抗グリコアルブミン抗体、トリヨードサイロニン(T3)、抗T3抗体、総サイロキシン(T4)、抗T4抗体、薬剤（抗テンカン剤等）、薬剤に結合する抗体、C-反応性蛋白(CRP)、抗CRP抗体、サイトカイン類、サイトカイン類に結合する抗体、α−フェトプロテイン(AFP)、抗AFP抗体、癌胎児性抗原(CEA)、抗CEA抗体、CA19-9、抗CA19-9抗体、CA15-3、抗CA15-3抗体、CA-125、抗CA-125抗体、PIVKA-II、抗PIVKA-II抗体、副甲状腺ホルモン(PTH)、抗PTH抗体、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)、抗hCG抗体、甲状腺刺激ホルモン(TSH)、抗TSH抗体、インスリン、抗インスリン抗体、C-ペプタイド、抗C-ペプタイド抗体、エストロゲン、抗エストロゲン抗体、線維芽細胞増殖因子-23(FGF-23)、抗FGF-23抗体、グルタミン酸脱炭酸酵素(GAD)、抗GAD抗体、ペプシノーゲン、抗ペプシノーゲン抗体、B型肝炎ウイルス(HBV)抗原、抗HBV抗体、C型肝炎ウイルス(HCV)抗原、抗HCV抗体、成人T細胞性白血病ウイルス1型(HTLV-I)抗原、抗HTLV-I抗体、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)抗原、抗HIV抗体、インフルエンザウイルス抗原、抗インフルエンザウイルス抗体、結核菌抗原(TBGL)、抗結核菌抗体、マイコプラズマ抗原、抗マイコプラズマ抗体、ヘモグロビンA1c、抗ヘモグロビンA1c抗体、心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)、抗ANP抗体、脳性ナトリウム利尿ペプチド(BNP)、抗BNP抗体、トロポニンT、抗トロポニンT抗体、トロポニンI、抗トロポニンI抗体、クレアチニンキナーゼ-MB(CK-MB)、抗CK-MB抗体、ミオグロビン、抗ミオグロビン抗体、L-FABP、抗L-FABP抗体、H-FABP、抗H-FABP抗体、CCP抗原、抗CCP抗体、SP-D、抗SP-D抗体、カビ毒類［デオキシニバレノール(DON)、ニバレノール(NIV)、T-2トキシン(T2)等］に結合する抗体、内分泌撹乱物質類［ビスフェノールA、ノニルフェノール、フタル酸ジブチル、ポリ塩素化ビフェニル(PCB)類、ダイオキシン類、p, p’-ジクロロジフェニルトリクロロエタン、トリブチルスズ等］に結合する抗体、ステロイドホルモン類（アルドステロン、テストステロン等）に結合する抗体、大腸菌等の菌類、菌類由来の蛋白質に結合する抗体、食物アレルギー物質ダニ類等のアレルギー物質、抗アレルギー物質抗体等が挙げられる。

また、ビオチン化蛋白質の他に、ビオチン化炭化水素系化合物やビオチン化核酸も用いることができる。本発明のストレプトアビジン結合磁性粒子と、ビオチン化炭化水素系化合物とを反応させることにより、炭化水素系化合物結合磁性粒子を製造することができる。また、本発明のストレプトアビジン結合磁性粒子と、ビオチン化核酸とを反応させることにより、核酸結合磁性粒子を製造することができる。

ビオチン化炭化水素系化合物における炭化水素系化合物としては、例えばカビ毒類［デオキシニバレノール(DON)、ニバレノール(NIV)、T-2トキシン(T2)等］、内分泌撹乱物質類［ビスフェノールA、ノニルフェノール、フタル酸ジブチル、ポリ塩素化ビフェニル(PCB)類、ダイオキシン類、ｐ，ｐ’−ジクロロジフェニルトリクロロエタン、トリブチルスズ等］、ステロイドホルモン類（アルドステロン、テストステロン等）等が挙げられる。

ビオチン化核酸における核酸としては、例えばDNA、RNA、アプタマー、これらの誘導体等が挙げられる。

４．測定対象成分の測定方法
本発明の測定対象成分の測定方法の１つの態様は、本発明のストレプトアビジン結合磁性粒子と、ビオチン化蛋白質とを用いて、試料中の測定対象成分を測定する方法である。また、本発明の測定対象成分の測定方法の別の態様は、本発明の蛋白質結合磁性粒子を用いて、試料中の測定対象成分を測定する方法である。本発明の測定方法は、通常の免疫学的測定方法で使用される方法であれば如何なる方法を用いることができ、サンドイッチ法、競合法等が挙げられる。

ビオチン化蛋白質及び蛋白質結合磁性粒子における蛋白質としては、例えば測定対象成分に結合する抗体、抗原抗体反応において測定対象成分と競合する競合物質等が挙げられる。競合物質としては、例えば測定対象成分や、測定対象成分に結合する抗体が認識するエピトープを含む物質等が挙げられる。蛋白質の具体例としては、例えば前述の蛋白質等が挙げられる。

本発明における試料としては、本発明の測定対象成分の測定を可能とする試料であれば特に制限はなく、例えば全血、血漿、血清、髄液、唾液、羊水、尿、汗、膵液等が挙げられるが、血漿、血清等が好ましい。

測定対象成分としては、本発明の測定方法により測定することができるものであれば特に制限はなく、例えばIgG、IgM、IgA、IgE、アポ蛋白AI、アポ蛋白AII、アポ蛋白B、アポ蛋白E、リウマチファクター、D-ダイマー、酸化LDL、糖化LDL、グリコアルブミン、トリヨードサイロニン(T3)、総サイロキシン(T4)、薬剤（抗テンカン剤等）、C-反応性蛋白(CRP)、サイトカイン類、α−フェトプロテイン(AFP)、癌胎児性抗原(CEA)、CA19-9、CA15-3、CA-125、PIVKA-II、副甲状腺ホルモン(PTH)、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)、甲状腺刺激ホルモン(TSH)、インスリン、C-ペプタイド、エストロゲン、線維芽細胞増殖因子-23(FGF-23)、抗グルタミン酸脱炭酸酵素(GAD)抗体、ペプシノーゲン、B型肝炎ウイルス(HBV)抗原、抗HBV抗体、C型肝炎ウイルス(HCV)抗原、抗HCV抗体、成人T細胞性白血病ウイルス1型(HTLV-I)抗原、抗HTLV-I抗体、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)抗体、インフルエンザウイルス抗原、抗インフルエンザウイルス抗体、抗結核菌抗体、結核菌抗原(TBGL)マイコプラズマ抗体、ヘモグロビンA1c、心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)、脳性ナトリウム利尿ペプチド(BNP)、トロポニンT、トロポニンI、クレアチニンキナーゼ-MB(CK-MB)、ミオグロビン、L-FABP、H-FABP、抗CCP抗体、SP-D、カビ毒類［デオキシニバレノール(DON)、ニバレノール(NIV)、T-2トキシン(T2)等］、内分泌撹乱物質類［ビスフェノールA、ノニルフェノール、フタル酸ジブチル、ポリ塩素化ビフェニル(PCB)類、ダイオキシン類、ｐ，ｐ’−ジクロロジフェニルトリクロロエタン、トリブチルスズ等］、ステロイドホルモン類（アルドステロン、テストステロン等）、大腸菌等の菌類、食物アレルギー物質ダニ類等のアレルギー物質、抗アレルギー物質抗体等が挙げられる。

（Ｉ）本発明のストレプトアビジン結合磁性粒子と、ビオチン化蛋白質とを用いる測定対象成分の測定方法
（Ｉ−１）サンドイッチ法
サンドイッチ法により、試料中の測定対象成分を測定する方法としては、例えば以下の工程を含む方法等が挙げられる。
（１）試料中の測定対象成分を、水性媒体中で、本発明のストレプトアビジン結合磁性粒子、測定対象成分に結合する第１抗体にビオチンが結合したビオチン化第１抗体、及び、測定対象成分に結合する第２抗体と反応させ、磁性粒子上に、測定対象成分に結合する第１抗体、測定対象成分、及び、測定対象成分に結合する第２抗体からなる免疫複合体を生成させる工程；
（２）工程（１）後の反応混合物中の磁性粒子を磁力により集めて、磁力により集められた磁性粒子とそれ以外の成分とを分離する工程；及び、
（３）工程（２）で分離された磁性粒子上の免疫複合体を測定する工程。

第１抗体、第２抗体の代わりに、第１抗体フラグメント、第２抗体フラグメントをそれぞれ用いることもできる。抗体のフラグメントとしては、例えばFab、F(ab’)₂、Fab’等が挙げられる。

水性媒体としては、抗原抗体反応を可能とする水性媒体であれば特に制限はなく、例えば前述の水性媒体等が挙げられる。

工程（１）において、試料中の測定対象成分は、水性媒体中で、ストレプトアビジン結合磁性粒子、ビオチン化第１抗体、及び、第２抗体と反応し、磁性粒子上に、第１抗体、測定対象成分、及び、第２抗体からなる免疫複合体が生成する。

ここで、試料中の測定対象成分と、ストレプトアビジン結合磁性粒子、ビオチン化第１抗体、及び、第２抗体との反応は、磁性粒子上に、第１抗体、測定対象成分、及び、第２抗体からなる免疫複合体が生成する限りは、いかなる反応でもよく、例えば試料中の測定対象成分と、ストレプトアビジン結合磁性粒子、及び、ビオチン化第１抗体とを反応させて、磁性粒子上に、第１抗体と測定対象成分との免疫複合体を生成させた後に、第２抗体を反応させても、試料中の測定対象成分と、ストレプトアビジン結合磁性粒子、ビオチン化第１抗体、及び、第２抗体を、同時に反応させてもよい。磁性粒子上に、第１抗体と測定対象成分との免疫複合体を生成させた後に、第２抗体を反応させる場合には、当該免疫複合体を生成させた後に洗浄工程を設けることもできる。第１抗体と測定対象成分との免疫複合体を生成させた後の磁性粒子の洗浄は、当該免疫複合体を磁性粒子上に保持し得る洗浄であれば特に制限はなく、例えば、磁性粒子上に測定対象成分と第１抗体との免疫複合体を生成させた後の反応混合物から磁性粒子以外の成分を除去し、磁性粒子が残った反応容器に洗浄液を添加し、磁性粒子を洗浄する方法や、反応後の反応混合物に洗浄液を添加すると同時に、磁性粒子以外の成分を除去し、磁性粒子を洗浄する方法等が挙げられる。磁性粒子以外の成分の除去は、例えば磁力により磁性粒子を集めて、残った成分を吸引することにより行うことができる。洗浄液としては、例えば前述の水性媒体、前述の水性媒体に界面活性剤が添加された水性媒体等が挙げられる。界面活性剤としては、例えばツイーン(Tween)20等の非イオン性界面活性剤等が挙げられる。

工程（１）の抗原抗体反応における反応温度は、本発明の測定対象成分の測定を可能とする温度であれば特に限定はなく、通常、0〜50℃であり、4〜45℃が好ましく、20〜40℃が特に好ましい。反応時間は、本発明の測定対象成分の測定を可能とする時間であれば特に限定はなく、通常、5分間〜1時間であり、5〜20分間が好ましい

工程（２）において、工程（１）後の磁性粒子、すなわち、第１抗体、測定対象成分、及び、第２抗体からなる免疫複合体が結合した磁性粒子は磁力によって集められ、集められた磁性粒子は、それ以外の成分と分離される。磁性粒子を集めるための磁力は、本発明の測定対象成分の測定を可能とする磁力であれば特に制限はない。磁力により集められた磁性粒子と、それ以外の成分との分離は、本発明の測定対象成分の測定を可能とする分離であれば特に制限はない。

また、工程（２）の後に、又は、工程（２）と同時に、第１抗体、測定対象成分、及び、第２抗体からなる免疫複合体を結合した磁性粒子を洗浄する工程を含んでいてもよい。磁性粒子の洗浄は、例えば前述の方法等によって行うことができる。

工程（３）において、において、工程（２）により分離された磁性粒子上の免疫複合体を測定することにより、試料中の測定対象成分を測定することができる。免疫複合体の測定方法としては、例えば、以下の方法等が挙げられる。

(1)第２抗体が標識化されていない場合
第２抗体に結合する第３抗体に標識が結合した標識化第３抗体を、第１抗体、測定対象成分、及び、第２抗体からなる免疫複合体が結合している磁性粒子と反応させて、磁性粒子上に、第１抗体、測定対象成分、第２抗体、及び、第３抗体からなる免疫複合体を形成させ、該免疫複合体中の標識を測定することにより、分離された磁性粒子上の免疫複合体を測定することができる。第３抗体の代わりに、第３抗体フラグメントを用いることもできる。第２抗体に結合する第３抗体としては、例えば第２抗体のＦｃ領域に結合する抗体又はそのフラグメント等が挙げられる。標識の測定は、分離された磁性粒子上の免疫複合体の測定を可能とする方法であれば、特に制限はなく、例えば化学発光の測定、蛍光の測定、吸光度の測定等が挙げられる。抗体のフラグメントとしては、例えばFab、F(ab’)₂、Fab’等が挙げられる。

(2)測定対象成分に結合する第２抗体が標識化されている場合
磁性粒子上に形成された、第１抗体、測定対象成分、及び、標識化第２抗体からなる免疫複合体中の標識を測定することにより、分離された磁性粒子上の免疫複合体を測定することができる。標識の測定は、分離された磁性粒子上の免疫複合体の測定を可能とする方法であれば、特に制限はなく、例えば化学発光の測定、蛍光の測定、吸光度の測定等が挙げられる。

(A)化学発光の測定
化学発光の測定は、以下の方法等によって行うことができる。
(A-1)標識が酵素である場合
標識が酵素である場合には、例えばその酵素と反応して光を生成する基質を標識化抗体若しくはフラグメントに作用させ、生成した光(hν)の強度を発光強度計等で測定することにより行うことができる。酵素としては、その酵素の基質と反応し、光を生成し得るものであれば特に制限はなく、例えばアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ等が挙げられる。

酵素としてアルカリホスファターゼを用いる場合、アルカリホスファターゼと反応して光を生成するアルカリホスファターゼの基質としては、例えば３−（２'−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３'−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン・二ナトリウム塩(AMPPD)、２−クロロ−５−｛４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２'−（５'−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］カン］−４−イル｝フェニルホスフェート・二ナトリウム塩(CDP-Star^TM)、３−｛４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２'−（５'−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン］−４−イル｝フェニルホスフェート・二ナトリウム塩(CSPD^TM)、［１０−メチル−９（１０Ｈ）−アクリジニルイデン］フェノキシメチルリン酸・二ナトリウム塩(Lumigen^TM APS-5)、９−（４−クロロフェニルチオホスホリルオキシメチリデン）−１０−メチルアクリダン・二ナトリウム塩等が挙げられる。

酵素として、ペルオキシダーゼを用いる場合、ペルオキシダーゼと反応して光を生成するペルオキシダーゼの基質としては、例えば過酸化水素と発光化合物（例えば、ルミノール化合物、ルシゲニン化合物等）との組み合わせ等が挙げられる。

酵素として、β−Ｄ−ガラクトシダーゼを用いる場合、β−Ｄ−ガラクトシダーゼと反応して光を生成するβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの基質としては、例えばガラクトン−プラス［Galacton-Plus、アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）社製］等が挙げられる。

酵素として、ルシフェラーゼを用いる場合、ルシフェラーゼと反応して光を生成するルシフェラーゼの基質としては、例えばルシフェリン、セレンテラジン等が挙げられる。

(A-2)標識が発光物質である場合
標識が発光物質である場合には、例えば生成した免疫複合体中の発光物質に起因する光の強度を、発光強度計等で測定することにより行うことができる。発光物質としては、本発明の測定を可能とする発光物質であれば特に制限はなく、例えばアクリジニウムおよびその誘導体、ルテニウム錯体化合物、ロフィン等が挙げられる。

(B)蛍光の測定
蛍光の測定は、以下の方法等によって行うことができる。
(B-1)標識が酵素である場合
標識が酵素である場合には、例えばその酵素と反応して蛍光を生成する基質を標識化抗体若しくはフラグメントに作用させ、生成した蛍光の強度を蛍光強度計等で測定することにより行うことができる。酵素としては、その酵素の基質と反応し、蛍光を生成し得るものであれば特に制限はなく、例えばペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ等が挙げられる。

酵素として、ペルオキシダーゼを用いる場合、ペルオキシダーゼと反応して蛍光を生成するペルオキシダーゼの基質としては、例えば過酸化水素と蛍光化合物［例えば、４−ヒドロキシフェニル酢酸、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、クマリン等］との組み合わせ等が挙げられる。

酵素として、β−Ｄ−ガラクトシダーゼを用いる場合、β−Ｄ−ガラクトシダーゼと反応して蛍光を生成するβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの基質としては、例えば４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド又はその類似化合物等が挙げられる。

酵素として、β−グルクロニダーゼを用いる場合、β−グルクロニダーゼと反応して蛍光を生成するβ−グルクロニダーゼの基質としては、例えばTokyoGreen ^TM -βGluU（積水メディカル社製）等が挙げられる。

(B-2)標識が蛍光物質である場合
標識が蛍光物質である場合には、例えば生成した免疫複合体中の蛍光物質に起因する蛍光の強度を、蛍光強度計等で測定することにより行うことができる。蛍光物質としては、本発明の測定を可能とする蛍光物質であれば特に制限はなく、例えばFITC（フルオレッセイン イソチオシアナート）、RITC（ローダミンＢ−イソチオシアナート）、quantum dot(Science, 281, 2016-2018, 1998)、フィコエリスリン等のフィコビリ蛋白質、GFP(Green fluorescent Protein）、RFP(Red fluorescent Protein)、YFP(Yellow fluorescent Protein)、BFP(Blue fluorescent Protein)等が挙げられる。

(C)吸光度の測定
吸光度の測定は、以下の方法等によって行うことができる。
(C-1)標識が酵素である場合
標識が酵素である場合には、例えばその酵素と反応して色素を生成する基質を標識化抗体若しくはフラグメントに作用させ、生成した色素の吸光度を分光光度計やマルチウェルプレートリーダー等で測定することにより行うことができる。酵素としては、その酵素の基質と反応し、色素を生成し得るものであれば特に制限はなく、例えばペルオキシダーゼ等が挙げられる。

酵素として、ペルオキシダーゼを用いる場合、ペルオキシダーゼと反応して色素を生成するペルオキシダーゼの基質としては、例えば過酸化水素と酸化発色型色原体との組み合わせ等が挙げられる。酸化発色型色原体としては、例えば、ロイコ型色原体、酸化カップリング発色型色原体等が挙げられる。

ロイコ型色原体は、過酸化水素およびペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、単独で色素へ変換される物質である。具体的には、テトラメチルベンジジン、ｏ−フェニレンジアミン、１０−Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン(CCAP)、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン(MCDP)、１０−Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン ナトリウム塩(DA-67)、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ヘキサ（３−スルホプロピル）−４，４’，４’’−トリアミノトリフェニルメタン(TPM-PS)、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン ナトリウム塩(DA-64)、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル〕アミン(BCMA)等が挙げられる。

酸化カップリング発色型色原体は、過酸化水素およびペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、２つの化合物が酸化的カップリングして色素を生成する物質である。２つの化合物の組み合わせとしては、カプラーとアニリン類（トリンダー試薬）との組み合わせ、カプラーとフェノール類との組み合わせ等があげられる。カプラーとしては、例えば４−アミノアンチピリン(4-AA)、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラジン等があげられる。アニリン類としては、Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン(TOOS)、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン(MAOS)、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン(DAOS)、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン(TOPS)、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン(HDAOS)、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−メチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ビス（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン(EMSE)、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−４−フルオロ−３，５−ジメトキシアニリン(F-DAOS)等があげられる。フェノール類としては、フェノール、４−クロロフェノール、３−メチルフェノール、３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨード安息香酸(HTIB)等があげられる。

磁性粒子上に生成した免疫複合体の測定における測定値に基づいた、試料中の測定対象成分濃度は、例えば、以下の方法により決定することができる。

既知濃度の測定対象成分を用いて上記工程（１）から工程（３）を行い、測定対象成分の濃度と測定値（標識由来の情報量）との関係を表す検量線を作成し、次いで、測定すべき試料を用いて測定を行い、得られた測定値を予め作成した検量線に照らし合わせて、測定すべき試料中の測定対象成分濃度を決定する。

（Ｉ−２）競合法１
競合法により、試料中の測定対象成分を測定する方法としては、例えば以下の工程を含む方法等が挙げられる。
（１）試料中の測定対象成分を、水性媒体中で、本発明のストレプトアビジン結合磁性粒子、測定対象成分及び競合物質の両者に結合する抗体にビオチンが結合したビオチン化抗体、及び、競合物質に標識が結合した標識化競合物質と反応させる工程；及び、
（２）工程（１）で生成した、測定対象成分に結合する抗体と標識化競合物質の免疫複合体中の標識を測定する工程。

工程（１）の後、抗原抗体反応後の磁性粒子を洗浄する工程を設けることができる。磁性粒子の洗浄は、例えば前述の洗浄方法等によって行うことができる。

工程（２）における標識の測定は、例えば前述の方法等によって行うことができる。
磁性粒子上に生成した免疫複合体の測定における測定値に基づいた、試料中の測定対象成分濃度は、例えば、以下の方法により決定することができる。

既知濃度の測定対象成分を用いて上記工程（１）及び工程（２）を行い、測定対象成分の濃度と測定値（標識由来の情報量）との関係を表す検量線を作成し、次いで、測定すべき試料を用いて測定を行い、得られた測定値を予め作成した検量線に照らし合わせて、測定すべき試料中の測定対象成分濃度を決定する。

（Ｉ−３）競合法２
競合法により、試料中の測定対象成分を測定する方法としては、例えば以下の工程を含む方法等が挙げられる。
（１）試料中の測定対象成分を、水性媒体中で、本発明のストレプトアビジン結合磁性粒子、競合物質にビオチンが結合したビオチン化競合物質、及び、測定対象成分及び競合物質の両者に結合する抗体に標識が結合した標識化抗体、と反応させる工程；及び、
（２）工程（１）で生成した、競合物質と標識化抗体の免疫複合体中の標識を測定する工程。

工程（１）の後、抗原抗体反応後の磁性粒子を洗浄する工程を設けることができる。磁性粒子の洗浄は、例えば前述の洗浄方法等によって行うことができる。

工程（２）における標識の測定は、例えば前述の方法等によって行うことができる。
磁性粒子上に生成した免疫複合体の測定における測定値に基づいた、試料中の測定対象成分濃度は、例えば、以下の方法により決定することができる。

既知濃度の測定対象成分を用いて上記工程（１）及び工程（２）を行い、測定対象成分の濃度と測定値（標識由来の情報量）との関係を表す検量線を作成し、次いで、測定すべき試料を用いて測定を行い、得られた測定値を予め作成した検量線に照らし合わせて、測定すべき試料中の測定対象成分濃度を決定する。

（ＩＩ）本発明の蛋白質結合磁性粒子を用いる測定対象成分の測定方法
（ＩＩ−１）サンドイッチ法
サンドイッチ法により、試料中の測定対象成分を測定する方法としては、例えば、本発明の蛋白質結合磁性粒子において、蛋白質として測定対象成分に結合する抗体を用いる以下の工程を含む方法等が挙げられる。
（１）試料中の測定対象成分を、水性媒体中で、測定対象成分に結合する第１抗体が固定化された磁性粒子、及び、測定対象成分に結合する第２抗体と反応させ、磁性粒子上に、測定対象成分に結合する第１抗体、測定対象成分、及び、測定対象成分に結合する第２抗体からなる免疫複合体を生成させる工程；
（２）工程（１）後の反応混合物中の磁性粒子を磁力により集めて、磁力により集められた磁性粒子とそれ以外の成分とを分離する工程；及び、
（３）工程（２）で分離された磁性粒子上の免疫複合体を測定する工程。

第１抗体、第２抗体の代わりに、第１抗体フラグメント、第２抗体フラグメントをそれぞれ用いることもできる。水性媒体としては、抗原抗体反応を可能とする水性媒体であれば特に制限はなく、例えば前述の水性媒体等が挙げられる。

工程（１）において、試料中の測定対象成分は、水性媒体中で、磁性粒子上の第１抗体、及び、第２抗体と反応し、磁性粒子上に、第１抗体、測定対象成分、及び、第２抗体からなる免疫複合体が生成する。

ここで、試料中の測定対象成分と、磁性粒子上の第１抗体、及び、第２抗体との反応は、磁性粒子上に、第１抗体、測定対象成分、及び、第２抗体からなる免疫複合体が生成する限りは、いかなる反応でもよく、例えば試料中の測定対象成分と、磁性粒子上の第１抗体とを反応させて、磁性粒子上に、第１抗体と測定対象成分との免疫複合体を生成させた後に、第２抗体を反応させても、試料中の測定対象成分と、磁性粒子上の第１抗体、及び、第２抗体を、同時に反応させてもよい。磁性粒子上に、第１抗体と測定対象成分との免疫複合体を生成させた後に、第２抗体を反応させる場合には、当該免疫複合体を生成させた後に洗浄工程を設けることもできる。第１抗体と測定対象成分との免疫複合体を生成させた後の磁性粒子の洗浄は、当該免疫複合体を磁性粒子上に保持し得る洗浄であれば特に制限はなく、例えば、前述の洗浄方法等が挙げられる。

工程（１）の抗原抗体反応における反応温度は、本発明の測定対象成分の測定を可能とする温度であれば特に限定はなく、通常、0〜50℃であり、4〜45℃が好ましく、20〜40℃が特に好ましい。反応時間は、本発明の測定対象成分の測定を可能とする時間であれば特に限定はなく、通常、5分間〜1時間であり、5〜20分間が好ましい。
工程（２）及び工程（３）は、前述の（Ｉ−１）の工程（２）及び工程（３）と同じである。

磁性粒子上に生成した免疫複合体の測定における測定値に基づいた、試料中の測定対象成分濃度は、例えば、前述の（Ｉ−１）の場合と同様の方法により決定することができる。

（ＩＩ−２）競合法１
競合法により、試料中の測定対象成分を測定する方法としては、例えば、本発明の蛋白質結合磁性粒子において、蛋白質として測定対象成分及び競合物質の両者に結合する抗体を用いる以下の工程を含む方法等が挙げられる。
（１）試料中の測定対象成分を、水性媒体中で、測定対象成分及び競合物質の両者に結合する抗体が固定化された磁性粒子、及び、競合物質に標識が結合した標識化競合物質と反応させる工程；及び、
（２）工程（１）で生成した、測定対象成分に結合する抗体と標識化競合物質の免疫複合体中の標識を測定する工程。

工程（１）の後、抗原抗体反応後の磁性粒子を洗浄する工程を設けることができる。磁性粒子の洗浄は、例えば前述の洗浄方法等によって行うことができる。

工程（２）における標識の測定は、例えば前述の方法等によって行うことができる。
磁性粒子上に生成した免疫複合体の測定における測定値に基づいた、試料中の測定対象成分濃度は、例えば、前述の（Ｉ−２）の場合と同様の方法により決定することができる。

（ＩＩ−３）競合法２
競合法により、試料中の測定対象成分を測定する方法としては、例えば、本発明の蛋白質結合磁性粒子において、蛋白質として抗原抗体反応において測定対象成分と競合する競合物質を用いる以下の工程を含む方法等が挙げられる。
（１）試料中の測定対象成分を、水性媒体中で、競合物質が固定化された磁性粒子、及び、測定対象成分及び競合物質の両者に結合する抗体に標識が結合した標識化抗体と反応させる工程；及び、
（２）工程（１）で生成した、競合物質と標識化抗体の免疫複合体中の標識を測定する工程。

工程（１）の後、抗原抗体反応後の磁性粒子を洗浄する工程を設けることができる。磁性粒子の洗浄は、例えば前述の洗浄方法等によって行うことができる。
工程（２）における標識の測定は、例えば前述の方法等によって行うことができる。
磁性粒子上に生成した免疫複合体の測定における測定値に基づいた、試料中の測定対象成分濃度は、例えば、前述の（Ｉ−３）の場合と同様の方法により決定することができる。

また、ビオチン化蛋白質の代わりに、ビオチン化炭化水素系化合物を用いて、試料中の測定対象成分を測定することもできる。測定対象成分としては、例えばビオチン化炭化水素系化合物を構成する炭化水素系化合物や当該炭化水素系化合物に結合する抗体等が挙げられる。炭化水素系化合物としては、例えば前述の炭化水素系化合物等が挙げられる。ビオチン化炭化水素系化合物を用いた試料中の測定対象成分の測定は、例えば前述のサンドイッチ法（Ｉ−１）又は（ＩＩ−１）の方法や、競合法（Ｉ−３）又は（ＩＩ−３）の方法等を用いて行うことができる。この場合、サンドイッチ法（Ｉ−１）及び（ＩＩ−１）の第１抗体の代わりに炭化水素系化合物を用い、また、競合法（Ｉ−３）又は（ＩＩ−３）における競合物質として、炭化水素系化合物を用いる。

さらに、ビオチン化蛋白質の代わりに、ビオチン化核酸を用いて、試料中の測定対象成分を測定することもできる。測定対象成分としては、例えばビオチン核酸を構成する核酸に結合する核酸や蛋白質等が挙げられる。蛋白質としては、例えば前述の蛋白質等が挙げられる。ビオチン化核酸を用いた試料中の測定対象成分の測定は、通常の核酸測定方法や、前述の測定方法等が挙げられる。

５．測定対象成分の測定用試薬
本発明の測定対象成分の測定用試薬の１つの態様は、本発明のストレプトアビジン結合磁性粒子と、ビオチン化蛋白質とを含む試薬である。また、本発明の測定対象成分の測定用試薬の別の態様は、本発明の蛋白質結合磁性粒子を含む試薬である。本発明の測定対象成分の測定用試薬は、本発明の測定対象成分の測定方法に使用される。ビオチン化蛋白質及び蛋白質結合磁性粒子における蛋白質としては、例えば前述の蛋白質等が挙げられる。

また、本発明のストレプトアビジン結合磁性粒子とビオチン化炭化水素系化合物とを含む試薬、又は、本発明のストレプトアビジン結合磁性粒子とビオチン化炭化水素系化合物とから製造される炭化水素系化合物結合磁性粒子を含む試薬を用いて、試料中の測定対象成分を測定することもできる。測定対象成分としては、例えばビオチン化炭化水素系化合物を構成する炭化水素系化合物や当該炭化水素系化合物に結合する抗体等が挙げられる。炭化水素系化合物としては、例えば前述の炭化水素系化合物等が挙げられる。

さらに、本発明のストレプトアビジン結合磁性粒子とビオチン化核酸とを含む試薬、又は、本発明のストレプトアビジン結合磁性粒子とビオチン化核酸とから製造される核酸結合磁性粒子を含む試薬を用いて、試料中の測定対象成分を測定することもできる。測定対象成分としては、例えばビオチン核酸を構成する核酸に結合する核酸や蛋白質等が挙げられる。蛋白質としては、例えば前述の蛋白質等が挙げられる。

本発明の測定用試薬には、必要に応じて、通常の免疫学的測定方法で使用される免疫学的測定用試薬に含まれる成分を含んでもよい。当該成分としては、例えば水性媒体、塩類、金属イオン、糖類、防腐剤、非特異反応抑制剤、界面活性剤、酵素安定化剤等が挙げられる。水性媒体としては、例えば前述の水性媒体等が挙げられる。塩類としては、例えば塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化アンモニウム、臭化リチウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、臭化カルシウム、臭化マグネシウム、臭化アンモニウム等が挙げられる。金属イオンとしては、例えばマグネシウムイオン、マンガンイオン、亜鉛イオン等が挙げられる。糖類としては、例えばマンニトール、ソルビトール等が挙げられる。防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、抗生物質（ストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等）、バイオエース、プロクリン300等が挙げられる。非特異反応抑制剤としては、例えばウシ血清アルブミン(BSA)、ウシ胎児血清(FBS)、カゼイン、ブロックエース（大日本製薬社製）等が挙げられる。界面活性剤としては、例えば陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤等が挙げられる。酵素安定化剤としては、例えばペルオキシダーゼ安定化緩衝液、アルカリホスファターゼ安定化緩衝液等が挙げられる。

以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。

（１）ストレプトアビジン結合磁性粒子の製造
磁性粒子にはアミノ基タイプEstapor磁性粒子EM2-100/40（メルク社製）を用いた。当該磁性粒子はコア・シェル構造から成り、粒径が1.62μmであり、内部コア部分には全質量比41.2%の磁性体を含み、ポリスチレンからなるシェル部分には化学的にアミノ基が97μeq/gで修飾されている粒子である。当該磁性粒子を2 mg採取し、1.0%のTrimethylstearylammonium Chloride （東京化成社製）を含むpH5.5、10 mmol/L酢酸緩衝液（以下、分散液Ａという）を4 mL加え、分散させた。続いて容器横に強力磁石を配することで磁性粒子を収集し、分散液Ａを吸引除去した（以下、分散液の添加、磁性粒子の収集、吸引除去の一連の操作を「洗浄」と略す）。該洗浄を続けて4回行った後、pH5.5、10 mmol/L酢酸緩衝液で懸濁させて、30 mg/mLの磁性粒子の懸濁液を調製した。グルタルアルデヒドは25%グルタルアルデヒド水溶液（ナカライテスク社製）をpH5.5、10 mmol/L酢酸緩衝液で希釈し、0.038%、0.063%、0.088%、0.113%の各溶液を調製した。ストレプトアビジンとして、遺伝子組み換え体のストレプトアビジン（ロシュ社製）を用い、pH5.5、10 mmol/L酢酸緩衝液に24.5 mg/mLで溶解することにより、ストレプトアビジン溶液を調製し、氷冷で1時間以上静置した。

次に粒子分散液66.7μLにストレプトアビジン溶液30μLを加え、続いて0.038%のグルタルアルデヒド溶液30μLを加え、35℃で20時間、ウエーブローターで攪拌した。グルタルアルデヒド溶液の濃度が0.063%、0.088%、0.113%の溶液についても同様の操作を行なった。

得られた粒子を、1.0%のBSA、0.09%のアジ化ナトリウムを含む50 mmol/LのMES緩衝液(pH6.5)で10回洗浄し、ストレプトアビジン結合磁性粒子を得た。

（２）ストレプトアビジン結合磁性粒子のビオチン結合能の測定
上記（１）で得られたストレプトアビジン結合磁性粒子、及び、市販のストレプトアビジン結合磁性粒子について、以下の方法により、ビオチン結合能を測定した。

ストレプトアビジン結合磁性粒子を0.1%BSA・PBS［PBS：0.15 mol/L 塩化ナトリウムを含有する10 mmol/L リン酸緩衝液(pH7.2)］に1 mg/mLで分散させ、倍々希釈法で0.0156 mg/mLの6段階（64倍希釈）まで希釈した。この6サンプルとブランク(0.1%BSA・PBS)それぞれを96穴ブラックプレートに50μLずつ分注した。次にBiotin-Fluorescein (Thermo Scientific社製)を0.1%BSA・PBSで1μg/mLに希釈し、サンプルを分注したウエルに50μLずつ分注した。サンプルを分注したプレートはシェーカーインキュベーター(アマライト社製)で振盪しながら37℃で10分間インキュベートし、粒子が分散した状態での蛍光強度を蛍光プレートリーダー“プレートカメレオンＶ”（HIDEX社製）で測定した。

ここで磁性粒子上のストレプトアビジンに蛍光標識ビオチンが結合すると、ストレプトアビジンに結合した蛍光標識ビオチンどうしが近接して存在することになり、蛍光の消光が起こる。蛍光の消光は単位面積当たりの磁性粒子に結合したストレプトアビジンへの蛍光標識ビオチンの結合量が大きくなるほど高くなる。この性質を利用し、ビオチン結合能が既知の市販の磁性粒子をレファレンスとして、このストレプトアビジンの蛍光減少率をあらかじめ評価しておくことにより、本発明のストレプトアビジン結合磁性粒子のビオチン結合能を算出した。本実施例ではストレプトアビジン結合磁性粒子の希釈サンプルから、蛍光強度が５０％減少した時のストレプトアビジン結合磁性粒子濃度を直線近似で算出し、レファレンスのストレプトアビジンと比較することで、ビオチン結合能(pmol/mm²)を算出した。

測定結果を第１表に示す。

第１表から明らかな様に、上記（１）で得られたストレプトアビジン結合磁性粒子は、市販のストレプトアビジン結合磁性粒子（ダイナル社製 DynabeadsT1、及びメルク社製 BE-M08/10）に比較して、高いビオチン結合能を有することが分かった。

磁性粒子上のストレプトアビジンの架橋構造の分析
実施例１の方法と同様の方法により得られたビオチン結合能が2.61 pmol/mm²、4.95 pmol/mm²、6.76 pmol/mm²であるストレプトアビジン結合磁性粒子について、それぞれのストレプトアビジン結合磁性粒子を4 mLのPBSで10回洗浄し、1%SDS/PBSに置換した後、60℃で1時間インキュベートした。次に磁性粒子を磁石で集磁し、上清の蛋白溶液を回収した後、SDS-PAGEで分析した。同様の操作を、市販のストレプトアビジン結合磁性粒子に対しても行った。SDS-PAGEの結果を図１に示す。

図１から明らかな様に、ストレプトアビジン及び市販のストレプトアビジン結合磁性粒子においては、ストレプトアビジンを構成する単量体のみが認められたのに対して、本発明のストレプトアビジン結合磁性粒子においては、単量体に加え、二量体、三量体、四量体及びさらに高次のバンドが認められた。これにより、市販のストレプトアビジン結合磁性粒子においては、ストレプトアビジンが架橋構造を取っていないのに対して、本発明のストレプトアビジン結合磁性粒子においては、ストレプトアビジンが架橋構造を取っていることが判明した。

［試験例１］ ストレプトアビジン結合磁性粒子の分散性の評価
実施例１と同様の方法により調製した、ビオチン結合能が4.54 pmol/mm²であるストレプトアビジン結合磁性粒子について、当該ストレプトアビジン結合磁性粒子を0.1%BSAを含むPBSに0.1 mg/mLで分散させ、冷暗所で24時間静置した。これを転倒混和で、25回攪拌し、その分散度合いを比較した。その結果を図２に示す。図２の上は、静置した状態のストレプトアビジン結合磁性粒子を、下は、転倒混和25回後のストレプトアビジン結合磁性粒子の分散状態を表す。

図２から明らかなように、本発明のストレプトアビジン結合磁性粒子は、分散性が非常に良いことが判明した。

本発明により、ビオチン結合能の高いストレプトアビジン結合磁性粒子及びその製造方法、該ストレプトアビジン結合磁性粒子を用いて製造される蛋白質結合磁性粒子及びその製造方法、測定対象成分の測定方法、並びに、測定対象成分の測定用試薬が提供される。本発明の製造方法により製造されるストレプトアビジン結合磁性粒子、及び、蛋白質結合磁性粒子、並びに、本発明の測定対象成分の測定方法、及び、測定対象成分の測定用試薬は、臨床診断上、有用である。

Claims (4)

1. 以下の工程を含むことを特徴とする、ストレプトアビジン結合磁性粒子の製造方法。
   （１）表面にアミノ基を有する磁性粒子を含む懸濁液を調製する工程；及び、
   （２）工程（１）で調製した懸濁液に、ストレプトアビジン存在下にグルタルアルデヒドを添加し、磁性粒子を、ストレプトアビジン及びグルタルアルデヒドと反応させる工程。
2. さらに、以下の工程（３）を含む、請求項１記載の製造方法。
   （３）工程（２）で調製したストレプトアビジン結合磁性粒子と還元剤とを反応させる工程。
3. 以下の工程を含むことを特徴とする、蛋白質結合磁性粒子の製造方法。
   （１）表面にアミノ基を有する磁性粒子を含む懸濁液を調製する工程；
   （２）工程（１）で調製した懸濁液に、ストレプトアビジン存在下にグルタルアルデヒドを添加し、ストレプトアビジン結合磁性粒子を調製する工程；及び、
   （３）工程（２）で調製したストレプトアビジン結合粒子と、ビオチン化蛋白質とを反応させる工程。
4. 以下の工程を含むことを特徴とする、蛋白質結合磁性粒子の製造方法。
   （１）表面にアミノ基を有する磁性粒子を含む懸濁液を調製する工程；
   （２）工程（１）で調製した懸濁液に、ストレプトアビジン存在下にグルタルアルデヒドを添加し、ストレプトアビジン結合磁性粒子を調製する工程；
   （３）工程（２）で調製したストレプトアビジン結合磁性粒子と還元剤とを反応させる工程；及び、
   （４）工程（３）で調製したストレプトアビジン結合磁性粒子と、ビオチン化蛋白質とを反応させる工程。

Images