JPH07209166A - 基体表面への被検体の結合方法、低分子量被検体の定量方法、及びビオチン−被検体複合体 - Google Patents

基体表面への被検体の結合方法、低分子量被検体の定量方法、及びビオチン−被検体複合体

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JPH07209166A
JPH07209166A JP6332023A JP33202394A JPH07209166A JP H07209166 A JPH07209166 A JP H07209166A JP 6332023 A JP6332023 A JP 6332023A JP 33202394 A JP33202394 A JP 33202394A JP H07209166 A JPH07209166 A JP H07209166A
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 圧電表面横波デバイスの質量検知表面等の基
体表面に低分子量被検体を簡単かつ確実に付着させ、被
検体の存在及び／又は量を検知する。 【構成】（ａ）（ｉ）選択的反応性表面を与えるべくビ
オチン−結合タンパク質で構成された結合材料層で基体
表面を被覆することと、（ｉｉ）ビオチン−被検体複合
体を与えるべく被検体をビオチンに直接又は間接的に共
有結合させることと、（ｉｉｉ）被検体をビオチン−被
検体複合体に結合させるように該複合体で上記反応性表
面を被覆することとによって、前記基体表面に被検体を
結合させる段階；（ｂ）（ａ）の（ｉｉｉ）で与えられ
た表面結合被検体を、既知又は未知量の被検体を含むサ
ンプル中の、被検体に選択的に結合する検出可能部分と
接触させる段階；及び（ｃ）前記表面に結合した前記検
出可能部分の量を測定し、この測定量からサンプル中の
被検体の量を導出する段階；を含む。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、一般には、サンプル中
の対象被検体を検出するための化学的方法に関する。特
に、本発明は、基体表面上の被検体の検出を可能にする
ために、該基体表面に被検体を結合するための新規な方
法に関する。更に、本発明は、この方法を実施するため
に有効な新規な試薬（ビオチン−被検体複合体）に関す
る。
【０００２】
【技術背景】反応性固体表面を使用して様々な種類の被
検体を検出するための様々な方法が知られている。ハイ
ブリッド形成定量法では、例えば、対象被検体の存在及
び／又は量を示すために、基体（例えば、ガラス又はプ
ラスチック製のビーズ，プレート，チューブ等）の表面
上の標識（ラベル）を検出することが多い。また、様々
なタイプの被検体分子の分離及び／又は検出を容易にす
るために反応性表面が使用される様々なタイプのクロマ
トグラフ方式がある。更に別の事例では、微量の生物材
料を測定するために質量バイオセンサが使用され、この
場合も、上記事例と同様に、特定の成分と選択的に結合
する変性された表面が使用される。本発明は、広範囲に
亙る様々な状況に対して適用されることが可能である
が、上記の質量バイオセンサと共に使用されるのに特に
適している。
【０００３】本発明と共通に譲渡された米国特許第５，
１３０，２５７号（Ｂａｅｒ他）、欧州特許公開第４１
６，７３０号（発明者Ｔｏｍ−Ｍｏｙ他）、１９９３年
４月１日付けで出願された同時係属中の米国特許出願第
０８／０４１，６６２号（名称「サンプル中の被検体を
測定するための質量センサ（Ａ Ｍａｓｓ Ｓｅｎｓｏ
ｒ ｆｏｒ Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ Ａｎａｌｙｔｅｓ
ｉｎ ａ Ｓａｍｐｌｅ）」、発明者Ｃ．Ａ．Ｍｙｅｒ
ｈｏｌｔｚ他）に説明されているように、好ましいタイ
プの質量バイオセンサは、音響導波路として圧電結晶を
使用する。こうしたデバイスによる選択的な質量検出
は、反応性層上に存在する質量が検出対象物質の量に比
例して変化するように、検出対象の物質に対して選択的
に反応する化学的反応性層で上記デバイスの表面を被覆
することによって実現される。従って、こうしたデバイ
スは、検出器がその中に沈められている溶液中の被検体
の濃度を測定することが可能な化学センサとして機能す
る。例えば、上記の米国特許出願第０８／０４１，６６
２号に説明されている通りに、圧電表面波デバイス（ｐ
ｉｅｚｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｓｕｒｆａｃｅ ｗａｖｅ
ｄｅｖｉｃｅ）が、従来の定量法を使用して溶液中の
特定の抗体の濃度を測定するために、次のように使用さ
れる。このデバイスの質量検知表面が、特定の抗体に対
応する抗原を含むレセプター層で被覆される。その後
で、このデバイスがサンプル溶液に曝される、このサン
プル溶液中に存在する抗体がそのデバイスの表面に結合
し、それによって、その上部表面上に結合する質量を増
加させる。入力トランスデューサは、周期的な電気入力
信号から周期的な音響波を発生させる。上記入力トラン
スデューサを介して、上記デバイスに結合されたラジオ
周波数エネルギーは、上記表面の少数の波長に限定され
た表面音響波に変換される。この表面音響波の速度は、
上記デバイスの上部表面上に結合した質量に応じて変化
する。この表面音響波は、上記デバイスの表面に沿って
伝搬して出力トランスデューサに達し、出力トランスデ
ューサは、表面音響波を再びラジオ周波数エネルギーに
変換する。表面音響波の伝搬速度の変化は、上記結晶の
表面に結合した質量に対応する。入力電気信号と出力電
気信号の周波数又は相対位相を監視することによって、
結晶表面における質量変化が測定されることが可能であ
る。こうした音響導波路デバイスは、表面横波（ＳＴ
Ｗ）、レイリー波（ＳＡＷ）、ラブ波、表面スキミング
バルク波（ｓｕｒｆａｃｅ−ｓｋｉｍｍｉｎｇ ｂｕｌ
ｋ ｗａｖｅ《ＳＳＢＷ》）を含む様々な波動を使用す
ることが可能であるが、ＳＴＷデバイスが好ましい。
【０００４】本発明は、表面横波バイオセンサ内の圧電
結晶表面のような基体表面に被検体分子を結合させるた
めに、ビオチンとビオチン結合タンパク質との間の強力
な相互作用を利用する。ビオチンとビオチン結合タンパ
ク質アビジンとの間で形成される極めて高い親和性（Ｋ
ａ≒１０１５Ｍ−１）ではあるが、非共有の結合を使用
することが、様々の論文に取り上げられてきた。Ｍ．Ｗ
ｉｌｃｈｅｋ他は、論文「Ｔｈｅ Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉ
ｏｔｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｎ Ｂｉｏａｎａｌｙｔ
ｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」Ａｎａｌ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．１７１：１−３２（１９８８）の中で、ア
ビジン−ビオチン複合体が有効であることが証明されて
いる幾つかの事例の概要を説明している。表面に材料を
結合させるためにアビジン−ビオチン相互作用を使用す
ることを提案する参考文献には、更に別のものがある。
例えば、ＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ９１／０７０８７は、ビ
オチン−アビジン複合体の生成によって「アンチリガン
ド（ａｎｔｉ−ｌｉｇａｎｄ）」を選択的に固定化する
ことが可能な領域を固体表面上に形成するための方法を
説明している。米国特許第４，９５２，５１９号と欧州
特許公開第３９６，１１６号は、ビオチン又はアビジン
を固体支持体表面に結合させるために、固体支持体表面
を誘導体化することに関する。ＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ８
８／０４７７７は、アビジン又はビオチンがその上に固
定化される検出表面を含む被検体検出デバイスを説明し
ている。更に、両方がＧｉｅｓｅに与えられた米国特許
第４，４７８，９１４号とＵ．Ｓ．ＲＥ３１，７１２
は、リガンド結合タンパク質（例えばアビジン）と反応
性リガンドエキステンダー（例えばビオチン）との交互
層で被覆された変性表面を説明している。本発明と共通
に譲渡された上記欧州特許公開第４１６，７３０号は、
上記デバイスの圧電結晶表面上にリガンド結合層（例え
ばアビジン被覆）が備えられた質量バイオセンサを開示
し、このリガンド結合層の上部表面上にリガンド保持被
覆（例えばビオチニル化抗体層）が備えられる。
【０００５】上記の参考文献の幾つかは、様々な被検体
検出と定量手順とにおいてビオチン−アビジン複合体生
成を使用することを説明しているが、ビオチン−アビジ
ン複合体の生成を使用して低分子量被検体（例えば測定
対象の環境被検体）を固相表面に付着させるための方法
を提供する文献は１つもない。典型的には、上記のよう
に、ビオチンは、タンパク質部分又は核酸部分のような
高分子量の分子に既に付着している。低分子量の被検体
を吸着すること、又は、低分子量の被検体をプレートや
チューブ等の表面に共有結合の形で結合させることは、
困難だろう。表面横波（ｓｕｒｆａｃｅ ｔｒａｎｓｖ
ｅｒｓｅ ｗａｖｅ）デバイスにおいては、個々の定量
サイクルの間に結合部分が洗い流されることを防いで、
表面横波デバイスを反復使用することを可能にするため
に、低分子量部分の強力な、好ましくは共有結合による
付着が特に重要である。
【０００６】
【発明の目的】本発明は、上記の技術における上記の要
求に対処し、圧電表面横波デバイスの質量検知表面のよ
うな基体表面に低分子量の被検体分子を付着させるため
の簡単で、確実な方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【発明の概要】従って、本発明は、低分子量の被検体を
基体表面に結合させるための方法に関する。好ましい実
施例では、基体表面は、表面横波デバイスの圧電結晶で
ある。但し、後で詳細に説明するように、本発明の方法
は、他の様々な状況においても同様に有効である。本発
明の方法は、アビジンのようなビオチン結合タンパク質
で基体表面を被覆すること、対象被検体又は後述する官
能基的に対象被検体と同等な分子をビオチンに共有結合
させること、及びその後でビオチニル化された被検体を
被覆表面上の層として付与することを含む。
【０００８】本発明の更に別の側面は、上記のように処
理されて被検体分子が結合した表面を、被検体又は被検
体アナログ（上記被検体と同じ仕方で被検体結合部分と
相互作用し結合することが可能な分子種）を含むサンプ
ル中の、定量的に検出可能な被検体結合部分（表面結合
被検体に共有結合又はその他の形で結合する分子種）と
接触させることによって、サンプル中の被検体の存在及
び／又は量を測定し、その被検体に対する定量を可能に
するための方法を提供することを含む。好ましい実施例
では、この方法は、上記のように被検体で被覆した表面
横波デバイスを、被検体結合部分（例えば抗原性被検体
に対する抗体）と既知量又は未知量の被検体又は被検体
アナログとを含む溶液中に浸す段階、及び前記デバイス
の表面上に結合した質量の変化を評価する段階を含む。
【０００９】本発明の別の側面では、次の構造式を有す
るビオチン被検体複合体が提供される。
【００１０】
【化２】
【００１１】上式中、Ｘは結合部分を表し、Ａは約１０
００未満の分子量を有する被検体を表す。
【００１２】本発明の更に別の側面では、最初にその結
合表面が上記のようなビオチン結合タンパク質によって
被覆され、その後で、詳細に後述する通りのビオチン結
合被検体の層で被覆される、圧電表面横波デバイスが提
供される。
【００１３】
【実施例】本発明を詳細に説明する前に、本発明は、特
定の被検体に限定されず、被覆方式が様々であってよい
ということを理解されたい。更に、本明細書で使用され
る術語が特定の実施例を説明するためのものであるにす
ぎず、限定を意図していないということを理解された
い。これに加えて、本明細書に使用される単数形は、文
脈によって特に明確に示されない限り、複数のものを含
むということを理解されたい。従って、例えば、「被検
体」は被検体の混合物を含み、「ビオチン結合タンパク
質」は、２つ以上のビオチン結合タンパク質の混合物を
含み、他の場合も同様である。この点で、本発明の技術
は、例えば圧電表面横波デバイス内に存在する結合表面
のような結合表面上で複数の被検体を定量するために使
用可能であるということを指摘しておくことが重要であ
る。
【００１４】本明細書で使用する術語を、次に示す意味
を有するものとして定義する。
【００１５】本明細書で使用される「被検体」は、定量
対象の分子種を意味することが意図されている。好まし
い被検体は低分子量の被検体であり、特に好ましい被検
体は約１０００未満の分子量を有する「環境被検体（ｅ
ｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌａｎａｌｙｔｅ）」である。
この「環境被検体」は、健康と安全等に関して大きな関
心を集めている、外部環境内に人工的に存在する被検体
を意味する。上記のように、こうした被検体は反応性表
面に結合される。サンプル中の被検体の存在又は量が、
サンプル中に含まれる被検体結合部分（例えば、抗原被
検体の場合は抗体）を表面結合被検体に結合させること
によって、測定される。「被検体」は更に、特定の状況
で対象被検体と官能基的に同等である分子種を含むこと
が意図されている。例えば、定量対象の被検体が、サン
プル溶液中に含まれる抗体に結合する抗原である競争免
疫定量法では、「被検体」は、抗原それ自体を含むばか
りでなく、この実際の抗原と概ね同じ仕方で、かつ同程
度の親和度で、上記抗体と結合するどのような分子種を
も含む。従って、「被検体」は、被検体アナログ、被検
体フラグメント等を含む。
【００１６】本発明の被検体を説明するために使用され
る「低分子量」は、約１０００未満の分子量を意味する
ことが意図され、好ましくは約６００未満、最も好まし
くは約３００未満の分子量を意味することが意図されて
いる。
【００１７】本明細書で使用される「ビオチン結合タン
パク質」は、１０１４Ｌ／Ｍ以上のＫａを有するどのよ
うなビオチン結合タンパク質をも含むことが意図されて
いる。こうしたタンパク質は、非限定的に、卵白タンパ
ク質アビジン、分子量１５，０００の４個の同一のサブ
ユニットを含む四量体、及び自然発生した再結合によっ
て生成されたか化学的に合成された概ね同一の四量体構
造を有するストレプトアビジンを含む。更に、「アビジ
ン」が本明細書で使用される時には、この術語が更にス
トレプトアビジンと他のビオジン結合タンパク質とを含
むことが意図されている。
【００１８】ビオチンを被検体に結合させるヒドロカル
ビル部分の好ましい構造を意味する「アルキレン」は、
従来通りの意味で使用され、１〜２４個の炭素原子を含
む二官能性の分枝又は非分枝の飽和炭化水素鎖を意味
し、例えば、メチレン（−ＣＨ２−）、エチレン（−Ｃ
Ｈ２−ＣＨ２−）、プロピレン（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ
Ｈ２−）、２−メチルプロピレン〔−ＣＨ２−ＣＨ（Ｃ
Ｈ３）−ＣＨ２−〕、ヘキシレン〔−（ＣＨ２）６−〕
等を含む。「低級アルキレン」は、１〜６個の炭素原子
を有するアルキレン基を意味し、例えば、メチレン、エ
チレン、プロピレン等を意味する。後で説明するよう
に、アルキレン結合部分は、ビオチン−被検体複合体生
成に干渉しない１個以上の置換基又は介在結合基を含ん
でもよい。
【００１９】ビオチンを被検体に結合させるヒドロカル
ビル部分の別の構造を意味する「アルケニレン」は、従
来通りの意味で使用され、２〜２４個の炭素原子と、１
〜６個、典型的には１個又は２個の二重結合とを含む二
官能性の分枝又は非分枝の炭化水素鎖を意味する。
【００２０】ビオチンを被検体に結合させるヒドロカル
ビル部分の更に別の構造を意味する「アルキニレン」
は、従来通りの意味で使用され、２〜２４個の炭素原子
と、１〜６個、典型的には１個又は２個の三重結合とを
含む二官能性の分枝又は非分枝の炭化水素鎖を意味す
る。
【００２１】本明細書で使用される「アルキル」は、１
〜２４個の炭素原子を含む分枝又は非分枝の飽和炭化水
素基を意味し、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピ
ル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチ
ル、オクチル、デシル、テトラデシル、ヘキサデシル、
エイコシル、テトラコシル等を意味する。本明細書の好
ましいアルキル基は、１〜１２個の炭素原子を含む。
「低級アルキル」は、１〜６個、好ましくは１〜４個の
炭素原子を有するアルキル基を意味する。
【００２２】本明細書で使用される「アルコキシ」は、
単一の末端エーテル結合によって結合されたアルキル基
を意味し、即ち、「アルコキシ」基は、Ｒが上記の定義
のアルキルである「−ＯＲ」として定義されることが可
能である。「低級アルコキシ」基は、１〜６個、好まし
くは１〜４個の炭素原子を有するアルコキシ基を意味す
る。
【００２３】「ハロ」又は「ハロゲン」は、フルオロ、
クロロ、ブロモ、ヨードを意味し、一般的に有機化合物
中の水素原子のハロ置換に関する。
【００２４】「任意の」又は「任意に」は、この術語を
伴って記述される事象又は事態が生じても生じなくても
よいということと、この記述が上記事象又は事態が生じ
る事例と上記事象又は事態が生じない事例とを含むとい
うことを意味する。例えば、「任意に置換されるアルキ
ル」は、アルキレン部分が置換されても置換されなくて
もよいということと、この記述が非置換のアルキレンと
置換されたアルキレンとの両方を含むということを意味
する。
【００２５】被検体結合過程の最初の段階は、選択的に
反応する表面を形成するために、選択された基体の表面
を特定の結合材料、例えば、ビオチン結合タンパク質の
層で被覆することを含む。アビジン等のタンパク質で様
々なタイプの表面を被覆する方法は、この技術分野で公
知である。使用する具体的な被覆方法は、決定的に重要
であるわけではなく、アビジン又は他のビオチン結合タ
ンパク質で表面を被覆するための公知の方法のいずれか
を使用することが可能である。例えば、固体支持体の表
面にタンパク質を付着させるための従来の手段を説明し
ているＷｏｎｇ著「Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏ
ｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓ
ｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ」ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，
ＢｏｃａＲａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａを参照されたい。
【００２６】シリカ支持体を使用する時には、好ましい
被覆方法は、アビジンで被覆する前に、３段階の処理を
使用して表面を官能基化することを含む。上記の同時係
属中の米国特許出願第０８／０４１，６６２号に説明さ
れているように、ＳｉＯ２を１００〜１０００Åの厚さ
で表面上にスパッタ溶着し、その結果としてシリカ表面
上に幾つかの遊離ヒドロキシル基がもたらされる。第２
の段階では、上記の第１の層を更に官能基化するため
に、上記ヒドロキシル基をオルガノシランカップリング
剤で処理する。このオルガノシランカップリング剤は、
式ＲｎＳｉＹ（４−ｎ）で表されるものであることが好
ましく、前式中Ｙは、加水分解型基、例えば、アルコキ
シ、典型的には低級アルコキシ、アシルオキシ、典型的
には低級アシルオキシ、アミン、ハロゲン、典型的には
塩素等を表し、Ｒは、上記カップリング剤が有機樹脂と
ポリマーとに結合することを可能にする官能性を有する
非加水分解型の有機ラジカルを表し、ｎは、１、２、又
は３である。こうしたオルガノシランカップリング剤の
１例は、３−グリシドオキシプロピルトリメトキシシラ
ン（「ＧＯＰＳ」）であり、この物質のカップリング特
性は、この技術分野で公知である。例えば、Ａｒｋｉｎ
ｓ著「Ｓｉｌａｎｅ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ａｇｅｎｔ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」Ａｎｄｅｒｓｏｎ他編、Ｐｅｔｒ
ａｒｃｈ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｒｅｇｉｓｔｅｒ ａｎｄ
Ｒｅｖｉｅｗ（１９８７）を参照されたい。オルガノ
シランカップリング剤の別の例は、（γ−アミノプロピ
ル）トリエトキシシランである。更に他の適切なカップ
リング剤が当業者に公知である。第３の段階では、必要
に応じて、アビジン被覆に結合する表面反応性基を与え
るために、この時点で既に基体表面と共有結合している
上記オルガノシランカップリング剤を誘導体化する。例
えば、上記オルガノシランカップリング剤が表面近接ジ
オール基を与える場合には、こうした表面近接ジオール
基を、従来の方法、例えば、過ヨウ素酸ナトリウムとの
反応、によって反応性アルデヒド基に変換することが可
能である。この反応性アルデヒド基は、アビジン中のア
ミノ基と反応してイミン、即ち、シッフ塩基、−Ｎ＝Ｃ
＜を形成する。適切なｐＨの適切な還元剤、例えば、シ
アノ水素化ホウ素ナトリウムで、上記イミンを還元する
ことによって、そのアミン誘導体が得られ、その結果と
して、圧電表面波デバイスの表面層にアビジンが共有結
合によって付着する。或いは、上記オルガノシランカッ
プリング剤が表面アミノ基を与える場合には、こうした
アミノ基は、アビジン上に存在するカルボキシル基と直
接反応して、共有アミド結合を形成することが可能であ
る。この実施例では、表面アミン基との反応の前に、ア
ビジンのカルボキシル基を活性化することが望ましいだ
ろう。
【００２７】アビジンを基体表面に結合させるための更
に他の方法は、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ他著「Ｉｍ
ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌｉｇａｎｄ
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ：
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９２），ｐｐ．１
９９−２０２に説明されている。こうした他の方法の例
は、臭化シアンと過ヨウ素酸シアンとによってセファロ
ースを活性化することを含み、この活性化の後で、アビ
ジンを活性化表面に直接結合させることが可能である。
【００２８】アビジン又は同様のビオチン結合タンパク
質で基体表面を被覆した後に、共有結合ビオチン−アビ
ジン複合体が調製され、その後で、この複合体はアビジ
ン被覆表面に結合することになる。適切な被検体は、約
１０００未満、好ましくは約６００未満、最も好ましく
は約３００未満の分子量を有する。好ましい被検体は環
境被検体であり、この環境被検体の例は、非限定的に、
アセトクロル（ａｃｅｔｏｃｈｌｏｒ）、アラクロル
（ａｌａｃｈｌｏｒ）、アルジカルブ（ａｌｄｉｃａｒ
ｂ）、アルジカルブスルホン、アルジカルブスルホキシ
ド、アルドリン、アメトリム（ａｍｅｔｒｙｍ）、２−
アミノベンゾイミダゾール、アトラジン（ａｔｒａｚｉ
ｎｅ）、ベノミル（ｂｅｎｏｍｙｌ）、ベンゾイミダゾ
ール、２−ベンゾイミダゾリル尿素、ブタクロル（ｂｕ
ｔａｃｈｌｏｒ）、カプタホル（ｃａｐｔａｆｏｌ）、
カプタン、３−カルバミル−２，４，５−トリクロロ安
息香酸、カルバリル（ｃａｒｂａｒｙｌ）、カルベンダ
ジム（ｃａｒｂｅｎｄａｚｉｍ）、カルボフラン（ｃａ
ｒｂｏｆｕｒａｎ）、カルボフランフェノール、クロル
デン、クロロタロニル（ｃｈｌｏｒｏｔｈａｌｏｎｉ
ｌ）、デセチルアトラジン（ｄｅｓｅｔｈｙｌ ａｔｒ
ａｚｉｎｅ）、デスイソプロピルアトラジン（ｄｅｓｉ
ｓｏｐｒｏｐｙｌ ａｔｒａｚｉｎｅ）、３，５−ジク
ロロアニリン、ジクロロフェノール、ジクロルプロプ
（ｄｉｃｈｌｏｒｐｒｏｐ）、ジデアルキアトラジン
（ｄｉｄｅａｌｋｙ ａｔｒａｚｉｎｅ）、ジエルドリ
ン、エンドスルファン（ｅｎｄｏｓｕｌｆａｎ）、エン
ドリン（ｅｎｄｒｉｎ）、ＥＰＴＣ（Ｓ−エチルジプロ
ピルチオカルバメート）、フォルペト（ｆｏｌｐｅ
ｔ）、ヘプタクロル、ヘキサクロロベンゼン、３−ヒド
ロキシ−カルボフラン、イプロジオン（ｉｐｒｏｄｉｏ
ｎｅ）、３−ケトカルボフラン、３−ケトカルボフラン
フェノール、ＭＢＣ、メタラキシル（ｍｅｔａｌａｘｙ
ｌ）、メトミル（ｍｅｔｈｏｍｙｌ）、メトプレン（ｍ
ｅｔｈｏｐｒｅｎｅ）、メトラクロル（ｍｅｔｏｌａｃ
ｈｌｏｒ）、１−ナフトール、ペンタクロロニトロベン
ゼン、ペンタクロロフェノール、フタルイミド、ポリ塩
化ビフェニル、プロメトリン（ｐｒｏｍｅｔｒｙｎ）、
プロシミドン（ｐｒｏｃｙｍｉｄｏｎｅ）、プロパクロ
ル（ｐｒｏｐａｃｈｌｏｒ）、シマジン（ｓｉｍａｚｉ
ｎｅ）、シメトリン（ｓｉｍｅｔｒｙｎｅ）、テルブト
リン（ｔｅｒｂｕｔｒｙｎ）、テルブチルアジン（ｔｅ
ｒｂｕｔｙｌａｚｉｎｅ）、２，４，５，６−テトラク
ロロ−３−シアノベンズアミド、テトラクロロヒドロキ
ノン、テトラクロロフェノール、テトラヒドロフタルイ
ミド、チアベンダゾール（ｔｈｉａｂｅｎｄａｚｏｌ
ｅ）、チオファナート−メチル（ｔｈｉｏｐｈａｎａｔ
−ｍｅｔｈｙｌ）、２，５，６−トリクロロ−４−ヒド
ロキシイソフタロニトリル、トリクロロフェノール、ビ
ンシオゾリン（ｖｉｎｃｉｏｚｏｌｉｎ）、２，４−ジ
クロロフェノキシ酢酸（「２、４−Ｄ」）、２，４，５
−トリクロロフェノキシ酢酸（「２，４，５−Ｔ」）、
（４−クロロ−２−メチルフェノキシ）酢酸（「ＭＣＰ
Ａ」）、（４−クロロ−２−メチルフェノキシ）酪酸
（「ＭＣＰＢ」）を含む。共有結合ビオチン−被検体複
合体は、次の一般式によって表されることが可能であ
る。
【００２９】
【化３】
【００３０】上式中、Ｘは結合基であり、Ａは被検体で
ある。Ｘは、１〜６個、典型的には１〜４個の−Ｏ−、
−Ｓ−、−ＮＲ１−（ここで、Ｒ１は水素又は低級アル
キル）、−ＣＯＮＨ−、−（ＣＯ）−、又は−ＣＯＯ−
結合を任意に含む低級アルキル、低級アルコキシ、ヒド
ロキシル、ハロゲン、アミノからなる群から選択される
０〜６個、好ましくは０〜４個の置換基で置換された、
典型的にはＣ１〜Ｃ２４、より典型的にはＣ１〜Ｃ１２
のヒドロカルビル結合である。一般的に、Ｘは、アルキ
レン骨格を有するだろうが、本明細書で上記で定義した
ようにアルケニレン構造又はアルキニレン構造を有する
ことも可能である。
【００３１】被検体がビオチンと反応することが可能で
あるように、例えば、アミノ基、ヒドロキシル基、カル
ボキシル基、又は類似の基を被検体上に与えることによ
って、被検体を官能基化することが必要だろう。こうし
た官能基化を行うための方法は、合成有機化学の分野の
専門家には公知であることを理解されたい。例えば、環
境被検体であるアトラジン（ａｔｒａｚｉｎ）を例にす
ると、このアトラジンは、次式に示される通りに、アル
キルアミノ「ハンドル（ｈａｎｄｌｅ）」を与えるため
に、１，３−ジアミノプロパンとの反応によって官能基
化されることが可能である。
【００３２】
【化４】
【００３３】その後で、適切なカップリング剤の存在下
で、官能基化されたアトラジン分子が、ビオチン自体、
又は、更に典型的には、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
長鎖ビオチン（「ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン」）のような
活性ビオチン誘導体と結合することが可能であり、その
結果として次式の複合体が得られる。
【００３４】
【化５】
【００３５】一般的には、定量対象である被検体が、そ
の被検体上の官能基と容易に反応するように活性化され
たビオチン分子と結合させられる。様々な活性ビオチン
が、例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ
ｏ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｓｉｇｍ
ａ，ａｎｄ Ｖｅｃｔｏｒから、製品として入手可能で
ある。活性ビオチンの例は、後述するビオチンを含む。
【００３６】様々なタイプの分子にビオチンを結合させ
るための方法が、この技術分野で公知であり、使用され
る具体的な方法は、重要ではない。適切な方法が、例え
ば、上記で既に参考文献として取り上げている「Ｔｈｅ
Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｎ
Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏ
ｎｓ」Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７１：１−３２
（１９８８）の中で、Ｍ．Ｗｉｌｃｈｅｋ他によって説
明されている。上記の参考文献の中で要約されているよ
うに、カップリング反応は、次のように示すことができ
る。
【００３７】
【化６の１】
【００３８】
【化６の２】
【００３９】
【化６の３】
【００４０】
【化６の４】
【００４１】上記の反応において、Ｂはカルボキシル基
のないビオチン（即ち、反応式の左側にある活性ビオチ
ン構造の中に組み込まれている）を表し、Ｒはこの式に
示されていない当該分子の残りの部分を表している。式
中の略語は次の通りである。「ＢＮＨＳ」はビオチンＮ
−ヒドロキシスクシンイミドエステル、「ＮＰ」はニト
ロフェニル、「ＤＢＢ」はｐ−ジアゾベンゾイルビオシ
チン、「ＢＣＨＺ」はビオシチンヒドラジド（Ｎ６−ビ
オチニル−Ｌ−リシンヒドラジド）、「ＭＰＢ」は３−
（Ｎ−マレイミド−プロピオニル）ビオシチン、「ｐｈ
ｏｔｏｂｉｏｔｉｎ」はＮ−（４−アジド−２−ニトロ
フェニル）−Ｎ′−（Ｎ−ビオチニル−３−アミノプロ
ピル）−Ｎ′−メチル−１，３−プロパンジアミン、
「Ｂ−１１−ｄＵＴＰ」は５〔Ｎ（３−アミノアリル）
Ｎ′−ビオチニル−６−アミノカプロイル〕デオキシウ
リジン−５′−トリホスフェイトである。
【００４２】この後で、共有結合ビオチン−被検体複合
体が、上記のように処理された、即ちビオチン結合タン
パク質の層を含む、活性表面上の被覆層として与えられ
る。これは、適切な溶媒系中に上記複合体を溶解させる
ことによって行われる。様々な溶媒又は溶媒系が使用可
能であることを当業者は理解しているだろうが、特に好
ましい溶媒系の例は、水とジメチルホルムアミドとの組
み合わせである。一般的には、上記共有結合複合体を、
溶解を生じさせるのに必要な最小限度の量の有機溶媒中
に溶解し、その後で、水の中に注入する（共有結合複合
体の典型的な最終濃度は約１重量％である）。更に、こ
の溶液を、上記の通りに処理した反応性表面上に少なく
とも単層の厚さに塗る。その後で、定量的に検出可能な
被検体結合部分、即ち、共有結合、イオン結合、又はリ
ガンド−レセプター結合によって、或いは吸着によっ
て、上記被検体に結合する分子種、に基体表面を接触さ
せることによって、上記表面上の被検体の量を測定す
る。その後で、上記表面上に存在する被検体−結合部分
の量を、例えば、その被検体−結合部分上に存在するラ
ベルの検出、又は表面結合部分の質量の測定等によっ
て、測定する。
【００４３】圧電表面横波デバイスでは、上記のように
被覆される基体表面は、圧電結晶結合表面である。圧電
表面横波デバイスの例は、本発明と共通して譲渡された
米国特許第５，１３０，２５７号（Ｂａｅｒ他）に開示
されており、図１に示されている。図１では、石英又は
ニオブ酸リチウム（ＬｉＮｂＯ３）のような圧電基体１
１上に、電極１２′、１２″を有するインターディジタ
ルトランスデューサ（ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌ ｔｒ
ａｎｓｄｕｃｅｒ）（ＩＤＴ）１２のような入力トラン
スデューサと、インターディジタルトランスデューサ
（ＩＤＴ）１３のような出力トランスデューサとが形成
される。これらのＩＤＴは、典型的には０．１〜１．０
ミクロンのオーダーの厚さＴ１と、１〜１００ミクロン
のオーダーの幅Ｗ１と、１〜１００ミクロンのオーダー
の間隔Ｓ１とを有する。任意に、各ＩＤＴの外側縁部に
反射性格子が配置される。これらのトランスデューサと
格子とは、公知のホトリソグラフィ方法によって形成さ
れることが可能である。
【００４４】一般的に、基体１１用に選択される材料
は、圧電性であり、かつ、この基体の表面において表面
横波を捕捉することを可能にする固有の結晶カット（ｃ
ｒｙｓｔａｌ ｃｕｔ）を持たなければならない。更
に、この材料には、（１）低い音響損失を有すること
（即ち、低い粘性減衰を有すること）、（２）上記トラ
ンスデューサ上に存在する流体の寄生的な電気的作用を
最少にするために高い誘電率と高い電気機械的結合定数
とを有すること、及び（３）温度変化に伴う音速の変動
が小さいことが必要である。石英は、音速の温度変動が
小さいという利点を有する。ニオブ酸リチウムは、ＩＤ
Ｔ１２、１３に対するより適切な圧電結合という利点を
有する。伝搬方向を９０°回転させることによって、
（典型的にはＳＡＷデバイスで使用される）石英のＳＴ
カット（ＳＴ−ｃｕｔ）を、ＳＴＷデバイスに使用する
ことが可能である。
【００４５】表面１４の上部表面上には、ＩＤＴ１２と
ＩＤＴ１３との間に、ＩＤＴ１２、１３の幅と間隔に匹
敵する要素幅Ｗ２と要素間隔Ｓ２とを有する金属格子１
５が形成される。この格子は、横音響波を基体表面に捕
捉する。検出器の性能に対する流体の誘電的影響を最少
にするために、この格子の指状突起がブスバー（ｂｕｓ
ｓ−ｂａｒ）と共に短縮されることが可能である。
【００４６】付着層１６が、素子１２、１３、１４の上
部表面上に、（スパッタリング又は蒸着によって）溶着
させられる。化学物質による腐食から素子１１〜１５を
保護するために、この層１６は、表面上に強力に接着し
て密封状態をもたらさなければならない。この層は、１
０〜１，０００Åオーダーの厚さＴ２を有し、上記のよ
うにビオチニル化された被検体の層に結合するのに適合
したビオチン結合タンパク質の反応性層１８のための、
適切な結合表面を与えるように選択される。
【００４７】本発明による方法の好ましい実施例は、複
数の上記圧電表面波デバイスを使用し、これらのデバイ
スは上記の同時係属中の米国特許出願第０８／０４１，
６６２号の中で説明されており、これらのデバイスは、
サンプル中の被検体の存在に応答する複数の圧電横波サ
ンプルデバイスと、少なくとも１個の圧電表面横波基準
デバイスとを含み、上記圧電横波サンプルデバイスの結
合表面上には、サンプル中の被検体の存在に反応するビ
オチニル化被検体の層に結合するのに適合したビオチン
結合タンパク質が積層され、上記圧電表面横波基準デバ
イスの結合表面上には、このデバイスをサンプルに接触
させることによって生じる干渉に反応しないようにされ
たビオチン結合タンパク質が積層される。
【００４８】圧電表面横波デバイスと組み合わせて本発
明による新規の方法を説明してきたが、この方法を、音
響センサ、光センサ、重量測定センサ、電気化学セン
サ、光電気化学センサ、静電容量センサ、サーミスター
センサと組み合わせて使用することも可能である。圧電
結晶を使用する重量測定センサは、レイリー（Ｒａｙｌ
ｅｉｇｈ）表面音響波デバイス及びラブ（Ｌａｍｂ）音
響波デバイスのような、表面横波デバイスを含む。使用
可能な光センサは、光ファイバエバネッセントセンサ
と、エバネッセント平面導波路センサとを含む。電気化
学センサの例は、電圧測定センサ、電流測定センサ、及
び電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）センサを含む。
【００４９】本発明の方法は、他のタイプの基体、例え
ば、クロマトグラフィー支持体マトリックス、シリカビ
ーズ、ガラスチューブ、ペトリ皿等、に被検体を結合さ
せることと組み合わせて使用されることが可能である。
【００５０】更に、本発明は、様々な種類の被検体を測
定するために使用されることが可能である。応用の範囲
は、非限定的に、環境検知（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａ
ｌｓｅｎｓｉｎｇ）、試験管内診断法（ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、食品、及び農業品質検
査管理、調査、医療を含む。環境検知に使用する場合の
例は、天然水中の汚染物質の測定、飲料水の品質の評
価、水サンプル中の殺虫剤の測定、土壌汚染の測定、産
業排水の監視等を含む。
【００５１】本発明が好ましい実施例に関して説明され
てきたが、上記説明とその説明で使用された事例とが単
なる例示のためのものであり、本発明の範囲を限定しな
いということを理解されたい。本発明の範囲内の他の側
面と利点と変更とが、当業者には明らかだろう。
【００５２】当業者に対して本発明の方法の使用法を詳
細に開示し説明するために、以下の具体例（実施例）を
説明するが、これらの実施例は、本発明の範囲を逸脱し
ないことが意図されている。使用する数値（例えば量、
温度等）に関しては正確性を確保するよう努めたが、誤
りと誤差とが生じている可能性もある。特に明示しない
限り、割合は重量割合であり、温度は℃であり、圧力は
大気圧又は大気圧に近い圧力である。
【００５３】実施例１ 〔アビジン被覆シリカ基体の調製〕： （ａ）シリカ基体のシラン化：３−グリシドオキシプロ
ピルトリメトキシシラン（「ＧＯＰＳ」）の１０％溶液
を、ＧＯＰＳ（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ
ｏ．）２．５ｍｌと、イソプロパノール２０ｍｌと、Ｈ
２Ｏ２．５ｍｌと、酢酸１ｍｌとを使用して調製した。
ＳｉＯ２で前処理したシリカ基体を上記溶液に接触させ
た。１時間に亙って加水分解を行い、その後でトリエチ
ルアミン（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ
ｏ．）０．２５ｍｌを触媒として加えた。結合を生じさ
せるために、更に１時間に亙って反応を続けさせた。そ
の後、蒸留水で基体表面を３〜５回洗浄し、真空又はヘ
リウム中、或いは機械炉内で、１１０℃で１０分間に亙
って乾燥させた。
【００５４】（ｂ）ＧＯＰＳ上のエポキシド基又はジオ
ール基の酸化：０．１％過ヨウ素酸塩溶液を、ＮａＩＯ
４１ｇと、Ｈ２Ｏ２００ｍｌと、酢酸８００ｍｌとを使
用して調製した。その後で、シラン化した基体を上記溶
液と共に室温において３０分間に亙ってインキュベート
（ｉｎｃｕｂａｔｅ）し、その後で水で洗浄した。
【００５５】（ｃ）アビジンを伴っての基体のインキュ
ベート：更に、（ｂ）で洗浄した基体を、ｐＨ８．５の
ホウ酸塩緩衝化塩類液（「ＢＢＳ」）中の濃度０．１ｍ
ｇ／ｍｌのアビジンＤ（Ｖｅｃｔｏｒ）の溶液と共にイ
ンキュベートし、４℃において２０〜２４時間に亙っ
て、静かに反転することによって混合した。
【００５６】（ｄ）安定した還元生成物へのシッフ塩基
の還元：（ｃ）のインキュベートの後で、ｐＨ６のリン
酸緩衝液（０．１Ｍ）中のＮａＢＨ３ＣＮ０．１Ｍ溶液
を、３回の１５分間の間隔を置いて加え、最終ＮａＢＨ
３ＣＮ濃度０．１Ｍを得た。その後で、基体表面をｐＨ
７．０のＰＢＳ（リン酸緩衝溶液）で洗浄した。
【００５７】〔アトラジン−ビオチン複合体の合成と結
合〕： （ａ）ジアミノプロパン−アトラジンの合成：ｎ−プロ
パノール４０ｍｌ中に、アトラジン（Ｕｌｔｒａ−Ｓｃ
ｉｅｎｔｉｆｉｃ）４００ｍｇと１，３−ジアミノプロ
パン（Ｓｉｇｍａ）４００当量（約１０ｍｌ）とを含む
溶液を、１時間に亙って環流させた。その反応混合物に
対して、Ｋｏｄａｋ Ｃｈｒｏｍａｇｒａｍ Ｓｈｅｅ
ｔ １３１８１ ＳｉｌｉｃａＧｅｌを使用してＴＬＣ
を行い、エーテル：ヘキサン／１：１中で希釈した。
【００５８】その後で、上記混合物の体積が１０ｍｌに
減少するまで、上記混合物をロータリーエバポレーター
で、一晩、濃縮した。この体積が減少したサンプルを、
分液漏斗に移し、１００ｍｌの０．５ＮのＮａＯＨで塩
基性にした。その水性相を塩化メチレン（ＣＨ２Ｃ
ｌ２）を用いて４回抽出した。
【００５９】混合した有機相を５０ｍｌの飽和ＮａＣｌ
で洗浄し、ＭｇＳＯ４を用いて乾燥させた。この混合物
を濾過し、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去し、
その残留物を真空中で２日間に亙って乾燥させた。開始
材料（４００ｍｇ）からの最終収量は４２１ｍｇであ
り、この収量は理論収量の９０％であった。その最終生
成物は、透明で、黄色であり、非常に粘性を帯びてい
た。
【００６０】ジアミノプロパンによるアトラジンのアダ
クトであることを確認するために、その生成物を電子噴
霧質量分析（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｍａｓｓ ｓ
ｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）を使用して分析した。この質
量分析は、２５４．１ａｍｕにおいて単一のピークを示
し、ジアミノプロパンで変性されたアトラジンの場合の
適正な分子量を、その主要な生成物が有することを示し
た。
【００６１】質量分析の後で、ジアミノプロパン−アト
ラジンをＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミド−長鎖ビオチン、Ｐｉｅｒｃｅ）と反応
させた。上記の通りに調製したジアミノプロパン−アト
ラジン（１０ｍｇ）を、ジメチルホルムアミド４０μｌ
中に溶解し、ｐＨ８．５の１ｍｌの４０ｍＭのＮａＨＣ
Ｏ３中に溶解されたＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ試薬２
０ｍｇを更に加えた。この混合物を２時間に亙って４℃
でインキュベートし、その後で、上記手順を使用してア
ビジンＤ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）で既に誘導体化し
たＳＴＷデバイスに適用した。ビオチニル化アトラジン
の最大の結合を得るためには、このインキュベートに２
時間以上を要したが、一晩に亙ってインキュベートを行
うことも可能である。
【００６２】〔ＳＴＷデバイスの評価〕：その後で、バ
イオセンサ測定構成の形でＳＴＷデバイスを試験した。
図２のグラフは、本発明の実現性を実証している。この
グラフは、ビオチニル化アトラジンが既にＳＴＷデバイ
スに固定化されている実験から取られたデータを表して
いる。競争免疫定量法形式を使用して、アトラジン抗体
が定濃度で存在する中でのアトラジンを、標識（ラベ
ル）試薬を使用せずにリアルタイムで検出した。
【００６３】この実験は、誘導体化したアトラジンが適
切にＳＴＷデバイスに固定化されたことと、アトラジン
分子上の認識部位に悪影響を与えることなく誘導体化さ
れたこととを証明した。
【００６４】実施例２ 〔カルベンダジム（ｃａｒｂｅｎｄａｚｉｍ）のビオチ
ニル化アナログの合成と結合〕：先ず最初に、２−アミ
ノベンゾイミダゾールを無水コハク酸と反応させること
によって、カルベンダジムのビオチニル化アナログを合
成した。こうして生成した２−スクシンアミドベンゾイ
ミダゾールを、ビオシチンヒドラジド（Ｎ６−ビオチニ
ル−Ｌ−リシンヒドラジン）と反応させた。その結果と
して生じたビオチニル化アナログを、実施例１で説明し
たようにＳＴＷデバイスに適用した。
【００６５】実施例３ 〔２，４−ジクロロフェノールのビオチニル化アナログ
の合成と結合〕：２，４−ジクロロフェノールをｐ−ジ
アゾ−ベンゾイルビオシチンと反応させることによっ
て、２，４−ジクロロフェノールのビオチニル化アナロ
グを合成した。その結果として生じた２，４−ジクロロ
フェノールのビオチニル化アナログを、実施例１で説明
したようにＳＴＷデバイスに適用した。
【００６６】実施例４ 〔２，４−ジクロロフェノキシ酢酸のビオチニル化アナ
ログの合成と結合〕 ２，４−ジクロロフェノキシ酢酸をビオシチンヒドラジ
ド（Ｎ６−ビオチニル−Ｌ−リシンヒドラジン）と反応
させることによって、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸
のビオチニル化アナログを合成した。その結果として生
じた２，４−ジクロロフェノキシ酢酸のビオチニル化ア
ナログを、実施例１で説明したようにＳＴＷデバイスに
適用した。
【００６７】以上詳述したように、本発明は、〔１〕基
体の表面に被検体を結合させるための方法であって：選
択的反応性表面を与えるために、ビオチン結合タンパク
質で構成される特定の結合材料の層で基体表面を被覆す
る段階；ビオチン−被検体複合体を生じさせるために、
約１０００未満の分子量を有する被検体をビオチンに対
して直接的又は間接的に共有結合させる段階；及び被検
体を前記ビオチン−被検体複合体に結合させるように、
前記選択的反応性表面を前記ビオチン−被検体複合体で
被覆する段階；を含むことを特徴とし、次のような好ま
しい実施態様を有する。
【００６８】〔２〕ビオチン結合タンパク質が、アビジ
ンとストレプトアビジンとから成る群から選択される
〔１〕に記載の方法。
【００６９】〔３〕被検体が、環境被検体である〔１〕
に記載の方法。
【００７０】〔４〕被検体が、アセトクロル、アラクロ
ル、アルジカルブ、アルジカルブスルホン、アルジカル
ブスルホキシド、アルドリン、アメトリム、２−アミノ
ベンゾイミダゾール、アトラジン、ベノミル、ベンゾイ
ミダゾール、２−ベンゾイミダゾリル尿素、ブタクロ
ル、カプタホル、カプタン、３−カルバミル−２，４，
５−トリクロロ安息香酸、カルバリル、カルベンダジ
ム、カルボフラン、カルボフランフェノール、クロルデ
ン、クロロタロニル、デセチルアトラジン、デスイソプ
ロピルアトラジン、３，５−ジクロロアニリン、ジクロ
ロフェノール、ジクロルプロプ、ジデアルキアトラジ
ン、ジエルドリン、エンドスルファン、エンドリン、Ｅ
ＰＴＣ、フォルペト、ヘプタクロル、ヘキサクロロベン
ゼン、３−ヒドロキシカルボフラン、イプロジオン、３
−ケトカルボフラン、３−ケトカルボフランフェノー
ル、ＭＢＣ、メタラキシル、メトミル、メトプレン、メ
トラクロル、１−ナフトール、ペンタクロロニトロベン
ゼン、ペンタクロロフェノール、フタルイミド、ポリ塩
化ビフェニル、プロメトリン、プロシミドン、プロパク
ロル、シマジン、シメトリン、テルブトリン、テルブチ
ルアジン、２，４，５，６−テトラクロロ−３−シアノ
ベンズアミド、テトラクロロヒドロキノン、テトラクロ
ロフェノール、テトラヒドロフタルイミド、チアベンダ
ゾール、チオファナート−メチル、２，５，６−トリク
ロロ−４−ヒドロキシイソフタロニトリル、トリクロロ
フェノール、ビンシオゾリン、２，４−ジクロロフェノ
キシ酢酸、２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸、
（４−クロロ−２−メチルフェノキシ）酢酸（「ＭＣＰ
Ａ」）、（４−クロロ−２−メチルフェノキシ）酪酸
（「ＭＣＰＢ」）を含む群から選択される〔１〕に記載
の方法。
【００７１】〔５〕被検体が、アトラジンである〔４〕
に記載の方法。
【００７２】〔６〕被検体をビオチンに直接結合させる
〔１〕に記載の方法。
【００７３】〔７〕被検体を結合基によってビオチンに
結合させる〔１〕に記載の方法。
【００７４】〔８〕ビオチン−被検体複合体が、次の構
造式を有する〔７〕に記載の方法。
【００７５】
【化７】
【００７６】上式中、Ｘは前記結合基、Ａは前記被検体
である。
【００７７】
〔９〕Ｘが、１〜６個の−Ｏ−、−Ｓ−、
−ＮＲ１−（但しＲ１は水素又は低級アルキル）、−Ｃ
ＯＮＨ−、−（ＣＯ）−、又は、−ＣＯＯ−結合を任意
に含む低級アルキル、低級アルコキシ、ヒドロキシル、
ハロゲン、アミノから成る群から選択される０〜６個の
置換基で置換された、Ｃ１〜Ｃ２４のヒドロカルビル結
合基である〔８〕に記載の方法。
【００７８】〔１０〕Ｘが、１〜４個の−Ｏ−、−ＮＨ
−、−ＣＯＮＨ−、又は、−（ＣＯ）−結合を任意に含
む低級アルキル、低級アルコキシ、ヒドロキシル、ハロ
ゲン、アミノから成る群から選択される０〜４個の置換
基で置換された、Ｃ１〜Ｃ１２のアルキレン結合基であ
る
〔９〕に記載の方法。
【００７９】〔１１〕ビオチン−被検体複合体が、次の
構造式を有する〔１〕に記載の方法。
【００８０】
【化８】
【００８１】〔１２〕基体が、圧電表面横波デバイスで
ある〔１〕に記載の方法。
【００８２】また、本発明は、〔１３〕低分子量の被検
体を定量するための方法であって： （ａ）（ｉ）選択的反応性表面を与えるために、ビオチ
ン−結合タンパク質で構成された特定の結合材料の層で
基体の表面を被覆することと、（ｉｉ）ビオチン−被検
体複合体を与えるために、前記被検体をビオチンに直接
的又は間接的に共有結合させることと、（ｉｉｉ）前記
被検体を前記ビオチン−被検体複合体に結合させるよう
に前記ビオチン−被検体複合体で前記反応性表面を被覆
することとによって、前記基体の表面に前記被検体を結
合させる段階； （ｂ）前記段階（ａ）の（ｉｉｉ）で与えられた表面結
合被検体を、既知量又は未知量の前記被検体を含むサン
プル中の、前記被検体に選択的に結合する検出可能部分
と接触させる段階；及び （ｃ）前記表面に結合した前記検出可能部分の量を測定
し、この測定量から前記サンプル中の前記被検体の量を
導出する段階； を含むことを特徴とし、次のような好ましい実施態様を
有する。
【００８３】〔１４〕ビオチン結合タンパク質が、アビ
ジンとストレプトアビジンとから成る群から選択される
〔１３〕に記載の方法。
【００８４】〔１５〕被検体が、環境被検体である〔１
３〕に記載の方法。
【００８５】〔１６〕被検体が、アセトクロル、アラク
ロル、アルジカルブ、アルジカルブスルホン、アルジカ
ルブスルホキシド、アルドリン、アメトリム、２−アミ
ノベンゾイミダゾール、アトラジン、ベノミル、ベンゾ
イミダゾール、２−ベンゾイミダゾリル尿素、ブタクロ
ル、カプタホル、カプタン、３−カルバミル−２，４，
５−トリクロロ安息香酸、カルバリル、カルベンダジ
ム、カルボフラン、カルボフランフェノール、クロルデ
ン、クロロタロニル、デセチルアトラジン、デスイソプ
ロピルアトラジン、３，５−ジクロロアニリン、ジクロ
ロフェノール、ジクロルプロプ、ジデアルキアトラジ
ン、ジエルドリン、エンドスルファン、エンドリン、Ｅ
ＰＴＣ、フォルペト、ヘプタクロル、ヘキサクロロベン
ゼン、３−ヒドロキシカルボフラン、イプロジオン、３
−ケトカルボフラン、３−ケトカルボフランフェノー
ル、ＭＢＣ、メタラキシル、メトミル、メトプレン、メ
トラクロル、１−ナフトール、ペンタクロロニトロベン
ゼン、ペンタクロロフェノール、フタルイミド、ポリ塩
化ビフェニル、プロメトリン、プロシミドン、プロパク
ロル、シマジン、シメトリン、テルブトリン、テルブチ
ルアジン、２，４，５，６−テトラクロロ−３−シアノ
ベンズアミド、テトラクロロヒドロキノン、テトラクロ
ロフェノール、テトラヒドロフタルイミド、チアベンダ
ゾール、チオファナート−メチル、２，５，６−トリク
ロロ−４−ヒドロキシイソフタロニトリル、トリクロロ
フェノール、ビンシオゾリン、２，４−ジクロロフェノ
キシ酢酸、２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸、
（４−クロロ−２−メチルフェノキシ）酢酸（「ＭＣＰ
Ａ」）、（４−クロロ−２−メチルフェノキシ）酪酸
（「ＭＣＰＢ」）を含む群から選択される〔１３〕に記
載の方法。
【００８６】〔１７〕被検体が、アトラジンである〔１
６〕に記載の方法。
【００８７】〔１８〕被検体をビオチンに直接結合させ
る〔１３〕に記載の方法。
【００８８】〔１９〕被検体を結合基によってビオチン
に結合させる〔１３〕に記載の方法。
【００８９】〔２０〕ビオチン−被検体複合体が、次の
構造式を有する〔１９〕に記載の方法。
【００９０】
【化９】
【００９１】上式中、Ｘが前記結合基であり、Ａが前記
被検体である。
【００９２】〔２１〕Ｘが、１〜６個の−Ｏ−、−Ｓ
−、−ＮＲ１−（但しＲ１は水素又は低級アルキル）、
−ＣＯＮＨ−、−（ＣＯ）−、又は、−ＣＯＯ−結合を
任意に含む低級アルキル、低級アルコキシ、ヒドロキシ
ル、ハロゲン、アミノから成る群から選択される０〜６
個の置換基で置換された、Ｃ１〜Ｃ２４のヒドロカルビ
ル結合基である〔２０〕に記載の方法。
【００９３】〔２２〕Ｘが、１〜４個の−Ｏ−、−ＮＨ
−、−ＣＯＮＨ−、又は、−（ＣＯ）−結合を任意に含
む低級アルキル、低級アルコキシ、ヒドロキシル、ハロ
ゲン、アミノから成る群から選択される０〜４個の置換
基で置換された、Ｃ１〜Ｃ１２アルキレン結合基である
請求項２１に記載の方法。
【００９４】〔２３〕ビオチン−被検体複合体が、次の
構造式を有する〔１３〕に記載の方法。
【００９５】
【化１０】
【００９６】〔２４〕基体が、圧電表面横波デバイスで
あり、段階（ｃ）を、前記表面に結合した検出可能部分
の質量を測定することによって行う〔１３〕に記載の方
法。
【００９７】更に、本発明は、〔２５〕次の構造式を有
するビオチン−被検体複合体であり、次のような好まし
い実施態様を有する。
【００９８】
【化１１】
【００９９】上式中、Ｘが結合基であり、Ａが約１００
０未満の分子量を有する被検体である。
【０１００】〔２６〕Ｘが、１〜６個の−Ｏ−、−Ｓ
−、−ＮＲ１−（但しＲ１は水素又は低級アルキル）、
−ＣＯＮＨ−、−（ＣＯ）−、又は、−ＣＯＯ−結合を
任意に含む低級アルキル、ヒドロキシル、ハロゲン、ア
ミノから成る群から選択される０〜６個の置換基で置換
された、Ｃ１〜Ｃ２４のヒドロカルビル結合基である
〔２５〕に記載のビオチン−被検体複合体。
【０１０１】〔２７〕Ｘが、１〜４個の−Ｏ−、−ＮＨ
−、−ＣＯＮＨ−、又は、−（ＣＯ）−結合を任意に含
む低級アルキル、ヒドロキシル、ハロゲン、アミノから
成る群から選択される０〜４個の置換基で置換された、
Ｃ１〜Ｃ１２アルキレン結合基である〔２６〕に記載の
ビオチン−被検体複合体。
【０１０２】〔２８〕ビオチン−被検体複合体が、次の
構造式を有する〔２７〕に記載のビオチン−被検体。
【０１０３】
【化１２】
【０１０４】
【発明の効果】本発明によれば、ビオチンとビオチン結
合タンパク質との間の強力な相互作用を利用して、圧電
表面横波デバイスの質量検知表面のような基体表面に低
分子量の被検体分子を簡単かつ確実に結合させることが
できる。この結果として、本発明によれば、各種サンプ
ル中の低分子量の被検体分子の存在及び／又は量を容易
に検知することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】現行の被検体結合方式と診断方式とに組み合わ
せて使用可能な表面横波デバイスを示す断面図である。
【図２】本発明の方法を用いて用意されたアトラジン被
覆圧電表面横波デバイスを使用したアトラジン抗体の検
出を示す、実施例１で説明した実験作業から得られたグ
ラフである。
【符号の説明】
１１ 圧電基体 １２，１３ インターディジタルトランスデューサ １２′，１２″ 電極 １４ 表面 １５ 金属格子 １６ 付着層 １８ 反応性層

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 基体の表面に被検体を結合させるための
    方法であって：選択的反応性表面を与えるために、ビオ
    チン結合タンパク質で構成される特定の結合材料の層で
    基体表面を被覆する段階；ビオチン−被検体複合体を生
    じさせるために、約１０００未満の分子量を有する被検
    体をビオチンに対して直接的又は間接的に共有結合させ
    る段階；及び被検体を前記ビオチン−被検体複合体に結
    合させるように、前記選択的反応性表面を前記ビオチン
    −被検体複合体で被覆する段階；を含む基体表面への被
    検体の結合方法。
  2. 【請求項２】 低分子量の被検体を定量するための方法
    であって： （ａ）（ｉ）選択的反応性表面を与えるために、ビオチ
    ン−結合タンパク質で構成された特定の結合材料の層で
    基体の表面を被覆することと、（ｉｉ）ビオチン−被検
    体複合体を与えるために、前記被検体をビオチンに直接
    的又は間接的に共有結合させることと、（ｉｉｉ）前記
    被検体を前記ビオチン−被検体複合体に結合させるよう
    に前記ビオチン−被検体複合体で前記反応性表面を被覆
    することとによって、前記基体の表面に前記被検体を結
    合させる段階； （ｂ）前記段階（ａ）の（ｉｉｉ）で与えられた表面結
    合被検体を、既知量又は未知量の前記被検体を含むサン
    プル中の、前記被検体に選択的に結合する検出可能部分
    と接触させる段階；及び （ｃ）前記表面に結合した前記検出可能部分の量を測定
    し、この測定量から前記サンプル中の前記被検体の量を
    導出する段階； を含む低分子量被検体の定量方法。
  3. 【請求項３】 次の構造式を有するビオチン−被検体複
    合体。 【化１】 上式中、Ｘが結合基であり、Ａが約１０００未満の分子
    量を有する被検体である。
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