NL1014816C2 - Werkwijze voor het bepalen van binding met natuurlijke receptoren. - Google Patents

Description

Werkwijze voor het bepalen van binding met natuurlijke receptoren

Gebied van de uitvinding

De uitvinding ligt op het gebied van de ontwikkeling, door toepassing van biosensoren, van 5 nieuwe geneesmiddelen die binding met natuurlijk receptoren vertonen.

Achtergrond van de uitvinding

Er is een voortdurende behoefte aan nieuwe geneesmiddelen, in het bijzonder aan geneesmiddelen die een controleerbare en specifieke wisselwerking met receptoren in het 10 lichaam kunnen aangaan. Het gaat daarbij vooral om aan celmembraan gebonden receptoren, zoals receptoren die deel uitmaken van het centrale zenuwstelsel. Voor die ontwikkeling dient in zo kort mogelijk tijd een zo groot mogelijk aantal kandidaat-geneesmiddelen in vitro te kunnen worden getest op mogelijke wisselwerking met dergelijke receptoren.

Optische meettechnieken zijn geschikt om de hiervoor beschreven interacties te meten. Door 15 de binding van liganden aan receptoren zal de brekingsindex dicht aan het sensoroppervlak veranderen.

Een van de te gebruiken detectiemethoden in dergelijke testen betreft Surface Plasmon Resonance (SPR), meer in het bijzonder de BIACORE® (Pharmacia). De BIACORE is een geïntegreerd geheel bestaande uit een optische detectie-eenheid, een doorstroomsysteem en 20 een sensoroppervlak. Dit oppervlak is een vervangbare sensorchip bestaande uit een glaasje met een dunne goudlaag waarop een coating bestaande uit gecarboxyleerd dextraan is aangebracht. Aan deze coating kan een receptormolecuul worden gekoppeld (Löfös en Johnsson 1990).

Detectie in dit systeem is gebaseerd op surface plasmon resonance (SPR), wat neerkomt op 25 het meten van veranderingen in de brekingsindex die worden veroorzaakt door binding van moleculen aan het sensoroppervlak. Bij een bepaalde golflengte en invalshoek wordt lichtenergie geabsorbeerd door vrije elektronen in de dunne metaalfilm en zal dientengevolge de intensiteit van het gereflecteerde licht afhemen. De hoek waar dit verschijnsel plaatsvindt, verandert met de massa op het sensoroppervlak. Het uiteindelijk gemeten verschil in 30 brekingsindex is afhankelijk van de snelheid van associatie en dissociatie van een receptor molecuul en het desbetreffende ligand.

Met SPR, meer specifiek de BIACORE 2000 en 3000 series, is een verandering in brekingsindex tengevolge van binding aan receptormoleculen van deeltjes met een massa r. O .i van enkele honderden daltons waar te nemen. De hoeveelheid te binden deeltjes, en dus de concentratie daarvan, moet dan echter zeer hoog zijn. Dit houdt in dat de praktische toepasbaarheid van SPR voor de beschreven werkzaamheden beperkt is.

2 m

De brekingsindexveranderingen zoals hiervoor beschreven liggen in de orde grootte van 10' 5 tot 10'8. Met een sensor op basis van Mach-Zehnder Interferometrie (MZI) kunnen deze kleine brekingsindexveranderingen waargenomen worden. (R. Heideman, 1993). Ook met de MZI worden brekingsindexveranderingen gemeten. De detectie is niet gebaseerd op het meten van lichtintensiteitsveranderingen zoals bij SPR maar op het meten van faseverschillen van het licht. Omdat de faseverandering van licht nauwkeuriger te meten is 10 dan lichtintensiteitsveranderingen, is de op MZI gebaseerde sensor beter instaat om brekingsindexveranderingen t.g.v. laagmoleculaire componenten nauwkeurig te meten.

Beschrijving van de uitvinding

De uitvinding betreft een werkwijze voor het bepalen van specifieke binding tussen een 15 natuurlijke receptor en zijn ligand, door middel van reversibele immobilisatie van membraan-gebonden receptoren, eiwitten of andere biologische moleculen aan sensor-oppervlakken. De werkwijzen volgens de uitvinding zijn gedefinieerd in bijgaande conclusies. Onder een "natuurlijke receptor" wordt hier verstaan een biologisch molecule dat een specifieke bindingspartner heeft. Deze specifieke bindingspartner wordt aangeduid als 20 "ligand". Onder "aanwezig in celmembraanfragmenten" wordt verstaan zodanig aanwezig - gewoonlijk op celmateriaal - dat de natuurlijke functionaliteit behouden blijft.

De immobilisatie vindt plaats via een koppelende stof waarmee de receptor is verbonden en een daarmee bindende of complexerende stof, aangeduid als antistof, die is verbonden met het sensoroppervlak. De koppelende stof is bij voorbeeld een antigeen en de antistof is dan 25 een antilichaam tegen het antigeen. Voorbeelden zijn biotine en anti-biotine, digoxiginine en anti-digoxiginine. Voorwaarde is dat de interactie tussen antigeen en antilichaam te regenereren is.

In de literatuur wordt melding gemaakt van de immobilisatie van membraan-gebonden 30 biologische moleculen door deze moleculen eerst te zuiveren uit hun natuurlijke omgeving.

Vervolgens worden de moleculen geïmmobiliseerd aan het oppervlak van een kunstmatig membraan. Het grote nadeel van deze immobilisatietechniek is dat de biologische moleculen eerst gezuiverd moeten worden. Gedurende de zuivering verandert veelal de structuur van 3 het biologische molecuul en daarmee ook de biologische activiteit en specificiteit Na de zuivering worden de biologische moleculen in een kunstmatig membraan geplaatst De samenstelling van dit membraan wijkt af van het natuurlijke membraan waar het biologisch molecuul uit komt. Dit kan tot gevolg hebben dat wederom de biologische activiteit en 5 specificiteit wijzigen. Wanneer er metingen uitgevoerd worden met dit soort coatings is het dus de vraag of datgene wat wordt gemeten wel hetgeen is dat men wil meten. Daarom is het in tweeërlei opzicht van belang dat dit soort biologische moleculen geïmmobiliseerd worden zonder dat de moleculen uit hun natuurlijke omgeving gehaald worden.

Een tweede probleem dat optreedt is dat de interactie tussen bijvoorbeeld het ligand en de 10 desbetreffende receptor niet meer verbroken kan worden. Dat wil zeggen dat het sensor-oppervlak niet meer geregenereerd kan worden. Dit probleem ontstaat doordat veelal een cascademechanisme aanwezig is op cellulair niveau. Een voorbeeld hiervan is het mechanisme van de aan G-eiwit gebonden receptor. Op het moment dat een ligand bindt aan de receptor zal de α-subunit van het G-eiwitcomplex loslaten. Deze α-subunit zorgt voor 15 energieoverdracht naar het membraangebonden enzym adenylaatcyclase. In een gesloten systeem als de cel wordt de α-subunit gecirculeerd. Nadat de α-subunit de energie overgedragen heeft op het enzym kan het weer binden aan het G-eiwit. Op dat moment kan de ligand weer loslaten van het receptor molecule. Aan een sensoroppervlak vindt dit principe van circuleren niet plaats. Dit heeft tot gevolg dat een sensoroppervlak maar een 20 maal gebruikt kan worden.

De oplossing voor dit probleem is om de membranen op een generieke en reversibele manier te immobiliseren. Hiermee wordt bedoeld dat ieder membraantype op dezelfde manier aan het sensoroppervlak gebonden kan worden. Wanneer de interactie tussen de receptor en het ligand heeft plaatsgevonden, wordt het hele complex van membranen, met receptoren, en het 25 gebonden ligand verwijderd van het sensoroppervlak. Hierna kunnen opnieuw membraan-fragmenten gebonden worden aan het sensoroppervlak, waarna de interactie tussen de receptor en een nieuw te testen ligand gemeten kan worden.

Op de hieronder beschreven manieren kunnen membranen generiek en reversibel gebonden worden.

30 Op het sensoroppervlak wordt de antistof covalent gebonden. Deze antistoffen herkennen een laagmoleculair molecuul. Te denken valt aan biotine of stoffen met een vergelijkbare molecuulmassa. De verbinding tussen het sensoroppervlak en de antistof kan op covalente wijze geschieden. Het sensoroppervlak kan bij voorbeeld door plasmapolymerisatie worden ** f « ·'v 4 geactiveerd, zodanig dat het oppervlak functionele groepen bevat. Een bruikbare functionalisering is die met ethyleendiamine. Verdere functionalisering kan plaats vinden met bij voorbeeld thiolaan onder vorming van een thiol, waaraan zich bij voorbeeld PMPI (p-maleïdofenyl-isocyanaat) kan binden. PMPI vormt een isoureumbinding (-NH-CO-NH-) 5 met een amine of een carbamaat-binding (-NH-CO-0-) met bij voorbeeld een sacharide van de antistof. Wanneer het sensoroppervlak met een andere reactieve groep gefunctionaliseerd wordt, kunnen andere conventionele homo- of heterobifunctionele crosslinkers gebruikt worden (zie bij voorbeeld Wong, 1991). Voorbeelden van dit soort crosslinkers zijn disuccinimidylsuberaat (DSS), dimethylpimelimidaat (DMP), m-maleimidobenzoyl-10 sulfosuccinimide ester (Sulfo-MBS), N-Ssccinimidyl-4-azido-salicylaat (NHS-ASA), 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide(EDC).

Het biotine of de andere koppelende stof wordt covalent gebonden aan een lectine of een stof die net zoals lectine een interactie kan aangaan met een membraan, bij voorbeeld via de 15 sacharidecomponenten daarvan. Andere interacties tussen membraancomponenten en receptormoleculen zijn mogelijk. Voorbeelden van membraancomponenten zijn onder andere cholesterol, Na/K-pompen, membraangebonden enzymen en eiwitten, glycoproteinen en glycolipiden. Er is nu een gelabeld lectine gemaakt dat gebonden kan worden aan het sensoroppervlak d.m.v. de aangebrachte antilichamen tegen biotine. Vervolgens wordt een 20 oplossing van membraanfragmenten over het sensoroppervlak geleid. De membraanfragmenten zullen nu aan het sensoroppervlak binden doordat de lectine een interactie aangaat met de membraan. Deze interactie is in de meeste gevallen niet reversibel. Indien dit wel zo is, kan het lectine direct covalent gebonden worden aan het sensoroppervlak. De membranen kunnen van het sensoroppervlak verwijderd worden door 25 de verbinding tussen het covalent gebonden antilichaam en het gelabelde lectine te verbreken. Vervolgens kan op nieuw het gelabelde lectine aangeboden worden waarna opnieuw membraanfragmenten kunnen binden aan het sensoroppervlak.

Aldus kunnen 1.3* 1010 tot 2.7* 1010 receptoren per mm2 sensoroppervlak worden gekoppeld, afhankelijk van de receptordichtheid in het membraan. In vergelijking met de literatuur 30 (Kalb, 1992 en Cooper, 2000), waar een oppervlaktedichtheid van de receptoren bereikt wordt van 2%, wordt in dit geval een oppervlaktedichtheid van 68% behaald.

5

Een variant op het hiervoor geschrevene is dat de membraanfragmenten direct gebiotinyleerd kunnen worden. Dit geeft in de meeste gevallen een verslechtering van het resultaat omdat het biotine ook aan de receptormoleculen zullen binden waardoor de receptormoleculen hun ligand niet meer kunnen herkennen en binden. Daarnaast kan er ook gebruik gemaakt 5 worden van de immobilisatie van andere receptormoleculen (zoals antilichamens receptoren, DNA etc.) om de membraanfragmenten te binden. De receptormoleculen herkennen dan biomoleculen in het membraan. Te denken valt aan onder andere antilichamen tegen lipopolysachariden en cholesterol.

Een gekoppelde, gebruikte sensor kan worden geregenereerd door incubatie of injectie met 10 een regeneratievloeistof. Afhankelijk van de koppelende stof en de antistof kan dit een zuur, een base, een zout (hoge concentratie), een zeep of een organisch oplosmiddel zijn, of een combinatie van deze middelen. Voor biotine-antibiotine voldoet een oplossing van natriumhydroxide van bij voorbeeld 25 mM. In andere gevallen kan een andere oplossing nodig zijn voor het regenereren van het sensoroppervlak (Tsang, 1991).

15

Voorbeelden 1. Inleiding

Hier wordt de ontwikkeling beschreven van een V2-receptor-coating met een verwijderbare receptor-ligand-laag voor toepassing op een Mach-Zehnder Interferometer (MZI). Een ligand 20 (agonist) van de V2-receptor is vasopressine, in het bijzonder arginine-vasopressine (AVP). Experimenten met radioreceptor-analyse (RRA) evenals experimenten uitgevoerd met een biosensor op basis van ‘surface plasmon resonance’ (SPR) hebben aangetoond dat het mogelijk is receptor-membraanfragmenten (RMF’s) generiek en op een regenereerbare manier te immobiliseren op het MZI-sensoroppervlak.

25 Hier wordt beschreven hoe een bio-interface (RMF’s) moet worden geïmplementeerd op een geïntegreerde Mach-Zehnder Interferometer (IMZI). De IMZI-chips met de verkregen receptor-biocoating moet de sensorspecificaties vervullen wat betreft: • selectieve detectie van de agonist AVP van de V2-receptor • regenereerbaarheid van het sensoroppervlak 30 · een generiek detectiesysteem om verschillende typen membraan gebonden receptoren te testen.

2. Materiaal en methoden 6

De IMZI-sensorchips, aangeschaft bij Mierij Meteo bv, werden voorzien van een V2-RMF-biocoating. Twee technieken werden toegepast voor de immobilisatie van de V2-RMF. Deze coatings bestonden uit: 1) gebiotinyleerde V2-RMF gebonden aan de anti-biotine, die op zijn beurt covalent 5 werd gekoppeld aan het plasma-gepolymeriseerde sensoroppervlak, en 2) natuurlijke V2-RMFgebonden aan de anti-biotine op het sensoroppervlak via een generieke intermediair molecule, namelijk lectine-biotine, waarbij lectine zich bindt aan de sacharidecomponenten van de RMF’s en/of wordt geïncorporeerd in de lipidestructuur van de membranen.

10 2.1. Bereiding van de Vr-receptor-membraanfragmenten (RMF)

De V2-receptorcellen werden verkregen door het klonen en isoleren van de cellijn van het type 2936hV2R. Door de resulterende celsuspensies te behandelen met lysis-buffer werden V2-receptor-membraanfragmenten (RMF) verkregen overeenkomstig het protocol 15 beschreven in bijlage B bij het Progress Report phase 2.

Celgroei:

Voor groei in suspentie (in spinner flasks) is L-15 medium gebruikt (liebowitz's medium; Gibco 41300-021) aan gevuld met 10% FBS, 2mM glutamine, pen/strep, 0.1% Plutonic F-68 20 (gibco 24040-032), 250 ug/ml hygromycine (Gibco). De celdichtheid wordt maximaal 106 cellen/ml. Twee keer per week worden de cellen uitverdund.

Membraanbereiding:

Membraan buffer 100 mM TRIS-HC1, pH 7.5 (kamer temperatuur.), 10 mM MgC12 25 Lysis buffer 50 mM TRIS-HC1, pH 7.5 (room temp.), 3 mM EDTA, 2 mM MgC12 1. De cellen worden verzameld en gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur bij 700 rpm afgedraaid.

2. De cellen worden geresuspendeerd in ijskoude lysisbuffer en gehomogeniseerd in 3 0 een glas-glas homogeniseerder met 12-15 bewegingen.

3. De membranen worden gedurende 30 minuten bij 4°C afgedraaid bij 21,000g.

4. De pellet wordt uiteindelijk geresuspendeerd in ijskoude membraan buffer,en bewaard bij -80°C.

- ‘ '"Ti 7 2.2. Het functionaliseren van het oppervlak van de IMZI-chip (S1O3)

De IMZI-chips werden gereinigd met behulp van een op microgolven gebaseerd plasma-etsapparaat in een atmosfeer van argon/zuurstof gedurende 5 minuten bij een 100% microgolfVermogen van 1250 W. Meteen daarna, zonder interferentie, werden de monsters 5 in dezelfde microgolfkamer 30 seconden, bij 5% microgolfVermogen, blootgesteld aan een plasma van ethyleendiaminedamp. De gas-stroomsnelheid van 15 ml/min werd gecontroleerd door een massastroom-controlesysteem. Door middel van plasma-polymerisatie van MZI-chips in ethyleendiamine werden de oppervlakken gefunctionaliseerd met aminogroepen, die kunnen worden gebruikt voor de verdere koppeling van moleculen aan het oppervlak, 10 resulterend in zogenaamde ‘Optical qualified Functionalized Surfaces’ (OFS). De aminogroepen op de met plasma gepolymeriseerde chips worden gemodificeerd tot thiolgroepen (-SH) door middel van thionalisatie met 1 mg/ml thiolaan in een boraat-bufferoplossing.

Een anti-biotine-antilichaam werd gekoppeld aan het oppervlak van de IMZI-chip door de 15 chip te incuberen in 1 mg/ml N-[p-maleimidofenyl]isocyanaat (PMPI) in boraatbuffer gedurende 1 uur en vervolgens in 50 pg/ml anti-biotine in boraatbuffer gedurende 1 uur. Het sensoroppervlak kan met verschillende functionele groepen bekleed worden. Te denken valt aan o.a. carboxyl-, amino-, thiol-, epoxidegroepen. M.b.v. homo- of heterobifunctionele crosslinkers kunnen de receptor moleculen, waaraan de membraanfragmenten binden, 20 gebonden worden aan het sensoroppervlak.

2.3. Biotinylering van RMF ’s

Met PMPI gederivatiseerde RMF (biotinylering)

Aan 1 ml 0,5 mg/ml 1-cysteïne werd 1 ml 0,5 mg/ml NHS-LC-biotine toegevoegd (beide in 25 50 mM boraatbuffer, pH 8,9) en het reactiemengsel werd 2 uur bij kamertemperatuur geroerd. Aan dit mengsel werd 0,8 mg PMPI in 50 μΐ DMSO toegevoegd en het aldus ontstane mengsel werd vervolgens 1 uur bij kamertemperatuur in het donker geroerd.

Dan werd 2 ml RMF-oplossing (2 mg/ml eiwit, membraanbuffer) toegevoegd, en het resulterende mengsel werd ten minste 2 uur in het donker geroerd en vervolgens opgeslagen 30 bij 4°C tot het werd gebruikt.

2.4. Gebiotinyleerde Concanavalin A

8

Aan 100 μΐ Concanavalin A werd 50 μΐ 0,3 mg/ml NHS-LC-biotine in 50 mM boraatbuffer (pH 8,9) en 850 μΐ 50 mM boraatbuffer (pH 8,9) toegevoegd, en het mengsel werd 2 uur geroerd en vervolgens opgeslagen bij 4°C tot het werd gebruikt.

5 2.5. Immobilisatie van RMF’s op het sensoroppervlak

De RMF’s werden geïmmobiliseerd op de anti-biotine-IMZI-chips op twee verschillende regenereerbare manieren: • in één stap: voor binding van gebiotinyleerde RMF, of • in twee stappen: door binding van respectievelijk biotine-lectine en onge-10 modificeerde RMF.

2.6. IMZI-experimenten

De dubbele-cuvet werd gemonteerd op de optische vensters van de IMZI.

De eerste specifieke receptorexperimenten aan de IMZI-opstelling werden uitgevoerd met 15 een IMZI-chip gecoat met een muis anti-biotine-laag bereid zoals beschreven in 2.2.

Het monster - dat een verdunde oplossing kan zijn van gebiotinyleerde RMF’s, ongebiotinyleerde RMF’s of lectine-biotine in running buffer (Hepes-gebufferde NaCl, HBS) voor het immobiliseren van de RMF’s of een oplossing van AVP in HBS voor de detectie van AVP - werd in één of beide cuvetten geïnjecteerd en gemengd door opnieuw te spoelen 20 met een pipetventiel. De wasstappen werden uitgevoerd met HBS.

2.7. Berekening van de AVP gevoeligheid uit de respons van de verschuiving van de IMZI-fase

Het meetprincipe berust op verandering van de brekingsindex in het evenacente veld, 25 gemeten met een interferometer. Voor een vlakke optische golf als voelend element wordt in de literatuur (R. Heideman, 1993) een theoretische verband besproken tussen de fase-verschuiving en de effectieve verandering van de brekingsindex van de modus, de duur van de interactie, de golflengte van het gebruikte laserlicht en de verandering van de brekingsindex van de bedekking, inclusief reacties aan het oppervlak.

30 Voor een homogene eiwitlaag op het oppervlak van de de IMZI-sensor met een brekingsindex voor eiwit van 1,45 en voor water van 1,33 kan de verandering in brekingsindex worden berekend uit de faseverschuiving. De brekingsindex neemt toe met 0,001 bij .j ' ;·’ P ·; N . i '-V V ; 9 absorptie van 1 ng/mm2 eiwit op het sensoroppervlak (Pharmacia Biosensor AB, 1990). Dit resulteert in een verband tussen de faseverschuiving en de eiwitconcentratie op het oppervlak Am, in pg/mm2: 5 ΔΦ = 2.7 103 * Δη * 2π en Am = 370 * ΔΦ(2π) pg/mm2

Een faseverschuiving voor IMZI van 0.012π komt overeen met een eiwitdichtheid op het oppervlak van 3.7 pg/mm2 10 3. Resultaten en bespreking

De experimenten hadden als doel om de biocoating van vasopressine receptor-membraan-fragmenten (V2-RMF) te implementeren op de geïntegreerde Mach-Zender Interferometer (IMZI). Het doel was aan te kunnen tonen dat • IMZI kan worde gebruikt voor selectieve detectie van de V2-agonist AVP, en 15 · het sensoroppervlak kan worden geregenereerd.

Ook IMZI-chips met een biocoating die een andere aan het membraan gebonden receptor bevatte, namelijk de β-adienoceptor, werden bereid en getest op gevoeligheid voor AVP om te onderzoeken of: • de sensor kan worden gebruikt als een generiek detectiesysteem voor verschillende 20 typen aan een membraan gebonden receptoren.

3.1 Vasopressine-RMF-biocoating op de IMZI en detectie van A VP

De IMZI-sensorchips werden voorzien van een V2-RMF-biocoating zoals beschreven onder Materiaal en methoden. Deze coatings bestonden uit: 25 · gebiotinyleerde V2-RMF gebonden aan het sensoroppervlak gemodificeerd met anti-biotine, en • natuurlijke V2-RMF gebonden aan de anti-biotine op het sensoroppervlak via een generieke intermediair molecule, lectine-biotine, waarbij lectine zich bindt aan sacharidecomponenten van de RMF’s en/of wordt geïncorporeerd in de lipidestructuur 30 van de membranen.

Figuur 1 laat de on-line immobilisatie van gebiotinyleerde V2-RMF zien op een IMZI-chip met antibiotine-coating. De figuur laat een tijdplot van de IMZI-respons zien uitgedrukt in 10 responseenheden van een faseverschuiving van 2π (RU) tijdens immobilisatie. Een fase-verschuiving van 0,4 RU werd verkregen na injectie van 50 μΐ 25 pg/ml gebiotinyleerde V2-RMF. Na wassen met runningbuffer bleef een faseverschuiving van ca. 0,3 RU over. Dit geeft aan dat een V2-RMF-biotin-»-antibiotine-chip feitelijk is gerealiseerd.

5

Figuur 2 laat een responstijd-plot zien tijdens de binding van AVP aan de V2-RMF-biotine-»-antibiotine-chip. Twee minuten na injectie van 500 μΜ AVP werd de respons-tijdcurve afgebroken doordat een luchtbel tijdens de AVP-injectie op het sensoroppervlak terecht was gekomen. Na stabilisatie van het signaal werd een faseverschuiving van 0,055 RU bereikt. 10 Rekening houdend met het verband tussen faseverschuiving en eiwitconcentratie op het oppervlak, beschreven in Materiaal en methoden, komt dit overeen met een eiwitdichtheid op het oppervlak van ca. 18 pg/mm2. Vervanging van de oplossing door 750 μΜ AVP verhoogde de IMZI-respons tot 0,12 RU, overeenkomend met een dichtheid van gebonden AVP op het oppervlak van 45 pg/mm .

15 Het feit dat de respons niet verder toenam door een hogere AVP-concentratie, van 875 μΜ, wijst erop dat het verzadigingsniveau voor binding was bereikt.

Figuur 3 laat een respons-tijdplot zien voor immobilisatie van ongebiotinyleerde (natuurlijke) RMF via gebiotinyleerde lectine (Concanavaline A, ConA) op de IMZI-chip 20 met antibiotine-coating. De immobilisatiestappen van lectine-biotine en V2-RMF’s worden respectievelijk weergegeven in de IMZI-responscurve. Injectie van AVP resulteerde in een faseverschuiving van ca. 0,06 RU, wat overeenkomt met 22 pg/mm2 gebonden AVP aan het sensoroppervlak.

25 3.2 Regeneratie

Tussen de verschillende experimenten door werd de chip gewassen met 25 mM NaOH. Deze regeneratiestap leidde tot het verwijderen van al het biologische materiaal dat aan de antibiotinelaag vast zat. Dit duidt erop dat beide immobilisatiemethoden - gebiotinyleerde RMF en lectine-biotine met ongebiotinyleerde RMF - worden geregenereerd op het niveau 30 van antibiotine«-biotine.

3.3 β-Adrenoceptor-RMF biocoating op de IMZI en een negatieve controle * o ••'ï /" ' i *.· ; /-. · . o 11

Een negatieve controle werd uitgevoerd met een RMF-biocoaing die een alternatieve aan de membraan gebonden receptor bevatte, namelijk de β-adrenoceptor.

Figuur 4 laat een respons-tijdcurve zien die resulteert uit de IMZI-experimenten met een 5 chipoppervlak gecoat met antibiotine. De binding van lectine-biotine resulteert in een resterende faseverschuiving van 9 RU na het wassen met membraanbuffer. Een faseverschuiving van ca. 4 RU volgde daarna op de injectie van β-adrenoceptor RMF.

Dit toont aan dat ook een alternatieve receptor gebonden aan het membraan effectief kan worden geïmmobiliseerd. De methode waarbij gebiotinyleerde lectine (ConA) wordt 10 gebruikt blijkt een generieke immobilisatiemethode te zijn.

De injectie daarna van AVP op de aldus verkregen β-adrenoceptor -lectine-biotine-»-antibiotine-chip resulteerde in een aanvankelijke faseverschuiving van 0,2 RU. Na wassen met bufferoplossing keerde het responssignaal echter terug tot de basiswaarde.

Injectie van AVP leverde geen resterende IMZI-respons op. Dit toont aan dat de binding van 15 AVP aan de biocoating van de V2-receptor op de IMZI-chip specifiek is.

Conclusie

De resultaten verkregen met RRA en SPR konden worden gereproduceerd door experimenten met de geïntegreerde Mach-Zender Interferometer (IMZI). Alle doeleinden -20 specifieke detectie van AVP, het regenereren van de sensorchip en generieke immobilisatie van receptoren gebonden aan het membraan - werden gehaald.

4. Literatuur: • Cooper, M.A., Hansson, A., Löfls, S., and Williams, D.H., A vesicle capture sensor 25 chip for kinetic analysis of interactions with membrane-bound receptros,

Analytical Biochemistry 277,196-200,2000.

• Heideman, R.G., “Optical waveguide based evanescent field immunosensors”, Proefschrift, ISBN 9005679 3, 1993, Universiteit Twente • Kalb, E. et al., Biochim. Biophys. Acta, 1992, 1103,307-316.

30 · Pharmacia Biosensor AB, LöfSs en Johnsson, “BIAcore™ Methods Manual”, versie

November 1990, biz. 3-4.

• Tsang, V.C.W. and Wilkins, P.P., Optimum dissociating conditions for immuno 12 affinity and preferential isolation of antibodies with high specific activity, Journal of Immunological Methods, 138,1991,291-299.

• Wong, S.S., Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking, CRC Press, ISBN 0-8493-5886-8,1991.

5 .· , ·--·

Claims (9)

1. Werkwijze voor het reversibel koppelen van een natuurlijke receptor aan een sensoroppervlak, welke receptor aanwezig is in celmembraanfragmenten, met het kenmerk dat men de receptor verbindt met een koppelende stof die een specifieke en reversibele binding kan aangaan met een antistof, en de antistof met het sensoroppervlak verbindt.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij de koppelende stof biotine is en de antistof antibiotine is.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, waarbij men de antistof met het sensoroppervlak verbindt door midel van een covalente binding.

4. Werkwijze volgens een der voorgaande conclusies, waarbij men de receptor met de koppelende stof verbindt door middel van aan de koppelende stof gebonden lectine.

5. Werkwijze volgens een der voorgaande conclusies, waarbij men ten minste 101, i het bijzonder ten minste 1010 receptoren per mm2 sensoroppervlak koppelt

6. Werkwijze volgens een der voorgaande conclusies, waarbij men, voordat men de antistof met het sensoropppervlak verbindt, het sensoroppervlak activeert door plasma-etsen gevolgd door reactie meteen bifunctionele crosslinker.

7. Werkwijze volgens een der voorgaande conclusies, waarbij men voorafgaande aan het koppelen van receptor en sensoroppervlak een aldus gekoppelde, gebruikte sensor regenereert door incubatie of injectie met een regeneratievloeistof.

8. Sensor die reversibel is bekleed met een natuurlijke receptor, verkrijgbaar met de werkwijze volgens een der voorgaande conclusies. y' ' ' .· *s Werkwijze voor het bepalen van specifieke binding tussen een natuurlijke receptor en een ligand, met het kenmerk dat men de met de receptor beklede sensor volgens conclusie 8 in contact brengt met het ligand en de wisselwerking tussen de receptor en het ligand meet.

10. Werkwijze volgens conclusie 9, waarbij met de wisselwerking meet door middel van Mach-Zender-interferometrie. • f · - ' • -4 . ’ ·>;