DK161112B - Baeremateriale til anvendelse ved immunbestemmelse,fremgangsmaade til fremstilling af baerematerialet og anvendelse deraf ved immunbestemmelser - Google Patents

Description

i

DK 161112 B

Den foreliggende opfindelse angår et bæremateriale til anvendelse ved immunbestemmelse, hvor en immunologisk reaktionspartner er bundet kovalent til bærematerialet, en fremgangsmåde til fremstilling af bærematerialet samt anvendelse af 5 bærematerialet ved immunbestemmelse.

Fremgangsmåder til immunbestemmelse er vidt udbredte. Hyppigt anvendes ELISA-fremgangsmåden, hvor en immunreaktions reaktionspartner foreligger adsorberet til en fast fase. Som fast 10 fase anvender man i praksis her fortrinsvis små formstofrør eller mikrotiterplader, der på den indre overflade adsorberet bærer en reaktionspartner. Lige så almindeligt er det at anvende kugler, der på deres ydre overflade adsorberet bærer en reaktionspartner. De mest almindelige tre fremgangsmåder til 15 enzymimmunbestemmelse er nu sandwichmetoden, den indirekte metode og konkurrencemetoden. Ved sandwichmetoden adsorberes et antistof på bæreren, prøveopløsningen tilsættes, hvorved det i prøveopløsningen indeholdte specifikke antigen bindes til antistoffet. Derefter tilsættes enzymmærket specifikt antistof 20 for antigen-antistof-komplekset, hvilket mærkede antistof derpå bindes til komplekset. Til sidst tilsætter man det for enzymet specifikke substrat. Dette substrat reagerer på specifik måde. Reaktionen kan f.eks. bedømmes fotometrisk. Ved måling af lysabsorption eller den optiske tæthed kan man derpå 25 beregne antigenmængden, der er direkte proportional med absorptionen eller tætheden. Ved den indirekte metode adsorberes et antigen på et bæremateriale. Der tilsættes prøveopløsning, idet det i prøveopløsningen indeholdte, for det adsorberede antigens specifikke antistof reagerer med antigenet. Ved ti 1 — 30 sætning af enzymmærket antiglobulin binder antiglobulinet til antigen-antistof-komplekset. Efter tilsætning af et til enzymet specifikt substrat danner der sig igen en farve, der kan bedømmes ved fotometrisk måling og er direkte proportional med mængden af det ukendte antistof i prøveserumet. Ved den tred-35 je metode, konkurrencemtoden, bliver den ene af de to partnere i immunreaktionen adsorberet på et bæremateriale. Derefter tilsætter man en opløsning, der både indeholder den ukendte

DK 161112 B

2 anden partner i immunreaktionen og også en kendt mængde af en enzymmærket anden partner i immunreaktionen. Begge partnere binder sig nu i konkurrence med den på bæreren absorberede immunreaktionspartner. Ved en anden prøve tilsætter man en stan-5 dardopløsning, der kun indeholder mærket partner. De to opløsninger tilsættes nu enzymsubstratet, og farvedannelsen bestemmes ved fotometrisk måling. Differencen mellem standarden og prøven gør det muligt at beregne mængden af den ubekendte reaktionspartner.

10

Hyppigt gennemføres der også radioimmunbestemmelser (RIA). RIA anvendes som prøve til eftervisning og til kvantitativ bestemmelse af antigen eller antistof ved radioaktiv mærkning af den ene af de to reaktionspartnere. Den kan gennemføres som en 15 fastfaseprøve, idet den ene af de to reaktionspartnere er bundet til en fast fase, hvorved adskillelse af antigen-antistof-komplekset fra den frie partner lettes væsentligt. Prøven gennemføres efter den konkurrerende hæmnings princip. Derved hæmmes koncentrationsafhængigt bindingen af et radioaktivt 20 mærket antigen ved hjælp af det specifikke antistof ved hjælp af et ikke mærket antigen. Jo større andelen er af det umærkede antigen, som skal måles, desto mindre er antigen-antistof-kompleksets radioaktivitet. Ved fastfase-RIA er også den direkte bindingsprøve mulig.

25

Ved alle disse fremgangsmåder kan bærematerialet og den derpå adsorberede immunreaktionspartner kun anvendes én gang til prøven, derefter kastes begge sædvanligvis bort, da den bundne immunreaktionspartner er adsorptivt bundet til bærematerialet 30 over stærke og svage vekselvirkninger, sekundære, ikke-kova-lente lipofile-, dipol-dipol- eller ion-dipol-vekselvirkning. Alle disse bindinger holder ikke stand ved de drastiske betingelser, der ved en regenerering fører til dissociation af antigen-antistof-bindingen. En vis del af den til bærermateri-35 alet bundne immunreaktionspartner løsner sig ved regenereringsprocessen, således at det ikke er muligt at anvende de hidtil kendte bærere flere gange.

DK 161112 B

3

Fra A. Ref. Biochem. 35 (I) 1966, side 879, er det allerede kendt at binde proteiner til bærematerialer over bifunktionelle reagenser. Også fra DE offentliggørelsesskrift nr. 2.523. 207 er det kendt at binde bipolymerer over en bærer. Det er 5 imidlertid ikke angivet, hvorledes en sådan kovalent binding skal udføres. Fra Angewandte Chemie, 84. årgang, 1972, H. 8. side 319-330 er det kendt at gennemføre den kovalente binding over funktionelle grupper, der foreligger på bærematerialet. Til dette må den anvendte bærer altså råde over reaktionsdyg-10 tige grupper, der kan binde reaktanterne kovalent over bro-dannere. Det var således ønskeligt at finde en mulighed, således at et protein eller en partner i en immunologisk reaktion kan bindes kovalent til en bærer, uden at det først skulle være nødvendigt at gennemføre en derivatisering.

15

Det ville således være meget ønskeligt at finde et genanvendeligt bæremateriale til immunbestemmelser, hvor en reaktionspartner er således bundet til bærematerialet, at den ikke løsnes ved regenereringsreaktionen.

20

Det er således formålet med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe et bæremateriale, som på bundet måde indeholder en immunreaktionspartner, og som kan genanvendes flere gange.

25 Dette opnås ved hjælp af et bæremateriale til anvendes ved immunbestemmelser, hvor en af den immunologiske reaktions reaktionspartnere er bundet kovalent til bærematerialet, hvilket bærermateriale er ejendommeligt ved, at reaktionspartneren er kovalent bundet over heterobifunktionelle fotoaktiverbare for-30 bindeiser, hvis ene gruppe dannes af en arylazidgruppe. Hertil anvendes fortrinsvis følgende forbindelser som brodannere: - N-5-azido-2-nitrobenzoyloxysuccinimid (ANB-NOS) - p-azidophenacylbromid 35 - p-azidophenylglyoxal - 4-fluor-3-nitrophenyl-azid - methyl-4-azidobenzoimidat-HCl

DK 161112B

4 - N-succinimidy1-(4-azidophenyldithio)-propionat - N-(4-azidophenylthio)-phthalimid - N-hydroxysuccinimidyl-4-azido-benzoat - N-hydroxysuccinimidyl-4-azidosalicylsyre 5 - N-succinimidyl-6-(4'-azido-2'-nitrophenylami no)-hexanoat - sulfosuccinimidyl-6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino)-hexanoat - ethyl-4-azidophenyl-l,4-dithiobutyrimidat-HCl - N-succinmidyl-(4-azidophenyldithio)-propionat - sul fosuccinimidyl-(4-azidophenyldi thi o)-propi onat 10 - 4,4'-dithio-bis-phenylazid.

Det foretrækkes særligt at anvende Lomant's Reagens II: N-suc-cinimidyl-6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino)-hexanoat.

15 En således bundet reaktionspartner løsner sig selv under drastiske betingelser ikke fra bærematerialet, således at et på denne måde behandlet bæremateriale meget ofte kan genanvendes.

Som bæremateriale anvendes på sædvanlig måde kugler, mikroti-20 terplader eller små rør. Dette bæremateriaTe består af et formstof, der har den egenskab, at det i så lille grad som mulig binder reaktionspartneren adsorptivt. Desuden må det være egnet til binding med den som brodanner anvendte heterobifunktionelle forbindelse. Som særligt egnet har her et overflade-25 behandlet polyethylen vist sig at være, som f.eks. det, der sælges under betegnelsen "Minisorpmateriale" i form af små rør af firmaet NUNC, Danmark. Det er også muligt at anvendes form-stofmateriale, der ved derivatisering er egnet til binding med den heterobifunktionelle forbindelse.

30 Bæremateri al et ifølge opfindelsen egner sig til alle typer af immunbestemmelser, navnlig til ELISA og fastfase-RIA.

Alle reaktionspartnerne i en immunologisk reaktion kan være 35 bundet til bærematerialet. Således kan f.eks. et antigen, et allergen eller et antistof være fastgjort kovalent til bæreren.

DK 161112B

5

Reaktionspartneren bindes til bærematerialet over heterobi-funktionelle fotoakt i verbare forbindelser, hvis ene bifunktionelle gruppe er dannet ved hjælp af en arylazidgruppe. Fortrinsvis anvendes som brodanner de i krav 2 angivne forbindel-5 ser. Særligt foretrækkes den som Lohmant's Reagens II kendte forbindelse N-succinimidyl-6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino)-hexan, der på den ene side bærer en arylazidgruppe, der ved fotolysereaktion udløst af synligt lys omdannes under dannelse af et nitren. Det ved fotolysen dannede nitren er yderst 10 reaktionsdygtigt. Det indgår uselektivt med hensyn til sin reaktionspartner en kovalent binding med sin nærmeste nabo. Dette ved lysindvirkning fremkaldte nitren kan også reagere med forholdsvis inaktive materialer og er ved reaktionen ikke henvist til reaktionsdygtige grupper i et bestemt materiale, der 15 må anvendes af særlige grunde. Det reagerer endog med det kemisk relativt inaktive polyethylen. Den foretrukne brodanners anden funktionelle grupper er en N-hydroxy-succinimidester, der ved alkalisk pH reagerer meget skånsomt med en reaktants, som f.eks. proteins, ikke protonerede frie aminogrupper. På 20 denne måde er det muligt at binde f.eks. antigener, allergener og antistoffer.

En yderligere udførelsesform for opfindelsen består i, at man over brodanneren først binder protein A (agglutinogen fra Sta-25 phylococcus aureus med fire homologe bindingssteder for Fc-om-rådet i Immunoglobulin G: J. Sjodal (1977) Eur. J. Biochem.

73, 343-351) kovalent til bærematerialet. Tilførte antistof fer kan derpå med deres konstante del binde sig kovlent med det med protein belagte bæremateriale, og antistoffernes vari-30 able dele er da til rådighed for binding med den anden partner i den immunologiske reaktion. En således orienteret aktivering af bæreren forøger belægningens biologiske effektivitet i overordentlig grad og gør systemet mere følsomt regnet på den anvendelige bærerflade. Der foreligge da også den mulighed at 35 anvende den med Protein A kovalent belagte bærer til en yderligere kemisk reaktion. Med denne kemiske reaktion kan det i forvejen orienterende adsorptivt til proteinet bundne anti-

DK 161112 B

6 stof kovalent tværbindes med proteinet under anvendelse af en proteinbrodanner, således at antistoffet efter tværbindingsreaktionen foreligger orienteret og kovalent bundet til bæreren.

5

Den over brodanneren bundne reaktionspartner har en vis afstand fra bærematerialet og også en vis mobilitet. Dette har en meget gunstig virkning på den kovalent bundne reaktionspartners tilgængelighed, hvilket igen fører til en forbedring 10 af immunreaktionen.

Bærematerialet ifølge opfindelsen, der bærer den ene partner i en immunreaktion kovalent bundet over en brodanner, kan hyppigt genanvendes, idet reaktionspartneren, selv under de dra-15 stiske betingelser, der er nødvendige for regenereringen, ikke løsnes fra bærematerialet, eftersom den netop foreligger kovalent bundet og ikke adsorptivt bundet.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af et bære-20 materiale, hvor den ene af de i immunreaktionen deltagende partnere bindes kovalent til bærematerialet, er ejendommelig ved, at bindingen sker over en heterobifunktionel, fotoakti-verbar forbindelse, hvis ene gruppe dannes af en arylazidgrup-pe, fortrinsvis over N-succinimidy1-6-(41-azido-21-nitrophe-25 nylamino)-hexan, som brodanner.

Anvendelse ved immunbestemmelse kan med bærematerialet ifølge opfindelsen vilkårligt ofte gentages, da den kovalent bundne partner selv under regenereringens drastiske reaktionsbetin-30 gelser ikke løsnes og forbliver bundet.

Ved en yderligere måde at gå frem på bindes kovalent til bæreren Protein A, som derefter bærer et antistof. På denne måde bindes de konstante dele af antistoffet, og de variable dele 35 af antistoffet står til rådighed for den immunologiske reaktion. Efter gennemføring af den immunologiske reaktion kan bæreren med det kovalent bundne Protein A og det dertil ad- 7

ur\ I D I I I /. D

sorptivt eller kovalent bundne antistof derefter genudvindes ved regnerering.

Bærematerialet ifølge opfindelsen og anvendelsen heraf til im-5 munbestemmelse har flere fordele. Et og samme bæremateriale kan meget ofte anvendes til immunbestemmelser, efter der er foretaget efter omstændighederne egnede regnereringsforan-staltninger. Særligt fordelagtigt er det ifølge opfindelsen genanvendelige bæremateriale til immunbestemmelser, hvor der 10 som den reaktionspartner, der skal bindes, anvendes en sådan, der kun er til rådighed i begrænset mængde, da den er vanskelig at fremstille eller vanskelig at isolere eller syntetisere. I sådanne tilfælde kan den til rådighed stående mængde af reaktionspartner kobles til det derivatiserede bæremateriale, 15 og det er på denne måde muligt at udføre væsentligt flere immunbestemmelser med en begrænset foreliggende mængde reaktionspartner. Desuden sænkes omkostningerne for den enkelte bestemmelse i væsentlig grad.

20 Eksempel

Protein A blev bundet til et bæremateriale under anvendelse af forbindelsen N-succinimidyl-6-(41-azido-2' - ni trophenylamino)-hexan som brodanner. Efter tilsvarende vasketrin lod man det 25 bærerbundne Protein A reagere uden lysindvirkning med Loh- mant's reagens ved alkalisk pH-værdi. Denne anden brodanner reagerede under disse betingelser kovalent med det til bæreren bundne Protein A med N-hydroxy-succinimidesteren som funktionel gruppe. Efter yderligere vasketrin blev det derivatiserede 30 bærerbundne Protein A inkuberet med antistoffer, som herved med deres konstante del blev bundet til protein A. Efter fornyede yderligere vasketrin kunne man ved en fotokemisk reaktion kovalent binde det på Protein A orienterede antistof, idet den variable del af antistoffet vendte bort fra bærer-35 overfladen og var vendt mod det antigen, der skulle bindes.

Den således derivatiserede bærer havde en højere aktiverings-tæthed og en deraf resulterende højere enzymatisk aktivitet pr. overflade. Den kunne anvendes til 100 bestemmelser.

Claims (9)

1. Bæremateriale til anvendelse ved immunbestemmelser, hvor en 5 reaktionspartner i den immunologiske reaktion er bundet kovalent til bærematerialet, kendetegnet ved, at reaktionspartneren er bundet kovalent over heterobifunktionelle fotoaktiverbare forbindelser, hvis ene gruppe dannes af en arylazidgruppe. 10

2. Bæremateriale ifølge krav 1, kendetegnet ved, at at der som heterobifunktionel fotoaktiverbar forbindelse anvendes

15 N-5-azido-2-nitrobenzoyloxysuccinimid (ANB-NOS), p-azidophenacylbromid, p-azidophenylglyoxal, 4-fluor-3-nitrophenylazid, methyl-4-azidobenzoimidat-HCl,

20 N-succinimidyl-(4-azidophenyldithio)-prop ionat, N-(4-azidophenylthio)-phthalimid, N-hydroxysuccinimidyl-4-azi do-benzoat, N-hydroxysuccinimidyl-4-azidosalicylsyre, sulfosucci ni mi dy1-6-(4'-azido-2'-ni trophenylami no)-hexanoat, 25 ethyl-4-azidophenyl-l,4-dithiobutyrimidat-HCl, N-succinimidyl-(4-azidophenyldithio)-propionat, sulfosuccinimidyl-(4-azidophenyldithio)-propionat og/eller 4,4*-dithio-bis-phenylazid. 30

3. Bæremateriale ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den heterofunktionelle fotoaktiverbare forbindelse er N-suc-cinimi dy1-6-(4'-azido-2'-ni tropheny1 ami no)-hexanoat.

4. Bæremateriale ifølge krav 1, kendetegnet ved, at 35 der til brodanneren er bundet et protein, der bærer en reaktionspartner i den immunologiske reaktion. DK 161112 B

5. Fremgangsmåde til fremstilling af et bæremateriale ifølge krav 1, hvor det ene af de i immunreaktionen deltagende partnere bindes kovalent til bærematerialet, kendetegnet ved, at man gennemfører bindingen over en heterobifunktionel, 5 fotoaktiverbar forbindelse, hvis ene gruppe dannes af en aryl-azidgruppe, fortrinsvis over N-succinimidyl-6-(4,-azido-2’-nitrophenylamino)-hexan, som brodanner.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at 10 man binder fotoaktiverbare brodannere kovalent til Protein A (agglutinogen fra Staphylococcus aureus) (orienteret binding af antistoffer på en bærer) og derpå binder en immunreaktions ene reaktionspartner med den konstante del af proteinet.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at den til Protein A (agglutinogen fra Staphylococcus aureus) bundne reaktionspartner tværbindes kovalent med dette under anvendelse af heterobifunktionel brodanner.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at brodanneren er N-hydroxysuccinimidyl-4-azidosalicylsyre eller N-succinimidyl-6-(4-azido-2-nitrophenylamino)-hexan.

9. Anvendelse af bærematerialet ifølge krav 1 til immunbestem-25 melse. 30 35