TWI754939B - 不可逆共價鍵醣蛋白固定方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種不可逆共價鍵醣蛋白固定方法，包括 下步驟。提供有機硼酸及光親和試劑接觸至載體表面，有機硼酸以R1-ArB(OH)2表示，-ArB(OH)2為硼酸基，R1為第一交聯劑，有機硼酸藉由第一交聯劑R1結合至載體表面，光親和試劑藉由第二交聯劑R2結合至載體表面。之後，提供醣蛋白接觸至有機硼酸，醣蛋白包括Fc片段，其中Fc片段的醣鏈上的醇基與有機硼酸的硼酸基形成有機硼酸酯，以藉此固定醣蛋白。然後，進行紫外光照射，以使光親和試劑與醣蛋白形成共價鍵交聯。

Description

不可逆共價鍵醣蛋白固定方法
本發明是有關於一種不可逆共價鍵醣蛋白固定方法，且特別是有關於一種適用於複雜檢體樣品的不可逆共價鍵醣蛋白固定方法。
抗體具有與抗原決定基(epitope)緊密且專一性的結合力，因此，已被廣泛運用於免疫親和分離、標的治療投遞、酶聯免疫吸附實驗(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)及檢驗陣列等生醫技術中。
然而，習知的抗體交聯法如物理性吸附所製備的固定化之抗體，其抗體結合力較弱，於複雜的檢體樣品(例如：血液樣品)中會因其所含的鹼性物質，導致與硼酸結合的抗體解離，影響後續抗體分析之靈敏度。
基於上述，發展出一種可使抗體於複雜樣品中抵抗解離、結合力強並增加檢測靈敏度的固定方法，為目前所需研究的重要課題。
本發明提供一種不可逆共價鍵醣蛋白固定方法，可使抗體於複雜樣品中抵抗解離、結合力強並增加檢測靈敏。
本發明的不可逆共價鍵醣蛋白固定方法，包括以下步驟。提供有機硼酸及光親和試劑接觸至載體表面，有機硼酸以R1-ArB(OH)2表示，-ArB(OH)2為硼酸基，R1為第一交聯劑，有機硼酸藉由第一交聯劑R1結合至載體表面，光親和試劑藉由第二交聯劑R2結合至載體表面。之後，提供醣蛋白接觸至有機硼酸，醣蛋白包括Fc片段，其中Fc片段的醣鏈上的醇基與有機硼酸的硼酸基形成有機硼酸酯，以藉此固定醣蛋白。然後，進行紫外光照射，以使光親和試劑與醣蛋白形成共價鍵交聯。
在本發明的一實施例中，光親和試劑為二氮環丙烯(diazirine)化合物。
在本發明的一實施例中，載體包括奈米粒子。
在本發明的一實施例中，第一交聯劑R1為末端含胺基的有機連接子(linker)。
在本發明的一實施例中，第二交聯劑R2為末端含胺基的有機連接子(linker)。
在本發明的一實施例中，醣蛋白包括抗體。
在本發明的一實施例中，醣蛋白包括Fc融合醣蛋白(Fc-fusion glycoprotein)，其包括所述Fc片段。
在本發明的一實施例中，不可逆共價鍵醣蛋白固定方法用來檢測血液樣品中的抗原。
基於上述，本發明的不可逆共價鍵醣蛋白固定方法除了使醣蛋白Fc片段的醣鏈上的醇基與有機硼酸的硼酸基形成有機硼酸酯，更可進行紫外光照射，以使光親和試劑與醣蛋白形成共價鍵交聯。如此一來，可使醣蛋白於複雜樣品(例如：血液樣品)中抵抗解離、結合力強並增加檢測靈敏，更可同時兼顧位向性。
10:奈米粒子
12:光親和試劑
20:抗體
22:醣鏈
圖1A至圖1D為依照本發明的一實施例的一種不可逆共價鍵醣蛋白固定方法的示意圖。
圖2為本發明實例1及比較例1在牛血中的穩定度，隨著反應時間的螢光強度量測圖。
圖3A為本發明實例1及比較例2濃縮抗原的基礎輔助雷射解吸收飛行時間(matrix-assisted laser desorption ionixation-time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF)質譜儀分析圖。
圖3B為本發明實例1及比較例2的SAA/ISD(濃縮抗原效果)比例量測圖。
以下，將詳細描述本發明的實施例。然而，這些實施例 為例示性，且本發明揭露不限於此。
在本文中，由「一數值至另一數值」表示的範圍，是一種避免在說明書中一一列舉該範圍中的所有數值的概要性表示方式。因此，某一特定數值範圍的記載，涵蓋該數值範圍內的任意數值以及由該數值範圍內的任意數值界定出的較小數值範圍，如同在說明書中明文寫出該任意數值和該較小數值範圍一樣。
圖1A至圖1D為依照本發明的一實施例的一種不可逆共價鍵醣蛋白固定方法的示意圖。
請參照圖1A，提供載體，載體可包括奈米粒子10，奈米粒子10例如是大小介於2nm至800nm的磁性奈米粒子。之後，請參照圖1B，提供有機硼酸及光親和試劑12接觸至載體表面(本實施例中載體例如是奈米粒子10)。有機硼酸以R1-ArB(OH)2表示，-ArB(OH)2為硼酸基，R1為第一交聯劑。在本實施例中，硼酸例如可由以下化學結構表示，但本發明並不以此為限：
Figure 109117564-A0305-02-0006-1
R 3 =CH 3 ,
Figure 109117564-A0305-02-0006-2
,
Figure 109117564-A0305-02-0006-3
 有機硼酸藉由第一交聯劑R1結合至載體表面(本實施例中載體例如是奈米粒子10)，第一交聯劑R1可為末端含胺基的有機連接子(linker)。
請參照圖1B，光親和試劑12例如是二氮環丙烯(diazirine)化合物。在本實施例中，光親和試劑12例如可由以 下化學結構表示：
Figure 109117564-A0305-02-0007-4
n=1-10 除此之外，光親和試劑12例如也可由以下化學結構表示：
Figure 109117564-A0305-02-0007-5
n=1-10 必須說明的是，以上光親和試劑12的化學結構及n的數目均為例示說明，本發明並不以此為限。光親和試劑12藉由第二交聯劑R2結合至載體表面(本實施例中例如是奈米粒子10)，第二交聯劑R2可為末端含胺基的有機連接子(linker)。
請參照圖1B，第一交聯劑R1與第二交聯劑R2可以相同或不同，第一交聯劑R1與第二交聯劑R2可以是任意碳數且在末端為雙酸、雙胺或一酸與一胺結構。在本實施例中，第一交聯劑R1與第二交聯劑R2例如可由化學結構X-R-Y表示，其中R為烷基、烯基、炔基、芳香團或此四種基團的任意組合。更詳細而言，R例如是含有20個碳之烷基、烯基、炔基、芳香團或此四種基團的任意組合，但此處的碳數僅為例示說明，本發明並不以此為限。至於化學結構X-R-Y中的X及Y以及l及m，定義如下：X=Y=NH2，l=m=1；X=Y=COOH，l=m=0；X=NH2，Y=COOH，l=0，m=1或l=1，m=0； X=COOH，Y=NH2，l=0，m=1或l=1，m=0。必須說明的是，以上第一交聯劑R1與第二交聯劑R2的化學結構及各參數定義均為例示說明，本發明並不以此為限。
接下來，請參照圖1C，提供醣蛋白接觸至有機硼酸，醣蛋白包括Fc片段(Fragment，crystallizable)。在本實施例中，醣蛋白例如是抗體20，但本發明並不以此為限。抗體20之Fc片段的醣鏈22上的醇基與有機硼酸的硼酸基形成有機硼酸酯(boronate ester)，以藉此固定醣蛋白(本實施例中例如是抗體20)於奈米粒子10上。更詳細而言，醣蛋白可由基因工程及醣蛋白工程所得到，因此，醣蛋白可以是Fc融合醣蛋白(Fc-fusion glycoprotein)，其包括具有醣鏈的Fc片段，以實施本發明的不可逆共價鍵醣蛋白固定方法。
然後，請參照圖1D，進行紫外光照射，以使光親和試劑與醣蛋白(本實施例中例如是抗體20)形成共價鍵交聯。如此一來，藉由本發明的不可逆共價鍵醣蛋白固定方法，當醣蛋白例如是抗體時，可提升抗體結合力，並避免因複雜檢體樣品中的鹼性物質導致抗體解離，因此，本發明的不可逆共價鍵醣蛋白固定方法適用於進一步檢測血液樣品中的抗原，可有效地提升後續抗體分析的靈敏度。
以下，藉由實驗例來詳細說明上述實施例的不可逆共價鍵醣蛋白固定方法。然而，下述實驗例並非用以限制本發明。
實驗例
為了證明本發明所提出的不可逆共價鍵醣蛋白固定方法可提升抗體結合力，進而有效地提升抗體分析的靈敏度，以下特別作此實驗例。
須說明的是，由於不可逆共價鍵醣蛋白固定方法已於上文中詳細地描述，因此，下文中有關不可逆共價鍵醣蛋白固定方法，為求方便說明故省略細節之敘述。
圖2為本發明實例1及比較例1在牛血中的穩定度，隨著反應時間的螢光強度量測圖。
在圖2中，實例1主要是透過本發明的不可逆共價鍵醣蛋白固定方法，使結合有機硼酸及光親和試劑的磁性奈米粒子與抗體接觸，抗體Fc片段的醣鏈上的醇基與有機硼酸的硼酸基形成有機硼酸酯，以藉此固定抗體，再進行紫外光照射，以使光親和試劑與抗體形成共價鍵交聯。如此一來，實例1的磁性奈米粒子可與抗體形成具有位向性且不可逆的結合。比較例1則是使僅結合有機硼酸的磁性奈米粒子與抗體接觸，抗體Fc片段的醣鏈上的醇基與有機硼酸的硼酸基形成有機硼酸酯，以藉此固定抗體。如此一來，比較例1的磁性奈米粒子與抗體之間僅形成可逆的硼酸酯結合。
如圖2所示的結合分析(binding assay)螢光量測結果，與抗體結合的實例1及比較例1在胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)中培養1小時之後，結合抗體所顯示的螢光程度差不多。在 胎牛血清中培養12小時之後，實例1結合抗體所顯示的螢光程度沒有明顯改變，代表實例1與抗體的結合穩定。相較之下，在胎牛血清中培養12小時之後，比較例1結合抗體所顯示的螢光程度明顯下降的50%，代表隨著時間過去，比較例1與抗體的結合穩定度下降。基於圖2的實驗結果，可得知本發明的不可逆共價鍵醣蛋白固定方法能夠提升奈米粒子與抗體結合的穩定性，即使時間過去(12小時之後)，也可維持奈米粒子與抗體之間一定程度的結合力。尤其是將本發明的不可逆共價鍵醣蛋白固定方法應用於血液樣品等複雜的檢體樣品時，可穩定且有效地維持抗體的結合力。
圖3A為本發明實例1及比較例2濃縮抗原的基礎輔助雷射解吸收飛行時間(matrix-assisted laser desorption ionixation-time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF)質譜儀分析圖。圖3B為本發明實例1及比較例2的SAA/ISD(濃縮抗原效果)比例量測圖。
在圖3A及圖3B中，SAA為急性階段血漿蛋白，血清中的SAA偵測可提供發炎的可能診斷；ISD則為內部標準品(internal standard)。實例1主要是透過本發明的不可逆共價鍵醣蛋白固定方法，使結合有機硼酸及光親和試劑的磁性奈米粒子與抗體接觸，抗體Fc片段的醣鏈上的醇基與有機硼酸的硼酸基形成有機硼酸酯，以藉此固定抗體，再進行紫外光照射，以使光親和試劑與抗體形成共價鍵交聯。如此一來，實例1的磁性奈米粒子可與抗 體形成具有位向性且不可逆的結合。比較例2則為磁性奈米粒子與(3-胺基丙基)三乙氧基矽烷(APTES)以及辛二酸二琥珀醯亞胺酯(disuccinimidyl suberate，DSS)交聯劑進行反應，因此，比較例2的磁性奈米粒子無法與抗體形成具有位向性且不可逆的結合。如圖3A所示，實例1對於SAA結合呈現較高的專一性。如圖3B所示，實例1的SAA/ISD比例為比較例2的SAA/ISD比例的約20倍。因此，可得知本發明的不可逆共價鍵醣蛋白固定方法可維持抗體結合的專一性，進一步有效地改善後續抗原檢測的靈敏度。
綜上所述，本發明的不可逆共價鍵醣蛋白固定方法除了使醣蛋白Fc片段的醣鏈上的醇基與有機硼酸的硼酸基形成有機硼酸酯，更可進行紫外光照射，以使光親和試劑與醣蛋白形成共價鍵交聯。如此一來，可使奈米粒子與醣蛋白之間形成具有位向性且不可逆的結合，且具有較高的結合專一性。因此，可使醣蛋白於複雜樣品(例如：血液樣品)中抵抗解離、結合力強並增加檢測靈敏，更可同時兼顧位向性。
10:奈米粒子
20:抗體
22:醣鏈

Claims (5)

  1. 一種不可逆共價鍵醣蛋白固定方法，包括：提供載體；提供有機硼酸及光親和試劑接觸至所述載體的表面，所述有機硼酸以R1-ArB(OH)2表示，-ArB(OH)2為硼酸基，R1為第一交聯劑，所述有機硼酸藉由所述第一交聯劑R1結合至所述載體的表面，所述光親和試劑藉由第二交聯劑R2結合至所述載體的表面；提供醣蛋白接觸至所述有機硼酸，所述醣蛋白包括Fc片段(Fragment，crystallizable)，其中所述Fc片段的醣鏈上的醇基與所述有機硼酸的所述硼酸基形成有機硼酸酯(boronate ester)，以藉此固定所述醣蛋白；以及進行紫外光照射，以使所述光親和試劑與所述醣蛋白形成共價鍵交聯，其中所述光親和試劑為二氮環丙烯(diazirine)化合物，所述第一交聯劑R1為末端含胺基的有機連接子(linker)，所述第二交聯劑R2為末端含胺基的有機連接子(linker)。
  2. 如請求項1所述的不可逆共價鍵醣蛋白固定方法，其中所述載體包括奈米粒子。
  3. 如請求項1所述的不可逆共價鍵醣蛋白固定方法，其中所述醣蛋白包括抗體。
  4. 如請求項1所述的不可逆共價鍵醣蛋白固定方法，其中所述醣蛋白包括Fc融合醣蛋白(Fc-fusion glycoprotein)，其包括所述Fc片段。
  5. 如請求項1所述的不可逆共價鍵醣蛋白固定方法，其中所述醣蛋白固定方法用來檢測血液樣品中的抗原。
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