TWI788986B - 位向性共價鍵醣蛋白固定方法及抗體晶片 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種位向性共價鍵醣蛋白固定方法及抗體晶片。固定方法包括提供配置有炔基化表面之氧化亞銅奈米粒子及銀塗佈固體表面。藉由表面氧化亞銅奈米粒子自催化疊氮-炔環加成反應將含疊氮基之硼酸甲苯磺醯探針固化至氧化亞銅奈米粒子-銀塗佈固體表面。提供醣蛋白至硼酸甲苯磺醯探針，接著藉由醣蛋白上的醣體或抗體Fc片段上醣鏈的醇基與硼酸甲苯磺醯探針的硼酸基形成有機硼酸酯，將醣蛋白或抗體抓取於固體表面。經醣蛋白或抗體上鄰近探針的親核殘基經雙分子親核取代反應取代甲苯磺醯基，以透過共價鍵生成方式將醣蛋白固定於表面。

Description

位向性共價鍵醣蛋白固定方法及抗體晶片
本發明是有關於一種醣蛋白固定方法及抗體晶片，且特別是有關於一種位向性共價鍵醣蛋白固定方法及抗體晶片。
抗體具有與抗原決定基（epitope）緊密且專一性的結合力，因此，已被廣泛運用於免疫親和分離、標的治療投遞、酶聯免疫吸附實驗（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）及檢驗陣列等生醫技術中。這些應用需將抗體結合到作為載體的固體支持物上（例如，微量滴定板、奈米粒子或玻璃表面），同時保有分析物結合活性。
基於其化學複雜性，抗體的固定機制相當複雜。習知的抗體交聯法如物理性吸附所製備的固定化之抗體，其抗體結合力較弱，於複雜的檢體樣品（例如：血液樣品）中會因其所含的物質，導致與硼酸結合的抗體解離，影響後續抗體分析之靈敏度。若對抗體的離胺酸（lysine）、精胺酸（arginine）、天門冬胺酸（aspartate）及麩胺酸（glutamate）等殘基（residue）隨機進行希夫鹼（Schiff base）或醯胺鍵（amide bond）修飾，則具有位向不專一之缺點，易使抗體失去生物活性。
基於上述，發展出一種醣蛋白固定方法，可形成位向專一的共價鍵，具有高活性、結合力強並增加檢測靈敏度，為目前生醫檢測開發的重要課題。
本發明提供一種位向性共價鍵醣蛋白固定方法及抗體晶片，具有高活性、結合力強並增加檢測靈敏度。
本發明的位向性共價鍵醣蛋白固定方法包括以下步驟。提供銀塗佈固體表面，銀塗佈固體表面上配置有多個氧化亞銅奈米粒子。之後，固體表面（包括銀塗佈固體表面以及氧化亞銅奈米粒子）炔基化。接下來，提供含疊氮基之硼酸甲苯磺醯探針至銀塗佈固體表面，硼酸甲苯磺醯探針藉由氧化亞銅奈米粒子進行自催化疊氮-炔環加成反應（self-catalyzed azide-alkyne cycloaddition，SAAC）結合至固體表面。然後，提供醣蛋白至硼酸甲苯磺醯探針，醣蛋白可包括Fc片段（Fragment，crystallizable），其中醣蛋白上的醣體或Fc片段上醣鏈的醇基與硼酸甲苯磺醯探針的硼酸基形成有機硼酸酯（boronate ester），以藉此固定醣蛋白。接著，醣蛋白上的親核殘基（nucleophilic residue）經雙分子親核取代反應（S N2 reaction）取代硼酸甲苯磺醯探針中的甲苯磺醯基，並從末端疊氮基團（terminal azide group）釋放甲苯磺醯基，以透過親核殘基與末端疊氮基團之間的共價鍵固定醣蛋白。最後，釋放有機硼酸酯片段。
在本發明的一實施例中，含疊氮基之硼酸甲苯磺醯探針的結構由式（1）或式（1A）表示：
Figure 02_image001
式（1），
Figure 02_image002
式（1A）， 在式（1）及式（1A）中， R1為含硼基團，具有R1基團的芳族基團結構由式（2）、式（3）或式（4）表示：
Figure 02_image003
式（2）
Figure 02_image004
式（3）
Figure 02_image005
式（4）， X1為NH、
Figure 02_image006
或
Figure 02_image007
， m為1至8的正整數，a為2至10的正整數，b為2至10的正整數，c為1至15的正整數，d為1至15的正整數。
在本發明的一實施例中，硼酸甲苯磺醯探針的結構由式（1-1）、式（1-2）或式（1-3）表示：
Figure 02_image008
式（1-1）
Figure 02_image009
式（1-2）
Figure 02_image010
式（1-3）。
在本發明的一實施例中，銀塗佈固體表面的材料包括玻璃。
在本發明的一實施例中，銀塗佈固體表面的銀塗佈層厚度為5 nm至200 nm。
在本發明的一實施例中，炔基化是將配置有氧化亞銅奈米粒子的銀塗佈固體表面與結構由式（A）或式（B）表示的炔硫醇及由式（C）表示的硫醇進行反應：
Figure 02_image011
式（A）
Figure 02_image012
式（B）
Figure 02_image013
式（C）， 在式（A）中，n為5至15的正整數， 在式（B）中，x為1至15的正整數，y為1至15的正整數。
在本發明的一實施例中，提供硼酸甲苯磺醯探針至銀塗佈固體表面時，同時提供疊氮基三(乙二醇)至銀塗佈固體表面，疊氮基三(乙二醇)藉由自催化疊氮-炔環加成反應結合至氧化亞銅奈米粒子。
在本發明的一實施例中，醣蛋白包括抗體。
在本發明的一實施例中，釋放有機硼酸酯是透過多元醇進行。
本發明的抗體晶片使用上述位向性共價鍵醣蛋白固定方法。
基於上述，本發明的位向性共價鍵醣蛋白固定方法運用了硼酸甲苯磺醯探針，除了使醣蛋白上的醣體或Fc片段上醣鏈的醇基與硼酸甲苯磺醯探針的硼酸基形成有機硼酸酯，更可經由雙分子親核取代反應（S N2 reaction）使醣蛋白上的親核殘基（nucleophilic residue）取代硼酸甲苯磺醯探針中的甲苯磺醯基，以形成具有位向性的不可逆共價鍵。此外，本發明的位向性共價鍵醣蛋白固定方法運用了配置有氧化亞銅奈米粒子的銀塗佈固體表面，銀塗佈固體表面具有表面共振效果，可增強螢光訊號（MEF，metal-enhanced fluorescence，金屬增強螢光效應），氧化亞銅奈米粒子則可使硼酸甲苯磺醯探針藉由自催化疊氮-炔環加成反應（self-catalyzed azide-alkyne cycloaddition，SAAC）進行結合，因此，不同於習知的Cu(I)-催化疊氮-炔環加成（CuAAC）反應，無須額外使用銅離子，且可解決Cu(I)導致降解的硼酸反應性問題。如此一來，可有效地提高活性、強化結合力並增加檢測靈敏度。
以下，將詳細描述本發明的實施例。然而，這些實施例為例示性，且本發明揭露不限於此。
在本文中，由「一數值至另一數值」表示的範圍，是一種避免在說明書中一一列舉該範圍中的所有數值的概要性表示方式。因此，某一特定數值範圍的記載，涵蓋該數值範圍內的任意數值以及由該數值範圍內的任意數值界定出的較小數值範圍，如同在說明書中明文寫出該任意數值和該較小數值範圍一樣。
圖1A至圖1G為依照本發明的一實施例的一種位向性共價鍵醣蛋白固定方法的示意圖。
請參照圖1A，提供銀塗佈固體表面10。在本實施例中，銀塗佈固體表面10的銀塗佈層厚度為5 nm至200 nm，銀塗佈固體表面10的材料可包括玻璃，但本發明並不以此為限。更詳細而言，銀塗佈固體表面10的製造方式例如是在固體表面使用硝酸銀還原製程進行銀沉積，硝酸銀的濃度例如是0.01 M至0.1 M，反應溫度例如是25℃至70℃。
請參照圖1B，在銀塗佈固體表面10上配置多個氧化亞銅奈米粒子12，氧化亞銅奈米粒子12的大小例如是介於10 nm至100 nm。之後，請參照圖1C，使銀塗佈固體表面10以及氧化亞銅奈米粒子12炔基化，以進行後續的自催化疊氮-炔環加成反應（self-catalyzed azide-alkyne cycloaddition，SAAC）。更詳細而言，炔基化例如是將配置有氧化亞銅奈米粒子12的銀塗佈固體表面10與結構由式（A）或式（B）表示的炔硫醇及由式（C）表示的硫醇進行反應：
Figure 02_image011
式（A）
Figure 02_image012
式（B）
Figure 02_image013
式（C）， 在式（A）中，n為5至15的正整數， 在式（B）中，x為1至15的正整數，y為1至15的正整數。 在本實施例中，加入由式（C）表示的硫醇可調整表面的炔基化程度，其中式（A）或式（B）表示的炔硫醇及由式（C）表示的硫醇添加量的莫耳比例例如是0.01至100。在圖1C中，為了簡潔說明，省略繪示部分化學結構式，僅繪示炔基化作為示意說明。
請參照圖1D，提供硼酸甲苯磺醯探針至銀塗佈固體表面10，硼酸甲苯磺醯探針藉由自催化疊氮-炔環加成反應（self-catalyzed azide-alkyne cycloaddition，SAAC）結合至氧化亞銅奈米粒子12。在本實施例中，提供硼酸甲苯磺醯探針至銀塗佈固體表面10時，也可同時提供疊氮基三(乙二醇)至所述銀塗佈固體表面，疊氮基三(乙二醇)也可藉由自催化疊氮-炔環加成反應結合至氧化亞銅奈米粒子12。透過加入疊氮基三(乙二醇)，除了可消耗剩餘的炔基，更可改善表面的親水性。疊氮基三(乙二醇)的結構如下所示：
Figure 02_image014
在本實施例中，硼酸甲苯磺醯探針的結構可由式（1）或式（1A）表示：
Figure 02_image001
式（1）
Figure 02_image002
式（1A）， 在式（1）及式（1A）中， R1為含硼基團，具有R1基團的芳族基團結構可由式（2）、式（3）或式（4）表示：
Figure 02_image003
式（2）
Figure 02_image004
式（3）
Figure 02_image005
式（4）， X1為NH、
Figure 02_image006
或
Figure 02_image007
， m例如是1至8的正整數，a例如是2至10的正整數，b例如是2至10的正整數，c例如是1至15的正整數，d例如是1至15的正整數。 在圖1D以及接下來的圖式中，為了簡潔說明，省略繪示部分化學結構式，僅繪示連接子30作為示意說明。
硼酸甲苯磺醯探針的具體結構可由式（1-1）、式（1-2）或式（1-3）表示：
Figure 02_image008
式（1-1）
Figure 02_image009
式（1-2）
Figure 02_image010
式（1-3）
請參照圖1E及圖1F，提供醣蛋白至硼酸甲苯磺醯探針，醣蛋白可包括Fc片段（Fragment，crystallizable）。在本實施例中，醣蛋白例如是抗體20，但本發明並不以此為限。抗體20之Fc片段的醣鏈22上的醇基與硼酸甲苯磺醯探針的硼酸基形成有機硼酸酯（boronate ester），以藉此固定醣蛋白（本實施例中例如是抗體20）於固體表面（銀塗佈固體表面10及氧化亞銅奈米粒子12）上。更詳細而言，醣蛋白可由基因工程及醣蛋白工程所得到，因此，醣蛋白可以是Fc融合醣蛋白（Fc-fusion glycoprotein），其包括具有醣鏈的Fc片段，以實施本發明的位向性共價鍵醣蛋白固定方法。然而，本發明並不以此為限，醣蛋白也可以不包括Fc片段，亦即，醣蛋白上的醣體或Fc片段上醣鏈的醇基皆可與硼酸甲苯磺醯探針的硼酸基形成有機硼酸酯，以藉此固定醣蛋白。醣蛋白（本實施例中例如是抗體20）上的親核殘基（nucleophilic residue，Nu:）經雙分子親核取代反應（S N2 reaction）取代硼酸甲苯磺醯探針中的甲苯磺醯基，釋放甲苯磺醯基，以透過親核殘基與末端疊氮基團之間的共價鍵固定醣蛋白（本實施例中例如是抗體20）。共價鍵生成的位點為接近硼酸酯形成的區域，故此定方式具位向選擇性。
接下來，請參照圖1G，釋放有機硼酸酯。在本實施例中，釋放有機硼酸酯例如是透過多元醇進行，多元醇可包括甘油、山梨糖醇、甘露糖醇或聚乙二醇，但本發明並不以此為限。如此一來，藉由本發明的位向性共價鍵醣蛋白固定方法，當醣蛋白例如是抗體時，可提升抗體結合力，並避免因複雜檢體樣品中的物質導致抗體解離，因此，本發明的位向性共價鍵醣蛋白固定方法適用於進一步檢測血液樣品中的抗原，可有效地提升後續抗體分析的靈敏度。
本發明也提供一種抗體晶片，使用上述位向性共價鍵醣蛋白固定方法。
以下，藉由實驗例來詳細說明上述實施例的位向性共價鍵醣蛋白固定方法。然而，下述實驗例並非用以限制本發明。 實驗例
為了證明本發明所提出的位向性共價鍵醣蛋白固定方法可有效地提高活性、強化結合力並增加檢測靈敏度，以下特別作此實驗例。
須說明的是，由於位向性共價鍵醣蛋白固定方法已於上文中詳細地描述，因此，下文中有關位向性共價鍵醣蛋白固定方法，為求方便說明故省略細節之敘述。
圖2A及圖2B為使用功能性抗體微陣列針對SAP及C-RP的單蛋白生物標誌物的螢光檢測圖。
使用本發明的位向性共價鍵醣蛋白固定方法測量兩個單獨的生物標誌物SAP及C-RP。不同濃度的SAP（0.01 μg/mL、0.1 μg/mL、1 μg/mL、5 μg/mL和10 μg/mL）與使用本發明的位向性共價鍵醣蛋白固定方法製作的抗SAP抗體晶片一起反應。然後，使用生物素化抗SAP pAb（1 μg/mL）評估結合蛋白的存在，再使用螢光Cy3標記的鏈黴親和素（10 μg/mL）。圖2A顯示了相應的螢光強度檢測圖，可產生檢測信號的最低分析物濃度為1 μg/mL。針對濃度為0.1 μg/mL、1.0 μg/mL、1.5 μg/mL、2.0μg/mL和3.0μg/mL的C-RP進行分析，使用本發明的位向性共價鍵醣蛋白固定方法製作的抗hC-RP抗體晶片一起反應。然後，使用生物素化C-RP檢測抗體（1/100稀釋），再使用螢光Cy3標記的鏈黴親和素。圖2B顯示了相應的螢光強度檢測圖，靈敏度約為1.4 μg/mL（∼57 nM），在心血管風險評估的臨界濃度範圍內。因此，本發明的位向性共價鍵醣蛋白固定方法可達成的靈敏度適用於針對生物標誌物SAP及C-RP進行直接偵測。
圖3為使用本發明位向性共價鍵醣蛋白固定方法針對血清中C-RP、SAP, and RCA 120的螢光檢測圖。
圖3的B、C與D代表螢光圖像，分別描述三組捕獲的抗體陣列點，表明成功識別特定蛋白質。此外，圖3的A說明了同時捕獲和檢測三個目標。如圖3的E所示，隨著濃度增加， 由於捕獲更多分析物而產生螢光信號，在陣列的斑點上導致更高的螢光強度。因此，可得知本發明的位向性共價鍵醣蛋白固定方法能夠同時分析複雜生物樣品中的多個目標。
圖4為分別運用自催化疊氮-炔環加成反應以及Cu(I)-催化疊氮-炔環加成的螢光檢測圖。
如圖4所示，運用Cu(I)-催化疊氮-炔環加成反應顯示了強烈的背景信號，表示苯基硼酸可能經歷Cu(I)-媒介分解為酚類或苯類，進而導致強烈的非特異性蛋白質吸附。相較之下，如本發明位向性共價鍵醣蛋白固定方法運用自催化疊氮-炔環加成反應可降低背景信號，避免非特異性蛋白質吸附。
綜上所述，本發明的位向性共價鍵醣蛋白固定方法運用了硼酸甲苯磺醯探針，除了使醣蛋白上的醣體或Fc片段上醣鏈的醇基與硼酸甲苯磺醯探針的硼酸基形成有機硼酸酯，更可經由雙分子親核取代反應（S N2 reaction）使醣蛋白上的親核殘基（nucleophilic residue）取代硼酸甲苯磺醯探針中的甲苯磺醯基，以形成具有位向性的不可逆共價鍵，且具有較高的結合專一性。此外，本發明的位向性共價鍵醣蛋白固定方法運用了配置有氧化亞銅奈米粒子的銀塗佈固體表面，銀塗佈固體表面具有表面共振效果，可增強螢光訊號（MEF，metal-enhanced fluorescence，金屬增強螢光效應），氧化亞銅奈米粒子則可使硼酸甲苯磺醯探針藉由自催化疊氮-炔環加成反應（self-catalyzed azide-alkyne cycloaddition，SAAC）進行結合，因此，不同於習知的Cu(I)-催化疊氮-炔環加成（CuAAC）反應，無須額外使用銅離子，且可解決Cu(I)導致降解的硼酸反應性問題。如此一來，可使醣蛋白於複雜樣品（例如：血液樣品）中抵抗解離，同時可有效地提高活性、強化結合力並增加檢測靈敏度，更可兼顧位向性。
10:銀塗佈固體表面 12:氧化亞銅奈米粒子 20:抗體 22:醣鏈 30:連接子
圖1A至圖1G為依照本發明的一實施例的一種位向性共價鍵醣蛋白固定方法的示意圖。 圖2A及圖2B為使用功能性抗體微陣列針對SAP及C-RP的單蛋白生物標誌物的螢光檢測圖。 圖3為使用本發明位向性共價鍵醣蛋白固定方法針對血清中C-RP、SAP, and RCA 120的螢光檢測圖。 圖4為分別運用自催化疊氮-炔環加成反應以及Cu(I)-催化疊氮-炔環加成的螢光檢測圖。
10:銀塗佈固體表面
12:氧化亞銅奈米粒子
20:抗體
22:醣鏈
30:連接子

Claims (10)

  1. 一種位向性共價鍵醣蛋白固定方法，包括：提供銀塗佈固體表面，所述銀塗佈固體表面上配置有多個氧化亞銅奈米粒子；使所述銀塗佈固體表面及所述氧化亞銅奈米粒子炔基化；提供具有疊氮基的硼酸甲苯磺醯探針至所述銀塗佈固體表面，所述硼酸甲苯磺醯探針藉由自催化疊氮-炔環加成反應(self-catalyzed azide-alkyne cycloaddition，SAAC)結合至所述銀塗佈固體表面；提供醣蛋白至所述硼酸甲苯磺醯探針，所述醣蛋白上的醣體或Fc片段上醣鏈的醇基與所述硼酸甲苯磺醯探針的硼酸基形成有機硼酸酯(boronate ester)，以藉此固定所述醣蛋白；所述醣蛋白上的親核殘基(nucleophilic residue)經雙分子親核取代反應(SN2 reaction)取代所述硼酸甲苯磺醯探針中的甲苯磺醯基，並釋放所述甲苯磺醯基，以透過所述親核殘基與所述末端疊氮基團之間的共價鍵固定所述醣蛋白；以及釋放所述有機硼酸酯。
  2. 如請求項1所述的位向性共價鍵醣蛋白固定方法，其中所述硼酸甲苯磺醯探針的結構由式(1)或式(1A)表示：
    Figure 110132354-A0305-02-0018-1
     在式(1)及式(1A)中，R1為含硼基團，具有R1基團的芳族基團結構由式(2)、式(3)或式(4)表示：
    Figure 110132354-A0305-02-0018-2
     X1為NH、
    Figure 110132354-A0305-02-0018-5
    或
    Figure 110132354-A0305-02-0018-4
    ， m為1至8的正整數，a為2至10的正整數，b為2至10的正整數，c為1至15的正整數，d為1至15的正整數。
  3. 如請求項2所述的位向性共價鍵醣蛋白固定方法，其中所述硼酸甲苯磺醯探針的結構由式(1-1)、式(1-2)或式(1-3)表示：
    Figure 110132354-A0305-02-0019-6
  4. 如請求項1所述的位向性共價鍵醣蛋白固定方法，其中所述銀塗佈固體表面的材料包括玻璃。
  5. 如請求項1所述的位向性共價鍵醣蛋白固定方法，其中所述銀塗佈固體表面的銀塗佈層厚度為5nm至200nm。
  6. 如請求項1所述的位向性共價鍵醣蛋白固定方法，其中炔基化是將配置有所述氧化亞銅奈米粒子的所述銀塗佈固體表面與結構由式(A)或式(B)表示的炔硫醇及由式(C)表示的硫醇進行反應：
    Figure 110132354-A0305-02-0020-7
     在式(A)中，n為5至15的正整數，在式(B)中，x為1至15的正整數，y為1至15的正整數。
  7. 如請求項1所述的位向性共價鍵醣蛋白固定方法，其中提供所述硼酸甲苯磺醯探針至所述銀塗佈固體表面時，同時提供疊氮基三(乙二醇)至所述銀塗佈固體表面，疊氮基三(乙二醇)藉由自催化疊氮-炔環加成反應結合至所述氧化亞銅奈米粒子。
  8. 如請求項1所述的位向性共價鍵醣蛋白固定方法，其中所述醣蛋白包括抗體。
  9. 如請求項1所述的位向性共價鍵醣蛋白固定方法，其中釋放所述有機硼酸酯是透過多元醇進行。
  10. 一種抗體晶片，包含使用如請求項第8項所述的位向性共價鍵醣蛋白固定方法所得的抗體。
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