TW202207989A

TW202207989A - 用於標記生物分子之可裂解光反應探針

Info

Publication number: TW202207989A
Application number: TW110110120A
Authority: TW
Inventors: 張至為; 陳一德; 廖仲麒
Original assignee: 中央研究院
Priority date: 2020-03-20
Filing date: 2021-03-20
Publication date: 2022-03-01
Also published as: US20230176063A1; WO2021188978A1

Abstract

包含有可裂解光反應探針之組成物及使用該些探針之方法。該些探針可包括可偶聯至標記物之標籤、可連結至誘餌分子之可裂解連結子、及光激發探頭。該些組成物及方法可用於分析生物分子。

Description

用於標記生物分子之可裂解光反應探針

【相關申請案之相互引用】

本申請案主張2020年3月20日申請之臨時專利申請案第62/992,253號的優先權。

【序列表】

【0001.1】本申請案含有序列表，其已以ASCII格式以電子方式提交且其全部內容以引用方式併入本文中。於2021年3月17日產生之該ASCII複本命名為14815-500_600_SL.txt且大小為5,253個位元組。

【引用併入】

本說明書中提及之所有出版物及專利申請案均以引用的方式將其全部內容併入本文中，其程度如同具體並各別地指出每一各別出版物或專利申請案且以引用方式併入。

本文描述用於辨識、標記及分析生物分子之方法及組成物。具體描述可裂解探針，其可用於被光激發並標記生物分子之子集。該些方法及組成物特別可用於分析生物樣本，例如辨識細胞或組織樣本中之近端生物分子。

細胞由不同類型之生物分子(biological molecules,biomolecules)所組成。細胞中的生物分子與次細胞環境中的相鄰生物分子相互作用，形成複合體、胞器或其他群組，並執行各種基本細胞功能。鑑定次細胞環境(生物分子在其中相互作用)以及生物分子如何一起發揮作用是非常具挑戰性。生物分子很小，其存在於具有數千萬其他分子之細胞環境中。相鄰生物分子之間的相互作用通常較弱，並且用於研究生物分子之技術會破壞其相互作用。雖然諸如酵母雙雜交(yeast two-hybridization)測定技術及最近的鄰近標定(proximity labeling)等技術已令人對細胞環境有更深入的了解，但此些技術仍受到各種限制，例如非特異性結合、反應時間慢及破壞天然細胞環境、導致假陽性及錯過相互作用。需要更好的工具，以用於確定自然發生之生物分子相互作用。本文描述更佳地分析內源性生物分子相互作用之系統、組成物及方法。

本文描述更佳地分析內源性生物分子相互作用之系統、組成物及方法。該些方法及組成物可用於辨識、標記並分析生物分子。具體描述可裂解探針，其可用於被光激發(photoactivated)並標記生物分子之子集。該些方法及組成物特別可用於分析生物樣本，例如辨識細胞或組織樣本中之近端生物分子。此些探針尤其可用於透過顯微鏡系統之選擇性光照對生物分子進行選擇性標記及鄰近標定。

本發明之一態樣提供一種可裂解光反應探針。該裂解光反應探針之一些實施例包括一多價核心，其包含有複數連接位點。一些實施例包括一標籤(tag)，其結合(bound)至該些連接位點中之一者，其中該標籤建構成得以偶聯(conjugated)至一標記物(label)。一些實施例包括一可裂解連結子(linker)，其結合至該些連接位點中之第二者，並建構成得以連結至一誘餌分子，其中該可裂解連結子包括雙硫鍵以外之可裂解連結子鍵結。一些實施例包括一光激發探頭，其結合至該些連接位點中之第三者。

於一些實施例中，該探針為生物正交可裂解(bioorthogonally cleavable)。

於一些實施例中，該標籤包括生物素衍生物、CLIP標籤、鍵擊化學(click chemistry)標籤、地高辛(digoxigenin)、胜肽標籤、Halo標籤或SNAP標籤。於一些實施例中，生物素衍生物包括以下基團(moiety)：

於一些實施例中，該鍵擊化學標籤包括炔基類或疊氮類(azide-based)基團。

於一些實施例中，該鍵擊化學標籤包括以下基團：

於一些實施例中，該可裂解連結子包括偶氮苯(azobenzene)衍生物、硼酸酯、Dde衍生物、DNA寡聚體或胜肽。

於一些實施例中，偶氮苯衍生物包括以下基團：

於一些實施例中，該Dde衍生物包括以下基團：

於一些實施例中，該誘餌分子包括抗體、CLIP標籤、Halo標籤、蛋白A、蛋白G、蛋白L、RNA分子、小分子或SNAP標籤。

於一些實施例中，該光激發探頭包括芳基疊氮化物、二苯酮、或二氮環丙烯(diazirine)。

於一些實施例中，芳基疊氮化物包括以下基團：

於一些實施例中，二氮環丙烯包括以下基團：

於一些實施例中，二苯酮包括以下基團：

任一所請之可裂解光反應探針，其中該光激發探頭包括核甘酸鹼基(nucleobase)特異性3-氰基乙烯基咔唑核苷酸(3-cyanovinylcarbazole nucleoside,CNVK)，其包括以下基團：

任一所請之可裂解光反應探針，其中光激發探頭包括核甘酸鹼基特異性補骨脂素(psoralen)，其包括以下基團：

任一所請之可裂解光反應探針，其中苯氧基自由基捕捉基(phenoxyl radical trapper)包括光激發探頭，其包括以下基團：

於一些實施例中，可裂解連結子包括偶氮苯、硼酸酯、Dde基團、DNA寡聚體或可裂解胜肽。

於一些實施例中，可裂解連結子包括人鼻病毒3C(human rhinovirus 3C,HRV 3C)蛋白酶辨識序列、或菸草蝕紋病毒(tobacco etch virus,TEV)蛋白酶辨識序列。

於一些實施例中，多價核心包括式(I)之基團：

其中n為1、2、3、4、5或6；

R¹及R²各自獨立為氫、經取代烷基、經取代烯基、經取代炔基、經取代碳環基、經取代雜環基、經取代芳基、經取代雜芳基、或氮保護基；且

R³及R⁴中之一者為-(CH₂)_x(OCH₂CH₂)_y(CH₂)_zNR⁵R⁶，而另一者為連接位點，

其中x為1、2、3、4、5或6；

y為1、2、3、4、5或6；

z為0、1、2、3、4、5或6；且

R⁵及R⁶中之一者為連接位點，而另一者為氫、經取代烷基、經取代烯基、經取代炔基、經取代碳環基、經取代雜環基、經取代芳基、經取代雜芳基、或氮保護基。

於一些實施例中，多價核心包括式(I-1)或(I-2)之基團：

於一些實施例中，多價核心包括以下基團：

於一些實施例中，探針包括以下結構：

於一些實施例中，探針2及6進一步包括一額外連結子，其建構成得以分別將探針2及6連結至誘餌分子。

一些實施例進一步包括一彈性連結子(flexible linker)。於一些實施例中，該彈性連結子包括聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)或(GGGGS)n寡聚體(序列號SEQ ID NO：16)。

本發明之另一態樣提供一種方法，其將上述任一請求所主張之可裂解光反應探針供至一生物樣本，其中該可裂解光反應探針連結至該誘餌分子；使誘餌分子偶聯至生物樣本中之目標生物分子，以交聯探針與目標生物分子；供予光輻射，以激發該可裂解光反應探針之光激發探頭，並將探頭接至目標生物分子或目標生物分子鄰域(neighbor)，使得探針與目標生物分子發生雙交聯(double-crosslink)；裂解探針之可裂解連結子，從而裂解未雙交聯至目標生物分子或目標生物分子鄰域之探針；以及去除已裂解之未結合探針。

本發明之另一態樣提供一種光激發標記且鄰近標定之方法，其包括：將可裂解光反應探針供至一生物樣本，其中該探針包括一可裂解連結子、一光激發探頭以及一標籤附接至探針之核心；使誘餌分子偶聯至生物樣本中之目標生物分子，以交聯探針與目標生物分子；從影像導引顯微鏡系統之攝像光源照射生物樣本；利用可控相機對經照射之樣本攝像；利用相機擷取第一視野中生物樣本之次細胞形態的至少一影像；處理該至少一影像並基於經處理影像來確定樣本中之感興趣區域；獲取感興趣區域之座標資訊；利用光輻射選擇性照射該感興趣區域，以激發光激發探頭並將探頭接至目標生物分子或目標生物分子鄰域，使得探針與目標分子發生雙交聯；裂解探針之可裂解連結子，從而裂解未雙交聯至目標生物分子或目標生物分子鄰域之探針；以及去除已裂解之未結合探針。

於一些此等實施例中，裂解該可裂解連結子之步驟包括進行生物正交裂解反應。

於一些此等實施例中，該可裂解連結子包括一可裂解連結子鍵結，且裂解該可裂解連結子之步驟包括裂解非雙硫鍵之鍵結。

一些實施例進一步包括以下步驟：使可檢測標記物與探針之標籤偶聯，並透過可檢測標記物活性對鄰近目標生物分子之鄰域進行可檢測鄰近標定。

於一些實施例中，可檢測鄰近標定之步驟進一步包括光選擇性鄰近標定直徑小於300nm、小於200nm、或小於100nm之區域。

於該方法之一些實施例中，該可檢測標記物包括一催化標記物。

於該方法之一些實施例中，該生物樣本包括複數細胞。於於該方法之一些實施例中，該生物樣本包括至少一個、至少100個、至少1000個或至少10,00活細胞或固定細胞。於該方法之一些實施例中，該生物樣本包括固定細胞、組織、或細胞或組織萃取物。

於該方法之一些實施例中，選擇性地照射包括：照射點擴散函數(point spread function)所定義之區域。

於該方法之一些實施例中，其中該生物樣本設置於顯微鏡載台上，該方法進一步包括自載台移除感興趣區域(region of interest)之至少一部分。

於該方法之一些實施例中，該方法進一步包括對樣本進行質譜分析或定序分析。

於該方法之一些實施例中，該標籤包括生物素衍生物、CLIP-標籤、鍵擊化學標籤、地高辛、Halo標籤、胜肽標籤或SNAP標籤。

於該方法之一些實施例中，該標籤包括鍵擊化學標籤，其包括炔基類或疊氮類基團。

於該方法之一些實施例中，該可裂解連結子包括偶氮苯衍生物、硼酸酯、Dde衍生物、DNA寡聚體或胜肽。

於該方法之一些實施例中，該誘餌分子包括抗體、CLIP標籤、Halo標籤、蛋白A、蛋白G、蛋白L、小分子或SNAP標籤。

於該方法之一些實施例中，該光激發探頭包括芳基疊氮化物、二苯酮、或二氮環丙烯。

本發明之另一態樣提供可裂解光反應探針，其包括具有複數連接位點之多價核心以及結合至該些連接位點中之一者的標籤，其中該標籤建構成得以偶聯至一標記物。一些實施例包括一可裂解連結子，其結合至該些連接位點中之第二者，並建構成得以連結至一誘餌分子，其中該可裂解連結子包括胜肽序列。

一些實施例包括一光激發探頭，其結合至該些連接位點中之第三者，其中該多價核心包括式(II)或(III)之基團：

其中m、r及q各自獨立為1、2、3、4、5或6；

其中*包括該複數連接位點中用於可裂解連結子之其中一連接位點；其中**包括該複數連接位點中用於標籤或光激發探頭之一者的不同連接位點；其中***包括該複數連接位點中用於光激發探頭或標籤之不同連接位點；且R⁷、R⁸、R⁹、R¹⁰、R¹¹及R¹²各自獨立為氫、視情況(optionally) 取代烷基、視情況取代烯基、視情況取代炔基、視情況取代碳環基、視情況取代雜環基、視情況取代芳基、視情況取代雜芳基、或氮保護基。

於一些實施例中，**包括用於標籤之連接位點，且***包括用於光激發探頭之連接位點。

於一些實施例中，該胜肽序列包括蛋白酶辨識序列。於一些實施例中，該胜肽序列包括人鼻病毒3C(HRV 3C)蛋白酶辨識序列、菸草蝕紋病毒(TEV)蛋白酶辨識序列、或凝血酶(thrombin)辨識序列。

於一些實施例中，該可裂解連結子進一步包括一可偶聯(conjugatable)胺基酸，其建構成得以偶聯至誘餌分子。

於一些實施例中，該可裂解連結子進一步包括半胱胺酸或具鍵擊反應性(clickable)的胺基酸。於一些實施例中，該可裂解連結子包括具有疊氮(azido)或炔基團之具鍵擊反應性的胺基酸。本發明之另一態樣提供一種用於標定生物樣本之套組，其包括：上述任一所請之可裂解光反應探針於第一容器中；以及一指示材料(instructional material)。

本發明之另一態樣提供一種用於標定生物分子之套組，其包括：一多價核心基團於第一容器中，其中該多價核心包括複數連接位點；以及一指示材料。

於一些實施例中，該套組包括一標籤，其建構成得以偶聯至一標記物並結合至或建構成得以結合至該多價核心基團。

於一些實施例中，該套組包括一可裂解連結子，其具有雙硫鍵除外之可裂解連結子鍵結，其中該可裂解連結子連結至或建構成得以連結至誘餌分子。

於一些實施例中，該套組包括一光激發探頭，其結合至或建構成得以結合至多價核心基團之第三連接位點。

於該套組之一些實施例中，該多價核心、該標籤、該可裂解連結子及該光激發探頭存在於同一分子中。

於該套組之一些實施例中，該標籤、該可裂解連結子及該光激發探頭中之至少一者係與多價核心分開。

該套組之一些實施例進一步包括一連結子裂解分子(linker cleavage molecule)。於該套組之一些實施例中，該連結子裂解分子包括核酸內切酶(endonuclease)或位點特異性蛋白酶。於該套組之一些實施例中，該連結子裂解分子包括人鼻病毒3C(HRV 3C)蛋白酶或菸草蝕紋病毒(TEV)蛋白酶。於該套組之一些實施例中，該連結子裂解分子包括X因子腸胜肽酶(factor X enteropeptidase)或凝血酶(thrombin)。

該套組之一些實施例進一步包括抗氧化劑、緩衝劑、界面活性劑(detergent)、核酸酶抑制劑、穩定劑及清洗劑中之一或更多者。

該套組之一些實施例進一步包括一誘餌分子。

該套組之一些實施例進一步包括一可檢測標記物。

該套組之一些實施例進一步包括與生物素特異性偶聯之標記物。

該套組之一些實施例進一步包括固定液。

1:基於顯微鏡的系統

10:顯微鏡

11:照射組件

12:攝像組件

13:第一處理模組

13a:處理模組

14:第二處理模組

17:訊號轉換器

101:載台

102:物鏡

103:目鏡

111:照射光源

117:圖像照射裝置

121:相機

122:攝像光源

123:對焦裝置

124:第一快門

141:記憶單元

201:標籤

202:光激發探頭

203:可裂解連結子

204:誘餌分子

205:多功能探針

205’:探針

205a:探針

205b:探針

205 frag:探針片段

205df:探針片段

206:標記物

207:酵素或催化劑

208:標定複合體

209:基板

210:感興趣生物分子

211:鄰域分子

212:直接光反應探針

212’:直接光反應探針

212a:直接光反應探針

218:酵素/催化劑基質

218’:活化之酵素/催化劑基質

218”:活化之酵素/催化劑基質

221:可裂解區域

222:額外彈性連結子

223:具鍵擊反應性胺基酸

224:胜肽類探針

225:胜肽類探針

230:多價核心

231:生物分子

232:第一連接位點

234:第二連接位點

236:第三連接位點

240:標定系統

244:抗體

246:細胞

247:核仁

250:細胞核

255:探針

255’:探針

255a:探針

255frag:探針片段

255df:探針片段

402:顯微鏡系統

404:窄帶光

406:基板

408:細胞

408a:細胞

412:胞器

414:廣大區域

416:細胞核

418:感興趣區域

S:樣本

透過參考以下闡述說明性實施例之詳細敘述及附圖，可更佳理解本文所述之方法及設備的特徵及優點，其中：

圖1示出可用於光選擇性空間標記並鄰近標定基板上細胞之系統的示意圖。

圖2A示出多功能可裂解光反應探針之示意圖。可裂解光反應探針具有含複數連接位點之多價核心。標籤、可裂解連結子及光激發探頭結合至探針上之連接位點。圖2B示意性地示出鄰近標定系統，其可用於使用圖2A中所示之探針以標定小感興趣區域中的生物分子。

圖2C示出比較示意圖，其比較使用本文所述之多功能可裂解光反應探針在小感興趣區域(ROI)中標定生物分子之直接光化學標定與光輔助酵素鄰近標定的結果。探針示於圖2B中。

圖3A及圖3B示意性地示出相較於使用具有苛刻裂解反應之探針的結果(圖3A)，使用如本文所述之多功能可裂解光反應探針及溫和裂解條件對蛋白質結構的影響(圖3B)。

圖4A-4K示出可用於本文所述之可裂解光反應探針中的標籤示例。標籤建構成得以與標記物相互作用以標定與感興趣目標分子相鄰之生物分子。圖4A-圖4E示出可用於探針之鍵擊化學標籤示例。圖4F-4H示出可用於探針之生物素衍生物示例。圖4I示出地高辛基團標籤。圖4J示出胜肽標籤(序列號SEQ ID NO：1)。圖4K示出SNAP標籤。

圖5A-5E示出可用於本文所述之可裂解光反應探針中之位點特異性可裂解連結子示例。圖5A示出偶氮苯基團。圖5B示出硼酸酯基團。圖5C示出Dde基團。圖5D示出DNA寡聚體。圖5E示出胜肽基團。

圖6A-6E示出可用於本文所述之可裂解光反應性探針中以與樣本中感興趣分子偶聯之誘餌分子的示例。圖6A示出可用作誘餌分子之抗體。圖6B示出可用作誘餌分子之核酸部分。圖6C示出可用作誘餌分子之功能性蛋白的代表圖。圖6D亦示出小分子/藥物可用作誘餌分子。舉例示出厄洛替尼(erlotinib)。圖6E示出CLIP標籤，且可使用自標定(self-labeling)基團之其他成員(如Halo標籤或SNAP標籤)。

圖7A-7I示出可用於本文所述之可裂解光反應探針中之光活性(photoactive)探頭示例。

圖8A-8G示出可用於本文所述之可裂解光反應性探針中之連結子的額外示例。

圖9A-9G示出可裂解光反應探針之示例。該些探針具有帶複數連接位點之多價核心。標籤結合至連接位點中之一者，可裂解連結子結合至另一連接位點，而光激發探頭結合至探針上之另一連接位點。

圖10A-10B示意性地示出胜肽類可裂解光反應探針。此些探針具有可被胜肽裂解劑(例如被辨識特定肽序列之蛋白酶)裂解之胜肽區域。圖10A示出在胜肽區域之N末端上具有標籤及探頭之胜肽類探針的示例，其在胜肽區域之N末端上具有標籤及探頭。圖10B示出在胜肽區域之C末端上具有標籤及探頭之胜肽類探針的示例。圖10A-10B亦示出探針具有額外彈性連結子及可選之具鍵擊反應性的胺基酸。額外連結子(亦稱為間隔子/spacer)可扮演橋接誘餌分子與可裂解光反應探針之間連接位點的角色。可透過應用具有不同空間長度之連結子來控制探針與誘餌之間的距離。

圖10C-10I示出可與圖10A及10B中所示之探針一起使用之反應性或具鍵擊反應性之胺基酸示例。具鍵擊反應性之胺基酸可用於附接誘餌分子，例如抗體。

圖10J-10Q示出圖10A-10B中示意性示出之胜肽類可裂解光反應探針示例。用箭頭標出人鼻病毒3C(HRV 3C)蛋白酶、菸草蝕紋病毒(TEV)蛋白酶及凝血酶(點紋箭頭)之裂解位點。圖10J-10Q依出現順序分別揭示序列號SEQ ID NOS8-15。

圖11A-11D示出合成本文所述之可裂解光反應探針的方法。該些方法形成帶有標籤、可裂解連結子及光激發探頭之探針。圖11D揭示序列號SEQ ID NOS 10。

圖12A示意性地示出偶聯至抗體誘餌之可裂解光反應探針。

圖12B及圖12C示意性地示出使用偶聯至抗體誘餌之可裂解光反應探針對分子進行光選擇性標記以標定細胞核仁中之蛋白質的反應流程。圖12B示出如何使用受控光進行反應。圖12B示出如何裂解可裂解探針以降低非光照區之背景。

圖12D示出使用圖12A及圖12B所示之反應流程的結果。核仁素蛋白質在光存在下被特異性標記(上圖及右圖)，但在無光下不被標記(下圖)。

圖13A表示影像導引系統之示意圖。

圖13B繪示圖13A之影像導導系統之光徑。

圖14A表示另一影像導引系統之示意圖。

圖14B繪示圖14A之影像導導系統之光徑。

圖15A表示又另一影像導引系統之示意圖。

圖15B繪示圖15A之影像導導系統之光徑。

本文描述可用於辨識、標記、獲得且分析生物分子及其相鄰生物分子之系統、組成物及方法。該些組成物及方法特別可用於分析生物樣本中之生物分子相互作用，例如分析細胞或組織樣本中之蛋白質、核酸、碳水化合物或脂質。該些組成物及方法利用可裂解光反應探針(例如，生物正交或溫和可裂解或酶特異性裂解)，其可標定生物分子及其相鄰生物分子，並大程度地保持生物分子中自然存在的分子結構。本文所述之溫和可裂解光反應探針可特別用於特異性標定細胞之次細胞區域中生物分子之子集，其使用具有精準照射控制之影像導引顯微鏡(例如美國專利公開案第2018/0367717號中所述之系統)，進而能夠對感興趣之細胞生物分子進行自動標定。探針可用於原位標記生物分子(例如細胞或組織內部的蛋白質)，隨後可進行標籤轉移或鄰近標定，例如使用酪胺訊號放大法(Tyramide Signal Amplification,TSA)。可透過例如質譜分析及定序之分析技術進一步分析生物分子。此些探針尤其可用於進行例如基因體學、蛋白質體學及轉錄體學之體學(omics)研究以及尋找用於診斷及治療之相關生物標記。

縮寫及定義：

用詞「胺基酸」意指天然存在及合成的胺基酸，以及作用類似天然存在胺基酸之胺基酸類似物及胺基酸模擬物。天然存在之胺基酸為遺傳密碼所編碼之胺基酸以及隨後經修飾之胺基酸，例如羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸、及O-磷絲胺酸。「胺基酸類似物」意指具有與天然存在胺基酸相同之基本化學結構(亦即α碳與氫、羧基、胺基及R基團結合)的化合物，例如高絲胺酸、正白胺酸、甲硫胺酸硫氧化物(methionine sulfoxide)、甲硫胺酸甲基鋶(methionine methyl sulfonium)。本文所述之胺基酸可被保守取代，只要保守取代之胜肽能夠實現所欲功能(例如被蛋白酶辨識)即可。保守取代之示例包括息寧胺酸(Thr)、甘胺酸(Gly)或天門冬醯酸(Asn)用於絲胺酸(Ser)以及組胺酸(His)、離胺酸(Lys)、麩胺酸(Glu)、麩胺酸醯胺(Gln)用於精胺酸(Arg)。保守取代描述於例如《Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Fourth Edition,Green and Sambrook,eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor 2014》及其更正與更新版中。

用詞「抗體」意指免疫球蛋白及相關分子，包括單株(monoclonal)抗體、多株(polyclonal)抗體、單體、二聚體、多聚體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、僅重鏈抗體(heavy chain only antibodies)、三鏈抗體、單鏈Fv、奈米抗體等，且亦包括抗體片段。抗體可為多株或單株或重組抗體。抗體可為鼠源、人類、人源化、嵌合或衍生自其他物種之抗體。如本文所用，當抗體或其他實體(entities)「特異性辨識」或「特異性結合」抗原或抗原決定基(epitope)時，其優先辨識蛋白質及/或大分子之複雜混合物中的抗原，且以實質上高於未呈現該抗原或抗原決定基之其他實體的親和力結合抗原或抗原決定基。

用詞「芳基」意指具有單環之芳香環系統(如苯基或經取代苯基)。感興趣之芳基包括，但不限於，衍生自以下之基團：乙烯合蒽(aceanthrylene)、乙烯合萘(acenaphthylene)、乙烯合菲(acephenanthrylene)、蒽(anthracene)、薁(azulene)、苯(benzene)、

(chrysene)、蔻(coronene)、螢蒽(fluoranthene)、茀(fluorene)、稠六苯(hexacene)、己芬(hexaphene)、并環己二烯(hexalene)、不對稱二環戊二烯并苯(as-indacene)、對稱二環戊二烯并苯(s-indacene)、二氫茚(indane)、茚(indene)、萘(naphthalene)、稠八苯(octacene)、辛芬(octaphene)、并環辛間四烯(octalene)、卵苯(ovalene)、戊-2,4-二烯(penta-2,4-diene)、稠五苯(pentacene)、并環戊二烯(pentalene)、戊芬(pentaphene)、苝(perylene)、丙烯合萘(phenalene)、菲(phenanthrene)、苉(picene)、七曜烯(pleiadene)、芘(pyrene)、吡蒽(pyranthrene)、玉紅省(rubicene)、聯伸三苯(triphenylene)、三萘(trinaphthalene)及其類似者。於某些實施例中，芳基包括6至20碳原子。於某些實施例中，芳基包括6至12碳原子。芳基之示例為苯基及萘基。

用詞「誘餌分子」意指與感興趣分子(其可稱為目標物或補獲物(prey))特異性相互作用之分子。誘餌分子之示例包括抗體、CLIP標籤、藥物、核酸、螢光原位雜交(FISH)探針、蛋白A、蛋白G、蛋白L、蛋白A/G、蛋白A/G/L、另一小分子及SNAP-標籤。

用詞「結合(binding)」意指第一基團與第二基團實體相互作用，其中第一與第二基團相互實體接觸。

用詞「生物正交(bioorthogonal)」意指不干擾生物體或不與其相互作用(例如對生物分子不具活性)。

用詞「生物正交反應」或「生物正交裂解反應」意指在生理相關條件下進行並與天然存在之官能團相容且通常具有快速動力學、對水性環境具耐受性及高選擇性的反應。生物正交反應係在被建構成得以維持天然存在之分子結構(例如蛋白質摺疊或三維結構)的條件下進行。生物正交反應不會破壞內源或樣本蛋白質或胜肽中多肽鏈之不同區域之間的交聯。例如，生物正交反應不會破壞天然存在之官能團中的共價鍵(如半胱胺酸側鏈中之雙硫鍵(-S-S-鍵))。生物正交可裂解連結子或生物正交可裂解探針中之可裂解連結子係建構成得以生物正交裂解，例如其與使用酵素或鍵特異性化學物相容，該酵素或鍵特異性化學物建構成得以在不破壞天然存在之官能團中的共價鍵下進行生物正交裂解。

用詞「生物素衍生物」意指生物素基團，包括生物素及生物素之變體，例如具開環或取代之生物素。通常，生物素衍生物利用結合生物素之實體或蛋白質(例如抗生物素蛋白(avidin)、中性抗生物素蛋白(NeutrAvidin)或抗生物素蛋白鏈菌素(streptavidin))即易於檢測到。

用詞「催化訊物沉積(catalyzed reporter deposition,CARD)」意指在目標生物分子(例如，碳水化合物、脂質、核酸或蛋白質)上或附近之可檢測分子的酶催化沉積(enzyme catalyzed deposition)。在一些實施例中，酶催化沉積中的酶為辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)，而可檢測分子為酪胺或地高辛(DIG)。

用詞「可裂解連結子鍵結」意指建構成得以被裂解劑特異性裂解之可裂解連結子中的化學鍵。通常，可裂解連結子鍵結係指單鍵；然而，於一些變體中，可裂解連結子鍵結可指多於一個鍵，例如在可被核酸內切酶裂解之雙股DNA可裂解連結子之例子中，其兩股DNA被裂解。

用詞「鍵擊化學」意指易於連接分子結構單元之化學方法。通常，鍵擊化學反應為有效、高產率、可靠、幾乎不產生副產物或不產生副產物、且與水性環境相容或無須添加溶劑。鍵擊化學之示例為環加成反應，例如導致1,2,3-三唑形成之炔烴與疊氮化物的銅(I)催化[3+2]-Huisgen 1,3-偶極環加成反應或Diels-Adler反應。鍵擊化學亦包括無銅反應，例如使用經取代環辛炔之變體(參見如JM Baskin等人之Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2007年10月23日，104(43),16793-16797)。鍵擊化學之其他示例為親核取代；C-C多鍵之加成(例如，Michael加成、環氧化、二羥基化、疊氮化)；以及nonaldol like化學(例如N-羥基琥珀醯亞胺活性酯偶聯)。鍵擊化學反應可為生物正交反應，但非必要。

用詞「偶聯(conjugate)」意指兩個或更多分子特異性相互作用之過程。在一些實施例中，標籤與標記物偶聯。在一些實施例中，誘餌與可裂解探針偶聯。

用詞「可偶聯(conjugatable)」意指可與另一分子特異性結合在一起之分子(其可偶聯至該另一分子)。在一些實施例中，誘餌可偶聯至感興趣生物分子。在一些實施例中，可裂解探針可偶聯至標記物

用詞「可檢測標記物」意指直接或間接偶聯至分子或建構成得以直接或間接偶聯至分子之化合物或組成物。標記物本身可為可檢測的，且可為直接可檢測標記物(舉例如，螢光標記物，例如螢光化學加成物、放射性同位素標記物等)、或者標記物可為間接可檢測的(舉例如，在酵素可檢測標記物之例子中，酵素可催化基質化合物或組成物之化學變化，且反應之產物為可檢測的)。可檢測標記之示例包括如生物素標記物、螢光標記物、辣根過氧化物酶、免疫學可檢測標記物(例如血凝素(HA)標籤、聚組胺酸標籤)、另一放光標記物及放射性標記物。間接標記物之示例為生物素，其可使用抗生物素蛋白鏈菌素檢測方法進行檢測。

用詞「酵素裂解反應」意指酵素介導之分子中鍵的裂解或水解。通常，酵素介導之反應裂解共價鍵並導致較小分子之形成。

用詞「免疫球蛋白結合蛋白(immunoglobulin-binding protein)」意指免疫球蛋白結合細菌蛋白及免疫球蛋白結合細菌蛋白之變體。示例包括蛋白A、蛋白G、蛋白L、蛋白A/G及蛋白A/G/L。蛋白A及蛋白G分別為最初從金黃色葡萄球菌及G群鏈球菌獲得之細菌蛋白，並對IgG型抗體之Fc區具有高親和力。蛋白A/G結合了蛋白A與蛋白G之結合結構域(binding domains)。蛋白A/G/L結合了蛋白A、蛋白G與蛋白L之結合結構域。免疫球蛋白結合蛋白結合至抗體之特定結構域。

用詞「指示材料」包括可用於傳達本發明一或更多組成物用於其指定用途之用處的出版物、記錄、圖表、連結或任何其他表達介質。本發明套組之指示材料例如可固定至包含該組成物或成分之容器，或者可與包含該組成物或成分之容器一起運送。或者，指示材料可與容器分開運送，以使指示材料與組成物或成分得以被接收者配合使用。

用詞「標記物」意指產生或可被誘導產生可檢測訊號之分子。在一些實施例中，標記物產生用於檢測相鄰生物分子的訊號。可使用之標記物的示例包括抗生物素蛋白標記物、中性抗生物素蛋白標記物或抗生物素蛋白鏈菌素標記物以檢測生物素標籤。

用詞「連結子」意指連接兩個或更多次結構之結構。連結子具有延伸於次結構之間的至少一不間斷原子鏈。連結子之原子係透過化學鍵連接，通常為共價鍵。

用詞「光激發探頭(light activated warhead)」意指與光激發部分有關之基團。光激發探頭之示例包括芳基疊氮化物、二苯酮及二氮環丙烯。一旦激發，光激發探頭便可結合至結合配體(binding partner)。

用詞「質譜儀」意指用於測量樣本中一或更多分子之質荷比的儀器。質譜儀通常包括離子源及質量分析儀。質譜儀之示例包括基質輔助雷射脫附游離法(matrix assisted laser desorption ionization,MALDI)、連續或脈衝電噴(electrospray,ES)遊離、離子噴、場磁場(magnetic sector)、熱噴、飛行時間及大簇碰撞(massive cluster impact)質譜。

用詞「質譜法」意指使用質譜儀檢測氣相離子。

用詞「質譜分析」包括線性飛行時間(TOF)、反射式飛行時間、單段四極柱、多段四極柱、單磁扇形(single magnetic sector)、多磁扇形(multiple magnetic sector)、傅立葉轉換、離子迴旋共振(ICR)或離子阱。

用詞「光激發(photoactivated或light activated)」意指藉由輻射能(例如，透過特定波長或波長範圍的光、UV光等)激發原子。在一些實例中，被光激發之分子在其緊鄰區內與另一分子或其自身之另一部分形成共價連結。

用詞「胜肽」意指其單體為胺基酸且單體透過醯胺鍵連接在一起之聚合物。胜肽通常為至少2個、至少5個、至少10個、至少20個、至少50個、至少100個或至少500個或更多個胺基酸長度。

用詞「光反應基團」意指暴露於光(例如，特定波長或波長範圍的光、UV光等)後即被激發之官能基團。光反應基團通常與其緊鄰區內之分子形成共價連結。

用詞「近端分子(proximity molecule)」或相鄰分子(neighboring molecule)意指靠近另一分子之分子。近端分子或鄰域分子(neighbor molecule)可結合至分子(例如，共價或非共價)，或者可靠近分子而不與分子結合。

用詞「捕獲物(prey)」意指誘餌分子之結合配體。例如，若抗體為誘餌，則誘餌分子可與其結合之相應蛋白質為相應補獲物。在一些實施例中，誘餌可與單個捕獲物結合。在一些實施例中，誘餌可與多於一個捕獲物結合。

用詞「蛋白質標籤」意指胺基酸之胜肽序列。蛋白質標籤通常可偶聯至標記物。蛋白質標籤之示例為”自標定(self-labeling)”標籤。自標定標籤之示例包括BL標籤、CLIP標籤、共價TMP標籤、HALO標籤及SNAP標籤。SNAP標籤為DNA修復蛋白O6-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉移酶之約20kDa變體，其可特異性辨識芐基鳥嘌呤(benzylguanine,BG)衍生物並與其快速反應。在標定反應期間，芐基部分共價接至SNAP標籤，釋出鳥嘌呤。CLIP標籤為SNAP標籤之變異，其建構成得以與O2-芐基胞嘧啶(benzylcytosine,BC)衍生物而非芐基鳥嘌呤(BG)特異性反應。

用詞「小分子」意指低分子量分子，其包括碳水化合物、藥物、酶抑制劑、脂質、代謝產物、單醣、天然產物、核酸、胜肽、擬肽物(peptidomimetics)、第二訊息者(second messenger)、有機小分子及外源物質(xenobiotics)。通常，小分子小於約1000分子量或小於約500分子量。

用詞「標籤」意指能夠檢測目標分子之官能基團、化合物、分子、取代基或其類似者。標籤可啟動可檢測之生物學或生理化學訊號，該訊號允許透過任何手段進行檢測，例如吸光度、化學放光、比色法、螢光、冷光、磁共振、磷光、放射性。因標籤而提供之可檢測訊號可因標籤基團(例如，螢光標籤)之生物化學或物理化學特性而具直接可檢測性，或者可因標籤與另一化合物或試劑相互作用而具間接可檢測性。通常，標籤為小的官能基團或小的有機化合物。在一些實施例中，所採用之標籤具有小於約1,000Da、750Da、500Da或甚至更小的分子量。

用詞「標記(tagging)」意指將標籤加至官能基團、化合物、分子、取代基或其類似者之過程。通常，標記能夠檢測目標分子。

用詞「酪胺訊號放大(tyramide signal amplification,TSA)」意指催化訊物沉積(catalyzed reporter deposition,CARD)，一種酵素介導檢測方法，其利用酵素(例如辣根過氧化物酶)之催化活性將非活性酪胺催化成高活性酪胺。可在低濃度之過氧化氫(H₂O₂)存在下進行放大。在一些示例子，酪胺可用可檢測標記物來標定，例如螢光素(例如生物素或2,4-二硝基苯酚(DNP))。

除非另外指出，否則本文所述技術之實行可採用化學、生物化學、細胞生物學、免疫學、分子生物學(包括細胞培養、重組技術、定序技術)及有機化學技術之習知技術及描述，其於該領域中之文獻中解釋(例如，Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Fourth Edition,Green and Sambrook,eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor 2014、及其更正及更新版；John D.Roberts and Marjorie C.Caserio(1977)Basic Principles of Organic Chemistry,second edition.W.A.Benjamin,Inc.,Menlo Park,CA)。

組成物

本文描述包括可裂解光反應探針(例如，生物正交或溫和可裂解探針)之物質組成物。可裂解光反應探針可有利地與顯微鏡系統一起使用，例如本文及美國專利公開案第2018/0367717 A1號中所述之系統，以實現鄰近感興趣生物分子之細胞生物分子的自動標定。被標定之分子可鄰接(adjacent)感興趣生物分子，亦可靠近(close-by)但不鄰接，例如當中介分子(intervening molecule)位於感興趣生物分子與細胞生物分子之間以進行捕獲或分析時。靠近但不鄰接感興趣分子之分子可為細胞結構之一部分，或者有助於感興趣之細胞微環境。圖1示出用於光選擇性空間標記及標定之系統的示意圖。圖1之底部示出基板406，例如顯微鏡載台，以及設置在基板上之單層複數細胞408。在一些實施例中，可使用自動化顯微鏡系統分析整個基板或基板之一部分的表面以辨識感興趣的區域。例如，可對樣本染色或標定以辨識感興趣區域。圖1之頂部示出細胞408a的放大圖，其為複數細胞408中之一者。細胞408a具有細胞核416及複數不同類型的胞器412，例如細胞膜、粒線體、核醣體及液泡。顯微鏡系統402選擇性地將窄帶光404照射到感興趣區域(ROI)418上，以分析感興趣區域418。照光可為選擇性的，且細胞及基板之廣大區域414 未被照光。如以下更詳細解釋，窄帶光404僅激發感興趣區域418中之溫和可裂解光反應探針。

圖2A示意性地呈現多功能探針205(除非具體上下文另外指出，否則在本文中亦可互換稱為多功能可裂解光反應探針、可裂解光反應探針或探針)。圖2A示出多功能探針205，其具有含複數連接位點之多價核心230，即第一連接位點232、第二連接位點234及第三連接位點236。圖2A之多功能探針具有接至第一連接位點232之標籤201(圓形)、接至第二連接位點234之可裂解連結子203(矩形)以及接至第三連接位點236之光激發探頭202(三角形)，因而形成三價之三功能探針。誘餌分子204(圓角正方形)接至可裂解連結子203。圖2B示出可與圖2A所示之多功能探針205一起使用之標定系統240示例，以標定與感興趣目標生物分子相鄰之生物分子。標定系統240包括帶有標記物206及酵素或催化劑207與酵素/催化劑基質218之標定複合體(labeling complex)208。在一些實施例中，標記物206為中性抗生物素蛋白，而酵素或催化劑207為過氧化物酶，並利用過氧化物(未示出)而達活性。在此示例中，標籤201與標記物206相互辨識並偶聯。酵素或催化劑207活化酵素/催化劑基質218，且一旦活化，經活化之酵素/催化劑基質218可結合並可檢測地標定其附近的生物分子。

圖2C示出比較示意圖，其比較了使用直接光化學標定，以及使用本文所述之多功能可裂解光反應探針與光輔助酵素標定，在微小之感興趣區域(ROI)中標定生物分子之的結果。圖2B示出將本文所述探針及系統用於具有生物分子(A)之試樣上以比較直接光化學標定(頂圖，標為過程B)及光輔助酵素標定(底圖，標為過程C)。在進行過程B或過程C之前，分析包含感興趣生物分子210(將在此使用蛋白質作為示例，但可用其他生物分子作代替進行分析)的樣本(例如，細胞或組織樣本)。樣本可進行預處理，例如固定及染色。例如，可固定樣本並用細胞染色劑(例如蘇木紫與伊紅(H&E)；曼森氏三色染色(Masson’s trichrome stain))，用辨識感興趣蛋白之免疫螢光標示抗體或透過其他方法作鑑別。一旦鑑別出感興趣區域，即可分析感興趣區域內相鄰生物分子之複合體。如過程B中所示，用直接光反應探針212處理樣本，且將圖案化光導向樣本並激發直接光反應探針212以形成經激發之直接光反應探針212'。經激發之直接光反應探針212'能夠與緊鄰之其他分子形成複合體(在過程B中以虛線圓呈現)。經激發之直接光反應探針212'可擴散並標定感興趣分子210附近之鄰域分子211。然而，光反應探針之直接光激發的標定直徑(300-600nm)在空間上受到所用光源之繞射極限的限制。此外，由於光反應探針可自由擴散，因此圖案化光徑中之任何蛋白質均會被標定。過程B亦顯示其標定更遠的生物分子231。經激發之直接光反應探針212'所標定的區域或標定精確度涵蓋約300-600nm的區域。此區域會包含到未緊鄰感興趣蛋白質之生物分子，而在一些情況下可能會導致混淆、誤導或無益的結果。

相比之下，於過程C中(示於圖2C之下圖)，將與誘餌分子(辨識感興趣生物分子)預偶聯之多功能探針205(參見圖2A)供至基板209上的樣本。如步驟1所示，圖案化光亦被導向樣本。然而，在此，圖案化光激發光反應探頭202，其結合至附近的分子或基團。除了將光導向有限的激發區域，光反應探頭亦受到其所附接之探針205的限制，而光反應探頭變成附接至感興趣生物分子。已接上之探針205a現與感興趣生物分子(或其附近者)發生雙交聯。圖2C亦顯示步驟2之裂解，可裂解連結子203被裂解，例如若可裂解連結子為可裂解胜肽連結子，則可透過加入蛋白酶。步驟1及步驟2亦顯示使用本文所述之探針及方法如何降低背景或不需要之標定。在步驟1中，探針205'接至生物分子；然而，由於探針205'在光傳輸區域外，故光反應探頭202未被激發而未結合至感興趣之生物分子。在步驟2中，探針205'被裂解成兩部分，即未結合而在洗滌步驟中被洗去之片段205 frag以及因去除標籤201(其為未結合片段205 frag之一部分而被洗去)而去標之205 df。探針片段205 df或205 frag均無法標定任何生物分子。探針205b雖被裂解，但透過雙交聯而仍接在感興趣生物分子。在一些變型中，探針205b可交聯至誘餌分子或另一近端生物分子；但原理仍相同。探針205b包含標籤201，並標定鄰域分子(如下更詳細解釋)。

標定系統240包括帶有標記物206及酵素或催化劑207與酵素/催化物基質218之標定複合體208。

用洗滌溶液洗去多餘的探針，並如上所述透過位點特異性除去單交聯探針(例如，在非光照區)。步驟3及4示出使用圖2B所示之標定系統240標定感興趣分子210附近的分子。亦可使用其他標定系統。舉例來說，複合體208與標籤201偶聯，酵素或催化劑207將酵素/催化劑基質218活化成活化之酵素/催化劑基質218'。由於探針205b接至感興趣分子210，因而標定鄰域分子211，而未標定較遠分子231。本文所述之可裂解連結子可實現從探針標記轉移至小於10nm半徑(指三功能(多功能)探針之半徑尺寸)內之鄰域分子。

透過使用方才所述之標記及標定將酵素或催化劑207(例如過氧化物酶)光選擇性地定位在感興趣分子附近並標定感興趣區域中之鄰域分子211，可將偶合(coupling)反應定位在小至<100nm之區域中。在一些變化態樣中，可標定較大區域(例如，大至約200nm、大至約300nm、大至約400nm)。再者，樣本中某些感興趣分子具有多於一個的定位區域，因此會同時與不同位置處之不同分子複合體相互作用。可在多於一個位置中接連利用光輔助標籤轉移(例如，標記鄰域分子)。例如，在如圖2B過程C中所示施加光且如圖所示標記鄰域分子之後，可將光選擇性地施加至樣本中之第二(第三、第四等)位置，並可根據需求重複多次此過程。除了例如因使用顯微鏡分析來導引光及本文所述之探針而對樣本極小區域中相對少量之鄰域分子進行標定(沉積標記物)外，如所下所解釋，還可用足夠溫和的處理來進行該過程，使得細胞結構保持完整(例如，反應亦為生物正交性)。

圖3A及圖3B示意性地示出相較於使用具有苛刻裂解反應之探針的結果(圖3A)，使用如本文所述之多功能可裂解光反應探針及溫和裂解條件對蛋白質結構的影響(圖3B)。在溫和裂解條件下，得以保持蛋白質結構，而反應為生物正交性；而在苛刻裂解條件下，蛋白質變性，而反應為非生物正交性。圖3A示意性地示出相對苛刻之裂解，例如在裂解反應中透過使用諸如三(2-羧乙基)膦(TCEP)或二硫蘇糖醇(DTT)還原劑所介導的裂解。除了裂解連結子外，TCEP或DTT還破壞其他雙硫鍵，包括蛋白質中半胱胺酸胺基酸之間常見之自然存在的共價雙硫鍵，從而使蛋白質變性。據估計，細胞中有多於90%的蛋白質含有至少一半胱胺酸胺基酸，且真核蛋白質體中約三分之一的蛋白質形成雙硫鍵。因此，在樣本上進行相對苛刻之裂解而破壞雙硫鍵可能會顯著破壞蛋白質結構、破壞整體細胞結構並改變自然發生之生物分子相互作用。該裂解反應可視為非生物正交反應。在一些實施例中，生物正交反應保留衍生自生物體(例如，衍生自真核生物)之結構，而不考慮非生物體結構，例如病毒。

圖3B示意性地示出使用本文所述多功能探針之相對溫和裂解反應。裂解反應使用較溫和的試劑，例如酵素或連結子特異性化學物，以裂解可裂解連結子。在一些實施例中，溫和裂解劑為實質上具特異性。換言之，其實質且特異性地結合至感興趣目標(例如，可裂解連結子)並對將其裂解，而實質上不結合或裂解其他分子(例如，少於1%的時間、少於0.1%等)。在一些實施例中，溫和裂解劑發揮作用以裂解其他鍵，例如C-C鍵，並保持例如雙硫(-S-S-)鍵的完整。如圖3B所示，雙硫鍵所介導之蛋白質三維結構在如本文所述進行溫和裂解後仍保持完整。由於例如自然存在之相鄰分子(與感興趣蛋白質相鄰)的標記及鄰近標定係取決於相鄰分子與感興趣蛋白質之相對鄰近度，因此維持生物分子之三維結構及整體細胞結構可導致更精確地標記且標定相鄰分子，從而於溫和裂解反應中降低假陽性及假陰性。溫和的裂解反應可為生物正交，因為其實質上不破壞天然存在之蛋白質結構或細胞結構。

圖4A-4K示出可用於本文所述之可裂解光反應探針中之標籤示例。標籤係建構成得以與可檢測標記物相互作用以標定與感興趣目標分子相鄰之生物分子。圖4A-圖4E示出可用於探針之鍵擊化學標籤示例。鍵擊化學標籤可為例如疊氮化物基團或炔烴基團。圖4F-4H示出可用作探針標籤之生物素衍生物示例。圖4I示出地高辛基團標籤。圖4J示出胜肽標籤。特別地，圖4J示出具有6個組胺酸之聚His標籤(序列號SEQ ID NO：1)。然而，組胺酸標籤可以更少或更多組胺酸來代替，例如5個(序列號SEQ ID NO：17)或7-10或更多個(序列號SEQ ID NO：18)。圖4K示出SNAP標籤，且亦可使用CLIP標籤或Halo標籤。

圖5A-5E示出可用於本文所述之可裂解光反應探針中之位點特異性可裂解連結子示例。圖5A示出偶氮苯基團。可例如用二硫亞磺酸鈉(sodium dithionite)或偶氮還原酶(azoreductase)，在裂解步驟期間裂解偶氮苯連結子。圖5B示出硼酸酯基團。可用亞硫醯氯及吡啶裂解硼酸酯可裂解連結子。圖5C示出Dde基團。可使用酵素或簡單小分子裂解Dde可裂解連結子。圖5D示出DNA寡聚體可裂解連結子，且可使用其他核酸分子來代替。可使用限制酶、核酸酶或使用互補寡聚體之競爭性方法裂解DNA寡聚體，其取決於所標定的分子。圖5E示出胜肽基團連結子，且胜肽基團連結子將於下參考圖10A-10Q進行更詳細討論。可在裂解步驟中使用蛋白酶來裂解胜肽連結子。在一些實施例中，位點特異性可裂解連結子可偶聯至誘餌分子。例如，偶聯至誘餌分子(例如NHS-酯)之連結子可與蛋白質誘餌(例如抗體)結合。基於各種原因，例如成本或裂解效率，可選擇特定裂解連結子及相關裂解劑。

圖6A-6E示出可用於本文所述之可裂解光反應性探針中以與樣本中感興趣分子偶聯之誘餌分子的示例。圖6A示出可用作誘餌分子之抗體。可使用任何時候的抗體。圖6B示出可用作誘餌分子之核酸部分，例如螢光原位雜交探針(FISH探針)。圖6C示出可用作誘餌分子之功能性蛋白的代表圖。功能性蛋白之示例包括蛋白A、蛋白G、蛋白L、蛋白A/G或蛋白質藥物。可用於本文所述之可裂解光反應探針中之其他誘餌分子包括生物藥物。可用作誘餌之生物藥物示例包括阿巴西普(abatacept,Orencia)；阿昔單抗(abciximab,ReoPro)；A型肉毒桿菌毒素(abobotulinumtoxinA,Dysport)；阿達木單抗(adalimumab,Humira)；阿達木單抗-阿托(adalimumab-atto,Amjevita)；曲妥珠單抗恩他新偶聯物(ado-trastuzumab emtansine,Kadcyl)；阿柏西普(aflibercept,Eylea)；半乳糖苷酶β(agalsidase beta,Fabrazyme)；albiglutide(Tanzeum)；阿地介白素(aldesleukin,Proleukin)；阿侖單抗(alemtuzumab,Campath,Lemtrada)；阿葡糖苷酶α(alglucosidase alfa,Myozyme,Lumizyme)；阿利庫單抗(alirocumab,Praluent)；阿替普酶(alteplase)；cathflo活化酶(cathflo activase,Activase)；阿那白滯素(anakinra,Kineret)；艾斯福酶α(asfotase alfa,Strensiq)；辛凝血素α(Octocog Alfa)；天冬醯胺酶(asparaginase,Elspar)；天冬醯胺酶菊歐文菌(asparaginase erwinia chrysanthemi,Erwinaze)；阿替珠單抗(atezolizumab,Tecentriq)；巴利昔單抗(basiliximab,Simulect)；貝卡普明(becaplermin,Regranex)；貝拉西普(belatacept,Nulojix)；貝利單抗(belimumab,Benlysta)；貝伐單抗(bevacizumab,Avastin)；貝羅托昔單抗(bezlotoxumab,Zinplava)；布林莫單抗(blinatumomab,Blincyto)；貝倫妥單抗維多汀(brentuximab vedotin,Adcetris)；康納單抗(canakinumab,Ilaris)；卡普洛馬伯片迪肽(capromab pendetide,ProstaScint)；聚乙二醇化賽妥珠單抗(certolizumab pegol,Cimzia)；西妥昔單抗(cetuximab,Erbitux)；膠原蛋白酶(collagenase,Santyl)；溶組織梭菌膠原酶(collagenase clostridium histolyticum,Xiaflex)；達利珠單抗(daclizumab,Zenapax)；達利珠單抗(daclizumab,Zinbryta)；達土木單抗(daratumumab,Darzalex)；達貝泊汀α(darbepoetin alfa,Aranesp)；地尼介白素迪夫托斯(denileukin diftitox,Ontak)；地諾單抗(denosumab,Prolia,Xgeva)；迪奴圖單抗(dinutuximab,Unituxin)；鏈道酶α(dornase alfa,Pulmozyme)；杜拉魯肽(dulaglutide,Trulicity)；艾卡拉肽(ecallantide,Kalbitor)；艾庫組單抗(eculizumab,Soliris)；艾洛硫酸酶α(elosulfase alfa,Vimizim)；埃羅妥珠單抗(elotuzumab,Empliciti)；依泊汀α(epoetin alfa,Epogen/Procrit)；依那西普(etanercept,Enbrel)；依那西普-szzs(etanercept-szzs,Erelzi)；伏洛單抗(evolocumab,Repatha)；非格司亭(filgrastim,Neupogen)；非格司亭-sndz(filgrastim-sndz,Zarxio)；促卵泡激素α(follitropin alpha,Gonal f)；加硫酶(galsulfase,Naglazyme)；穀卡匹酶(glucarpidase,Voraxaze)；戈利木單抗(golimumab,Simponi)；戈利木單抗注射劑(golimumab injection,Simponi Aria)；替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan,Zevalin)；伊達珠單抗(idarucizumab,Praxbind)；艾度硫酸酯酶(idursulfase,Elaprase)；A型因可肉毒毒素(incobotulinumtoxinA,(Xeomin)；英利昔單抗(infliximab,Remicade)；英利昔單抗-dyyb(infliximab-dyyb,Inflectra)；干擾素α-2b(interferon alfa-2b,Intron A)；干擾素α-n3(interferon alfa-n3,Alferon N Injection)；干擾素β-1a(interferon beta-1a,Avonex,Rebif)；干擾素β-1b(interferon beta-1b,Betaseron,Extavia)；干擾素γ-1b(interferon gamma-1b,Actimmune)；伊匹單抗(ipilimumab,Yervoy)；ixekizumab(Taltz)；拉羅尼酶(laronidase,Aldurazyme)；美泊利單抗(mepolizumab, Nucala)；甲氧基聚乙二醇-表皮素β(methoxy polyethylene glycol-epoetin beta,Mircera)；美曲普汀(metreleptin,Myalept)；那他珠單抗(natalizumab,Tysabri)；耐昔妥珠單抗(necitumumab,Portrazza)；尼沃單抗(nivolumab,Opdivo)；歐必妥昔單抗(obiltoxaximab,Anthim)；歐比妥珠單抗(obinutuzumab,Gazyva)；奧克纖溶酶(ocriplasmin,Jetrea)；奧法木單抗(ofatumumab,Arzerra)；olaratumab(Lartruvo)；奧馬珠單抗(omalizumab,Xolair)；onabotulinumtoxinA(Botox)；奧普瑞介白素(oprelvekin,Neumega)；帕利夫明(palifermin,Kepivance)；帕利珠單抗(palivizumab,Synagis)；帕尼單抗(panitumumab,Vectibix)；副甲狀腺激素(parathyroid hormone,Natpara)；培門冬酶(pegaspargase,Oncaspar)；派非格司亭(pegfilgrastim,Neulasta)；聚乙二醇化干擾素α-2a(peginterferon alfa-2a,Pegasys)；聚乙二醇化干擾素α-2b(peginterferon alfa-2b,PegIntron,Sylatron)；聚乙二醇化干擾素β-1a(peginterferon beta-1a,Plegridy)；聚乙二醇重組尿酸酶(pegloticase,Krystexxa)；派立珠單抗(pembrolizumab,Keytruda)；帕妥珠單抗(pertuzumab,Perjeta)；ramucirumab(Cyramza)；蘭尼單抗(ranibizumab,Lucentis)；拉布立酶(rasburicase,Elitek)；雷昔庫單抗瑞利珠單抗(raxibacumabreslizumab,Cinqair)；瑞替普酶(reteplase,Retavase)；利納西普(rilonacept,Arcalyst)；瑞瑪毒素B(rimabotulinumtoxinB,Myobloc)；利妥昔單抗(rituximab,Rituxan)；羅米司亭(romiplostim,Nplate)；沙格司亭(sargramostim,Leukine)；sebelipase alfa(Kanuma)；塞庫金單抗(secukinumab,Cosentyx)；思圖昔單抗(siltuximab,Sylvant)；替博非格司亭(tbo-filgrastim,Granix)；替奈普酶(tenecteplase,TNKase)；托珠單抗(tocilizumab,Actemra)；曲妥珠單抗(trastuzumab,Herceptin)；優西努單抗(ustekinumab,Stelara)；維多珠單抗(vedolizumab,Entyvio)；ziv-阿柏西普(ziv-aflibercept,Zaltrap)。

圖6D亦示出小分子/藥物可用作誘餌分子。舉例示出厄洛替尼(erlotinib)。圖6E示出CLIP標籤，且可使用自標定(self-labeling)基團之其他成員(如Halo標籤或SNAP標籤)。

圖7A-7I示出可用於本文所述之可裂解光反應探針中之光活性(photoactive)探頭示例。圖7A示出二苯酮光活性探頭，其可透過單光子激發之320-365nm UV-A照射或雙光子激發之720-800nm來激發。圖7B、7C及7D示出基於芳基疊氮化物之探頭，其可透過單光子激發之250-365nm照射或雙光子激發之800nm來激發。圖7B示出苯基疊氮化物光活性探頭。圖7C示出四氟苯基疊氮化物光活性探頭。圖7D示出羥苯基疊氮化物光活性探頭。圖7E示出二氮環丙烯光活性探頭。圖7F示出三氟甲基苯基二氮環丙烯(trifluoromethylphenyl diazirine)光活性探頭。圖7G示出3-氰基乙烯基咔唑核苷酸(CNVK)光活性探頭，其具核甘酸鹼基特異性。圖7H示出補骨脂素光活性探頭，其亦具核甘酸鹼基特異性。補骨脂素與DNA或RNA反應形成共價加成物。在一些實施例中，補骨脂素光活性探頭可被長波長UV光(例如，UVA，310-400nm)激發。圖7I示出利用催化劑之苯氧基自由基捕捉基光活性探頭。特定光激發探頭之選擇可取決於所欲波長及誘餌分子的類型。例如，可選擇多功能探針之組成及用於前探針分析之組成，以免相互干擾(或最小程度地干擾)。

圖8A-8G示出可用作本文所述之可裂解光反應性探針中之連結子的額外連結子示例。圖8A示出BCN-NHS連結子。圖8B示出 DBCO-NHS連結子。圖8C示出炔烴-NHS連結子。圖8D示出DBCO-PEG3-NHS連結子。圖8E示出炔烴-PEG5-NHS連結子。圖8F顯示出疊氮基-PEG4-NHS連結子。圖8G示出疊氮丁酸-NHS連結子。

圖9A-9G示出可用於組成物中並用於實施本文所述方法之可裂解光反應探針示例。探針具有帶複數連接位點之多價核心。標籤、可裂解連結子及光激發探頭結合至探針上之連接位點。在一些實施例中，多價核心包括式(I)之基團。在一些實施例中，n為1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，R¹及R²各自獨立為氫、經取代烷基、經取代烯基、經取代炔基、經取代碳環基、經取代雜環基、經取代芳基、經取代雜芳基、或氮保護基。在一些實施例中，R³及R⁴中之一者為-(CH₂)_x(OCH₂CH₂)_y(CH₂)_zNR⁵R⁶，而另一者為連接位點，其中x為1、2、3、4、5或6；y是1、2、3、4、5或6；z為0、1、2、3、4、5或6；且R⁵及R⁶中之一者為連接位點，而另一者為氫、經取代烷基、經取代烯基、經取代炔基、經取代碳環基、經取代雜環基、經取代芳基、經取代雜芳基、或氮保護基。

圖10A-10B示意性地示出胜肽類可裂解光反應探針。此些探針具有可被胜肽裂解劑(例如被辨識特定肽序列之蛋白酶)裂解之胜肽區域，且該胜肽區域可被特異性裂解(例如被蛋白酶)。圖10A示出胜肽類探針224之示例，其在胜肽區域之N末端上具有標籤201及光反應探頭202。圖10B示出胜肽類探針225示例，其在胜肽區域之C末端上具有標籤201及探頭202。圖10A-10B亦示出探針具有額外彈性連結子222(在本文中亦稱為間隔子/spacer)及可選之具鍵擊反應性胺基酸223。圖10C-10I 示出可與圖10A及10B中所示之探針一起使用之反應性或具鍵擊反應性之胺基酸示例。圖10C示出疊氮丙胺酸(azidoalanin)之具鍵擊反應性胺基酸。圖10D示出疊氮離胺酸(azidolysine)之具鍵擊反應性胺基酸。圖10E示出炔丙基甘胺酸(propargylglycine)之具鍵擊反應性胺基酸。圖10F示出半胱胺酸之具鍵擊反應性胺基酸。圖10G示出NHS活化C末端之具鍵擊反應性胺基酸。圖10H示出NHS活化天門冬胺酸之具鍵擊反應性胺基酸。圖10I示出NHS活化麩胺酸。

圖10J-10Q示出圖10A-10B中示意性示出之胜肽類可裂解光反應探針示例。標出人鼻病毒3C(HRV 3C)蛋白酶(格紋箭頭)、菸草蝕紋病毒(TEV)蛋白酶(條紋箭頭)及凝血酶(點紋箭頭)之裂解位點。蛋白水解可裂解胜肽序列可在裂解期間被蛋白酶特異性地裂解。可用於本文所述之探針的蛋白水解可裂解胜肽序列示例包括得以被活化凝血因子X腸胜肽酶(本文亦稱為X因子腸胜肽酶或Xa因子)、人鼻病毒(HRV)3C蛋白酶、凝血酶及菸草蝕紋病毒(TEV)蛋白酶辨識之序列。在此些蛋白酶中，因子Xa及凝血酶於血液中自然發現。除了胜肽類探針之蛋白水解可裂解胜肽序列以外，此些蛋白酶可辨識並裂解細胞或細胞萃取物中的蛋白質。儘管在某些情況下，此可能會擾亂樣本中天然存在之蛋白質環境，並在某些分析中導致誤導或假象結果，但亦當注意，此些裂解反應之數量可能會被充分地限制，而可用於某些目的或在某些情況下。不干擾天然存在之生物分子(例如細胞或組織樣本中天然存在之蛋白質)的裂解反應視為生物正交，在保持天然存在之蛋白質結構的情況下可裂解的探針可視為具有生物正交可裂解胜肽序列之生物正交可裂解探針。如上所討論，儘管Sulfo-SBED探針可用於本文所述之某些方法以用於特定應用，但在其他實施例中，用二硫蘇糖醇(DTT)或2-巰基乙醇(2-mercaptoethanol)裂解Sulfo-SBED探針以裂解其S-S鍵亦會不利地破壞天然存在之蛋白質(例如，其為非生物正交)。

腸胜肽酶辨識胜肽序列DDDDK|(序列號SEQ ID NO：2)以進行裂解，其中在離胺酸後之連結子鍵結發生裂解。

Xa因子辨識胜肽序列LVPR|GS(序列號SEQ ID NO：3)以進行裂解，其中在精胺酸與甘胺酸之間的連結子鍵結發生裂解。

人鼻病毒(HRV)3C蛋白酶辨識胜肽序列LEVLFQ|GP(序列號SEQ ID NO：4)以進行裂解，其中在麩胺醯胺與甘胺酸之間的連結子鍵結發生裂解。

TEV蛋白酶較佳對胜肽序列ENLYFQ|S(序列號SEQ ID NO：5)進行裂解，其中在麩胺醯胺與絲胺酸之間的連結子鍵結發生裂解。TEV蛋白酶亦可辨識序列ENLYFQ|G(序列號SEQ ID NO：6)以進行裂解，其中在麩胺醯胺與甘胺酸之間的連結子鍵結發生裂解。

凝血酶辨識胜肽序列LVPR|GS(序列號SEQ ID NO：7)以進行裂解，其中在精胺酸與甘胺酸之間的連結子鍵結發生裂解。

除了用於蛋白水解之特異性辨識序列外，胜肽部分還可包含其他胺基酸。可裂解光反應探針可具有C末端或N末端標籤(例如生物素化)。

圖10J示出C-HRV3C偶聯前胜肽探針，其具有HRV3C蛋白水解可裂解胜肽序列GRRRYLEVLFQGP(序列號SEQ ID NO：8)。

圖10K示出N-HRV3C偶聯前胜肽探針，其具有HRV3C蛋白酶切割位點胜肽序列LEVLFQGPYRRRG(序列號SEQ ID NO：9)。

圖10L示出N-TEV偶聯前胜肽探針，其具有TEV蛋白酶切割位點胜肽序列ENLYFQGGGGS(序列號SEQ ID NO：10)。

圖10M示出N-凝血酶偶聯前胜肽探針，其具有凝血酶切割位點胜肽序列LVPRGSYRRRG(序列號SEQ ID NO：11)。

圖10N示出SN-凝血酶偶聯胜肽探針，其具有凝血酶切割位點胜肽序列LVPRGS(序列號SEQ ID NO：12)。

圖10O示出PN-HRV3C偶聯胜肽探針，其具有HRV 3C蛋白酶切割位點胜肽序列LEVLFQGPGGGGS(序列號SEQ ID NO：13)。

圖10P示出PN-TEV偶聯胜肽探針，其具有TEV蛋白酶切割位點胜肽序列ENLYFQGGYRRRG(序列號SEQ ID NO：14)。

圖10Q示出C-TEV偶聯胜肽探針，其具有TEV蛋白酶切割位點胜肽序列GGGGSYENLYFQG(序列號SEQ ID NO：15)。

如上所指，一些探針包括彈性連結子(在本文中亦稱為間隔子)。彈性連結子為用於將兩個分子或基團連接在一起之彈性分子或分子之延伸。連結子可由彈性基團組成，以使鄰接的結構域可相對於另一者自由移動。彈性連結子可包括彈性胺基酸殘基，例如甘胺酸(G)或絲胺酸(S)。彈性連結子亦可包括蘇胺酸(T)及丙胺酸(A)殘基。可在連結子中重複一串胺基酸。例如，連結子可包括甘胺酸殘基長度後再接著是絲胺酸殘基，例如形成(GGGGS)n寡聚體，其中n為1、2、3、4、5、6、7、8或更大(序列號SEQ ID NO：19)，重複GGGGS模體(motif)(序列號SEQ ID NO：16)。彈性連結子亦可包括烷基，例如聚乙二醇(CH₂CH₂O)_m連結子，其中m為1至50、或2-30、或3-6。聚合彈性連結子之其他示例包括聚丙二醇、聚乙烯、聚丙烯、聚醯胺及聚酯。彈性連結子可為線性分子，其於具有至少一或兩個原子之鏈中，且可包括更多個。

圖11A-11D示出合成本文所述之可裂解光反應探針的方法。該些方法形成帶有標籤、可裂解連結子及光激發探頭之探針。該些圖亦示出可偶聯誘餌分子之區域。三功能分子探針可透過使用市售分子作為結構單元及常規使用之合成步驟來合成。用於合成探針之圖11A-11D所示之流程係提供作為示例，而非用於限制目的。圖11A示出探針1之合成流程。圖11B示出探針2之合成流程。圖11C示出探針7之合成流程。圖11D示出探針IV N-TEV的合成流程。

一些實施例提供可裂解光反應探針，其包括包含有複數連接位點之多價核心。一些實施例提供結合至該些連接位點中之一者的標籤，其中標籤建構成得以偶聯至標記物。一些實施例提供結合至該些連接位點中之第二者的可裂解連結子，其建構成得以連結至誘餌分子，其中該可裂解連結子包括胜肽序列。一些實施例提供結合至該些連接位點中之第三者的光激發探頭，其中該多價核心包括式(II)或(III)之基團：

其中m、r及q各自獨立為1、2、3、4、5或6；其中*包括該複數連接位點中用於可裂解連結子之其中一連接位點；其中**包括該複數連接位點中用於標籤或光反應探頭之一者的不同連接位點；其中***包括該複數連接位點中用於光反應探頭或標籤之不同連接位點；且R⁷、R⁸、R⁹、R¹⁰、R¹¹及R¹²各自獨立為氫、視情況取代烷基、視情況取代烯基、視情況取代炔基、視情況取代碳環基、視情況取代雜環基、視情況取代芳基、視情況取代雜芳基、或氮保護基。

於可裂解光反應探針之一些實施例中，其中**包括用於標籤之連接位點，且***包括用於光反應探頭之連接位點

於可裂解光反應探針之一些實施例中，該胜肽序列包括蛋白酶辨識序列。

於可裂解光反應探針之一些實施例中，該胜肽序列包括人鼻病毒3C(HRV 3C)蛋白酶辨識序列、菸草蝕紋病毒(TEV)蛋白酶辨識序列、或凝血酶(thrombin)辨識序列。

於可裂解光反應探針之一些實施例中，該可裂解連結子進一步包括一可偶聯胺基酸。

於可裂解光反應探針之一些實施例中，該可裂解連結子進一步包括半胱胺酸或具鍵擊反應性的胺基酸。

於可裂解光反應探針之一些實施例中，該可裂解連結子包括具有疊氮(azido)或炔基團之具鍵擊反應性的胺基酸。

圖12A示意性地示出偶聯至抗體誘餌之可裂解光反應探針。圖12B及圖12C示意性地示出使用偶聯至抗體誘餌之可裂解光反應探針對分子進行光選擇性標記以標定細胞核仁中之蛋白質的反應流程。如圖。圖12B示出如何使用受控光進行反應。圖12B亦示出如何裂解可裂解探針以降低非光照區之背景。圖12B中所示之反應類似於圖2C中所示者，差異僅在於誘餌分子204為抗體244，而探針255包括作為誘餌之抗體244。當探針255之光反應探頭被激發時，其結合至誘餌/抗體244，而不是細胞分子。然而，探針255仍保留在感興趣蛋白質(於此例中為細胞246之細胞核250中核仁247中的核仁蛋白/核仁素(nucleolin))之附近。在裂解步驟期間，光選擇區域之外的探針255仍裂解成片段255frag及去標之探針片段255df(其於洗滌步驟中被洗去)。圖12D示出使用圖12A及12B所示之反應流程的結果。核仁素蛋白質在光存在下被特異性標記(上圖及右圖)，但在無光下不被標記(下圖)。與誘餌分子連結之探針經過光激發後進行裂解而被選擇性地保留，並與酵素(例如，在此例中為HRP)偶聯，以於半徑約10nm至約100nm進行空間標定，其取決於所使用之特定酵素及反應時間。在該方法之一些實施例中，選擇性照光包括照射由點擴散函數所定義之區域。

本文所述之光選擇性標記及標定可在各種類型之樣本中進行，例如獲自組織、細胞或顆粒之樣本，如來自實體(例如，人類受試者、小鼠受試者、大鼠受試者、昆蟲受試者、植物、真菌、微生物、病毒)或非源自生物之組織樣本或細胞樣本，例如細胞培養樣本或人工組織支架樣本(例如實驗室培養細胞、體外培養之心臟組織、3維列印組織等)。使用本文所述之探針、材料及方法進行分析之樣本可為活樣本(活細胞)或可為非活樣本(例如固定樣本)。用於標記及標定之樣本可包括單層樣本、多層樣本、固定在基板(例如顯微鏡載玻片)上之樣本、未固定在基板上之樣本、細胞懸液、或萃取物，例如體外細胞萃取物、重組細胞萃取物或合成萃取物。在一些實施例中，樣本為非固定(未固定)。可用於標記活細胞之探針的示例包括利用小分子或有時稱為自標定分子(例如，Clip標籤、Halo標籤、SNAP標籤)之探針。在一些實施例中，可使用本文所述之方法及材料自動分析大量細胞(例如，至少約1,000個細胞、至少10,000個細胞、至少100,000個細胞、至少1百萬個細胞)。在一些實施例中，可分析較少數量的細胞，例如不超過1,000個細胞、不超過100個細胞或僅幾個細胞或單個細胞。在一些實施例中，樣本為固定的。例如，細胞或組織樣本可用例如醋酸、丙酮、甲醛(4%)、福馬林(10%)、甲醇、戊二醛或苦味酸固定。固定劑可為相對強固定劑，且可交聯分子，或者可為較弱且非交聯分子。在分析之前，可將用於分析之細胞或組織樣本冷凍，例如使用乾冰或速凍。在分析之前，可將細胞或組織樣本包埋於固體材料或半固體材料(例如石蠟或樹脂)中。在一些實施例中，可對用於分析之細胞或組織樣本進行固定，接著進行包埋，例如福馬林固定及石蠟包埋(FFPE)。

本揭示內容提供一實施例，其亦為用於影像導引顯微照射之基於顯微鏡的系統。請參考圖13A及13B。本實施例之基於顯微鏡的系統包括顯微鏡10、攝像組件12、照射組件11及處理模組13a。顯微鏡10包括物鏡102及載台101。載台101配置成裝載有樣本S。攝像組件12可包括(可控)相機121、攝像光源122、對焦裝置123及第一快門124。請進一步參見圖13B，該照射組件11可包括照射光源111及圖像照射裝置117。圖像照射裝置117可包括第二快門112、透鏡模組113(例如中繼透鏡113a及113b、四分之一波長片113c)、至少一對掃描鏡115及掃描透鏡116。或者，可使用數位微鏡裝置(DMD)或空間光調變器(SLM)作為圖像照射裝置117。

在本實施例中，處理模組13a耦接至顯微鏡10、攝像組件12及照射組件11。處理模組13a可為電腦、工作站、或電腦之中央處理單元(CPU)，其能夠執行被設計用於操作系統的程式。

處理模組13a控制攝像組件12，使得相機121擷取第一視野之樣本S的至少一影像，並將影像傳送至處理模組13a並透過處理模組13a基於預定義之標準自動地即時處理影像，以確定影像S中之感興趣區域並獲得關於該感興趣區域之座標資訊。稍後，處理模組13a可根據接收到之關於感興趣區域的座標資訊來控制照射組件11之圖像照射裝置117以照射樣本S之感興趣區域。又，在對感興趣區域完全照光之後，處理模組13a控制顯微鏡10之載台101移動至第一視野之後的第二視野。

在本實施例中，攝像光源122經由攝像光徑提供攝像光以於樣本攝像期間照射樣本S。沿著攝像光徑之第一快門124設置於攝像光源122與顯微鏡10之間。可控相機121設置於顯微鏡10上或攝像光徑上。

又，照射光源111經由照射光徑提供照射光以照射樣本S。沿著照射光徑之圖像照射裝置117設置於照射光源111與顯微鏡10之間。

本揭示內容提供另一實施例，其亦為用於影像導引顯微照射之基於顯微鏡的系統。此系統包括額外處理模組，以改善照射效能，並將詳細描述此系統。請參考圖14A及14B。圖14A代表根據本揭示內容之一實施例的影像導引系統示意圖，而圖14B繪出圖14A之影像導引系統之光徑。

如圖14A及14B所示，用於影像導引顯微照射之基於顯微鏡的系統1包括顯微鏡10、照射組件11、攝像組件12、第一處理模組13及第二處理模組14。基於顯微鏡之系統1設計成用於拍攝顯微鏡影像，並利用此影像或此些影像確定樣本上之照射圖像並對其照光，從而快速(例如在300毫秒內)完成一個影像的所有步驟，並在很短的時間(例如10小時)內達成蛋白質體學研究之整個照射程序。

顯微鏡10包括載台101、物鏡102及目鏡103。該載台配置成用以裝載樣本S。顯微鏡10之載台101可為高精度顯微鏡載台。

攝像組件12可包括相機121、攝像光源122、對焦裝置123及第一快門124。相機121安裝在顯微鏡10上。詳細地說，相機121係透過顯微鏡10之目鏡103耦接至顯微鏡10。對焦裝置耦接至相機121，並被控制以在樣本S之攝像期間協助自動對焦程序。提供攝像光之攝像光源122(如圖14A中從攝像組件12至物鏡102的陰影區域所示)經由攝像光徑(如圖14A在陰影區域所示之攝像光線中以空白箭頭所標示的路徑)對樣本S進行照光。沿著攝像光徑之的第一快門124設置於攝像光源122與顯微鏡10之間。攝像光源122可為鎢鹵素燈、弧光燈、金屬鹵化物燈、LED燈、雷射光或其多項者。第一快門的快門時間可隨攝像光源121的類型而變化。以LED光源為例，第一快門124的快門時間為20微秒。

若想要執行雙色成像，則透過第一處理模組13將第一色光之快門關閉，並打開第二色光之快門。此可能額外需要40微秒。相機121接著以另一20毫秒的曝光時間來拍攝另一影像。第一處理模組13隨後關閉第二色光之快門。

在本實施例中，請進一步參考圖14B，照射組件11包括照射光源111及圖像照射裝置117，該圖像照射裝置117包括第二快門112、透鏡模組113(例如中繼透鏡113a和113b，四分之一波長片113c)、至少一對掃描鏡115及掃描透鏡116。或者，可使用DMD或SLM作為圖像照射裝置117。照射光源111經由照射光徑提供照射光(如圖14A中從照射組件11至物鏡102之空心箭頭所示)以對樣本S照光。沿照射光徑之第二快門112設置於照射光源111與顯微鏡10之間。沿照射光徑之一對掃描鏡115設置於第二快門112與顯微鏡10之間。相機121可為高端科學相機，例如具有高量子效率之sCMOS相機或EMCCD相機，以實現短曝光時間。為了獲得足夠光子用於影像處理，曝光時間為例如20毫秒。

第一處理模組13耦接至顯微鏡10及攝像組件12。詳細地說，第一處理模組13耦接並因此控制相機121、攝像光源122、第一快門、對焦裝置123及顯微鏡10的載台101，以進行攝像、保持對焦及變換視野。第一處理模組13可為電腦、工作站或電腦之中央處理單元(CPU)，其能夠執行設計用來操作系統的程式。第一處理模組13接著啟動相機 121以拍攝某個視野(FOV)之樣本S的影像。此外，相機121可藉由USB埠或其上之Camera Link而連接至第一處理模組13。本系統之控制及影像處理程序將於以下段落中更加詳細說明。

在本實施例中，第二處理模組14耦接至照射組件11及第一處理模組13。詳細地說，第二處理模組14耦接並因此控制圖像照射裝置117(包括第二快門112與一對掃描鏡)，以對第一處理模組13所確定之感興趣區域中的目標點進行照光。第二處理模組14可為FPGA、ASIC板、另一中央處理單元、或另一電腦。本系統之控制及影像處理程序將於以下段落中更加詳細說明。

簡言之，基於顯微鏡之系統1如下操作。第一處理模組13控制攝像組件12，使得相機121擷取第一視野之樣本S的至少一影像。該影像或該些影像接著被傳送至第一處理模組13，並由第一處理模組13基於一預定義標準自動地即時進行處理，以確定影像中之感興趣區域，並從而獲得關於感興趣區域之座標資訊。影像處理運算法係利用影像處理技術而事先獨立設計好，例如閥值擷取(thresholding)、侵蝕(erosion)、濾波(filtering)或人工智能訓練之語義分割法(artificial intelligence trained semantic segmentation method)。隨後，關於感興趣區域之座標資訊傳送至第二處理模組14。第二處理模組14則根據所接收到之關於感興趣區域的座標資訊來控制照射組件12以對樣本S之感興趣區域進行照光(亦即，照射感興趣區域內之彼些目標點)。此外，在對感興趣區域完全照光(或者照射感興趣區域中之所有目標點)之後，第一處理模組13控制顯微鏡10之載台101移動至第一視野之後的下一個視野(即第二視野)。移動至後續視野後，該方法進一步重複攝像-影像處理-照射步驟，直到照射所有指定視野之感興趣區域。

此外，本揭示內容亦提供另一實施例，其為用於影像導引顯微照射之基於顯微鏡的方法。該基於顯微鏡之方法係利用前述基於顯微鏡之系統，並包括以下步驟(a)至(e)：(a)由第一處理模組13啟動攝像組件12之相機121，以擷取第一視野之樣本S的至少一影像，其中樣本S載於顯微鏡10之載台101上；(b)將樣本S之該影像或該些影像自動傳送至第一處理模組13；(c)基於一預定義標準，由第一處理模組13自動即時地進行樣本S之影像處理，以確定影像中之感興趣區域並獲得關於感興趣區域之座標資訊；(d)將關於感興趣區域之座標資訊自動傳送至第二處理模組14；(e)透過第二處理模組14以根據所接收到之座標資訊來控制照射組件11而對樣本S中之感興趣區域照光。此外，在本實施例中，在對感興趣區域完全照光之後，該方法進一步包含以下步驟：透過第一處理模組13控制顯微鏡10之載台101移動至第一視野之後的下一個視野(即第二視野)。

本文所使用之基於顯微鏡的系統1與前述系統實質上相同，並在此省略組成件之細節及構成元件之變化。

再者，如圖13A及13B所示，照射之光徑始自照射光源111。第二快門112對於此照射光源111來說是必要的。為了達到用於點照光之高切換速度，機械快門可能不夠快。可利用聲光調變器(acousto-optic modulator，AOM)或電光調變器(electro optic modulator，EOM)來實現高速。例如，AOM可達到25奈秒上升/下降時間，其對本實施例中之方法及系統來說是足夠的。在第二快門112之後，可用一對中繼透鏡113a及113b來調整光束大小。在中繼透鏡113a及113b之後，四分之一波長片113c可利於產生圓偏振。光接著抵達該成對掃描鏡(即XY掃描鏡)115，以將照射光一次一個地導引至所欲點。光接著經過掃描透鏡116及管狀透鏡(包含於顯微鏡中，未示於此處)與顯微鏡10之物鏡102，以照射樣本S之目標點。具高數值孔徑(NA)之物鏡102可能需有足夠的光強度以用於光化學反應或光轉化。

又，本揭示內容亦提供另一實施例，其亦為用於影像導引顯微照射之另一基於顯微鏡的系統。用於影像導引顯微照射之該基於顯微鏡的系統與前述系統實質上相同。請參考圖15A及15B。在本實施例中，基於顯微鏡之系統1包括顯微鏡10、照射組件11、攝像組件12、第一處理模組13及第二處理模組14。顯微鏡10包括載台101、物鏡102及目鏡103。載台101配置成用以裝載樣本S。請進一步參考圖15B，照射組件11包括照射光源111及圖像照射裝置117，圖像照射裝置117包括至少一第二快門112、至少一中繼透鏡(例如中繼透鏡113a及113b)、四分之一波長片113c、至少一對掃描鏡115及掃描透鏡116。或者，可使用DMD或SLM作為圖像照射裝置117。攝像組件12可包括相機121、攝像光源122、對焦裝置123及第一快門124。相機121安裝在顯微鏡10上。

前述實施例中所述之系統與此處之間主要的差異在於，此處之第一處理模組13耦接至顯微鏡10之載台101及攝像組件12之攝像光源122及第一快門124。然，此處之第二處理模組14包括記憶單元141並耦接至相機121、照射組件11及第一處理模組13。換言之，在本實施例中，相機121是由第二處理模組14控制，而非第一處理模組(亦即，電腦)13。若需要高速影像數據傳輸及處理，相機121可經由Camera Link連接至第二處理模組14。記憶單元141可為隨機存取記憶體(RAM)、快閃記憶體(flash ROM)、或硬碟(hard drive)，而隨機存取記憶體可為動態隨機存取記憶體(DRAM)、靜態隨機存取記憶體(SRAM)、或零電容隨機存取記憶體(zero-capacitor random access memory，Z-RAM)。

因此，於本實施例之系統1中，其操控如下。第一處理模組13控制攝像組件12，而第二處理模組14控制相機121，使得相機121擷取第一視野之樣本S的至少一影像。該影像或該些影像自動傳送至第二處理模組14之記憶單元141。第二處理模組14接著基於預定義標準自動即時地進行影像處理，以確定影像中之感興趣區域，並從而獲得關於感興趣區域之座標資訊。稍後，第二處理模組14根據所接收到之關於感興趣區域的座標資訊以控制照射組件11而對樣本S之感興趣區域進行照光。

該基於顯微鏡之系統1的每個細節元件之組成、變化或對其他元件的連接關係參考前述實施例，故在此不再重複。

又，本揭示內容亦提供另一實施例，其為用於影像導引顯微照射之另一基於顯微鏡的方法。用於影像導引顯微照射之基於顯微鏡的方法與上述者實質上相同。亦請參考圖15A及15B，用於影像導引顯微照射之基於顯微鏡的方法包括以下(a)至(d)步驟：(a)由第一處理模組13控制攝像組件12，並由第二處理模組14啟動攝像組件12的相機121，以擷取第一視野之樣本S的至少一影像，且樣本S係載於顯微鏡10之載台 101上；(b)將樣本S之該影像或該些影像自動傳送至第二處理模組14之記憶單元141；(c)基於預定義標準，由第二處理模組14自動即時地進行樣本S之影像處理，以確定影像中之感興趣區域並獲得關於感興趣區域之座標資訊；以及(d)由第二處理模組14根據所接收之座標資訊來控制照射組件11以對樣本S中之感興趣區域進行照光。

用於執行探頭激發或光選擇性標記及標定的光波長範圍在一些實施例中為約200nm至約800nm，例如約200nm至約250nm、約250nm至約300nm、約300nm至約350nm、約350nm至約400nm、約400nm至約450nm、約450nm至約500nm、約500nm至約550nm、約550nm至約600nm、約600nm至約650nm、約650nm至約700nm、約700nm至約750nm、或約750nm至約800nm。在一些實施例中，用於執行光選擇標記及標定之光波長為短波長UV光(例如254nm；265-275nm)；長紫外光(例如365nm；300-460nm)。在一些實施例中，用於執行探頭激發或光選擇性標記及標定之光波長範圍在一些實施例中為約800nm至約2000nm，例如約800nm至約900nm、約900nm至約1000nm、約1000nm至約1100nm、約1100nm至約1200nm、約1200nm至約1300nm、約1300nm至約1400nm、約1400nm至約1500nm、約1500nm至約1600nm、約1600nm至約1700nm、約1700nm至約1800nm、約1800nm至約1900nm、或約1900nm至約2000nm。在一些實施例中，用於執行光選擇標記及標定之光波長為短波長UV光(例如254nm；265-275nm)；長紫外光(例如365nm；300-460nm)。用於探頭光激發之波長不同於用於攝像之波長。在一些實施例中，光反應探頭激發係利用約300-450nm、550nm(用於單光子激發)或>720nm(用於多光子激發)之光輻射(光)。特定波長取決於特定探頭。裂解可由酵素或化學物(例如用於裂解偶氮苯之二硫亞磺酸鈉)驅動。

在一些實施例中，探針之多價核心(例如核心基團)可約70Da至約500Da。多價核心可包括或可為單個胺基酸或單個核苷酸。在一些實施例中，核心之最大寬度可小於1nm。

方法

本文亦揭示光選擇性標記及標定生物分子之方法及分析方法。該些方法可單獨或組合地用於標記及/或標定碳水化合物、脂質、核酸、蛋白質。該些方法可包括以下步驟：用誘餌分子及溫和可裂解光反應探針處理生物樣本，並使誘餌分子結合至生物樣本中之補獲物。在一些實施例中，探針包括光激發探頭及標籤，並透過可裂解連結子結合至誘餌分子。一些實施例包括以下步驟：用影像導引顯微鏡系統之攝像光源照射生物樣本。一些實施例包括以下步驟：用可控照相機對被照射之樣本進行攝像。一些實施例包括以下步驟：用相機擷取第一視野中樣本之次細胞形態的至少一影像。一些實施例包括以下步驟：處理該至少一影像，並基於該處理後之影像確定樣本中的感興趣區域。一些實施例包括以下步驟：獲得該感興趣區域之座標資訊。

一些實施例包括以下步驟：基於所獲得之座標資訊，用交聯光選擇性地照射感興趣區域，從而使探針與誘餌雙交聯。一些實施例進一步包括以下步驟：使用標籤以產生可檢測標記物並用可檢測標記物標定鄰近捕獲物之蛋白質。一些實施例包括其中可檢測標記物包括酪胺標記物之步驟。一些實施例包括其中生物樣本包含複數細胞之步驟。一些實施例包括其中生物樣本包含複數活細胞之步驟。一些實施例包括其中生物樣本包含細胞萃取物之步驟。一些實施例包括其中選擇性照射包括照射直徑小於300nm、小於200nm或小於100nm區域的步驟。一些實施例包括進一步包括從顯微鏡載台移除至少該感興趣區域的步驟。

一些實施例包括進一步包括使樣本進行質譜或定序分析的步驟。一些實施例包括其中該標籤包含生物素衍生物、鍵擊化學標籤、Halo標籤、SNAP標籤、CLIP標籤、地高辛或胜肽標籤之步驟。一些實施例包括其中鍵擊化學標籤包含炔類或疊氮類基團。一些實施例包括其中可裂解連結子為偶氮苯衍生物、Dde衍生物、DNA寡聚體、胜肽或硼酸酯。一些實施例包括其中誘餌分子包含抗體、蛋白A、蛋白G、蛋白L、SNAP標籤、CLIP標籤或小分子。一些實施例包括其中光激發探頭包含芳基疊氮化物、二氮環丙烯或二苯酮。

本文亦描述光選擇性標記、標定及分析方法。該些方法可包括將可裂解光反應探針供至生物樣本之步驟，其中該探針包括可裂解連結子、光激發探頭及標籤，其接至探針的核心。該些方法可包括將誘餌分子結合至生物樣本中之目標生物分子的步驟，其中誘餌分子偶聯至探針。該些方法可包括從影像導引顯微鏡系統之攝像光源照射生物樣本的步驟。

該些方法可包括以下步驟：用可控相機對被照射樣本進行攝像。該些方法可包括以下步驟：用相機擷取第一視野中之生物樣本之次細胞形態的至少一影像。該些方法可包括以下步驟：處理該至少一影像，並基於該處理後之影像確定樣本中之感興趣區域。該些方法可包括以下步驟：獲得感興趣區域之座標資訊。該些方法可包括以下步驟：用光輻射選擇性照射感興趣區域，以激發光激發探頭，並將探頭接至目標生物分子或目標生物分子鄰域，從而使探針與目標分子呈雙交聯。該些方法可包括以下步驟：裂解探針之可裂解連結子。該些方法可包括以下步驟：去除被裂解且未結合之探針。

一些實施例包括標定直徑小於300nm、小於200nm或小於100nm的區域。在一些實施例中，生物樣本包括至少一個、至少100個、至少1000個或至少10,000個活細胞。

一些方法包括使具有目標生物分子之生物樣本與本文所述之探針接觸、使用光輻射以使探針與目標生物分子進行空間上選擇性光交聯、裂解探針、洗去未結合探針或被裂解探針、用標記物標定生物分子/探針複合體、以及選擇性鄰近標定生物分子鄰域分子。

套組

本文亦提供用於實行本文所述方法之套組及系統，例如用於產生探針，並分析、標記且標定生物分子。套組通常將包含至少一本文所述之可裂解光反應探針或其組成。在一些實施例中，該至少一可裂解光反應探針係建構成溫和可裂解(例如，生物正交可裂解)。

此外，套組通常將包括指示材料，其揭示產生或修飾該一或更多探針之手段，舉例如，將誘餌部分接至探針、將探針應用至樣本、使誘餌部分偶聯至捕獲分子(於樣本中)、經由光反應探頭將探針光交聯至感興趣分子、透過可裂解連結子鍵結對可裂解連結子進行光反應裂解、去除(洗掉)未光反應探針。

套組亦可包括額外組成，以利於套組為其所設計之特定應用。因此，例如，在套組包含用於標記及標定生物分子之一或更多可裂解光反應探針下，該套組可額外包含一或更多裂解分子(例如，化學物、核酸內切酶、蛋白酶)。該套組可額外包含一或更多誘餌分子，例如本文所述之任何誘餌分子(如抗體、功能性蛋白(例如，蛋白A、蛋白G、蛋白藥物等)、自標定蛋白(例如CLIP標籤、Halo標籤、SNAP標籤)、小分子或藥物)。

該套組可額外包含檢測樣本及/或檢測標記物之工具(例如，用於酵素標記物之酵素基質、用於檢測螢光標記物之過濾組(filter set)、酵素或相關檢測試劑，包括用於執行催化訊物沉積(CARD)或訊號放大之試劑(例如，抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、抗生物素蛋白鏈菌素、HRP、酪胺、過氧化氫等)。該套組可額外包括用於一或更多步驟(例如，樣本固定後、探針裂解後等)之清洗溶液，例如封閉劑、介面活性劑、鹽(例如，氯化鈉、氯化鉀、磷酸鹽緩衝液(PBS))。套組可包括多種清洗溶液(例如配置成在使用前要稀釋之洗滌緩衝液濃縮物，或用於製備一或更多清洗溶液之組成)及常規用於實行特定方法之其他試劑。套組可包含固定劑及其他樣本製備材料(例如，乙醇、甲醇、福馬林、石蠟等)。

套組可視情況地包括指示材料，其教示探針、裂解分子、向探針添加誘餌分子與清洗溶液及類似者之使用。

實驗與方法

[實施例1]證明使用偶氮探針成功地對核仁蛋白進行局部光選擇性標記。圖12A示出核仁蛋白之光選擇標記示意圖。核仁蛋白為真核細胞之核仁中發現的蛋白質，其參與核醣體的合成。透過使用BCN-NHS(CAS # 1516551-46-4)作為偶氮探針1與二抗之間的額外連結子，將偶氮探針1偶聯至二抗。U2OS細胞樣本在玻璃底腔室玻片(chamber slide)上生長，並用2.4%PFA固定。將結合有偶氮探針1之抗體應用於用抗-核仁蛋白抗體染色的樣本。將樣本暴露於780nm之雙光子輻射下(200mW，200μs/像素)使光激發探頭與抗體光交聯，隨後在室溫下用1M二硫亞磺酸鈉反應超過16小時，以去除未交聯的探針。添加偶聯至Alexa Fluor 647染料之中性抗生物素蛋白，並分析樣本中的Alexa Fluor 647。Alexa Fluor 647為亮遠紅螢光染料，非常適於594nm或633nm雷射線激發。結果示於圖12D之上圖中。圖12D之右上示出特寫視圖。觀察到特徵核仁形狀。圖12D之右下示出側視圖。圖12D之下圖示出與上圖相同處理之對照區域，差異僅在於下圖所示之樣本未暴露於光激發光。未觀察到明顯染色。

[實施例2]

BCN-抗體之製備：

1.對於100μl的反應，製備70μl抗體溶液(1.2-1.5μg/μl)。2.加入10μl之1M碳酸氫鈉(或1M硼酸鹽緩衝液，最終50-100mM)及BCN-NHS(Sigma-Aldrich # 744867，最終濃度：200μM)。用ddH₂O將最終體積調整為100μl。3.倒轉幾次，輕輕混合，然後輕輕旋轉。4.在室溫下於振盪器/混合器上反應1小時。若需要，請避光。5.加入10μl 之1M甘胺酸終止反應，並在室溫下再反應30-60分鐘。6.使用脫鹽柱透過樹脂過濾以去除未偶聯之小分子。

探針3-抗體偶聯物之製備：7.將0.5-1μg/μl抗體與探針3混合(終濃度：100μM)，在4℃下反應過夜。8.使用脫鹽柱透過樹脂過濾以去除未偶聯之小分子。

光選擇性標定：9.用探針3-抗體及DRAQ5(細胞核標記)於含0.1%Triton之PBS溶液中處理核仁蛋白染色的細胞60分鐘。10.用0.1%Triton之PBS溶液補充液洗滌樣本，並用2.4%PFA固定樣本。11.定義所欲區域，並用780nm之160-200mW脈衝雷射標定選定區域內之探針3-抗體染色的核仁蛋白。12.用PBS洗滌標定樣本，並在室溫下用1M二硫亞磺酸鈉反應過夜。13.透過用中性抗生物素蛋白-Dy550偶聯物(1：200)染色以檢查標定。

[實施例3]

探針IV N-TEV之製備

將偶聯前胜肽N-TEV溶解於DMSO/水(1/1)中至1mM。將4-芐基苯甲酸N-琥珀醯亞胺酯(N-Succinimidyl 4-Benzoylbenzoate,TCI # S0863)溶於純無水DMSO中至2mM。將10μL之N-TEV儲存溶液(stock solution)與10μL之4-芐基苯甲酸N-琥珀醯亞胺酯儲存溶液、10μL之1M硼酸鈉緩衝液(pH=8.5)、70μL之DMSO/水(1/1)混合，並在室溫下反應2小時。加入10μL之1M甘胺酸溶液淬息反應，並用MALDI-MS驗證。

當特徵或元件在本文中被稱為在另一特徵或元件”上”時，其可直接在另一特徵或元件上，或者亦可存在中間特徵及/或元件。相反地，當特徵或元件被稱為”直接在”另一特徵或元件”上”時，則不存在中間特徵或元件。亦將理解，當特徵或元件被稱為”連接”、”附接”或”耦接”至另一特徵或元件時，其可直接連接、附接或耦接至另一特徵或元件或可能存在中間特徵或元件。相反地，當特徵或元件被稱為”直接連接”、”直接附接”或”直接耦接”至另一特徵或元件時，則不存在中間特徵或元件。儘管對一實施例作描述或示出，但如此描述或示出之特徵及元件可應用於其他實施例。本領域之技術人員亦將理解，提及設置為鄰接另一特徵之結構或特徵可具有與鄰接特徵重疊或位於鄰接特徵下方之部分。

本文所使用之術語僅出於描述特定實施例之目的，並非旨於限制本發明。例如，如本文所使用，單數形式”一”、”一個”及”該”亦用於包括複數形式，除非上下文另外明確指出。將進一步理解，用詞”包括”及/或”包括有”(當用於本說明書中時)指所述特徵、步驟、操作、元件及/或組成之存在，但不排除一或更多其他特徵、步驟、操作、元件、組成及/或其群組的存在或添加。如本文所使用，用詞”及/或”包括一或更多相關列出項目之任何及所有組合，並可縮寫為”/”。

為便於描述，可於本文中使用空間相對用詞，例如”下方”、”之下”、”下部”、”上方”、”上部”及其類似者，以描述如圖中所示之元件或特徵與另一元件或特徵的關係。將理解，除了圖中所繪之位向之外，空間相對用詞亦用於涵蓋裝置在使用或操作中之不同位向。例如，若圖中之裝置為倒置，則描述為在其他元件或特徵”下方”或”之下”的元件將接著定向為在其他元件或特徵”上方”。因此，示例性用詞”下方” 可涵蓋”上方”及”下方”之兩位向。可以其他方式定向裝置(旋轉90度或其他方向)，並據此解釋本文使用之空間相對描述語。類似地，除非另具體指明，否則用詞”向上”、”向下”、”垂直”、”水平”及其類似者在本文中僅用於解釋目的。

雖然用詞”第一”及”第二”可用於本文以描述各種特徵/元件(包括步驟)，但除非上下文另外指明，否則此些特徵/元件不應受此些用詞的限制。此些術語可用於區分一特徵/元件與另一特徵/元件。因此，在不悖離本發明之教示下，下文討論之第一特徵/元件可稱為第二特徵/元件，且類似地，下文討論之第二特徵/元件可稱為第一特徵/元件。

在整篇本說明書及隨後之請求項中，除非上下文另外要求，否則用語”包括”及諸如”包括有”之變化詞意指可在方法及物品(例如，包括裝置及方法之組成件及設備)中共同使用各種組成。例如，用詞”包括有”將被理解為暗示包括任何所述元件或步驟，但不排除任何其他元件或步驟。

一般而言，本文所述之任何設備及方法應理解為包括性，但組成及/或步驟之全部或子集可替代地為排他性，並可表示為”由(各種組成、步驟、子組成或子步驟)組成”或”基本上由(各種組成、步驟、子組成或子步驟)組成”。

如本文在說明書及請求項中所使用(包括在示例中所使用，且除非另明確指定)，所有數字可讀作好像有用語”大約”或”近似地”開頭，即使該用語並未明確出現。當描述大小及/或位置時，可使用措辭”大約”或”近似”來指所述之值及/或位置落於值及/或位置之合理預期範圍內。例如，數值可具有所述值(或值之範圍)之+/-0.1%值、所述值(或值之範圍)之+/-1%值、所述值(或值之範圍)之+/-2%值、所述值(或值之範圍)之+/-5%值、所述值(或值之範圍)之+/-10%值等。除非上下文另指明，否則本文給出之任何數值亦應理解為包括大約或近似於該值。例如，若揭示值”10”，則亦揭示了”約10”。本文所載之任何數值範圍旨在包括其中包含的所有子範圍。亦當理解，如本領域技術人員適當理解的那樣，當揭示值時，則亦揭示了”小於或等於該值”、”大於或等於該值”以及值之間的可能範圍。例如，若揭示值”X”，則亦揭示了”小於或等於X”以及”大於或等於X”(例如，其中X為數值)。亦當理解，在整個該申請中，以多個不同格式提供數據，且此數據表示末點與起點以及數據點之任何組合範圍。例如，若揭示特定數據點”10”及特定數據點”15”，則當理解，視為已揭示大於、大於或等於、小於、小於或等於、以及等於10與15以及介於10與15之間。亦當理解，亦揭示兩個特定單元之間的每一單元。例如，若揭示10及15，則亦揭示了11、12、13及14。

儘管以上描述各種說明性實施例，但在不悖離如請求項所述之本發明範圍下，可對各種實施例進行多種改變中的任一者。例如，在替代實施例中，可經常改變各種所述方法步驟執行的順序，且在其他替代實施例中，可完全跳過一或更多方法步驟。各種裝置及系統實施例之可選特徵可包含於一些實施例中，但不在其他實施例中。因此，前文敘述主要出於示例性目的而提供，而不應解釋為限制本發明之範圍，因其於請求項中闡明。

本文所包括之示例及圖示係以說明而非限制方式示出可在其中實行本標的之特定實施例。如所述，可利用其他實施例並從其衍生，從而可在不悖離本揭示內容之範圍下進行結構及邏輯上之替換及改變。若事實上多於一者被揭示，可僅出於方便而在本文中各別地或共同地以用詞”發明”來指稱本發明標的之此等實施例，而無意將本申請之範圍限制為任何單個發明或發明概念。因此，儘管本文已圖示並描述特定實施例，但為實現相同目的而計算出之任何佈設皆可代替所示之特定實施例。本揭示內容旨在涵蓋各種實施例之任何及所有改編或變化。本領域技術人員在閱讀以上描述後將可顯而易見以上實施例之組合及未具體描述於本文中之其他實施例。

<110> 中央研究院

<120> 用於標記生物分子之可裂解光反應探針

<130> 14815-500.600

<140>

<141>

<150> 62/992,253

<151> 2020-03-20

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成6xHis標籤

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<213> 人工序列

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<223> 人工序列的描述：合成肽

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<223> 人工序列的描述：合成肽

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<223> 人工序列的描述：合成肽

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<223> 人工序列的描述：合成肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<221> SITE

<222> (1)..(10)

<223> 此序列可包括7-10個殘基

<220>

<221> misc_feature

<223> 關於取代及較佳實施例之詳細說明請見申請之說明書

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<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<220>

<221> SITE

<222> (1)..(40)

<223> 此序列可包括1-8 "Gly Gly Gly Gly Ser"重複單元

<220>

<221> misc_feature

<223> 關於取代及較佳實施例之詳細說明請見申請之說明書

<400> 19

201:標籤

202:光激發探頭

203:可裂解連結子

204:誘餌分子

205:多功能探針

230:多價核心

232:第一連接位點

234:第二連接位點

236:第三連接位點

Claims

一種可裂解光反應探針，包括：

一多價核心，其包括複數連接位點；

一標籤，其結合至該些連接位點中之一者，其中該標籤件構成得以偶聯至一標記物；

一可裂解連結子，其結合至該些連接位點中之一第二者，並建構成得以連結至一誘餌分子，其中該可裂解連結子包括非雙硫鍵之一可裂解連結子鍵結；以及

一光激發探頭，其結合至該些連接位點中之一第三者。
如請求項1所述之可裂解光反應探針，其中，該探針為生物正交可裂解。
如請求項1或2所述之可裂解光反應探針，其中，該標籤包括生物素衍生物、CLIP標籤、鍵擊化學標籤、地高辛、Halo標籤、胜肽標籤、或SNAP標籤。
如請求項3所述之可裂解光反應探針，其中，該生物素衍生物包括以下基團：
如請求項3所述之可裂解光反應探針，其中，該鍵擊化學標籤包括炔類或疊氮類基團。
如請求項3所述之可裂解光反應探針，其中，該鍵擊化學標籤包括以下基團：
如請求項3所述之可裂解光反應探針，其中，該可裂解連結子包括偶氮苯衍生物、硼酸酯、Dde衍生物、DNA寡聚體或特異性可裂解胜肽。
如請求項7所述之可裂解光反應探針，其中，該偶氮苯衍生物包括以下基團：
如請求項7所述之可裂解光反應探針，其中，該Dde衍生物包括以下基團：
如上述請求項中任一者所述之可裂解光反應探針，其中，該誘餌分子包括抗體、CLIP標籤、Halo標籤、蛋白A、蛋白G、蛋白L、RNA分子、小分子或SNAP標籤。
如上述請求項中任一者所述之可裂解光反應探針，其中，該光激發探頭包括芳基疊氮化物、二苯酮、或二氮環丙烯。
如請求項11所述之可裂解光反應探針，其中，該芳基疊氮化物包括以下基團：
如請求項11所述之可裂解光反應探針，其中，該二氮環丙烯包括以下基團：
如請求項11所述之可裂解光反應探針，其中，該二苯酮包括以下基團：
如請求項1-10中任一項所述之可裂解光反應探針，其中，該光激發探頭包括核甘酸鹼基特異性3-氰基乙烯基咔唑核苷酸(3-cyanovinylcarbazole nucleoside,CNVK)，其包括以下基團：
如請求項1-10中任一項所述之可裂解光反應探針，其中，該光激發探頭包括核甘酸鹼基特異性補骨脂素(psoralen)，其包括以下基團：
如請求項1-10中任一項所述之可裂解光反應探針，其中，該苯氧基自由基捕捉基(phenoxyl radical trapper)包括光激發探頭，其包括以下基團：
如上述請求項中任一項所述之可裂解光反應探針，其中，該可裂解連結子包括偶氮苯、硼酸酯、Dde基團、DNA寡聚體或可裂解胜肽。
如上述請求項中任一項所述之可裂解光反應探針，其中，該可裂解連結子包括人鼻病毒3C(HRV 3C)蛋白酶辨識序列、或菸草蝕紋病毒(tobacco etch virus,TEV)蛋白酶辨識序列。
如上述請求項中任一項所述之可裂解光反應探針，其中，該多價核心包括式(I)之基團：

其中n為1、2、3、4、5或6；

R¹及R²各自獨立為氫、經取代烷基、經取代烯基、經取代炔基、經取代碳環基、經取代雜環基、經取代芳基、經取代雜芳基、或氮保護基；且

R³與R⁴中之一者為-(CH₂)_x(OCH₂CH₂)_y(CH₂)_zNR⁵R⁶，而另一者為連接位點，

其中x為1、2、3、4、5或6；

y為1、2、3、4、5或6；

z為0、1、2、3、4、5或6；且

R⁵與R⁶中之一者為連接位點，而另一者為氫、經取代烷基、經取代烯基、經取代炔基、經取代碳環基、經取代雜環基、經取代芳基、經取代雜芳基、或氮保護基。
如請求項20所述之可裂解光反應探針，其中，該多價核心包括式(I-1)或(I-2)之基團：
如請求項21所述之可裂解光反應探針，其中該多價核心包括以下基團：
如請求項1或2所述之可裂解光反應探針，其包括以下結構：
如請求項23所述之可裂解光反應探針，其中該些探針2及6分別進一步包括一額外連結子分子，其建構成得以將該些探針2及6連結至該誘餌分子。
如上述請求項中任一項所述之可裂解光反應探針，進一步包括一彈性連結子。
如上述請求項中任一項所述之可裂解光反應探針，進一步包括一彈性連結子，其包括有聚乙二醇或(GGGGS)n寡聚體(序列號SEQ ID NO：16)。
一種光激發標定之方法，包括：

將請求項1-22中任一項所述之可裂解光反應探針供至一生物樣本，其中該可裂解光反應探針連結至該誘餌分子；

使該誘餌分子偶聯至該生物樣本中之目標生物分子，以交聯該探針與該目標生物分子；

供予光輻射，以激發該可裂解光反應探針之該光激發探頭，並將該探頭接至該目標生物分子或目標生物分子鄰域，使得該探針與該目標生物分子呈雙交聯；

裂解該探針之該可裂解連結子，從而裂解未雙交聯至該目標生物分子或目標生物分子鄰域之探針；以及

去除該已裂解且未結合探針。
一種分析方法，包括：

將一可裂解光反應探針供至一生物樣本，其中該探針包括一可裂解連結子、一光激發探頭以及一標籤接至該探針之一核心；

使該誘餌分子偶聯至該生物樣本中之目標生物分子，以交聯該探針與該目標生物分子；

從一影像導引顯微鏡系統之一攝像光源照射該生物樣本；

利用一可控相機對該經照射樣本攝像；

利用該相機擷取第一視野中該生物樣本之次細胞形態的至少一影像；

處理該至少一影像並基於該經處理影像來確定該樣本中之一感興趣區域；

獲取該感興趣區域之座標資訊；

利用光輻射選擇性照射該感興趣區域，以激發該光激發探頭並將該探頭接至該目標生物分子或目標生物分子鄰域，使得該探針與目標分子呈雙交聯；

裂解該探針之該可裂解連結子，從而裂解未雙交聯至該目標生物分子或目標生物分子鄰域之該探針；以及

去除該已裂解且未結合探針。
如請求項27或28所述之方法，其中，裂解該可裂解連結子包括進行生物正交裂解反應。
如請求項27-29中任一項所述之方法，其中，該可裂解連結子包括一可裂解連結子鍵結，且裂解該可裂解連結子之該步驟包括裂解非雙硫鍵之鍵結。
如請求項27-30中任一項所述之方法，進一步包括：使一可檢測標記物與該探針之該標籤偶聯，並透過可檢測標記物活性對鄰近該目標生物分子之鄰域進行可檢測鄰近標定。
如請求項31所述之方法，其中，可檢測鄰近標定包括光選擇性鄰近標定直徑小於300nm、小於200nm、或小於100nm之區域。
如請求項31或32所述之方法，其中，該可檢測標記物包括一催化標記物。
如請求項27-33中任一項所述之方法，其中，該生物樣本包括複數細胞。
如請求項27-33中任一項所述之方法，其中，該生物樣本包括至少一個、至少100個、至少1000個或至少10,00活細胞或固定細胞。
如請求項27-34中任一項所述之方法，其中，該生物樣本包括固定細胞、組織、或細胞或組織萃取物。
如請求項27-36中任一項所述之方法，其中，選擇性照射包括：照射點擴散函數所定義之區域。
如請求項27-37中任一項所述之方法，其中，該生物樣本設置於一顯微鏡載台上，該方法進一步包括自該載台移除乾感興趣區域之至少一部分。
如請求項27-38中任一項所述之方法，進一步包括對樣本進行質譜分析或定序分析。
如請求項27-39中任一項所述之方法，其中，該標籤包括生物素衍生物、CLIP-標籤、鍵擊化學標籤、地高辛、Halo標籤、胜肽標籤或SNAP標籤。
如請求項27-40中任一項所述之方法，其中，該鍵擊化學標籤包括炔基類或疊氮類基團。
如請求項27-41中任一項所述之方法，其中，該可裂解連結子包括偶氮苯衍生物、硼酸酯、Dde衍生物、DNA寡聚體或胜肽。
如請求項27-42中任一項所述之方法，其中，該誘餌分子包括抗體、CLIP標籤、Halo標籤、蛋白A、蛋白G、蛋白L、小分子或SNAP標籤。
如請求項27-43中任一項所述之方法，其中，該光激發探頭包括芳基疊氮化物、二苯酮、或二氮環丙烯。
一種可裂解光反應探針，包括：

一多價核心，包括有複數連接位點；

一標籤，結合至該些連接位點中之一者，其中該標籤建構成得以偶聯至一標記物；

一可裂解連結子，結合至該些連接位點中之一第二者並建構成得以連結至一誘餌分子，其中該可裂解連結子包括一胜肽序列；

一光激發探頭，結合至該些連接位點中之一第三者，

其中該多價核心包括式(II)或(III)之基團：

其中m、r及q各自獨立為1、2、3、4、5或6；

其中*包括該複數連接位點中用於該可裂解連結子之其中一連接位點；其中**包括該複數連接位點中用於該標籤或該光激發探頭之一者的不同連接位點；其中***包括該複數連接位點中用於該光激發探頭或該標籤之不同連接位點；且R⁷、R⁸、R⁹、R¹⁰、R¹¹及R¹²各自獨立為氫、視情況(optionally)取代烷基、視情況取代烯基、視情況取代炔基、視情況取代碳環基、視情況取代雜環基、視情況取代芳基、視情況取代雜芳基、或氮保護基。
如請求項45所述之可裂解光反應探針，其中，**包括用於該標籤之該連接位點，且***包括用於該光激發探頭之該連接位點。
如請求項45或46所述之可裂解光反應探針，其中，該胜肽序列包括蛋白酶辨識序列。
如請求項45-47中任一項所述之可裂解光反應探針，其中，該胜肽序列包括人鼻病毒3C(HRV 3C)蛋白酶辨識序列、菸草蝕紋病毒(TEV)蛋白酶辨識序列、或凝血酶(thrombin)辨識序列。
如請求項45-48中任一項所述之可裂解光反應探針，其中，該可裂解連結子進一步包括一可偶聯胺基酸，其建構成得以偶聯至誘餌分子。
如請求項45-48中任一項所述之可裂解光反應探針，其中，該可裂解連結子進一步包括半胱胺酸或具鍵擊反應性之胺基酸。
如請求項45-50中任一項所述之可裂解光反應探針，其中，該可裂解連結子包括具有疊氮或炔基團之具鍵擊反應性的胺基酸。
一種用於標定生物樣本之套組，包括：

請求項1-26或45-51中任一項所述之可裂解光反應探針於一第一容器中；以及

一指示材料。
一種用於標定生物樣本之套組，包括：

一多價核心基團於一第一容器中，其中該多價核心包括複數連接位點；

一標籤，建構成得以偶聯至一標記物並結合至或建構成得以結合至該多價核心基團；

一可裂解連結子，包括非雙硫鍵之一可裂解連結子鍵結，其中該可裂解連結子連結至或建構成得以連結至一誘餌分子；

一光激發探頭，結合至或建構成得以結合至該多價核心基團上之一第三連接位點；以及

一指示材料。
如請求項53所述之套組，其中，該多價核心、該標籤、該可裂解連結子及該光激發探頭存在於同一分子中。
如請求項53所述之套組，其中，該標籤、該可裂解連結子及該光激發探頭中之至少一者係與該多價核心分開。
如請求項53-55中任一項所述之套組，進一步包括一連結子裂解分子。
如請求項56所述之套組，其中，該連結子裂解分子包括核酸內切酶或位點特異性蛋白酶。
如請求項56所述之套組，其中，該連結子裂解分子包括人鼻病毒3C(HRV 3C)蛋白酶或菸草蝕紋病毒(TEV)蛋白酶。
如請求項56所述之套組，其中，該連結子裂解分子包括X因子腸胜肽酶或凝血酶。
如請求項53-59中任一項所述之套組，進一步包括以下之一或更多者：抗氧化劑、緩衝劑、界面活性劑、核酸酶抑制劑、穩定劑及清洗劑。
如請求項53-60中任一項所述之套組，進一步包括一誘餌分子。
如請求項53-61中任一項所述之套組，進一步包括一可檢測標記物。
如請求項53-62中任一項所述之套組，進一步包括與生物素特異性偶聯之一標記物。
如請求項53-63中任一項所述之套組，進一步包括固定液。