TW202405426A - 光活化抗體共軛體 - Google Patents

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張至為
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Abstract

本發明揭露包括光反應性探針及主要目標探針之套組及使用該套組之方法。該光反應性探針可藉由光輻射在選定之關注區域被活化，且該被活化之光反應性探針容許該主要目標探針在該選定之關注區域與樣品之分子形成共價鍵。該套組及方法可用於分析生物樣品中的生物分子。

Description

光活化抗體共軛體
本發明說明用於鑑定、標籤化及分析生物分子之方法及套組。本發明具體地說明可用於生物分子之子集的光活化及標籤化之光反應性套組。該方法及套組可特別用於分析生物樣品，諸如鑑定在細胞或組織樣品中的鄰近生物分子。 優先權請求
本申請案請求在2022年4月8日以“PHOTOACTIVE ANTIBODY CONJUGATE”為標題申請之美國臨時專利申請案第63/329,219號之優先權，以其完整內容併入本文以供參考。 以參考併入
將本說明書中提及的所有出版物及專利申請案以彼等完整內容併入本文以供參考，其程度如同每個單獨的出版物或專利申請案經具體且單獨地指示予以併入以供參考。
細胞係由不同類型之生物分子 (biomolecules)所組成。在細胞中的生物分子係與亞細胞環境中的相鄰生物分子相互作用以形成複合物、胞器或其他組合且及進行各種基本的細胞功能。使生物分子於其中彼此相互作用及如何使生物分子一起作用的亞細胞環境特徵化非常有挑戰性。生物分子很小且彼等存在於具有數千萬個其他分子的細胞環境中。在相鄰生物分子之間的相互作用通常較弱且用於研究生物分子的許多技術會破壞彼等之相互作用。儘管諸如酵母雙雜交(two-hybridization)檢定及最近的鄰近標記之技術有助於增長我們對細胞環境的瞭解，但是該等技術仍遭受到各種限制，諸如非特異性結合、緩慢的反應時間及破壞天然的細胞環境，導致偽陽性及錯過的相互作用。所需要的是用於確定自然發生的生物分子相互作用的更好工具以解決該等或其他問題。
本發明說明用於鑑定、標籤化及分析生物分子之方法及套組。本發明具體地說明可用於生物分子之子集的光活化及標籤化之光反應性套組。該方法及套組可特別用於分析生物樣品，諸如鑑定在細胞或組織樣品中的鄰近生物分子。該等套組尤其可用於經由通過顯微鏡系統之選擇性光照明以選擇性地標籤化及鄰近標記生物分子。
本發明說明光反應性套組，其包括以式( I)表示之光反應性探針： ( I)，其中C部分為單一化學鍵或連結子；B部分包括1至50個光反應性部分且與C部分結合，其中1至50個光反應性部分之各者係衍生自以式( II)表示之釕基化合物： ( II)
其中在式 (II)中：L 1、L 2、L 3和L 4各自獨立為配位基；且X 1和X 2各自獨立為具有反應性部分之配位基，其中反應性部分經配置與C部分鍵結；G部分包括與C部分結合之誘餌分子，其中誘餌分子為抗體且經配置與樣品中的第一分子共軛。該等及其他實施態樣可包括主要目標探針，其包括與光可激發的目標部分結合之可檢測的標籤部分，其中當光反應性探針以雙光子光源在700 nm至1100 nm之波長範圍下或以單一光源在200 nm至1100 nm之波長範圍下經光活化且主要目標探針藉由經光活化之探針作用以形成經光激發之主要目標探針時，經光激發之主要目標探針經配置與樣品中的標的分子形成共價鍵。
在該等及其他實施態樣中，光反應性套組可包括其中X 1和X 2各自獨立地選自由下列所組成之群組：3-乙炔基吡啶、3-(溴甲基)吡啶、順丁烯二醯亞胺、4'-甲基-4-羧基聯吡啶-N-琥珀醯亞胺酯、菸鹼醛、l-(4-(吡啶-3-基)-lH-1,2,3-三唑-1-基)乙酮、4-戊炔腈和4-胺基丁炔。
在該等及其他實施態樣中，光反應性套組可包括其中L 1與L 2接合以形成第一雙配位基且L 3與L 4接合以形成第二雙配位基，其中第一雙配位基及第二雙配位基係獨立地選自由下列所組成之群組：2,2'-聯吡啶基(bpy)、4,4'-二氰基-5,5'-二甲基-2,2'-聯吡啶(CN-Me-bpy)、4,4'-二甲基-2,2'-聯吡啶(dmb)、4,4'-二-三級丁基-2,2'-聯吡啶(dbpy)、4,4',5,5'-四甲基-2,2'-聯吡啶(tmb)、2-苯基吡啶(ppy)、6-溴-2,2'-聯吡啶、6,6'-二溴-2,2'-聯吡啶、5-溴-2,2'-聯吡啶、6-胺基-2,2'-聯吡啶、6,6'-二胺基-2,2'-聯吡啶、2,2'-聯吡啶-6-甲腈、2,2'-聯吡啶-6,6'-雙(甲腈)、2,2'-聯吡啶-6-羧酸、2,2'-聯吡啶-6,6'-二羧酸和雙喹啉。
在該等及其他實施態樣中，光反應性套組可包括其中式( II)之釕基化合物為下列之一者： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、及彼等之衍生物。
在該等及其他實施態樣中，光反應性套組可包括其中光反應性部分包括下列部分： 、 、 、 、 、 、或彼等之衍生物。
在該等及其他實施態樣中，連結子可包括下列部分： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、或 。
在該等及其他實施態樣中，光反應性套組可包括其中連結子包括胺基酸、(PEG) n、寡核苷酸或肽之至少一者，其中n為1至20的整數。
在該等及其他實施態樣中，光反應性套組可包括其中當光反應性探針以雙光子光源在700 nm至1100 nm之波長範圍下經光活化且主要目標探針藉由經光活化之探針作用以形成經光激發之主要目標探針時，經光激發之主要目標探針經配置與樣品中的標的分子形成共價鍵。在該等及其他實施態樣中，光反應性套組可包括進一步其中當光反應性探針以單一光源在300 nm至800 nm之波長範圍下經光活化且主要目標探針藉由經光活化之探針作用以形成經光激發之主要目標探針時，經光激發之主要目標探針經配置與樣品中的標的分子形成共價鍵。
在該等及其他實施態樣中，光反應性套組可包括其中可檢測的標籤部分為生物素衍生物、長葉毛地黃配質標籤、CLIP-標籤、鹵基標籤、SNAP-標籤、寡核苷酸、肽標籤和點擊化學標籤中至少一者，且點擊化學標籤包含炔類部分或疊氮化物類部分。
在該等及其他實施態樣中，光反應性套組可包括其中光可激發的目標部分為下列中至少一者： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 (R’=CH 2CH 2OMe或Et)、 、 (X=N 2 +或Br)、 、及彼等之衍生物。
在該等及其他實施態樣中，光反應性套組可包括其中主要目標探針為去硫生物素-酚或生物素-酚。
在該等及其他實施態樣中，光反應性套組可包括其中光可激發的目標部分為 。
在該等及其他實施態樣中，光反應性套組可包括其中可檢測的標籤部分為生物素衍生物、點擊化學標籤、CLIP-標籤、長葉毛地黃配質標籤、鹵基標籤、寡核苷酸、肽標籤和SNAP-標籤中至少一者，且光反應性部分包括下式部分： 。
在該等及其他實施態樣中，光反應性套組可包括連接子，其中連接子可與主要目標探針之可檢測的標籤部分共軛。在該等及其他實施態樣中，光反應性套組可包括其中連接子為螢光連接子。在該等及其他實施態樣中，光反應性套組可包括標籤-酵素複合物，其中標籤-酵素複合物可與連接子共軛，且進一步其中標籤-酵素複合物之酵素包括過氧化酶。在該等及其他實施態樣中，光反應性套組可包括連接子，其中連接子可與主要目標探針之可檢測的標籤部分共軛；標籤-酵素複合物，其中標籤-酵素複合物之標籤可與連接子共軛，且進一步其中標籤-酵素複合物之酵素包括過氧化酶；及附加的目標探針，其經配置與標的分子藉由標籤-酵素複合物之過氧化酶的催化活性以形成附加的目標探針共價鍵。在該等及其他實施態樣中，光反應性套組可包括其中附加的目標探針係與主要目標探針相同或不同且包括附加的目標探針標籤部分和附加的目標探針目標部分。在該等及其他實施態樣中，光反應性套組可包括其中連接子為螢光連接子。
在該等及其他實施態樣中，光反應性套組可包括其中光反應性探針的濃度範圍為0.1 ug/mL至100 ug/mL且主要目標探針的濃度範圍為1 uM至20 mM。
本發明亦說明光反應性套組，其包括以式( I)表示之光反應性探針： ( I)，其中C部分為單一化學鍵或連結子；B部分包括與C部分結合之至少一個光反應性部分；且G部分包括與C部分結合之誘餌分子。在該等及其他實施態樣中，光反應性套組可包括主要目標探針，其包括與光可激發的目標部分結合之可檢測的標籤部分，其中光反應性探針之誘餌分子經配置與樣品中的第一分子共軛，且其中當光反應性探針經光活化且主要目標探針藉由經光活化之探針作用以形成經光激發之主要目標探針時，經光激發之主要目標探針經配置與樣品中的標的分子形成共價鍵。
在該等及其他實施態樣中，光反應性套組可包括其中誘餌分子包括下列中至少一者：抗體、抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、鏈黴抗生物素蛋白、另一生物素結合蛋白、CLIP-標籤、鹵基標籤、SNAP-標籤、另一自行標記之蛋白質標籤、DNA或RN螢光原位雜交(FISH)探針、另一RNA分子、另一核酸分子、蛋白質A、蛋白質G、蛋白質L、蛋白質A/G、蛋白質A/G/L、另一免疫球蛋白結合肽、藥物或另一小分子。
在該等及其他實施態樣中，光反應性套組可包括其中光反應性部分為下列中至少一者：核黃素、光黃素、另一黃素衍生物、螢光素或彼等之衍生物、亞甲藍或彼等之衍生物、miniSOG光敏感化蛋白質、殺手紅(Killer Red)光敏感化蛋白質、另一光敏感化蛋白質、喋呤或彼等之衍生物、釕基光觸媒和孟加拉玫紅或彼等之衍生物。
在該等及其他實施態樣中，光反應性套組可包括其中誘餌分子為抗體且複數個光反應性部分係通過C部分與抗體結合，其中複數個範圍為1至50。
在該等及其他實施態樣中，光反應性套組可包括其中光反應性部分經配置以容許主要目標探針與樣品的分子形成共價鍵。
在該等及其他實施態樣中，光反應性套組可包括其中光反應性部分係衍生自以式(II)表示之釕基化合物： ( II) 其中在式 (II)中：L 1、L 2、L 3和L 4各自獨立為配位基；且 X 1和X 2各自獨立為配位基，其中X 1和X 2中至少一者具有連結區域，其中至少一個連結區域係與光反應性探針之C部分結合。
在該等及其他實施態樣中，光反應性套組可包括其中X 1和X 2各自獨立地選自由下列所組成之群組：3-乙炔基吡啶、3-(溴甲基)吡啶、順丁烯二醯亞胺、4'-甲基-4-羧基聯吡啶-N-琥珀醯亞胺酯、菸鹼醛、l-(4-(吡啶-3-基)-lH-1,2,3-三唑-1-基)乙酮、4-戊炔腈和4-胺基丁炔。
在該等及其他實施態樣中，光反應性套組可包括其中L 1與L 2接合以形成第一雙配位基且L 3與L 4接合以形成第二雙配位基，其中第一雙配位基及第二雙配位基係獨立地選自由下列所組成之群組：2,2'-聯吡啶基(bpy)、4,4'-二氰基-5,5'-二甲基-2,2'-聯吡啶(CN-Me-bpy)、4,4'-二甲基-2,2'-聯吡啶(dmb)、4,4'-二-三級丁基-2,2'-聯吡啶(dbpy)、4,4',5,5'-四甲基-2,2'-聯吡啶(tmb)、2-苯基吡啶(ppy)、6-溴-2,2'-聯吡啶、6,6'-二溴-2,2'-聯吡啶、5-溴-2,2'-聯吡啶、6-胺基-2,2'-聯吡啶、6,6'-二胺基-2,2'-聯吡啶、2,2'-聯吡啶-6-甲腈、2,2'-聯吡啶-6,6'-雙(甲腈)、2,2'-聯吡啶-6-羧酸、2,2'-聯吡啶-6,6'-二羧酸和雙喹啉。
在該等及其他實施態樣中，光反應性套組可包括其中式( II)之釕基化合物為下列中任一者： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、及彼等之衍生物。
在該等及其他實施態樣中，光反應性套組可包括其中光反應性部分包括下列部分： 、 、 、 、 、 、或彼等之衍生物。
在該等及其他實施態樣中，光反應性套組可包括其中連結子包括下列部分： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、或 。
在該等及其他實施態樣中，光反應性套組可包括其中連結子包括胺基酸、(PEG) n、寡核苷酸或肽之至少一者，其中n為1至20的整數。
在該等及其他實施態樣中，光反應性套組可包括其中光反應性部分以光源在200 nm至1100 nm之波長範圍下可經活化以容許主要目標探針與樣品中的標的分子形成共價鍵。
在該等及其他實施態樣中，光反應性套組可包括其中光反應性部分以雙光子光源在700 nm至1100 nm之波長範圍下可經活化以容許主要目標探針與樣品中的標的分子形成共價鍵。在該等及其他實施態樣中，光反應性套組可包括其中光反應性部分以光源在300 nm至800 nm之波長範圍下可經活化以容許主要目標探針與樣品中的標的分子形成共價鍵。
在該等及其他實施態樣中，光反應性套組可包括其中光反應性部分以雙光子光源在700 nm至1100 nm之波長範圍下可經活化以容許主要目標探針與樣品中的標的分子形成共價鍵。
在該等及其他實施態樣中，光反應性套組可包括其中可檢測的標籤部分為生物素衍生物、CLIP-標籤、長葉毛地黃配質標籤、鹵基標籤、寡核苷酸、肽標籤、SNAP-標籤和點擊化學標籤中至少一者，且點擊化學標籤包含炔類部分或疊氮化物類部分。
在該等及其他實施態樣中，光反應性套組可包括其中目標部分為下列中一或多者： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 (R’=CH 2CH 2OMe或Et)、 、 (X=N 2 +或Br)、 、及彼等之衍生物。
在該等及其他實施態樣中，光反應性套組可包括其中主要目標探針為去硫生物素-酚或生物素-酚。
在該等及其他實施態樣中，光反應性套組可包括其中光可激發的目標部分為 。
在該等及其他實施態樣中，光反應性套組可包括其中可檢測的標籤部分為生物素衍生物、點擊化學標籤、CLIP-標籤、長葉毛地黃配質標籤、鹵基標籤、寡核苷酸、肽標籤和SNAP-標籤中至少一者，且光反應性部分包括下式部分： 。
在該等及其他實施態樣中，光反應性套組可包括連接子，其中連接子可與主要目標探針之可檢測的標籤部分共軛。在該等及其他實施態樣中，光反應性套組可包括其中連接子為螢光連接子。在該等及其他實施態樣中，光反應性套組可包括標籤-酵素複合物，其中標籤-酵素複合物可與連接子共軛，且進一步其中標籤-酵素複合物之酵素包括過氧化酶。
在該等及其他實施態樣中，光反應性套組可包括連接子，其中連接子可與主要目標探針之可檢測的標籤部分共軛；標籤-酵素複合物，其中標籤-酵素複合物之標籤可與連接子共軛，且進一步其中標籤-酵素複合物之酵素包括過氧化酶；及附加的目標探針，其經配置與標的分子藉由標籤-酵素複合物之過氧化酶的催化活性以形成附加的目標探針共價鍵。
在該等及其他實施態樣中，光反應性套組可包括其中附加的目標探針與主要目標探針不同且包括附加的目標探針標籤部分和附加的目標探針目標部分。在該等及其他實施態樣中，光反應性套組可包括其中連接子為螢光連接子。
在該等及其他實施態樣中，光反應性套組可包括其中光反應性探針的濃度範圍為0.1 ug/mL至100 ug/mL且主要目標探針的濃度範圍為1 uM至20 mM。
本發明亦說明用於光反應性標記之方法。該等及其他方法可包括下列步驟中一或多者：將光反應性套組之複數個光反應性探針遞送至樣品；將光反應性探針的第一部分之誘餌分子與樣品中的複數個第一分子經非共價共軛；將如本文所述之光反應性套組之複數個主要目標探針遞送至樣品；以光輻射選擇性地照光樣品的選定之關注區域，藉以活化複數個光反應性探針的光反應性部分以在選定之區域中形成複數個經光活化之光反應性探針；將主要目標探針之光可激發的目標部分經複數個經光活化之光反應性探針光激發以形成具有經光激發之目標部分的複數個經光激發之主要目標探針；及在複數個經光激發之主要目標探針與在樣品中的選定之關注區域中的複數個標的分子之間形成共價鍵，藉以使複數個主要目標探針與複數個標的分子結合。
在其中光反應性探針的第一部分之誘餌分子與樣品中的複數個第一分子經非共價共軛的步驟留下未經共軛之光反應性探針的第二部分之該等及其他方法中，該方法可另外包括以下步驟：將未經共軛之光反應性探針自樣品移出。
該等及其他方法可另外包括以下步驟中一或多者：將複數個連接子遞送至樣品；及將複數個連接子與複數個主要目標探針之可檢測的標籤部分共軛。
在其中複數個連接子包含螢光連接子之該等及其他方法中，該方法可另外包括以下步驟中一或多者：檢測在樣品中的複數個螢光連接子的位置，且藉以鑑定複數個主要目標探針及與彼等經共價結合之複數個標的分子的位置。
在該等及其他方法中，光激發的步驟可另外包括以下步驟：
光激發主要目標探針以形成複數個經光激發之各具有游離基的主要目標探針，且其中形成共價鍵的步驟包括在複數個經光激發之主要目標探針之各者與在樣品中的選定之關注區域中的複數個標的分子之各者中的胺基酸之間形成共價鍵。
在該等及其他方法中，形成共價鍵的步驟可包括在複數個經光激發之主要目標探針之各者與在樣品中的選定之關注區域中的複數個標的分子之各者中的胺基酸之間形成共價鍵。
在該等及其他方法中，胺基酸可選自由下列所組成之群組：丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺酸、天冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、蛋胺酸、苯基丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸和纈胺酸。
該等及其他方法可另外包括以下步驟中一或多者：將如本文所述之光反應性套組之連接子遞送至樣品，其中連接子可與主要目標探針之可檢測的標籤部分共軛；將如本文所述之光反應性套組之標籤-過氧化酶複合物遞送至樣品，其中標籤-酵素複合物之標籤可與連接子共軛，且進一步其中標籤-酵素複合物之酵素包含過氧化酶；將如本文所述之光反應性套組之附加的目標探針遞送至樣品，其中附加的目標探針經配置與標的分子藉由標籤-酵素複合物之過氧化酶的催化活性以形成附加的目標探針共價鍵；及將標籤-過氧化酶複合物與連接子共軛，其中標籤-過氧化酶催化附加的目標探針以在附加的目標探針與樣品之間形成共價鍵。
在該等及其他方法中，標籤-過氧化酶複合物可活化附加的目標探針以在附加的目標探針之目標部分具有游離基且在附加的目標探針之目標部分與樣品的酪胺酸之間形成共價鍵。
本發明亦說明分析方法，其包括以下步驟中一或多者：將如本文所述之光反應性套組之複數個光反應性探針遞送至樣品；將光反應性探針的第一部分之誘餌分子與樣品中的複數個第一分子經非共價共軛；將如本文所述之光反應性套組之複數個主要目標探針遞送至樣品；及自影像導引系統之成像光源照光樣品；將照光之樣品以相機成像；以相機獲取在第一視野中的樣品之至少一個亞細胞形態影像；處理至少一個影像且基於經處理之影像以測定在樣品中的關注區域；獲得關注區域的坐標訊息；且根據坐標訊息，藉由光輻射選擇性地照光關注區域以活化光反應性部分，其中經活化之光反應性部分容許主要目標探針在關注區域與樣品形成共價鍵。
該等及其他方法可包括照光10 us/像素至200 us/像素、25 us/像素至400 us/像素、50 us/像素至300 us/像素、75 us/像素至200 us/像素或400 us/像素至5000 us/像素的區域。
在該等及其他方法中，選擇性地照光的步驟包括以1 µW至300 mW之功率強度照光。在該等及其他方法中，選擇性地照光的步驟包括照光藉由點展開函數限定的區段。
該等及其他方法可另外包括以下步驟：將連接子與主要目標探針共軛及藉由可檢測的標記活性可檢測地鄰近標記與標的分子鄰近的相鄰分子。
在該等及其他方法中，可檢測地鄰近標記的步驟可包括鄰近標記直徑少於5 um、少於2 um、少於1 um、少於500 nm、少於300 nm、少於200 nm、少於100 nm、少於50 nm或少於20 nm的區域。
在該等及其他方法中，連接子可包括催化標記。
在該等及其他方法中，樣品可包括至少1、至少100、至少1000或至少10,000個活或固定細胞。在該等及其他方法中，樣品可包括固定細胞、固定組織、細胞萃取物或組織萃取物。
該等及其他方法可包括使經選擇性地照光之樣品經質譜分析或測序分析的步驟。
在該等及其他方法中，經活化之光活化部分可活化主要目標探針，藉以具有游離基且在選定之關注區域與樣品之胺基酸形成共價鍵。
本發明亦說明用於處理樣品以預測生物標誌之質譜實施方法。本發明說明可包括以下步驟中一或多者之方法：將樣品分成光標記樣品組和非標記樣品組；將如本文所述之光反應探針及主要目標探針遞送至光標記樣品組和非標記樣品組；選擇性地照光光標記樣品組的選定之關注區域且保持非標記樣品組在暗處，其中照光步驟容許主要目標探針與樣品形成共價鍵；通過在主要目標探針與複數個親和性磁珠之間的親和性沈澱以自光標記樣品組和非標記樣品組萃取複數個經探針結合之蛋白質；使經萃取之蛋白質進行質譜分析；根據個別蛋白質之肽片段的強度值計算在光標記樣品組與非標記樣品組之間的經鑑定之蛋白質列表中的個別蛋白質之相對量化值；測定在光標記樣品組與非標記樣品組之間的相對量化值之閾值；及在測定閾值後，預測對應於超過閾值之個別蛋白質的相對量化值之至少一種生物標誌。
該等及其他方法可另外包括將誘餌分子與樣品中的標的分子非共價共軛的步驟。
在該等及其他方法中，選擇性地照光選定之關注區域的步驟可另外包括活化在選定之區域中的光反應性部分的步驟，藉以容許經活化之光反應性部分容許主要目標探針在選定之關注區域與樣品形成共價鍵。
該等及其他方法可另外包括將光反應性探針之誘餌分子遞送至樣品的步驟。
該等及其他方法可另外包括自樣品移出未經共軛之光反應性探針的步驟，藉以容許光反應性探針引導在選定之關注區域的選擇性地照光。
該等及其他方法可另外包括將如本文所述之光反應性套組之連接子遞送至樣品及將連接子通過在連接子與主要目標探針之間的親和性與主要目標探針共軛的步驟。
在該等及其他方法中，連接子為用於鑑定與主要目標探針經共價結合之樣品的位置之螢光連接子。
在該等及其他方法中，經活化之光反應性部分可活化主要目標探針，藉以具有游離基且在選定之關注區域與樣品之胺基酸形成共價鍵。
在該等及其他方法中，胺基酸可選自由下列所組成之群組：丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺酸、天冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、蛋胺酸、苯基丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸和纈胺酸。
該等及其他方法可另外包括將如本文所述之光反應性套組之標籤-過氧化酶遞送至樣品及將標籤-過氧化酶與連接子共軛的步驟，藉以容許標籤-過氧化酶催化附加的目標探針以在附加的目標探針與樣品之間形成共價鍵。
在該等及其他方法中，標籤-過氧化酶可活化附加的目標探針以在附加的目標探針之目標部分具有游離基且在附加的目標探針之目標部分與樣品的酪胺酸之間形成共價鍵。
本發明亦說明用於處理經光標記之樣品以鑑定生物標誌列表之質譜實施方法。本發明說明包括以下步驟中一或多者之方法：獲得樣品；將如本文所述之光反應性套組遞送至樣品；選擇性地照光生物樣品的選定之關注區域，藉以容許主要目標探針標記在選定之關注區域的樣品之蛋白質；通過在主要目標探針與複數個親和性磁珠之間的親和性沈澱以自樣品萃取複數個經探針標記之蛋白質；使經萃取之蛋白質進行質譜分析；及鑑定樣品的經萃取之蛋白質。
該等及其他方法可另外包括計算樣品的經鑑定之蛋白質列表的各蛋白質之肽片段的強度值的步驟。
該等及其他方法可另外包括將經鑑定之蛋白質列表根據各蛋白質的強度值排序的步驟。
該等及其他方法可另外包括將誘餌分子與樣品中的標的分子非共價共軛的步驟。
在該等及其他方法中，選擇性地照光選定之關注區域的步驟可另外包括活化在選定之區域中的光反應性部分的步驟，藉以容許經活化之光反應性部分容許主要目標探針在選定之關注區域與樣品形成共價鍵。
該等及其他方法可另外包括將光反應性探針之誘餌分子遞送至樣品的步驟。
該等及其他方法可另外包括自樣品移除未經共軛之光反應性探針的步驟，藉以容許光反應性探針引導在選定之關注區域的選擇性地照光。
該等及其他方法可另外包括將如本文所述之光反應性套組之連接子遞送至樣品及將連接子通過在連接子與主要目標探針之間的親和性與主要目標探針共軛的步驟。
在該等及其他方法中，連接子可為經配置用於鑑定與主要目標探針經共價結合之樣品的位置之螢光連接子。
在該等及其他方法中，經活化之光反應性部分可活化主要目標探針，藉以具有游離基且在選定之關注區域與樣品之胺基酸形成共價鍵。在該等及其他方法中，胺基酸可選自由下列所組成之群組：丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺酸、天冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、蛋胺酸、苯基丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸和纈胺酸。
該等及其他方法可另外包括將如本文所述之光反應性套組之標籤-過氧化酶遞送至樣品及將標籤-過氧化酶與連接子共軛的步驟，藉以容許標籤-過氧化酶催化附加的目標探針以在附加的目標探針與樣品之間形成共價鍵。
在該等及其他方法中，標籤-過氧化酶可活化附加的目標探針以在附加的目標探針之目標部分具有游離基且在附加的目標探針之目標部分與樣品的酪胺酸之間形成共價鍵。
詳細說明
本發明說明用於鑑定、標籤化、獲得及分析生物分子及彼等之相鄰生物分子之系統、套組及方法。套組及方法可特別用於分析生物樣品中的生物分子相互作用，諸如分析細胞或組織樣品中的蛋白質、核酸、碳水化合物或脂質。套組及方法可有利地用於鑑定及/或單離先前未知的生物標誌(例如鄰近或相鄰分子)，諸如使用蛋白質測序及/或質譜分析。套組及方法利用可標記生物分子及彼等之相鄰生物分子之光反應性材料。本文所述之光反應性套組可特別用於特異性標記細胞之亞細胞區域中的生物分子子集，該標記係使用具有精準照光控制之影像導引顯微鏡，諸如在美國專利公開案第2018/0367717號所述之系統，藉以能夠自動標記關注的細胞生物分子。套組可用於生物分子(諸如在細胞或組織內部的蛋白質)之原位標籤化，且隨後可鄰近標記，諸如使用酪醯胺訊號增幅(Tyramide Signal Amplification)(TSA)。生物分子可藉由分析技術進一步分析，諸如質譜法及測序。該等套組尤其可用於執行體學(omics)研究，諸如基因體學(genomics)、蛋白質體學(proteomics)和轉錄體學(transcriptomics)，且可用於尋找用以診斷及治療之相關生物標誌。
縮寫及定義：
術語「胺基酸」係指天然存在及合成的胺基酸，以及以類似於天然存在的胺基酸的方式作用之胺基酸類似物和胺基酸模擬物。天然存在的胺基酸為以基因密碼所編碼之胺基酸，以及隨後經修飾之胺基酸，例如羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸和O-磷絲胺酸。「胺基酸類似物」係指具有與天然存在的胺基酸相同的基本化學結構之化合物，亦即α碳與氫、羧基、胺基及R基團結合，例如高絲胺酸、正白胺酸、甲硫胺酸硫氧化物(methionine sulfoxide)、甲硫胺酸甲基硫(methionine methyl sulfonium)。本文所述之胺基酸可經保守取代，只要經保守取代之肽能具有所欲功能(諸如可被蛋白酶辨識)。保守取代的實例包括用於Ser之Thr、Gly或Asn，及用於Arg之His、Lys、Glu或Gln。保守取代說明於例如Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Fourth Edition, Green and Sambrook, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 2014，以及其訂正版和更新版中。
術語「抗體」係指免疫球蛋白及相關分子，且包括單株抗體、多株抗體、單體、二聚物、多聚物、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、僅重鏈抗體、三鏈抗體、單鏈Fv、奈米抗體。抗體可為多株或單株或重組抗體。抗體可為鼠類、人類、驢、山羊、人源化、嵌合或源生自其他物種之抗體。如本文所使用，當抗體或其他實體「特異性辨識」或「特異性結合」抗原或表位時，其優先辨識在蛋白質及/或大分子之複合混合物中的抗原且以實質上比未展示抗原或表位之其他實體更高的親和性結合抗原或表位。初級抗體結合特異性抗原。二級(三級等)抗體經常通過在其他抗體上的Fc結構域與另一抗體及通常與抗體類別或子類別特異性結合。
術語「抗原結合片段」係指與抗原或表位結合之抗體片段。
術語「誘餌分子」係指與可稱為標的(或獵物(prey))之關注分子特異性相互作用之分子。誘餌分子的實例包括抗體、CLIP-標籤、藥物、核酸、螢光原位雜交(FISH)探針、蛋白質A、蛋白質G、蛋白質L、蛋白質A/G、蛋白質A/G/L、另一小分子和SNAP-標籤。
術語「結合」係指第一部分與第二部分之物理性相互作用，其中第一部分與第二部分彼此以物理性接觸。
術語「生物素衍生物」係指生物素部分，包括生物素和生物素之變異體，諸如具有開環或取代之生物素。生物素衍生物通常可容易地經生物素結合實體或蛋白質(諸如抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白)檢測。
術語「生物素結合蛋白」係指以高親和性特異性結合生物素之蛋白質。生物素檢測試劑的實例為每一生物素結合蛋白分子可分別結合四種生物素之結構類似物抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白。
術語「經催化之報導子沈積」(CARD)係指可檢測的分子經酵素催化沈積在標的生物分子(例如碳水化合物、脂質、核酸或蛋白質)上或附近。在一些實施態樣中，在經酵素催化沈積中的酵素為辣根過氧化酶(HRP)及可檢測的分子為酪醯胺或地高辛(digoxygenin)(DIG)。
術語「點擊化學」係指容易地接合分子構建單元之化學方法。點擊化學反應通常為有效的、高產率、可靠的、很少或不產生副產物及與水性環境可相容或無需添加溶劑。點擊化學的實例為環加成反應(諸如導致1,2,3-三唑形成之炔烴與疊氮化物的經銅(I)催化之[3+2]-休斯根(Huisgen) 1,3-偶極環加成反應)或狄耳士-阿爾德反應。點擊化學亦包括無銅反應，諸如使用經取代之環辛炔的變型(參見例如J. M. Baskin等人之Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2007 Oct. 23, 104 (43), 16793-16797.)。點擊化學的其他實例為親核性取代；C-C多鍵之加成反應(例如麥可(Michael)加成反應、環氧化反應、二羥基化反應、氮丙環化反應(aziridination))；及非醛醇樣化學(nonaldol like chemistry)(例如N-羥基琥珀醯亞胺活性酯偶合)。點擊化學反應可為生物正交反應，但非必要。
術語「共軛」係指使二或更多個分子特異性地相互作用之方法。在一些實施態樣中，使標籤與標記共軛。在一些實施態樣中，使誘餌與生物分子共軛。
術語「可共軛」係指可與其共軛的另一分子可特異性地在一起之分子。在一些實施態樣中，誘餌可與關注的生物分子共軛。在一些實施態樣中，連接子可與主要目標探針共軛。
術語「可檢測的標記」係指欲或經配置與分子直接或間接共軛之化合物或組成物。標記本身可為可檢測的且為直接可檢測的標記(諸如螢光標記，諸如螢光化學加成物、放射性同位素標記等)，或標記可為間接可檢測的(諸如在可酵素檢測的標記之例子中，酵素可催化受質化合物或組成物之化學變化且反應產物為可檢測的)。可檢測的標記的實例包括例如生物素標記、螢光標記、辣根過氧化酶、免疫學可檢測的標記(例如血球凝集素(HA)標籤、聚組胺酸標籤)、另一發光標記和放射性標記。間接標記的實例為生物素，其可使用鏈黴抗生物素蛋白檢測方法檢測。
術語「免疫球蛋白結合肽」係指能夠以高親和性與免疫球蛋白分子(抗體)之除了互補決定區域(CDR)/片段抗原結合(Fab)區域以外的區域特異性結合之肽。免疫球蛋白結合肽不為與其他抗體結合之抗體(例如不為二級抗體)。免疫球蛋白結合肽通常與免疫球蛋白(抗體)的Fc (片段、可結晶)區域結合。免疫球蛋白結合肽通常為免疫球蛋白結合細菌蛋白質的免疫球蛋白結合蛋白、其模擬物和其變異體，包括重組變異體。非抗體免疫球蛋白結合蛋白的實例包括蛋白質A、蛋白質G、蛋白質L、蛋白質Z、 蛋白質A/G和蛋白質A/G/L。蛋白質A和蛋白質G為最初分別自金黃色葡萄球菌及G族鏈球菌獲得的細菌蛋白質，且對IgG型抗體的Fc區域具有高親和性。蛋白質A/G係與蛋白質A和蛋白質G之結合結構域組合。蛋白質A/G/L係與蛋白質A、蛋白質G和蛋白質L之結合結構域組合。蛋白質A、蛋白質G、蛋白質L、蛋白質Z、蛋白質A/G及蛋白質A/G/L共享結構相似性。
術語「用法說明資料」包括可用於傳達本發明之一或多種組成物用於其指定用途的發佈、記錄、圖表、網站連結或任何其他媒體發布。本發明之套組的用法說明資料可例如貼在容納組成物或組分的容器上，或與容納組成物或組分的容器一起運輸。另一選擇地，用法說明資料可與容器分開運輸，意欲使用法說明資料及組成物或組分由接受者配合使用。
術語「標記」係指產生或可經誘導產生可檢測的訊號之分子。在一些實施態樣中，標記產生用於檢測相鄰生物分子的訊號。可使用之標記的實例包括抗生物素蛋白標記、中性抗生物素蛋白標記或鏈黴抗生物素蛋白標記以檢測生物素標籤。
術語「連結子」係指連接二或更多個次結構之結構。連結子具有在次結構之間延伸的至少一個不間斷的原子鏈。連結子的原子係藉由化學鍵(通常為共價鍵)連接。
詞組「結合至」、「偶合至」、「共軛至」、「可共軛至」、「附接至」及「連結至」係指直接或間接結合/共軛/附接/連結。例如，誘餌分子可直接結合至光反應性部分，在其間無需中介原子、基團或部分；另一選擇地，其可藉由一或多個在其間的中介原子、基團、部分或連結子以間接結合至光反應性部分。中介原子、基團、部分或連結子可包括例如一或多個非碳原子、基團或部分，或未經取代或經取代之伸烷基或烯烴基，其可包括胺、醯胺、醚、酯或硫酯鍵聯，且視需要地經一或多個雜原子及/或環中斷，包括視需要地經取代之芳族環。
術語「質譜儀」係指用於測量樣品中的一或多個分子之質荷比的儀器。質譜儀通常包括離子源及質量分析儀。質譜儀的實例包括基質輔助雷射脫附游離(MALDI)、連續或脈衝式電灑(ES)離子化法、離子噴霧、扇形磁場(magnetic sector)、熱噴霧、飛行時間和大簇碰撞(massive cluster impact)質譜法。
術語「質譜法」係指使用質譜儀檢測氣相離子。
術語「質譜分析」包括線性飛行時間(TOF)、反射式飛行時間、單段四極柱、多段四極柱、單一扇形磁場、多扇形磁場、傅立葉轉換、離子迴旋共振(ICR)或離子阱。
術語「經光活化(photoactivated或light activated)」係指藉助於輻射能(例如藉由光、UV光等的特定波長或波長範圍)激發原子。在一些實例中，經光活化之觸媒促進在攜標籤之酚與胺基酸之間的共價鍵形成。
術語「肽」係指其中單體為胺基酸且單體係通過醯胺鍵接合在一起之聚合物。肽通常為至少2、至少5、至少10、至少20、至少50、至少100或至少500或更多個胺基酸長度。
術語「光反應性部分」係指在暴露於光(例如光、UV光等的特定波長或波長範圍)後經活化之功能性部分。在一些實例中，光反應性部分可促進在目標探針與胺基酸或生物分子之間的共價鍵形成。
術語「鄰近分子」或相鄰分子係指在另一分子(通常為關注分子)附近之分子。鄰近分子或相鄰分子可結合至關注分子(例如經共價或非共價)或可靠近而不結合至關注分子。
術語「獵物」係指誘餌分子之結合配體。例如，若抗體為誘餌，則與抗體結合之對應蛋白質為對應獵物。在一些實施態樣中，誘餌可與單一獵物結合。在一些實施態樣中，誘餌可與一個以上的獵物結合。
術語「蛋白質標籤」係指胺基酸之肽序列。蛋白質標籤通常可與標記共軛。蛋白質標籤的實例為「自行標記(self-labeling)」標籤。自行標記標籤的實例包括BL-標籤、CLIP-標籤、共價TMP標籤、鹵基標籤和SNAP-標籤。SNAP-標籤為DNA修復蛋白質O6-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉移酶之~20 kDa變異體，其特異性地辨識苯甲基鳥嘌呤(BG)衍生物且與其快速反應。在標記反應期間，苯甲基部分經共價附接至SNAP-標籤，釋出鳥嘌呤。CLIP-標籤為SNAP-標籤之變異體，其經配置與O2-苯甲基胞嘧啶(BC)衍生物而非苯甲基鳥嘌呤(BG)特異性地反應。
術語「二級抗體」係指特異性地辨識另一抗體區域之抗體。二級抗體通常辨識特定的同型抗體之Fc區域。二級抗體亦可辨識來自一或多種特定物種之Fc。
術語「小分子」係指低分子量分子，其包括碳水化合物、藥物、酵素抑制劑、脂質、代謝物、單醣、天然產物、核酸、肽、擬肽物、第二信使、有機小分子和異源物。小分子通常具有少於(約) 1000之分子量或少於約500之分子量。小分子可為藥物分子。可於本文使用之藥物分子為最初意欲用於診斷、治癒、減輕、治療或預防措施之分子。
術語「標籤」係指能使標的分子或其他分子檢測之官能基、化合物、分子、取代基或類似者。標籤能使可檢測的生物學或生理化學訊號容許經由任何方式檢測，例如吸光度、化學發光、比色法、螢光、發光、磁共振、磷光和放射性。由於標籤所提供之可檢測的訊號可由於標籤部分(例如發光團標籤)的生物化學或生理化學性質而直接可檢測或由於標籤與另一化合物或劑相互作用而間接可檢測。標籤通常為小的官能基或小的有機化合物，諸如生物素、去硫生物素等。在一些實施態樣中，所使用之標籤具有小於約1,000 Da、750 Da、500 Da或甚至更小的分子量。
術語「標籤化」係指添加標籤至官能基、化合物、分子、取代基或類似者之方法。標籤化通常能使標的分子檢測。
術語「酪醯胺訊號增幅(TSA)」係指經催化之報導子沈積(CARD)，一種經酵素調介之檢測方法，其利用酵素(例如辣根過氧化酶)之催化活性以催化非活性酪醯胺成為高活性酪醯胺。增幅可在低濃度的過氧化氫(H2O2)存在下發生。在一些實例中，酪醯胺可經可檢測的標記，諸如螢光素(例如生物素或2,4-二硝基酚(DNP))標記。
除非另有其他指示，否則本文所述之技術的實施可使用本領域之文獻中所解釋的化學、生物化學、細胞生物學、免疫學、分子生物學(包括細胞培養、重組技術、測序技術)及有機化學技術之習知技術及說明(例如Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Fourth Edition, Green and Sambrook, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 2014，以及其訂正版和更新版；John D. Roberts and Marjorie C. Caserio(1977)Basic Principles of Organic Chemistry, second edition. W. A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA.)。
套組
本發明說明可用於實施本文所述之方法的套組，例如用於分析、標籤化、標記生物分子、鑑定及/或單離一或多種生物標誌(例如鄰近或相鄰分子)、預測生物標誌和鑑定生物標誌列表。套組可包括光反應性探針及/或目標探針。套組可包括附加組分以助於經設計之套組的特定應用。因此，例如套組可另外含有可用於檢測樣品及/或檢測標記的材料(例如用於酵素標記的酵素受質、用於檢測螢光標記的濾光組、酵素或相關檢測試劑，包括用於執行經催化之報導子沈積(CARD)或訊號增幅之試劑(例如生物素結合蛋白(諸如抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、鏈黴抗生物素蛋白)、HRP、酪醯胺、過氧化氫等)。套組亦可包括用於一或多個步驟(例如在樣品固定後)的清洗溶液，諸如阻斷劑、清潔劑、鹽(例如氯化鈉、氯化鉀、磷酸鹽緩衝鹽水(PBS))。套組可包括清洗溶液的變型(諸如經配置在使用前稀釋的清洗緩衝液濃縮物或用於製造一或多種清洗溶液的組分)及常規用於實施特定方法的其他試劑。套組可包括固定劑及其他樣品製備材料(例如乙醇、甲醇、福馬林、石蠟等)。
套組可包括用法說明資料，其揭示用於產生或修飾一或多種探針之方法，諸如用於將誘餌分子附接至光反應性部分以製備光反應性探針、將光反應性探針施加至樣品、將光反應性探針之誘餌分子與獵物分子(在樣品中)共軛、將未經共軛之光反應性探針自樣品移出(洗出)、將攜標籤之目標探針(在本文亦稱為主要目標探針)施加至樣品、將光反應性探針光活化以容許攜標籤之目標探針與關注分子結合、將未結合之目標探針移出(洗出)及將標記施加至樣品之方法。套組亦可或替代地包括教導光反應性探針、目標探針、標記及清洗溶液及類似者使用之用法說明資料。
本文所述之光反應性套組可有利地與顯微鏡系統一起使用，諸如本文及美國專利公開案第2018/0367717 A1中所述之系統，能夠自動化標記與關注的生物分子鄰近的細胞生物分子。經標記之分子可直接鄰近關注的生物分子或可靠近但不直接鄰近，諸如當中介分子存在於關注的生物分子與細胞生物分子之間時用於捕獲或分析。靠近但不鄰近關注分子之分子可為細胞結構的一部分或促成關注的細胞微環境。圖1顯示可用於生物分子之光選擇性空間標籤化及標記的示意圖。圖1的下部顯示基板106(諸如顯微鏡載台)及佈置在基板106上的單層複數個細胞108。在一些實施態樣中，整個基板或一部分基板的表面可使用自動化顯微鏡系統分析以鑑定關注區域。例如，可將樣品染色或標記以鑑定關注區域。圖1之上部顯示複數個細胞108之一的細胞108a的放大圖。細胞108a具有細胞核116及複數個不同類型的胞器112，諸如細胞膜、粒線體、核糖體和液泡。顯微鏡系統102選擇性地以窄帶光104照在關注區域(ROI) 118上以分析關注區域 118。可在選擇的區域中照光，且不照光其他(及較大)區域114的細胞及基板。如以下更詳細的解釋，窄帶光104活化光反應性探針以容許目標探針僅在關注區域118與生物樣品鍵結。
光反應性探針可以式(I)表示： (I) ( I)
其中C部分包括化學鍵或連結子，B部分包括與C部分結合之光反應性部分；且G部分包括與C部分結合且經配置與生物樣品共軛之誘餌分子。
在一些特定的實例中，光反應性探針可具有式(IA)： ( IA)
其中光反應性探針之連結子C包括在連結子的鄰近區域之K 1部分及在連結子的末端區域之K 2部分，其中光反應性部分B係與連結子(K 1)的鄰近區域結合及誘餌分子G係與連結子(K 2)的末端區域結合。
圖2A經圖例證具有與光反應性部分253共軛之誘餌分子251的光反應性探針205。圖2B經圖例證具有標籤部分261及目標部分263之目標探針206(在本文有時亦稱為主要目標探針)。圖2C顯示具有去硫生物素標籤及酚目標部分之目標探針。儘管圖2A和2C(一起)分別顯示誘餌分子251、標籤部分261及作為抗體(諸如二級抗體)的目標部分263(去硫生物素和酚)，但是可使用如本文所述之任何誘餌分子、標籤部分及目標部分。圖2D經圖例證具有生物素標籤226及經活化之酚基團243’之目標探針236。圖2D例證在光反應性探針(探針205)之光照明後的目標探針，其進而活化目標探針的酚基團，諸如在圖2C中所示之酚基團，藉以容許經活化之目標探針具有游離基(例如反應性基團)之酚基團。游離基尤其可用於與附近的蛋白質共軛。生物素標籤226(或另一標籤)稍後可用於單離或富集與其附接之標籤化相鄰蛋白質。例如，當標籤226為生物素時，相鄰蛋白質可藉由使用生物素-抗生物素蛋白親和性技術(生物素-生物素結合蛋白親和性技術)單離或富集。
圖2E例證釕光反應性探針與具有去硫生物素標籤及酚目標部分之目標探針的相互作用以實現相鄰蛋白質之標記。在進入如圖2G中所示之光反應性部分253’/虛線圓圈228的反應範圍後，苯變成酪胺醯基，其與附近的蛋白質之胺基酸酪胺酸殘基特異性反應且共軛。
圖2F至2G經圖例證在標的區域228中的生物分子鄰近標籤化的步驟。如圖2F可看出，在光反應性探針205遞送至樣品(諸如細胞或胞器樣品)及容許檢測且結合至樣品中的標的生物分子301，諸如初級抗體或碳水化合物、脂質、核酸或蛋白質(例如通過經結合之光反應探針205a)後，將目標探針206添加至樣品中。圖2G例證光反應性探針205之光激發以形成具有經光激發之光反應性部分253的經光激發之光反應性探針205’。經光激發之光反應性探針205’係與標的生物分子301共軛，且在與標的生物分子301共軛之光反應性探針205的光激發之後容許(箭頭254)目標探針206結合至相鄰分子。(圖2G顯示與分子(諸如相鄰分子261)結合之目標探針206的標籤部分261，且為了清楚起見，探針206的其餘部分(包括目標部分263)未顯示但存在)。儘管此實例顯示辨識及附接至關注的目標生物分子301之初級抗體216，但是具有其他誘餌分子251之其他光反應性探針205可檢測及結合至如本文所述之任何標的。目標探針206含有可使用本文所述之方法檢測之標籤部分261。例如，若標籤部分261為生物素衍生物(包括生物素)，則其可使用至少一種生物素結合蛋白(抗生物素蛋白、鏈黴抗生物素蛋白及/或中性抗生物素蛋白)檢測方法檢測。在一些實例中，此經光輔助之酵素標記方法可藉助於選擇性光催化探針(探針205)有利地顯著降低背景雜訊、以更高的分辨率及更精細的細節標記細胞質胞器且不以酪醯胺訊號增幅達成亞細胞蛋白質體。
圖2H顯示標記系統207的實例，該標記系統可與圖2B中所示之目標探針206一起使用以標記與關注的標的生物分子相鄰的生物分子。標記系統207包括具有連接子272之標記複合物271及酵素或觸媒274及附加的目標探針278。圖2H亦顯示螢光連接子部分284。當目標探針206之標籤部分261與連接子具有高親和性時，螢光連接子部分284可用於鑑定以目標探針206標記之區域。儘管此實例顯示螢光連接子部分284，但是可使用具有或不具有發光團之連接子。在一些實施態樣中，連接子272可為生物素結合蛋白-染料共軛體(抗生物素蛋白-染料共軛體、鏈黴抗生物素蛋白-染料共軛體、中性抗生物素蛋白-染料共軛體)或類似者，及酵素或觸媒274可為標籤-過氧化酶且利用過氧化物(未顯示)以求活性。圖2H亦顯示標籤282(諸如生物素)且可用於使酵素或觸媒274與連接子272(例如生物素結合蛋白，諸如抗生物素蛋白)共軛。在標籤(生物素)282-酵素274複合物與連接子272共軛後，其進而在以目標探針206標記之蛋白質上共軛，酵素或觸媒274可用於催化鄰近反應，其容許附加的目標探針活化，藉以標記在生物素282-酵素274複合物附近的蛋白質。在此例子中，目標探針206及附加的目標探針278可能為相同或不同的分子。
圖2H顯示連接子272及標籤部分261(圖2B)互相辨識且一起共軛。酵素或觸媒274可活化附加的目標探針278，且一旦活化，則經活化之目標探針278(例如酪醯胺探針)可結合且可檢測地標記在其附近的生物分子。附加的目標探針278可包括標籤部分及目標部分，且與目標探針206可相同或不同。本文所述之用於主要目標探針206的任何標籤部分及/或目標部分亦可用於附加的目標探針278中。
圖2I顯示比較直接的光化學標記(上圖，經標記為方法II)與使用本文所述之光反應性套組及系統的經光輔助之酵素標記(下圖，經標記為方法III)，在具有生物分子(I)的試樣上標記在小的關注區域(ROI)中的生物分子。在執行方法II或方法III前，分析含有關注的生物分子210(本文使用以實例方式說明的蛋白質，但是亦可能替代地分析其他的生物分子)的樣品(例如細胞或組織樣品)且鑑定關注區域。樣品可經預處理，諸如固定及染色。例如，可將樣品固定且以細胞染色劑(例如蘇木精與伊紅(H&E)；曼森氏三色染色(Masson’s trichrome stain))染色，以辨識關注蛋白質的經免疫螢光標記之抗體或藉由其他方法鑑定。一旦鑑定出關注區域，則可使用本文所述之方法及系統分析在關注區域內的相鄰生物分子之複合物。如圖2I之方法II中所例證，可將樣品以直接光反應性探針212處理，且導向樣品之關注區域的光(亦稱為圖案化光)可活化直接光反應性探針212以形成經活化之直接光反應性探針212'。經活化之直接光反應探針212'能夠與緊鄰的其他分子形成複合物(以方法II中的虛線圓圈顯示)。經活化之直接光反應性探針212’可擴散且標記在關注分子210附近的相鄰分子211。然而，直接光反應性探針之光活化的標記直徑(300至600 nm)在空間上受到所使用之光源的繞射極限的限制。另外，因為直接光反應探針可自由擴散，所以可標記在直接光反應性探針之路徑(例如在圖案化光之路徑)的任何蛋白質。方法II亦顯示其標記更遠的生物分子231。藉由經活化之直接光反應性探針212’標記之區域或經標記之精確度涵蓋約300至600 nm之區域。此區域可包括不緊鄰關注的蛋白質之生物分子，且在一些例子中可能導致混淆、誤導或無益的結果。
相比之下，在以圖2I的下部所示之方法III中，將光反應性部分253與誘餌分子251預共軛以形成光反應性探針205 (參見圖2A)。光反應性部分253可與誘餌分子251預共軛，諸如通過與或不與連結子之共價鍵，諸如圖4中所示之連結子。如圖2I之方法III中所例證，將光反應性探針205遞送至基板209上的樣品(試樣)且誘餌分子251 (作為光反應性探針205的一部分)辨識關注的對應生物分子(例如標的或獵物)。如圖2I之步驟(i)中所例證，圖案化光亦導向在選定之位置(關注區域)中的樣品。然而，圖案化光在此活化此刻附接至關注的生物分子(例如標的或獵物)之光反應性探針205’的光反應性部分253，且經活化之光反應性探針205’可促進主要目標探針206之目標部分263與附近樣品中的分子或部分形成共價鍵。除了僅導向有限的光活化區域之圖案化光以外，可輕易地接近的目標探針206僅在有限的觸媒半徑內(例如在光反應性部分的反應範圍內，諸如以標的區域228所示)經活化且具有足夠的反應性，使其在活化後不可能經歷長程擴散且因此使主要目標探針206變成與相鄰分子211和214共價結合。步驟(i)亦顯示如何使用本文所述之探針及方法可減少背景或不需要的標記。在步驟(i)中，將光反應性探針205a附接至生物分子；然而，因為光反應性探針205係在光傳輸區域(圖案化光區域)外部，所以光反應性探針205a未經活化，且目標探針206及在光傳輸區域外部的分子不鍵結。
將未經結合之目標探針以清洗溶液洗出。在圖2I的步驟(ii)和(iii)顯示使用圖2H中所示之標記系統207標記在關注分子210附近的分子。亦可使用其他標記系統。以實例方式說明，標記系統271之連接子272係與經標記之生物分子(211)的206之標籤部分261共軛，酵素或觸媒274活化附加的目標探針278以形成經活化之目標探針278’。經活化之附加的目標探針278’結合至相鄰分子211 (參見圖2I之附加的目標探針278”)。因為光反應性探針205’係附接至關注分子210且目標探針206及附加的目標探針278在反應前未擴散至非常遠，所以標記相鄰分子214，而未標記更遠的分子231。
藉由使用剛說明之標籤化及標記在關注分子的附近經光選擇性地定域化酵素或觸媒274 (例如作為標記系統207的一部分)(諸如過氧化酶)且標記在關注區域的相鄰分子214，使圖2I中所述之271的催化反應可定域化在小至＜100 nm之區域。在一些變型中，可能標記較大區域(例如至多約200 nm、至多約300 nm、至多約400 nm、至多約500 nm、至多約1 μm、至多約2 μm、至多約5 μm)。此外，在樣品中的一些關注分子可具有多個小的定域化區域且因此光反應性探針可在不同的位置同時與含有相同的關注分子之不同的分子複合物相互作用。光標記可連續地使用在至少一個以上的位置。例如，在如圖2I之方法III中所示之施加光後，可將光選擇性地施加至樣品的第二(第三、第四等)位置且此方法可根據需求重複許多次。除了標記(沈積標記至)樣品的非常小區域中相對少量的相鄰分子以外，諸如由於使用顯微鏡分析以導向光及本文所述且如下文所解釋的探針，使該方法亦可以足夠溫和或和緩的處理來執行，使得細胞構造在使用本文之方法的期間保持完整，有利地容許檢測天然存在的生物分子相互作用。
可在本文使用之誘餌分子的非限制性實例可包括下列中一或多者：抗體、CLIP-標籤、鹵基標籤、SNAP-標籤、功能性蛋白質(例如蛋白質A、蛋白質G、蛋白質L、蛋白質A/G、蛋白質A/G/L或蛋白質藥物)、免疫球蛋白結合肽、生物素結合蛋白(包括抗生物素蛋白、鏈黴抗生物素蛋白及/或中性抗生物素蛋白)、RNA分子、小分子(例如厄洛替尼(erlotinib))、核酸分子、螢光原位雜交(FISH)探針、片段抗原結合區域、奈米抗體、生物藥物及類似者。可用作為誘餌之生物藥物的實例包括阿巴西普(abatacept)(Orencia)；阿昔單抗(abciximab)(ReoPro)；A型肉毒桿菌毒素(abobotulinumtoxinA)(Dysport)；阿達木單抗(adalimumab)(Humira)；阿達木單抗-阿托(adalimumab-atto)(Amjevita)；阿多-曲妥珠單抗美坦新(ado-trastuzumab emtansine)(Kadcyla)；阿柏西普(aflibercept)(Eylea)；半乳糖苷酶β(agalsidase beta)(Fabrazyme)；阿比魯肽(albiglutide)(Tanzeum)；阿地介白素(aldesleukin) (Proleukin)；阿侖單抗(alemtuzumab)(Campath、Lemtrada)；阿糖苷酶α (alglucosidase alfa)(Myozyme、Lumizyme)；阿利庫單抗(alirocumab)(Praluent)；阿替普酶(alteplase)、凱斯福活化酶(cathflo activase)(Activase)；阿那白滯素(anakinra)(Kineret)；艾斯福酶α (asfotase alfa)(Strensiq)；天冬醯胺酸酶(Elspar)；天冬醯胺酸酶菊歐文氏菌(erwinia chrysanthemi)(Erwinaze)；阿替珠單抗(atezolizumab)(Tecentriq)；巴利昔單抗(basiliximab) (Simulect)；貝卡普明(becaplermin)(Regranex)；貝拉西普(belatacept)(Nulojix)；貝利單抗(belimumab)(Benlysta)；貝伐單抗(bevacizumab)(Avastin)；貝羅托昔單抗(bezlotoxumab)(Zinplava)；布林莫單抗(blinatumomab) (Blincyto)；貝倫妥單抗維多汀(brentuximab vedotin) (Adcetris)；康納金單抗(canakinumab)(Ilaris)；卡羅單抗噴地肽(capromab pendetide)(ProstaScint)；聚乙二醇化賽妥珠單抗(certolizumab pegol)(Cimzia)；西妥昔單抗(cetuximab)(Erbitux)；膠原蛋白酶(Santyl)；膠原蛋白酶溶組織芽胞梭菌(collagenase clostridium histolyticum)(Xiaflex)；達利珠單抗(daclizumab)(Zenapax)；達利珠單抗(Zinbryta)；達土木單抗(daratumumab)(Darzalex)；達貝泊汀α (darbepoetin alfa)(Aranesp)；地尼介白素迪夫托斯(denileukin diftitox)(Ontak)；地諾單抗(denosumab) (Prolia、Xgeva)；迪奴圖單抗(dinutuximab)(Unituxin)；去氧核醣核酸酶α (dornase alfa)(Pulmozyme)；杜拉魯肽(dulaglutide)(Trulicity)；艾卡拉肽(ecallantide)(Kalbitor)；艾庫組單抗(eculizumab) (Soliris)；艾洛硫酸酶α (elosulfase alfa)(Vimizim)；埃羅妥珠單抗(elotuzumab)(Empliciti)；依泊汀α (epoetin alfa) (Epogen/Procrit)；依那西普(etanercept)(Enbrel)；依那西普-szzs (Erelzi)；伏洛庫單抗(evolocumab)(Repatha)；非格司亭(filgrastim)(Neupogen)；非格司亭-sndz(Zarxio)；促卵泡激素α (follitropin alpha)(Gonal f)；加硫酶(galsulfase)(Naglazyme)；穀卡匹酶(glucarpidase)(Voraxaze)；戈利木單抗(golimumab)(Simponi)；戈利木單抗注射劑(Simponi Aria)；替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan) (Zevalin)；伊達珠單抗(idarucizumab)(Praxbind)；艾杜硫酶(idursulfase)(Elaprase)；A型肉毒桿菌毒素(incobotulinumtoxinA)(Xeomin)；英利昔單抗(infliximab) (Remicade)；英利昔單抗-dyyb(Inflectra)；干擾素α-2b (Intron A)；干擾素α-n3(Alferon N注射劑)；干擾素β-1a (Avonex、Rebif)；干擾素β-1b (Betaseron、Extavia)；干擾素γ-1b (Actimmune)；伊匹單抗(ipilimumab)(Yervoy)；依賽珠單抗(ixekizumab)(Taltz)；拉羅尼酶(laronidase) (Aldurazyme)；美泊利珠單抗(mepolizumab) (Nucala)；甲氧基聚乙烯乙二醇-紅血球生成素(epoetin) β (Mircera)；美曲普汀(metreleptin)(Myalept)；那他珠單抗(natalizumab) (Tysabri)；耐昔妥珠單抗(necitumumab) (Portrazza)；尼沃單抗(nivolumab)(Opdivo)；歐必妥昔單抗(obiltoxaximab) (Anthim)；歐比妥珠單抗(obinutuzumab)(Gazyva)；奧克纖溶酶(ocriplasmin) (Jetrea)；奧法木單抗(ofatumumab) (Arzerra)；奧拉妥單抗(olaratumab)(Lartruvo)；奧馬珠單抗(omalizumab)(Xolair)；A型肉毒桿菌毒素(onabotulinumtoxinA)(Botox)；奧普瑞介白素(oprelvekin) (Neumega)；帕利夫明(palifermin)(Kepivance)；帕利珠單抗(palivizumab)(Synagis)；帕尼單抗(panitumumab)(Vectibix)；副甲狀腺素(Natpara)；培門冬酶(pegaspargase) (Oncaspar)；派非格司亭(pegfilgrastim)(Neulasta)；聚乙二醇化干擾素(peginterferon) α-2a (Pegasys)；聚乙二醇化干擾素α-2b (PegIntron、Sylatron)；聚乙二醇化干擾素β-1a (Plegridy)；聚乙二醇重組尿酸酶(pegloticase) (Krystexxa)；派立珠單抗(pembrolizumab)(Keytruda)；帕妥珠單抗(pertuzumab)(Perjeta)；雷莫蘆單抗(ramucirumab)(Cyramza)；蘭尼珠單抗(ranibizumab) (Lucentis)；拉布立酶(rasburicase)(Elitek)；雷昔庫單抗瑞利珠單抗(raxibacumabreslizumab)(Cinqair)；瑞替普酶(reteplase)(Retavase)；利納西普(rilonacept)(Arcalyst)；B型瑞瑪毒素(rimabotulinumtoxinB)(Myobloc)；利妥昔單抗(rituximab)(Rituxan)；羅米司亭(romiplostim)(Nplate)；沙格司亭(sargramostim)(Leukine)；西貝利帕酶(sebelipase) α (Kanuma)；塞庫金單抗(secukinumab)(Cosentyx)；思圖昔單抗(siltuximab)(Sylvant)；tbo-非格司亭(filgrastim)(Granix)；替奈普酶(tenecteplase)(TNKase)；托珠單抗(tocilizumab) (Actemra)；曲妥珠單抗(trastuzumab)(Herceptin)；優西努單抗(ustekinumab)(Stelara)；維多珠單抗(vedolizumab) (Entyvio)；ziv-阿柏西普(aflibercept)(Zaltrap)。
光反應性部分的非限制性實例包括芳基疊氮化物、二苯基酮、核黃素、黃素、光黃素及/或其衍生物、螢光素或其衍生物、殺手紅(光敏化蛋白質)、miniSOG (光敏化蛋白質)、另一光敏化蛋白質(例如經配置在光照射後產生反應性氧物種(ROS))、亞甲藍或其衍生物、酚、喋呤衍生物、衍生物、釕基光觸媒和孟加拉玫紅衍生物。螢光素為具有四個帶負電的羧酸基團之螢光有機染料，且其衍生物經配置通常以保留活性中心且可具有例如添加物，諸如烴尾部、異硫氰酸酯、羧酸或胺。其他分子的衍生物(除非另有其他指定或自上下文中明瞭)通常保留分子的特徵功能，但可以其他方式修飾。在一些實施態樣中，複數個光反應性部分係與抗體(或其他誘餌分子)結合以形成光反應性探針。與抗體(或其他誘餌分子)結合之光反應性部分的數量範圍可為1至50 (例如1、1至5、1至10、1至20等)。
圖3A至3G和3Y至3AI顯示可用於本文所述之光反應性探針(例如光反應性探針205)之光反應性部分(例如253光反應性部分)的實例。圖3A至3N顯示釕基光觸媒。在圖3Y至3AI中，陰影區顯示連結子(共價鍵)附接的位置。圖3O顯示孟加拉玫紅衍生物。圖3P至Q顯示螢光素衍生物。圖3R顯示亞甲藍衍生物。圖3S至T顯示光黃素衍生物。圖3U至3V顯示核黃素和黃素衍生物。圖3W至3X顯示喋呤衍生物。特定的光反應性部分的選擇可取決於所欲波長及誘餌分子的類型而定。例如，可選擇光反應探針的成分及用於探測前分析的成分，藉以使彼此不干擾(或最小化干擾)。
在一些實施態樣中，以式(II)表示之釕基化合物可用於以式(I)或(IA)表示之光反應性探針的B部分(光反應性部分)：
(II)
其中L1、L2、L3和L4各自獨立為配位基；且X 1和X 2各自獨立為具有反應性部分之配位基，其中反應性部分可與如上文列出的式(I)之C部分結合。例如，X 1和X 2可各自獨立為3-乙炔基吡啶、3-(溴甲基)吡啶、順丁烯二醯亞胺、4'-甲基-4-羧基聯吡啶-N-琥珀醯亞胺酯、菸鹼醛、l-(4-(吡啶-3-基)-lH-1,2,3-三唑-1-基)乙酮、4-戊炔腈、4-胺基丁炔或類似者；且L 1與L 2可接合以形成第一雙配位基且L 3與L 4接合以形成第二雙配位基，其中第一雙配位基及第二雙配位基可各自獨立為2,2'-聯吡啶基(bpy)、4'-甲基-4-羧基聯吡啶-N-琥珀醯亞胺酯、4,4'-二氰基-5,5'-二甲基-2,2'-聯吡啶(CN-Me-bpy)、4,4'-二甲基-2,2'-聯吡啶(dmb)、4,4'-二-三級丁基-2,2'-聯吡啶(dbpy)、4,4',5,5'-四甲基-2,2’-聯吡啶(tmb)、2-苯基吡啶(ppy)、6-溴-2,2'-聯吡啶、6,6'-二溴-2,2’-聯吡啶、5-溴-2,2'-聯吡啶、6-胺基-2,2'-聯吡啶、6,6'-二胺基-2,2'-聯吡啶、2,2'-聯吡啶-6-甲腈、2,2'-聯吡啶-6,6'-雙(甲腈)、2,2'-聯吡啶-6-羧酸、2,2'-聯吡啶-6,6'-二羧酸、雙喹啉或類似者。據此，式(II)之釕基化合物可為[Ru(bpy) 2(甲基-bpy-NHS)] 2+、[Ru(bpy) 2(bpy-(NHS)2)] 2+、[Ru(bpy) 2(甲基-bpy-(CH2)3-NHS)] 2+、[Ru(bpy) 2(bpy-((CH2) 3-NHS)) 2] 2+、磺基-標籤NHS-酯、[Ru(bpy) 2(甲基-bpy-COOH)] 2+、[Ru(bpy) 2(bpy-(COOH) 2)] 2+、[Ru(bpy) 2(甲基-bpy-(CH 2) 3COOH)] 2+、[Ru(bpy) 2(bpy-((CH2)3COOH)) 2] 2+、彼等之鹽(例如雙(六氟磷酸鹽))或彼等之任何組合。NHS-酯基團可經化學基團置換，諸如順丁烯二醯亞胺基、碘乙醯基、半胱胺酸/硫醇基、點擊化學基團或類似者。羧基可經化學基團置換，諸如順丁烯二醯亞胺基、碘乙醯基、半胱胺酸/硫醇基、點擊化學基團或類似者。點擊化學基團可為炔烴、BCN、DBCO、N 3或類似者。在特定的實施態樣中，式(II)之釕基化合物係選自由下列所組成之群組：[Ru(bpy) 2(異硫氰基-啡啉)] 2+、[Ru(bpy) 2(胺基啡啉)] 2+、[Ru(聯吡啶) 2(3-乙炔基-吡啶) 2]+、Ru(聯吡啶) 2(3-乙炔基吡啶) 2Cl 2、Ru(聯吡啶) 2(3-乙炔基吡啶) 2(PF 6) 2、[Ru(雙喹啉) 2(4-戊炔腈) 2]+、Ru(雙喹啉) 2(4-戊炔腈) 2Cl 2、Ru(雙喹啉) 2(4-戊炔腈) 2(PF6) 2、[Ru(聯吡啶) 2(4-胺基丁炔) 2] +、[Ru(聯吡啶) 2(4-戊炔腈) 2] +、[Ru(聯吡啶) 2(菸鹼醛) 2] +、[Ru(聯吡啶)2(1-(4-(吡啶-3-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙酮) 2] +、[Ru(聯吡啶) 2(3-(溴甲基)吡啶) 2] +、[Ru(聯吡啶)2(順丁烯二醯亞胺) 2] +、Ru(4,4-二羧酸-2,2'-聯吡啶)(4,4'-雙(對己氧基苯乙烯基)-2,2-聯吡啶)(NCS) 2、順式-雙(異硫氰基)雙(2,2'-聯吡啶基-4,4'-二羧酸基)釕(II)、順式-雙(2,2'-聯吡啶)二氯釕(II)水合物、雙(4,4-二羧基-2,2-聯吡啶)二氯釕(II)、二-四丁基銨順式-雙(異硫氰基)雙(2,2′-聯吡啶基-4,4′-二羧酸基)釕(II)、彼等之鹽、彼等之立體異構物或彼等之互變異構物及彼等之任何組合。
圖4A至4L顯示在以上文列出的式(I)表示之光反應性探針中的C(連結子)部分之示例性部分。關於光反應性探針的C部分，一些實施態樣可使用例如NHS-BCN、NHS-(PEG) n-BCN、NHS-DBCO、NHS-(PEG) n-DBCO、NHS-炔烴、NHS-(PEG) n-炔烴、NHS-N 3、NHS-(PEG) n-N 3、NHS-順丁烯二醯亞胺、NHS-(PEG) n-順丁烯二醯亞胺、NHS-碘乙醯基、NHS-(PEG) n-碘乙醯基、NHS-半胱胺酸/硫醇基、NHS-(PEG) n-半胱胺酸/硫醇基、順丁烯二醯亞胺-肽/胺基酸、順丁烯二醯亞胺-(PEG) n-肽/胺基酸、順丁烯二醯亞胺-寡核苷酸、碘乙醯基-肽/胺基酸、碘乙醯基-(PEG) n-肽/胺基酸、碘乙醯基-寡核苷酸或類似者作為連結子，其中各n可獨立為1至20的整數。在一些實施態樣中，連結子包括(PEG) n、肽、胺基酸或寡核苷酸的部分，且其中各n可獨立為1至20的整數。聚合性連結子的其他實例包括其他的聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚乙烯、聚丙烯、聚醯胺和聚酯。連結子可為在鏈中具有至少一或兩個原子的線性分子，且可包括更多個。
圖5A至5K顯示可用於本文所述之目標探針中的標籤部分的實例。標籤部分(在本文有時亦稱為「標籤(tag或tags)」)經配置與可檢測的標記相互作用以標記與關注分子(第一分子)相鄰的生物分子且產生可檢測的標記。圖5A至5E顯示可與探針一起使用之點擊化學標籤的實例。點擊化學標籤可為例如疊氮化物部分或炔烴部分。圖5F至5H顯示可用作為目標探針中的探針標籤之生物素衍生物的實例。圖5I顯示長葉毛地黃配質部分標籤。圖5J顯示肽標籤。圖5J特別地顯示具有6個組胺酸之聚His標籤(SEQ ID NO. 1)。然而，組胺酸標籤可替代地包括更少或更多的組胺酸，諸如5個組胺酸或7至10個組胺酸或超過10個組胺酸。圖5K顯示SNAP-標籤。在一些事例中，亦可能使用CLIP-標籤、寡核苷酸或鹵基標籤。
圖6A至6L顯示可用於本文所述之目標探針中的目標部分的實例(例如連同標籤部分)，諸如在圖2B中所示之目標探針206中。在光反應性探針(例如光反應性探針205)之光活化後，經活化之光反應性探針可自目標探針206之目標部分263產生反應性中間物(諸如游離基)且目標部分263可與其鄰近的胺基酸或其他生物分子(例如相鄰分子，諸如相鄰分子211)形成共價鍵。胺基酸可為丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺酸、天冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、蛋胺酸、苯基丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸、纈胺酸或類似者。在一些變型中，目標部分可與相鄰碳水化合物、脂質或核酸形成鍵。
在作為光反應性探針205的光催化釕複合物-抗體共軛體的實施中，雙(2,2′-聯吡啶)-4′-甲基-4-羧基聯吡啶-釕可通過NHS-醯胺鍵聯與二級抗體特異性地共軛，且二級抗體可與關注區域(ROI)之初級抗體選擇性地雜交(參見例如圖2E至2E)。[Ru(bpy) 3] 2+為可藉由分別約425 nm和780 nm之光單光子或雙光子照光激發之光觸媒。所得經氧化之[Ru(bpy) 3] 3+可自作為目標探針的生物素-酚之酚羥基奪取電子(參見例如圖2B)，且對鄰近的酪胺酸殘基產生苯氧游離基及質子。為了達成用於組學研究(諸如蛋白質體剖析)之更高密度的標記，可利用HRP擴增，使酪醯胺基團與蛋白質相鄰分子附近的酪胺酸殘基進一步共價結合，隨後進行鏈黴抗生物素蛋白富集及在磁珠上酵素消化。最後，亞細胞/經定域化之蛋白質體剖析可藉由對試樣執行定量蛋白體組分析來獲得，諸如在自顯微鏡載玻片移出試樣後。該實施的特徵在於基於抗體之釕複合物([Ru(bpy) 3] 2+)-抗體共軛體的形成，該共軛體作為用於空間和經定域化之蛋白質體分析、鑑定無法以習知方法分級或單離的胞器之新穎蛋白質及經由單光子或雙光子照光之大小和形態可區分的標記之選擇性和光催化探針。
在一些實施態樣中，本發明說明包括光反應性探針及主要目標探針中至少一者或光反應性探針及主要目標探針兩者之光反應性套組。在此及其他實施態樣中，光反應性探針可以式(I)： (I)表示，其中C部分為單一化學鍵或連結子；B部分包括與C部分結合之光反應性部分；且G部分包括與C部分結合之誘餌分子。在此及其他實施態樣中，主要目標探針包括可檢測的標籤及目標部分。主要目標探針可包括與光可激發的目標部分結合之可檢測的標籤。在一些實施態樣中，光反應性探針之誘餌分子經配置與生物樣品中的第一分子共軛，且當光反應性探針經光活化且主要目標探針藉由經光活化之探針作用以形成經光激發之主要目標探針時，經光激發之主要目標探針經配置與生物樣品中的標的分子形成共價鍵。在一些實施態樣中，第一分子及標的分子為不同的實體。在一些實施態樣中，第一分子及標的分子為相同的實體。本文所揭示之第一分子亦可稱為或適用於標的分子，除非上下文另有其他指示。
如本文所述之光選擇性標籤化及標記可在各種樣品類型中執行，諸如自組織、細胞或粒子獲得的樣品，諸如來自實體(例如人類個體、小鼠個體、大鼠個體、昆蟲個體、植物、真菌、微生物、病毒)或組織樣品或不來自生物體的細胞樣品，諸如細胞培養樣品或人造組織支架樣品(例如經培養之實驗室細胞、試管內發育之心臟組織、3d列印組織等)。使用本文所述之探針、材料及方法分析之樣品可為活的(活細胞)或可不為活的(例如固定細胞)。用於標籤化及標記的樣品可包括單層樣品、多層樣品、固定至基板(例如顯微鏡載玻片)的樣品、未固定至基板的樣品、細胞懸浮液或萃取物，諸如試管內細胞萃取物、重構之細胞萃取物或合成萃取物。在一些實施態樣中，樣品未經固定(未固定)。用於標籤化活細胞之探針的實例包括利用小分子之探針或有時被稱為自行標記分子之探針(例如CLIP-標籤、鹵基標籤、SNAP-標籤)。在一些實施態樣中，大量的細胞可使用本文所述之方法及材料自動化分析(例如至少約1,000個細胞、至少10,000個細胞、至少100,000個細胞、至少1百萬個細胞)。在一些實施態樣中，可分析較少量的細胞，諸如不超過1,000個細胞、不超過100個細胞或僅很少的細胞或單一細胞。在一些實施態樣中，樣品經固定。例如，細胞或組織樣品可經例如乙酸、丙酮、甲醛(4%)、福馬林(10%)、甲醇、戊二醛或苦味酸固定。固定劑可為相對強的固定劑且可交聯分子，或可為較弱的固定劑且不交聯分子。可將用於分析的細胞或組織樣品在分析前冷凍，諸如使用乾冰或速凍。可將細胞或組織樣品在分析前包埋於固體材料或半固體材料中，諸如石蠟或樹脂。在一些實施態樣中，可使用於分析的細胞或組織樣品固定，隨後包埋，諸如福馬林固定及石蠟包埋(FFPE)。(光反應性探針)之誘餌部分可為核酸、蛋白質及小分子中一或多者。核酸誘餌部分可為DNA、cDNA或RNA。核酸誘餌部分可為原位雜交探針，諸如螢光原位雜交探針或非螢光原位雜交探針，諸如化學發光原位雜交探針(CISH)。原位雜交探針為由DNA、cDNA或RNA所組成之一或多種核酸股，其含有或經修飾以含有螢光或其他可檢測的部分。螢光原位雜交探針或非螢光原位雜交探針通常為15個鹼基至2,000個鹼基長度(諸如15至30個bp長度、15個bp至100個bp長度、30個bp至100個bp長度、100個bp至1000個bp長度、500個bp至200個bp長度等)，儘管可更長或更短。(光反應性)探針之原位雜交誘餌部分可用於(可經配置)與獵物或標的雜交。在(光反應性)探針之原位雜交誘餌部分結合至其獵物後，可使用光活化作用經光活化光反應性探針，且主要目標探針可藉由經光活化之探針作用以形成經光激發之主要目標探針，且經光激發之主要目標探針可(或經配置)與生物樣品中的第二分子(第三分子、第四分子等)形成共價鍵，諸如生物分子，諸如碳水化合物、脂質、核酸和蛋白質。在一些實施態樣中，誘餌分子可包括反應性配位基。反應性配位基可經配置與關注樣品中的對應分子反應。此反應可導致反應性配位基與對應分子之間快速且不可逆的結合。在一些實施態樣中，反應性配位基誘餌分子可利用自行標記蛋白質(SLP)技術。自行標記蛋白質技術係基於在一對反應物：反應性配位基與經配置(經設計)結合至配位基之融合蛋白質之間形成特定的共價鍵。用於自行標記蛋白質技術之融合蛋白質可為自行標記蛋白質標籤(通常源自於酵素)且與關注蛋白質(POI)融合。與增加化學反應速率而本身不被反應永久地改變的酵素反應相比，自行標記蛋白質技術可導致配位基與對應的融合蛋白質之間形成特定的共價鍵。與其他酵素反應類似，利用自行標記蛋白質技術之反應速率快速且反應非常專一。配位基可在自行標記蛋白質技術中標記融合蛋白質而不需要用於標記的額外酵素。用作為誘餌之反應性配位基(在光反應性探針中)的實例包括但不限於CLIP-標籤™配位基(亦稱為CLIP-標籤™受質或CLIP-標籤™)、鹵基標籤®配位基(亦稱為鹵基標籤®受質或鹵基標籤®)和SNAP-標籤®配位基(亦稱為SNAP-標籤®受質或SNAP-標籤®)。用作為誘餌之SNAP-標籤®配位基的實例為苯甲基鳥嘌呤(BG)衍生物及對應的融合蛋白質的實例為20 kDa DNA修復蛋白質O6-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉移酶(hATG)之衍生物(例如自行標記蛋白質SNAP-標籤蛋白質部分)，其與苯甲基鳥嘌呤(BG)衍生物特異性地及快速地反應且與關注蛋白質融合。SNAP-標籤®反應可釋出化學惰性的鳥嘌呤，且此系統(及其他自行標記蛋白質系統)除了可用於其他樣品，諸如非活(固定)細胞、細胞萃取物或其他組織萃取物以外，亦可安全地用於活細胞。可用作為誘餌之CLIP-標籤™配位基的實例為苯甲基胞嘧啶(BC)衍生物，諸如經由苯甲基連結子而具有胞嘧啶脫離基之O2-苯甲基胞嘧啶。對應的融合蛋白質的實例為20 kDa DNA修復蛋白質O6-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉移酶(hATG)之衍生物(例如自行標記蛋白質CLIP-標籤蛋白質部分)，其與苯甲基胞嘧啶(BC)衍生物特異性地及快速地反應且與關注蛋白質融合。可用作為誘餌之鹵基標籤®配位基為反應性鹵烷烴(例如氯烷烴)衍生物及對應的融合蛋白質的實例為細菌脫鹵酶酵素之修飾型式(例如自行標記蛋白質鹵基標籤蛋白質部分)，其移出脂族烴分子的鹵素，諸如通過經融合之親核性天冬胺酸酯殘基，且與關注蛋白質融合。作為一些光反應性探針的一部分之反應性配位基誘餌分子係通過光反應性探針連結子(或單一化學鍵)結合至光反應性探針之光反應性部分(例如在G-C-B光反應性探針、G-K2-K1-B光反應性探針等中的「G」部分)。關注蛋白質可為內源性蛋白質或非內源性蛋白質(抗體、結構蛋白質等)。具有關注蛋白質之融合蛋白質可以自行標記蛋白質部分(CLIP-標籤蛋白質部分、鹵基標籤蛋白質部分、SLIP-標籤化蛋白質部分)標籤化，且使用標準的重組蛋白質表現技術表現及如本文所述使用。細胞可以編碼融合蛋白質之包含核苷酸序列的核酸經基因修飾且直接分析，或可表現融合蛋白質且可將其添加至樣品中，諸如細胞樣品、細胞萃取物樣品、組織萃取物樣品等。在一些變型中，自行標記蛋白質可包括轉譯後修飾標籤部分或與關注蛋白質連接之非共價蛋白質部分，而不是融合蛋白質。
原位雜交誘餌部分的獵物可為靶DNA、靶cDNA或靶RNA，諸如在細胞、細胞萃取物或其他組織萃取物中之基因體的一部分(例如染色體、經表現之RNA、rRNA等)。
光反應性探針的濃度範圍可為0.1 ug/mL至100 ug/mL，而目標探針的濃度範圍可為1 uM至20 mM。在一些實施態樣中，用於光反應性探針活化或光選擇性標籤化及標記的光波長範圍為約200 nm至約1600 nm，例如約200 nm至約250 nm、約250 nm至約300 nm、約300 nm至約350 nm、約350 nm至約400 nm、約400 nm至約450 nm、約450 nm至約500 nm、約500 nm至約550 nm、約550 nm至約600 nm、約600 nm至約650 nm、約650 nm至約700 nm、約700 nm至約750 nm、約750 nm至約800 nm、約800 nm至約850 nm、約850 nm至約900 nm、約900 nm至約950 nm、約950 nm至約1000 nm、約1000 nm至約1100 nm、約1100 nm至約1200 nm、約1200 nm至約1300 nm、約1300 nm至約1400 nm、約1400 nm至約1500 nm或約1500 nm至約1600 nm。在一些實施態樣中，用於執行光選擇性標籤化及標記的光波長範圍在雙光子光源為約700 nm至約1600 nm (近紅外光)(例如780 nm)；或該光波長範圍在單光子光源為約300 nm至約650 nm或至約700 nm (可見光)(例如360 nm、405 nm、425 nm)。用於光反應性探針之光活化的光波長通常與用於成像的光波長不同。在一些實施態樣中，光反應性探針之活化利用約300至450 nm之光輻射(光)，單光子活化為550 nm或多光子活化為＞720 nm。特定的波長係取決於光反應性探針之特定的光反應性部分而定。
方法
本文亦揭示光選擇性地標籤化及標記生物分子之方法及分析方法。該方法可用於標籤化及/或標記單獨或組合之碳水化合物、脂質、核酸、蛋白質。該方法可包括以下步驟：將生物樣品(使生物樣品經受)以具有誘餌分子及光反應性部分之光反應性探針處理且將誘餌分子結合至生物樣品中的第一分子(亦即獵物)。在一些實施態樣中，生物樣品包含複數個細胞。在一些實施態樣中，生物樣品包含複數個活細胞。在一些實施態樣中，生物樣品包括至少1個、至少100個、至少1000個或至少10,000個活細胞。在一些實施態樣中，生物樣品包含細胞萃取物。在一些實施態樣中，光反應性部分係通過化學鍵或連結子與誘餌分子偶合。在一些實施態樣中，光反應性探針及第一分子形成經非共價共軛之探針-第一分子複合物或分子。在一些實施態樣中，誘餌分子包含抗體、CLIP-標籤、鹵基標籤、SNAP-標籤、蛋白質A、蛋白質G、蛋白質L、蛋白質A/G、蛋白質A/G/L、免疫球蛋白結合肽、生物素結合蛋白(諸如抗生物素蛋白、鏈黴抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白)、RNA分子、小分子、核酸分子、螢光原位雜交(FISH)探針、片段抗原結合區域或奈米抗體。在一些實施態樣中，光反應性部分或光反應性探針包括釕基光觸媒、銥基光觸媒、孟加拉玫紅衍生物、螢光素衍生物、亞甲藍衍生物、黃素衍生物、光黃素、核黃素、喋呤衍生物、光敏感化蛋白質、miniSOG、殺手紅、酚、芳基疊氮化物或二苯基酮。
該方法可包括將生物樣品以影像導引顯微鏡系統之成像光源照光的步驟。該方法可包括將照明之樣品以相機成像的步驟。該方法可包括以相機獲取在第一視野中的樣品之至少一個亞細胞形態影像的步驟。該方法可包括處理至少一個影像且基於經處理之影像以測定在樣品中的關注區域的步驟。該方法可包括獲得關注區域之坐標訊息的步驟。
該方法可包括將目標探針遞送至生物樣品的步驟。該方法可包括基於所獲得的坐標訊息以光選擇性地照光關注區域的步驟，藉以活化光反應性部分，導致在目標探針與生物樣品中的關注區域之生物樣品中的相鄰分子或關注分子之間形成共價鍵。該方法可包括自生物樣品移出未經共軛之光反應性探針的步驟，藉以容許光反應性探針引導在選定之關注區域的選擇性地照光。在一些實施態樣中，選擇性地照光的步驟包含照光25 us/像素至400 us/像素、50 us/像素至300 us/像素、75 us/像素至200 us/像素或400us/像素至5000us/像素的區域。在一些實施態樣中，主要目標探針包括標籤部分及目標部分。在一些實施態樣中，主要目標探針之標籤部分包括生物素衍生物、點擊化學標籤、鹵基標籤、SNAP-標籤、CLIP-標籤、長葉毛地黃配質、核酸標籤或肽標籤。在一些實施態樣中，點擊化學標籤包括炔類部分或疊氮化物類部分。在一些實施態樣中，目標探針之目標部分經配置以產生反應性中間物(例如苯氧游離基、碳烯或類似者)(在生物試樣中)，其負責與關注分子鄰近的蛋白質之胺基酸形成共價鍵。在一些實施態樣中，經活化之光反應性部分可促進在目標探針中形成游離基，藉以在光反應性部分與選定之關注區域中的生物樣品之胺基酸或生物分子之間形成共價鍵。在一些實施態樣中，胺基酸(例如關注蛋白質或相鄰蛋白質分子之胺基酸)可為丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺酸、天冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、蛋胺酸、苯基丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸、纈胺酸或類似者。
該方法可另外包括將可檢測的標記與目標探針共軛及將與第一分子鄰近的相鄰分子(亦即獵物)以可檢測的標記活性可檢測地鄰近標記的步驟。在一些實施態樣中，可檢測的標記包括催化標記。在一些實施態樣中，可檢測地鄰近標記包含光選擇性鄰近標記直徑(或最長的尺寸)少於5 μm、少於2 μm、少於1μm、少於500 nm、少於300 nm、少於200 nm或少於100 nm的區域。一些實施態樣包括將連接子與目標探針共軛的步驟。在一些實施態樣中，連接子係通過連接子與主要目標探針之間的親和性與目標探針共軛，藉以鑑定與目標探針經共價結合之生物樣品的位置。一些實施態樣另外包括將標籤-過氧化酶與連接子共軛的步驟。在一些實施態樣中，標籤-過氧化酶經配置以催化附加的目標探針(例如酪醯胺探針)，藉以在附加的目標探針與生物樣品之間形成共價鍵。(目標探針可為第一目標探針及附加的目標探針可為第二目標探針)。更特定言之，標籤-過氧化酶可活化附加的目標探針，藉以具有游離基且在附加的目標探針與生物樣品之酪胺酸之間形成共價鍵。一些實施態樣另外包括自顯微鏡載台移出至少關注區域的步驟。一些實施態樣另外包括使經選擇性地照光之樣品經質譜分析或測序分析的步驟。
一些方法包括令具有標的生物分子的生物樣品與如本文所述之光反應性探針接觸，藉此使套組之光反應性探針與標的生物分子經非共價共軛，洗出未經共軛之光反應性探針，使用光輻射經空間選擇性地活化套組之光反應性探針且因此誘導在套組的攜標籤之目標探針與鄰近標的生物分子的附近分子之間的鍵結，洗出未經結合之目標探針，且另外包含藉由標記以標記攜標籤之生物分子/探針複合物且選擇性地鄰近標記與標的生物分子鄰近的相鄰分子的步驟。
本文亦揭示用於處理經光標記之樣品以預測生物標誌之質譜實施方法。該方法可包括將數個生物樣品分成光標記樣品組和非標記樣品組的步驟。該方法可包括將如本文所述之光反應性套組遞送至光標記樣品組和非標記樣品組的步驟。在一些實施態樣中，誘餌分子係與生物樣品中的第一分子經非共價共軛。該方法可包括選擇性地照光光標記樣品組的選定之關注區域且保持非標記樣品組在暗處的步驟，其中照光步驟容許主要目標探針與樣品形成共價鍵。在一些實施態樣中，選擇性地照光選定之關注區域的步驟另外包含活化在選定之區域中的光反應性部分的步驟，藉以容許經活化之光反應性部分容許主要目標探針在選定之關注區域與生物樣品形成共價鍵。該方法可包括自生物樣品移出未經共軛之光反應性探針的步驟，藉以容許光反應性探針引導在選定之關注區域的選擇性地照光。在一些實施態樣中，經活化之光反應性部分可活化主要目標探針，藉以具有游離基且在選定之關注區域與生物樣品之胺基酸或生物分子形成共價鍵。在一些實施態樣中，胺基酸可為丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺酸、天冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、蛋胺酸、苯基丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸或纈胺酸。
該方法可包括通過在經主要目標探針結合之蛋白質與複數個親和性磁珠(例如鏈黴抗生物素蛋白磁珠)之間的親和性沈澱以自光標記樣品組和非標記樣品組萃取複數個經目標探針結合之蛋白質的步驟。該方法可包括使經萃取之蛋白質進行質譜分析的步驟。該方法可包括根據個別蛋白質之肽片段的強度值計算在光標記樣品組與非標記樣品組之間的經鑑定之蛋白質列表中的個別蛋白質之相對量化值的步驟。該方法可包括測定在光標記樣品組與非標記樣品組之間的相對量化值之閾值的步驟。該方法可包括在測定閾值後，預測對應於超過閾值之個別蛋白質的相對量化值之至少一種生物標誌的步驟。
本文亦揭示用於處理經光標記之樣品以鑑定生物標誌列表之質譜實施方法。該方法可包括將如本文所述之光反應性套組遞送至生物樣品的步驟。在一些實施態樣中，誘餌分子係與生物樣品中的第一分子經非共價共軛。該方法可包括選擇性地照光生物樣品的選定之關注區域的步驟，藉以容許主要目標探針標記在選定之關注區域的生物樣品之蛋白質。在一些實施態樣中，選擇性地照光選定之關注區域的步驟另外包含活化在選定之區域中的光反應性部分的步驟，藉以容許經活化之光反應性部分容許主要目標探針在選定之關注區域與生物樣品形成共價鍵。該方法可包括自生物樣品移出未經共軛之光反應性探針的步驟，藉以容許光反應性探針引導在選定之關注區域的選擇性地照明。在一些實施態樣中，經活化之光反應性部分可活化主要目標探針，藉以具有游離基且在選定之關注區域與生物樣品之胺基酸或生物分子形成共價鍵。在一些實施態樣中，胺基酸可為丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺酸、天冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、蛋胺酸、苯基丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸或纈胺酸。
該方法可包括通過在經主要目標探針結合之蛋白質與複數個親和性磁珠(例如鏈黴抗生物素蛋白磁珠)之間的親和性沈澱以自生物樣品萃取複數個經探針標記之蛋白質的步驟。該方法可包括使經萃取之蛋白質進行質譜分析的步驟。該方法可包括鑑定生物樣品的經萃取之蛋白質的步驟。該方法可包括計算生物樣品的經鑑定之蛋白質列表的各蛋白質之肽片段的強度值的步驟。該方法可包括將經鑑定之蛋白質列表根據各蛋白質的強度值排序的步驟。
該方法可包括鑑定及/或純化一或多種生物標誌(例如鄰近或相鄰分子)。
用於預測生物標誌或鑑定生物標誌列表之方法可另外包括將連接子遞送至生物樣品及將連接子通過在連接子與主要目標探針之間的親和性與經主要目標探針結合之蛋白質或生物分子共軛的步驟。在一些實施態樣中，連接子可為螢光連接子，藉以鑑定與主要目標探針經共價結合之生物樣品的位置。該方法可另外包括將標籤-過氧化酶遞送至生物樣品及將標籤-過氧化酶與連接子共軛的步驟，藉以容許標籤-過氧化酶催化附加的目標探針(例如酪醯胺探針)以在附加的目標探針與生物樣品之間形成共價鍵。在一些實施態樣中，標籤-過氧化酶活化附加的目標探針，藉以具有游離基且在附加的目標探針與生物樣品的酪胺酸之間形成共價鍵。
圖22例證使用如本文所述之光反應性套組，隨後以質譜分析之工作流程。與顯微光標記系統耦合之光活化套組，隨後以質譜分析之工作流程。收穫經光標記之核仁用於LC-MS/MS分析(左下圖)。核仁蛋白質體之真陽性的蛋白質分布。蛋白質係以比(雙光子標記/對照)的順序排序，前100個蛋白質中之97個被註釋為核仁蛋白質(下圖中間)。核仁蛋白質體之基因本體論分析(右下圖)。方案：參見以下的[LC-MS/MS分析]及[蛋白質鑑定及無標記量化]。 [實施例]
實驗及方法
[釕基抗體之共軛]將Ru(bpy) 3NHS-酯(雙(2,2'-聯吡啶)-4'-甲基-4-羧基聯吡啶-釕N-琥珀醯亞胺酯-雙(六氟磷酸酯)[CAS No.：136724-73-7]與驢抗兔/驢抗小鼠IgG抗體經由醯胺偶合反應共軛，如圖7中所示。將300微克抗體與Ru(bpy) 3NHS-酯在100 mM硼酸鹽緩衝液(pH 8.0)中以0.5 mg/mL之抗體及0.35 mM之Ru(bpy) 3NHS-酯的最終條件下反應。反應係在室溫下於暗處執行2 h。將甘胺酸添加至100 mM，使反應去活化，且接著將抗體-Ru(bpy) 3共軛體以重力流之離線粒徑篩析管柱(PD midiTrap G-25，Cytiva)純化。經純化之抗體-Ru(bpy) 3共軛體的濃度係使用未經共軛之抗體作為標準物以Pierce™ BCA蛋白質檢定法(Thermo Fisher Scientific)測量。為了確認Ru(bpy) 3分子在抗體上共軛，將經純化之產物以NanoDrop光譜儀(Thermo Fisher Scientific)在455 nm及280 nm波長下進一步檢測。
[細胞製備]將細胞在37℃，5%之CO2濕潤環境中在以10%之FBS補充的經達爾伯克氏改良之伊格爾氏培養基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)中培養。將2×105個細胞接種在玻璃底室中且培育約16 h至80至90%之細胞覆蓋率。然後將細胞以PBS清洗且以2.4%之聚甲醛(PFA)或甲醇固定。將固定之細胞以PBS/0.5%之Triton X-100培育以通透處理細胞膜，且以具有3%之BSA 的PBS/0.1%之Triton X-100經1 h阻斷處理，隨後以0.002%之鏈黴抗生物素蛋白經30 min及以40 μM生物素阻斷劑經15 min阻斷。
[釕基抗體之雜交]將細胞在室溫下與下列抗體之初級抗體在阻斷緩衝液[具有3%之BSA的PBS/0.1%之Triton X-100]中培育2 h：兔抗NCL、小鼠抗G3BP1、小鼠抗NPC。在以PBS/0.1%之Triton X-100清洗後，將10 μg/mL之抗體-Ru(bpy) 3共軛體在4℃下與初級抗體經隔夜雜交。隨後將細胞在室溫下以螢光標誌(山羊抗兔AlexaFluor 647或山羊抗小鼠AlexaFluor 647)經1 h染色。
[在亞細胞上的雙光子標記用於LC-MS/MS定量分析]將細胞以含有5至7 mM去硫生物素-酚及0.005%之甲基紫精的雙光子(2P)標記試劑培育。將與顯微鏡系統耦合之雙光子雷射以100至200 mW之雷射功率使用於空間上解析之光標記，且使細胞進行100至1000微秒之雷射曝光時間。將標記之細胞以含有10 mM之抗壞血酸鈉、5 mM trolox及0.02%之疊氮化鈉的緩衝液清洗以淬滅光化學反應，且將細胞最後以PBST清洗三次。
[以螢光顯微術驗證雙光子標記之性能]將標記之細胞/訊號在含有3%之BSA/PBS/0.1%之Triton X-100的阻斷緩衝液中以中性抗生物素蛋白-DyLight 488探測1 h，且將抗體-Ru(bpy) 3共軛體在室溫下與螢光標誌(山羊抗驢TexasRed)或抗初級抗體(山羊抗兔568或山羊抗小鼠568)經1 h雜交。接著將細胞在室溫下以核標誌(Hoechst 33258)經30 min染色。應用Zeiss LSM 880共焦顯微鏡以驗證標記訊號在xy截面及xz截面之胞器邊界內。
圖8顯示經基於抗體之釕(Ab-Ru)靶向之光標記的實驗結果(核仁標誌之共焦成像(洋紅色)、基於抗體之釕(紅色)、經2P標記之訊號：去硫生物素(綠色)；比例尺：20 μm)。圖8顯示經基於抗體之釕(Ab-Ru)靶向之光標記的實驗結果(核仁標誌之共焦成像(洋紅色)、基於抗體之釕(紅色)、經2P標記之訊號：去硫生物素(綠色)；比例尺：20 μm)。
[蛋白質萃取及在磁珠上酵素消化]將標記之細胞以含有10 mM Tris (pH 8.0)、1%之Triton X-100、1倍蛋白酶抑制劑混合液、10 mM抗壞血酸鈉、5 mM Trolox及1 mM疊氮化鈉之緩衝液刮削收穫。將收穫之細胞使用Q125超音波震盪器(Qsonica)在60%之功率下以1s開/2s關的間隔經2 min超音波震盪處理，接著以SpeedVac系統進行2 h之刮削緩衝液蒸發。將160 μL之含有4%之十二烷基硫酸鈉(SDS)、1%之Triton X-100、100 mM Tris (pH 8.0)及20 mM二硫蘇糖醇(DTT)之溶解緩衝液添加至收穫之細胞中，且將混合物以1 min開/2 min關的間隔循環5次渦漩震盪。為了收回自PFA固定所得之交聯醯胺基團，將溶解之細胞在99℃再加熱45分鐘，隨後再一輪以1 min開/2 min關的間隔循環5次渦漩震盪。將溶解液在20℃下以16,000 g離心20 min且收集上清液。使用Pierce™ 660 nm蛋白質檢定法(Thermo Fisher Scientific)測量蛋白質濃度且使240 μg之蛋白質進行免疫沈澱。將鏈黴抗生物素蛋白磁珠以稀釋緩衝液[0.5%之Triton X-100/PBS]清洗三次，將蛋白質溶解液稀釋10倍以降低SDS濃度低於0.4%，且將稀釋之溶解液添加至清洗之磁珠中及在2至8℃下以旋轉培育16 h。在此之後，將經生物素-蛋白質鍵結之磁珠以下列的清洗緩衝液清洗以最大程度降低非特異性結合：緩衝液A [2%之SDS、50 mM Tris (pH 8.0)]；緩衝液B [0.5M NaCl、0.1%之去氧膽酸、0.1%之SDS、1%之Triton X-100、50 mM HEPES]；緩衝液C [0.5%之去氧膽酸、0.5%之Triton X-100、10 mM Tris (pH 8.0)、250 mM LiCl]。將用於在磁珠上酵素消化之磁珠進一步以100 μL之50 mM三乙基碳酸氫銨緩衝液清洗三次，且接著將經生物素-蛋白質鍵結之磁珠在37℃下與0.2 μg之胰蛋白酶/Lys-C (V5071，Promega)以20 μL之最終體積混合100 min以進行初始消化。在此之後，收集上清液且以不添加其他酵素進行隔夜酵素消化。最後，將消化產物以添加2 μL 10%之甲酸酸化且以C18 Ziptip脫鹽。將脫鹽之肽以Speedvac乾燥且在LC-MS/MS分析前儲存在-20℃下。
[LC-MS/MS分析]以數據依賴擷取質譜法檢測免疫沈澱之產物。LC-MS/MS分析係使用與Orbitrap Fusion Lumos質譜儀(Thermo Fisher Scientific)耦合之UltiMate 3000 RSLCnano系統(Thermo Fisher Scientific)執行。將脫鹽之肽再懸浮於具有0.1%甲酸的水中且裝填至PepMap™ 100 C18 HPLC管柱(2 µm，100埃，75 µm×25 cm；Thermo Fisher Scientific)上，且經細胞核照光之樣品經160 min梯度溶析，經核仁-、SG-照明之樣品經120 min梯度溶析，將肽洗脫出來。在Orbitrap中以120,000之解像力、4×105之AGC標的值及50 ms之最大注入時間獲得範圍自m/z 375至1500之完整的MS光譜圖。碎片離子光譜係使用數據依賴方法在Orbitrap中以30,000之解像力的最高速模式紀錄。單一同位素前驅離子係藉由對具有2+、3+、4至7電荷態之離子分別使用1.2、0.7、0.4 Th之隔離窗口的四極柱來選擇。全部皆應用4×105之AGC標的值、54 ms之最大注入時間、具有30%之碰撞能量的高能量碰撞解離(HCD)碎片化及3 s之最大循環時間。動態排除設定至60 s，具有10 ppm之排除窗口。具有未指定、1+或高於8+之電荷狀態的前驅離子自碎片化選擇排除。
[蛋白質鑑定及無標記量化]將來自同一批雙光子照光的原始數據藉由Sequest HT演算法與Proteome Discoverer (Thermo Fisher Scientific)一起比對UniProtKB/ Swiss-Prot人類蛋白質數據庫(2020.02版本，20,365條目)以進行特徵提取、肽鑑定及蛋白質推論之處理。數據庫搜尋係如下執行：最多三個錯誤切割之胰蛋白酶肽；對肽離子的10 ppm之質量公差和對碎片的0.05 Da之質量公差；在Cys殘基上的靜態脲甲基化(+57.0215 Da)；在Asp和Gln殘基上的動態脫醯胺化(+0.9840 Da)；在Met殘基上的氧化(15.9949 Da)；在蛋白質N末端上的乙醯化(+42.0106 Da)；及在Tyr殘基上的去硫生物素酚修飾(+331.1896)。最小的肽長度設定為6個殘基。肽及蛋白質之誤判率(FDR)皆設定為1%。
用於無標記量化之層析峰比對的時間窗口設定為20 min。接著將肽水平數據標準化成總肽強度，且給出之蛋白質的量化值係自屬於該蛋白質的前三個強度獨特的肽之標準化強度的總和導出。
圖9顯示核仁標記實驗的結果。圖9顯示來自核仁標記實驗的經鑑定之總蛋白質。前100個蛋白質中之91%為核仁蛋白質，示意以Ab-Ru及目標探針(生物素-酚)標記小的ROI(核仁)為準確的，且經標籤(生物素)標記之蛋白質的萃取步驟及鑑定導致極佳的標記。
蛋白質係以對數計的經標記之細胞對未經標記之細胞的彼等倍數變化比排序。圖10顯示蛋白質體組成物揭露用於發現應激顆粒(SG)之新穎蛋白質的準確性及能力。富集之蛋白質中之62%為SG蛋白質，在不包括在當前的SG數據庫中的富集之蛋白質中，至少6種蛋白質經免疫細胞化學驗證與SG共定域化，示意經基於抗體之釕靶向之光標記可發現經標記之區域的新穎蛋白質。
圖11A至C顯示三種市場上可取得的光活化探針之結構調配物：圖11A：Ru(bpy) 3 2+，圖11B：核黃素和圖11C：孟加拉玫紅(上圖)。光標記係以完整FOV (波長(λ)=780 nm，功率=100 mW)與生物素基酪醯胺一起直接掃描在U-2OS細胞上執行。圖11D顯示最高的螢光訊號係使用Ru(bpy) 3 2+與0.005%之甲基紫精檢測。用於圖11之實驗方案：將U-2OS細胞在室溫下以含有500 µM去硫生物素-酚及100至1000 µM範圍之游離光反應性部分：Ru(bpy) 3 2+、核黃素和孟加拉玫紅的光標記試劑培育10 min。將雙光子顯微鏡系統以完整視野(FOV)用於空間上解析之光化學標記。將雙光子顯微鏡系統以100至200 mW之雷射功率使用於空間上解析之光標記，且使細胞進行100至200微秒之雷射曝光時間。將標記之細胞以含有10 mM抗壞血酸鈉、5 mM trolox及0.02%之疊氮化鈉的緩衝液清洗以淬滅光化學反應，且將細胞最後以PBST清洗三次。將標記之細胞以含有10 mM抗壞血酸鈉、5 mM trolox及0.02%之疊氮化鈉的緩衝液清洗以淬滅光化學反應，且將細胞最後以PBST清洗三次。將標記之細胞/訊號在含有3%之BSA/PBS/0.1%之Triton X-100的阻斷緩衝液中以中性抗生物素蛋白-DyLight 488探測1 h。接著將細胞在室溫下以核標誌(Hoechst 33258)經30 min染色。
圖12顯示光反應性部分與抗體成功共軛。將1 mg之抗體與Ru(bpy)-NHS以100倍莫耳比反應2 h或24 h，且將生成物以SEC-HPLC檢測以驗證Ru(bpy) 3 2+分子與抗體之共軛。SEC-HPLC顯示經Ru(bpy) 3 2+共軛之抗體(160 kDa)在10.4 min具有280 nm和455 nm的兩個特徵峰，表明Ru(bpy) 3 2+與抗體成功共軛。
圖13A至13B顯示光反應性部分與抗體成功共軛的結果。將10 mg重量之Ru(bpy) 3 2+抗體共軛，隨後使用40 kDa zeba旋轉脫鹽管柱移出未經共軛之Ru(bpy) 3 2+分子。在280 nm和455 nm的兩個吸光度觀察到大部分經Ru(bpy) 3 2+共軛之抗體峰。在16 min內在455 nm吸光度下未發現游離的Ru(bpy) 3 2+。關於圖12和13A至13B之實驗流程：參見1)「[釕基抗體之共軛]」(上文)，及2)：「[SEC-HPLC實驗流程(以驗證Ab-Ru共軛體]」。未經共軛之抗體及經Ru(bpy)-共軛之抗體(Ab-Ru)在天然狀態下的純度以SEC-HPLC測定。流動相為磷酸鈉緩衝液，pH 7.4。將試驗樣品以流動相稀釋至1 mg/mL，且將100 μL之生成物注入配備有TSKgel G3000SWXL管柱，7.8 mm ID×30 cm之HPLC系統中。將流動相以1.0 mL/min之等度流動應用至蛋白質分離。欲監測之溶析物的特徵為未經共軛之抗體(160 kDa)、Ab-Ru (160 kDa)、聚集體(＞160 kDa)及游離的Ru(bpy)分子(628 Da)。未經共軛之抗體及聚集體係以280 nm檢測，Ab-Ru及游離的Ru(bpy)分子係以455 nm檢測。所有的測量皆以光電二極體陣列檢測器進行。
圖14A至14C顯示使用釕基光反應性部分與抗體共軛的經誘導之細胞的特異性光標記的結果。圖14顯示經基於抗體之釕(Ab-Ru)靶向之光標記的實驗結果(應激顆粒標誌之共焦成像(綠色)，經光標記之訊號：去硫生物素(紅色)；比例尺：10 μm)。圖14A顯示在470 nm下照明。圖14B顯示對照組(沒有光)。圖14C顯示圖14A中所示之細胞的Z軸(側視圖)。經抗體共軛之Ru(bpy) 3 2+(Ab-Ru)經照光後產生具特異性及高解析度的結果。將U-2OS細胞經亞砷酸鹽誘導且與兔抗G3BP1(應激顆粒標誌：綠色)雜交以顯示用於標記之關注區域。將驢忼小鼠二級抗體與Ru(bpy) 3 2 + 共軛(Ab-Ru光活化探針)且與去硫生物素-酚及甲基紫精一起在470 nm LED波長下照光。在Dy-550中性抗生物素蛋白染色後觀察到清晰的應激顆粒圖案。沒有光的對照組在Dy-550中性抗生物素蛋白染色後未顯示出應激顆粒圖案。Z軸影像亦顯示使用Ab-Ru光活化探針在z平面之光標記效應的特異性及高解析度。關於圖14、17、18、20、22、23和24之實驗流程：「釕基抗體之雜交」(參見上文)，隨後參見「標記及分析」：將細胞以含有5 mM去硫生物素-酚及0.005%之甲基紫精的光標記試劑培育。將與顯微鏡系統耦合之470 nm LED雷射以100至200 mW之雷射功率使用於空間上解析之光標記，且使細胞進行37至1000微秒之雷射曝光時間。將標記之細胞以含有10 mM抗壞血酸鈉、5 mM trolox及0.02%之疊氮化鈉的緩衝液清洗以淬滅光化學反應，且將細胞最後以PBST清洗三次。
將標記之細胞/訊號在含有3%之BSA/PBS/0.1%之Triton X-100的阻斷緩衝液中以中性抗生物素蛋白-DyLight 488探測1 h，且將小鼠抗G3BP1抗體在室溫下與螢光標誌(山羊抗小鼠488)經1 h雜交。應用Zeiss LSM 880共焦顯微鏡以驗證標記訊號在xy截面及xz截面之胞器邊界內。
圖14顯示經基於抗體之釕(Ab-Ru)靶向之光標記的實驗結果(應激顆粒標誌之共焦成像(綠色)，經光標記之訊號：去硫生物素(紅色)；比例尺：10 μm)。
圖15顯示使用釕基光反應性部分與抗體之探針的小鼠腦組織樣品之選擇性光標記。對照組(沒有光)顯示沒有標記。將20 µM冷凍小鼠腦組織切片以兔抗核仁素(核標誌)染色，接著與抗兔Ab-Ru光活化探針(驢抗兔二級抗體與Ru(bpy) 3 2+共軛)雜交且與去硫生物素-酚及甲基紫精一起在457 nm LED波長下以功率10、20、30、40、50、60 mW照光。在Dy-550中性抗生物素蛋白染色後觀察到清晰的核圖案，以顯示在組織之選定區域上的光標記訊號(去硫生物素)。沒有光的對照區域未顯示出標記訊號。關於圖15、16和19的組織製備、初級抗體及Ab-Ru染色之實驗流程：「組織製備、初級抗體及Ab-Ru染色」。將經PFA固定之小鼠腦組織包埋在最適的切割溫度(OCT)之化合物中且冷凍切片至蓋玻片上。將10至30 µm小鼠腦切片在4℃下與兔抗NCL抗體在阻斷緩衝液[具有3%之BSA的PBS/0.1%之Triton X-100]中經隔夜培育。在以PBS/0.1%之Triton X-100清洗後，將10 μg/mL之抗體-Ru(bpy) 3共軛體在4℃下與初級抗體經隔夜雜交。接著將組織切片在室溫下以螢光標誌山羊抗兔AlexaFluor 647經1 h染色。關於圖15和16之額外實驗流程：「457 LED光源」：將10至30 µm組織切片與含有5 mM去硫生物素-酚及0.005%之甲基紫精的標記試劑培育。將與顯微鏡系統耦合之457 nm LED雷射以100至200 mW之雷射功率使用於空間上解析之光標記，且使組織切片進行37至1000微秒之雷射曝光時間。將標記之組織切片以含有10 mM抗壞血酸鈉、5 mM trolox及0.02%之疊氮化鈉的緩衝液清洗以淬滅光化學反應，且接著最後以PBST清洗三次。關於圖15、16和19之額外實驗流程：「驗證光標記性能」：將標記之組織/訊號在含有3%之BSA/PBS/0.1%之Triton X-100的阻斷緩衝液中以中性抗生物素蛋白-DyLight 550探測1 h。接著將組織切片在室溫下以核標誌(DAPI)經30 min染色。應用螢光顯微鏡或Zeiss LSM 880共焦顯微鏡以驗證標記訊號在xy截面及xz截面之核邊界內。
圖16顯示實驗結果，其顯示使用釕基光反應性部分與抗體之探針及中性抗生物素蛋白染色的小鼠腦組織樣品之光標記。將20 µM冷凍小鼠腦組織切片以兔抗核仁素(核標誌)染色，接著與抗兔Ab-Ru光活化探針(將驢抗兔二級抗體與Ru(bpy) 3 2+共軛)雜交且與去硫生物素-酚及甲基紫精一起在457 nm LED波長下照明。在Dy-550中性抗生物素蛋白染色後觀察到清晰的核圖案。Z軸影像顯示使用抗體-Ru(bpy) 3 2+光活化探針在z平面之光標記效應的特異性及高解析度。
圖17顯示實驗結果，其顯示使用釕基光反應性部分之探針及二級抗體誘餌之核仁區域的檢測。光標記訊號係使用雙光子技術標記。將經光標記(開)及未經標記(關)之關注區域使用Ab-Ru光活化探針(將驢抗兔二級抗體與Ru(bpy) 3 2+共軛)定域化在核仁內(兔抗NCL抗體：紅色)。將經光標記之(PL)訊號以抗去硫生物素(Dy-488中性抗生物素蛋白)染色。將PL訊號使用雙光子在波長=780 nm下標記。關於圖17、18、20、22、23、24之實驗流程：1).[在亞細胞上的雙光子標記用於LC-MS/MS定量分析](參見上文)，及2)[以螢光顯微術驗證雙光子標記之性能](參見上文)。
圖18A至18C顯示實驗結果，其顯示使用具有釕基光反應性部分之探針及結合初級抗體之Alexa fluor 568二級抗體誘餌的經光標記之亞細胞區室的檢測。圖18A顯示使用兔抗核仁素抗體之核仁檢測。圖18B顯示實驗結果，其顯示使用小鼠抗NPC抗體之核孔複合物檢測。圖18C顯示使用小鼠抗Ras GTPase活化蛋白質結合蛋白1抗體之應激顆粒檢測。
圖19顯示實驗結果，其顯示在固定的小鼠腦組織之特異性雙光子標記。關於圖19之實驗流程「2p標記」：將10至30 µm小鼠腦組織切片與含有5至7 mM去硫生物素-酚及0.005%之甲基紫精的雙光子(2P)標記試劑培育。將與顯微鏡系統耦合之雙光子雷射以10至200 mW之雷射功率使用於空間上解析之光標記，且使組織切片進行10至1000微秒之雷射曝光時間。將標記之組織切片以含有10 mM抗壞血酸鈉、5 mM trolox及0.02%之疊氮化鈉的緩衝液清洗以淬滅光化學反應，且將組織切片最後以PBST清洗三次。
圖20顯示實驗結果，其顯示經光標記之應激顆粒使用在及鄰近於酵素位點與酪胺酸殘基共價結合之經辣根過氧化酶活化之去硫生物素。關於圖20和21之實驗流程：「在光標記後的鄰近標記」：將標記之細胞/組織/訊號在室溫下在含有3%之BSA/PBS/0.1%之Triton X-100的阻斷緩衝液中以中性抗生物素蛋白-DyLight488或中性抗生物素蛋白-DyLight550探測1至2 h，隨後在室溫下以中性抗生物素蛋白-HRP(生物素-HRP)經1 h雜交。添加100 µm去硫生物素且在室溫下在細胞/組織樣品中培育30 min。添加過氧化氫以催化經HRP活化之去硫生物素在及鄰近於酵素位點與酪胺酸殘基共價結合。將鄰近標記之訊號在室溫下在含有3%之BSA/PBS/0.1%之Triton X-100的阻斷緩衝液中以中性抗生物素蛋白-DyLight550探測1 h。應用螢光顯微鏡或Zeiss LSM 880共焦顯微鏡以驗證標記訊號在xy截面及xz截面之胞器邊界內。
圖21顯示經光標記之小鼠肝組織樣品使用在及鄰近於酵素位點與酪胺酸殘基共價結合之經辣根過氧化酶活化之去硫生物素的鄰近標記。
圖22顯示使用與顯微光標記系統耦合之光活化套組，隨後以如本文所述之質譜分析之工作流程的實例。
圖23顯示實驗結果，其顯示描述使用在波長=780 nm之雙光子標記系統以抗體-釕光活化探針之精確且準確的經光標記之(PL)應激顆粒的共焦顯微照片。
圖24A至24C顯示使用抗體-釕光活化探針之雙光子標記。圖24A顯示雙光子標記Ab-Ru光活化探針之三種生物複製體的范恩圖。圖24B顯示在經光標記之樣品與對照樣品中的相對蛋白質水平(PL/CTL之比)以LOG 2維度的火山圖。過度表現(富集)之蛋白質顯示在以箭頭a和箭頭b為界的右上方。圖24C顯示在藉由PL/CTL之比排序的前50個蛋白質中發現74%之真陽性率(註釋為應激顆粒(sg))。實驗流程：參見上文的[LC-MS/MS分析]及[蛋白質鑑定及無標記量化]。
圖25A至25B顯示以PL/CTL之比排序的前50個蛋白質中之37個蛋白質經註釋為應激顆粒蛋白質(上圖)。以免疫螢光檢測驗證潛在的應激顆粒蛋白質。共焦顯微照片描述有或無亞砷酸鹽壓力刺激在U-2OS細胞中之潛在的應激顆粒蛋白質之應激顆粒形成。潛在的應激顆粒蛋白質(綠色)與熟知的G3BP1 SG標誌(紅色)高度共定域化。蛋白質體組成物揭露使用此方法發現新穎的應激顆粒生物標誌的準確性及能力(下圖)。透鏡：63x油。
當特徵或元件在本文被稱為在另一特徵或元件「上(on)」時，其可直接在另一特徵或元件上或亦可能有中介特徵及/或元件的存在。相反地，當特徵或元件被稱為「直接在」另一特徵或元件「上」時，沒有中介特徵或元件的存在。亦應理解當特徵或元件被稱為「連接」、「附接」或「偶合」至另一特徵或元件時，其可直接連接、附接或偶合至另一特徵或元件或可能有中介特徵或元件的存在。相反地，當特徵或元件被稱為「直接連接」、「直接附接」或「直接偶合」至另一特徵或元件時，沒有中介特徵或元件的存在。儘管已就一個實施態樣予以說明或顯示，但是如此說明或顯示之特徵及元件可應用至其他的實施態樣。那些熟習本技術領域者應意識到以經配置「鄰接」另一特徵而提及的結構或特徵可具有與鄰接的特徵重疊或位於其下方的部分。
本文所使用之術語僅以說明特定的實施態樣為目的，且不意欲限制本發明。例如，如本文所使用之單數形式「一(a)、(and)」及「該(the)」亦意欲包括複數形式，除非上下文另外其他明確的指示。應進一步理解當本說明書使用術語「包含(comprises及/或comprising)」時，其明確說明所述之特徵、步驟、操作、元件及/或組分的存在，但是不排除一或多個其他特徵、步驟、操作、元件、組分及/或彼等之群組的存在或添加。如本文所使用之術語「及/或」包括相關列出之項目中一或多者的任何及所有組合，且可縮寫為「/」。
為了容易說明，可於本文使用空間相對術語，諸如「之下(under)」、「下面(below)」、「較低(lower)」、「之上(over)」、「上面(upper)」及類似者，以說明如圖中所例證之一種元件或特徵與另一元件或特徵的關係。應理解，除了圖中所描述之之方位以外，空間相對術語亦意欲涵蓋設備在使用或操作中的不同方位。例如，若將圖中的設備倒置，則以在其他元件或特徵「之下(under或beneath)」所述之元件將定向在其他元件或特徵「之上(over)」。因此，示例性術語「之下(under)」可涵蓋「之上(over)」及「之下(under)」的兩種方位。可將設備以其他方式定向(旋轉90度或其他方位)且據此解釋本文所使用之空間相對敘詞。同樣地，術語「向上」、「向下」、「垂直」、「水平」及類似者僅以解釋為目的予以使用，除非另有其他具體的指示。
儘管術語「第一」及「第二」可在本文用以說明各種特徵/元件(包括步驟)，但是該等特徵/元件不應受到該等術語的限制，除非上下文另外其他指示。該等術語可用於區分一種特徵/元件與另一種特徵/元件。因此，在不脫離本發明之指導下，下文所討論之第一特徵/元件亦能稱為第二特徵/元件，且同樣地，下文所討論之第二特徵/元件亦能稱為第一特徵/元件。
在整篇本說明書及隨後之申請專利範圍中，除非上下文另有其他要求，否則單詞「包含(comprise)」及變化詞(諸如「包含(comprises及comprising)」)意指各種組分可共同地使用在方法及物品(例如包括設備及方法之組成件及裝置)中。例如，應理解術語「包含(comprising)」暗示納入任何所述之元件或步驟，但不排除任何其他元件或步驟。
通常應理解本文所述之裝置及方法中任一者為包容性(inclusive)，但是組分及/或步驟之全部或子集可另一選擇地為排他性，且可表示為「由各種組分、步驟、子組分或子步驟所組成」或另一選擇地「基本上由各種組分、步驟、子組分或子步驟所組成」。
如本文說明書及申請專利範圍中所使用(包括如實施例中所使用)及除非另有其他明確的指定，否則所有數字可如同以單詞「約(about或approximately)」為開頭讀取，即使該術語未明確出現。當說明大小及/或位置時，可使用慣用語「約(about或approximately)」指示所述之值及/或位置係在值及/或位置之合理的預期範圍內。例如，數值可具有所述值(或值之範圍)的+/-0.1%、所述值(或值之範圍)的+/-1%、所述值(或值之範圍)的+/-2%、所述值(或值之範圍)的+/-5%、所述值(或值之範圍)的+/-10%等之值。亦應理解本文所給出之任何數值包括約(about或approximately)該值，除非上下文另有其他指示。例如，若揭示值「10」，則亦揭示「約10」。意欲使本文所列舉之任何數值包括其中納入的所有子範圍。亦應理解當揭示值時，亦揭示「小於或等於該值」、「大於或等於該值」及在值之間的可能範圍，如熟習本技術領域者的適當理解。例如，若揭示值「X」，則亦揭示「小於或等於X」以及「大於或等於X」(例如在X為數值的情況下)。亦應理解在整個該申請案中，數據係以一些不同的格式提供，且此數據表示終點和起點及數據點之任何組合的範圍。例如，若揭示特定的數據點「10」及特定數據點「15」，則應理解被視為揭示大於、大於或等於、小於、小於或等於及等於10和15，以及介於10與15之間。亦應理解亦揭示兩個特定單元之間的各單元。例如，若揭示10和15，則亦揭示11、12、13和14。
本文所述之方法(包括使用者介面)中任一者可作為軟體、硬體或韌體實施，且可說明為儲存一組能夠由處理器執行之指令的非暫態電腦可讀取儲存媒體(例如電腦、平板電腦、智能手機等)，當由處理器執行時，由處理器控制步驟中任一者的執行，包括但不限於：展示、與使用者通訊、分析、修飾參數(包括定時、頻率、強度等)、測定、警報或類似者。
102:顯微鏡系統 104:窄帶光 106,209:基板 108:複數個細胞 108a:細胞 112:胞器 114:其他(及較大)區域的細胞及基板 116:細胞核 118:關注區域 205,205a,205’:光反應性探針 206,236:目標探針 207:標記系統 210:關注的生物分子 211,214:相鄰分子 212,212’:直接光反應性探針 216:初級抗體 226:生物素標籤 228:標的區域 231:更遠的生物分子 243’:經活化之酚基團 251:誘餌分子 253,253’:光反應性部分 254:箭頭 261:標籤部分 263:目標部分 271:標記複合物 272:連接子 274:酵素或觸媒 278,278’,278”:附加的目標探針 282:標籤 284:螢光連接子部分 301:標的生物分子
藉由參考以下提出例證性實施態樣之詳細說明及附圖獲得對本文所述之方法及裝置的特徵及優點更佳的理解，其中：
[圖1]顯示可用於在基板上光選擇性空間標籤化且鄰近標記細胞之系統的示意圖。
[圖2A]顯示具有標籤部分及目標部分之光反應性探針的示意圖例證。
[圖2B]顯示具有標籤部分及目標部分之目標探針的示意圖例證。
[圖2C]顯示具有去硫生物素標籤部分及酚目標部分之目標探針的實例。
[圖2D]經圖例證具有標籤部分及反應性酚部分之目標探針。
[圖2E]例證光反應性探針與目標探針之相互作用，使用圖2D所示之目標探針實現相鄰蛋白質的標記。
[圖2F至2G]經圖例證使用圖2A和2B所示之探針鄰近標籤化在靶區域中的生物分子的步驟。圖2F經圖例證光反應性探針與第一分子結合。
[圖2G]經圖例證在如圖2F所示之光反應性探針與第一分子結合後經光驅動之光反應性探針活化及光反應性探針結合至相鄰生物分子。
[圖2H]經圖例證可用於使用如圖2A和2B所示之探針標記生物分子之鄰近標記系統。
[圖2I]顯示比較在小的關注區域(ROI)中標記生物分子之不同方法的示意圖例證。右上圖例證直接的光化學標記及下圖例證使用如本文所述之光反應性探針及目標探針標記關注蛋白質的經光輔助之酵素標記。
[圖3A至3N]顯示可用於本文所述之光反應性探針之釕基光反應性部分的實例。圖3A顯示可用於本文所述之光反應性探針及方法之釕基光反應性部分的實例。
[圖3B]顯示釕基光反應性部分的另一實例。
[圖3C]顯示釕基光反應性部分的另一實例。
[圖3D]顯示釕基光反應性部分的另一實例。
[圖3E]顯示釕基光反應性部分的另一實例。
[圖3F]顯示釕基光反應性部分的另一實例。
[圖3G]顯示釕基光反應性部分的另一實例。
[圖3H]顯示釕基光反應性部分的另一實例。
[圖3I]顯示釕基光反應性部分的另一實例。
[圖3J]顯示釕基光反應性部分的另一實例。
[圖3K]顯示釕基光反應性部分的另一實例。
[圖3L]顯示釕基光反應性部分的另一實例。
[圖3M]顯示釕基光反應性部分的另一實例。
[圖3N]顯示釕基光反應性部分的另一實例。
[圖3O]顯示可用於本文所述之光反應性探針及方法之孟加拉玫紅部分及其衍生物的實例。
[圖3P至3Q]顯示可用於本文所述之光反應性探針及方法之螢光素衍生物的實例。
[圖3R]顯示可用於本文所述之光反應性探針及方法之亞甲藍衍生物的實例。
[圖3S至3T]顯示可用於本文所述之光反應性探針及方法之光黃素衍生物的實例。
[圖3U至3V]顯示可用於本文所述之光反應性探針及方法之核黃素及黃素衍生物的實例。
[圖3W和3X]顯示可用於本文所述之光反應性探針及方法之喋呤衍生物的實例。
[圖3Y]顯示釕基光反應性部分的另一實例。
[圖3Z]顯示釕基光反應性部分的另一實例。
[圖3AA]顯示釕基光反應性部分的另一實例。
[圖3AB]顯示釕基光反應性部分的另一實例。
[圖3AC]顯示釕基光反應性部分的另一實例。
[圖3AD]顯示釕基光反應性部分的另一實例。
[圖3AE]顯示釕基光反應性部分的另一實例。
[圖3AF]顯示釕基光反應性部分的另一實例。
[圖3AG]顯示釕基光反應性部分的另一實例。
[圖3AH]顯示釕基光反應性部分的另一實例。
[圖3AI]顯示釕基光反應性部分的另一實例。
[圖4A至4L]顯示可用於本文所述之光反應性探針之連結子部分的實例。
[圖5A至5E]顯示可用於本文所述之目標探針之標籤的實例。圖5A至5E顯示點擊化學分子。
[圖5F至5H]顯示可用於本文所述之探針及方法之生物素衍生物。
[圖5I]顯示可用於本文所述之探針及方法之長葉毛地黃配質。
[圖5J]顯示可用於本文所述之探針及方法之肽標籤的實例。
[圖5K]顯示可用於本文所述之探針及方法之SNAP-標籤的實例。
[圖6A至6L]顯示可用於本文所述之目標探針之目標部分的實例。
[圖7]經圖例證Ru(bpy) 3 2+經由基於NHS酯之醯胺偶合在抗體上共軛以形成光反應性探針。
[圖8]顯示經基於抗體之釕(Ab-Ru)靶向之光標記的實驗結果(核仁標誌之共焦成像(洋紅色；XY軸和Z軸結果的第一圖)、基於抗體之釕(紅色；自XY軸左起第二圖和Z軸向下第二圖)、經光(2P)標記之訊號：去硫生物素(綠色；自XY軸左起第三圖和Z軸向下第三圖)；比例尺：20 μm)。
[圖9]顯示小的關注區域(核仁)使用本文所揭示之Ab-Ru光反應性探針和生物素-酚目標探針及方法準確地經光標記。圖9顯示來自核仁標記實驗(圖8)的經鑑定之總蛋白質，其中蛋白質係以對數計的經標記之細胞對未經標記之細胞的彼等倍數變化比排序。
[圖10]顯示在使用本文所揭示之探針及方法鑑定之應激顆粒(SG)中的先前未經鑑定之蛋白質。蛋白質體組成物揭露使用該等方法發現新穎蛋白質的準確性及能力。
[圖11A至11D]顯示使用光反應性部分之強光標記。圖11A至11C顯示釕、核黃素和孟加拉玫紅部分之化學結構。圖11D顯示使用圖11A至11C所示之光反應性部分的細胞之螢光標記。
[圖12]顯示光反應性部分與抗體成功共軛。
[圖13A至13B]顯示光反應性部分與抗體成功共軛的結果。
[圖14A至14C]顯示使用釕基光反應性部分與抗體共軛的經誘導之細胞的特異性光標記的結果。圖14A顯示在470 nm下照光。圖14B顯示對照組(沒有光)。圖14C顯示在圖14A中所示之細胞的Z軸(側視圖)。
[圖15]顯示使用釕基光反應性部分與抗體之探針的小鼠腦組織樣品之選擇性光標記。對照組(沒有光)顯示沒有標記。
[圖16]顯示實驗結果，其顯示使用釕基光反應性部分與抗體之探針及中性抗生物素蛋白染色的小鼠腦組織樣品之光標記。
[圖17]顯示實驗結果，其顯示使用釕基光反應性部分之探針與二級抗體誘餌之核仁區域的檢測。光標記訊號係使用雙光子技術標記。
[圖18A至18C]顯示實驗結果，其顯示使用具有釕基光反應性部分之探針及結合初級抗體之Alexa fluor 568二級抗體誘餌的經光標記之亞細胞區室的檢測。圖18A顯示使用兔抗核仁素抗體之核仁檢測。圖18B顯示實驗結果，其顯示使用小鼠抗NPC抗體之核孔複合物檢測。圖18C顯示使用小鼠抗Ras GTPase活化蛋白質結合蛋白1抗體之應激顆粒檢測。
[圖19]顯示實驗結果，其顯示在固定的小鼠腦組織之特異性雙光子標記。
[圖20]顯示實驗結果，其顯示經光標記之應激顆粒使用經辣根過氧化酶活化之去硫生物素在及鄰近於酵素位點與酪胺酸殘基共價結合。
[圖21]顯示經光標記之小鼠肝組織樣品使用經辣根過氧化酶活化之去硫生物素在及鄰近於酵素位點與酪胺酸殘基共價結合之的鄰近標記。
[圖22]顯示使用與顯微鏡光標記系統配合之光活化套組，隨後以如本文所述之質譜分析之工作流程的實例。
[圖23]顯示實驗結果，其顯示描述使用在波長= 780 nm之雙光子標記系統以抗體-釕光活化探針之精確且準確的經光標記(PL)之應激顆粒的共焦顯微照片。
[圖24A至24C]顯示使用抗體-釕光活化探針之雙光子標記。圖24A顯示雙光子標記Ab-Ru光活化探針之三種生物複製體的范恩圖。圖24B顯示在經光標記之樣品與對照樣品中的相對蛋白質水平(PL/CTL之比)以LOG2維度的火山圖。過度表現(富集)之蛋白質顯示在以箭頭a和箭頭b為界的右上方。圖24C顯示在藉由PL/CTL之比排序的前50個蛋白質中發現74%之真陽性率(註釋為應激顆粒(sg))。
[圖25A至25B]顯示例證藉由免疫螢光檢測驗證潛在的應激顆粒蛋白質的結果。圖25A顯示以PL/CTL之比排序的前50個蛋白質中之37個蛋白質經註釋為應激顆粒蛋白質。圖25B顯示確認使用本文之方法檢測應激顆粒蛋白質的準確性及使用該等方法發現新穎的應激顆粒生物標誌的能力之蛋白質體組成物。
102:顯微鏡系統
104:窄帶光
106:基板
108:複數個細胞
108a:細胞
112:胞器
114:其他(及較大)區域的細胞及基板
116:細胞核
118:關注區域

Claims (93)

  1. 一種光反應性套組，其包含： 以式( I)表示之光反應性探針： ( I) 其中 該C部分為單一化學鍵或連結子； 該B部分包括1至50個光反應性部分且與該C部分結合，其中該1至50個光反應性部分之各者係衍生自以式( II)表示之釕基化合物： ( II) 其中在式 (II)中： L 1、L 2、L 3和L 4各自獨立為配位基；且 X 1和X 2各自獨立為具有反應性部分之配位基，其中該反應性部分經配置與該C部分鍵結； 該G部分包含與該C部分結合之誘餌分子，其中該誘餌分子為抗體且經配置與樣品中的第一分子共軛；及 主要目標探針，其包含與光可激發的目標部分結合之可檢測的標籤部分， 其中當該光反應性探針以雙光子光源在700 nm至1100 nm之波長範圍下或以單一光源在200 nm至1100 nm之波長範圍下經光活化且該主要目標探針藉由該經光活化之探針作用以形成經光激發之主要目標探針時，該經光激發之主要目標探針經配置與該樣品中的標的分子形成共價鍵。
  2. 如請求項1之光反應性套組，其中X 1和X 2各自獨立地選自由下列所組成之群組：3-乙炔基吡啶、3-(溴甲基)吡啶、順丁烯二醯亞胺、4'-甲基-4-羧基聯吡啶-N-琥珀醯亞胺酯、菸鹼醛、l-(4-(吡啶-3-基)-lH-1,2,3-三唑-1-基)乙酮、4-戊炔腈和4-胺基丁炔。
  3. 如請求項1之光反應性套組，其中L 1與L 2接合以形成第一雙配位基且L 3與L 4接合以形成第二雙配位基，其中該第一雙配位基及該第二雙配位基係獨立地選自由下列所組成之群組：2,2'-聯吡啶基(bpy)、4,4'-二氰基-5,5'-二甲基-2,2'-聯吡啶(CN-Me-bpy)、4,4'-二甲基-2,2'-聯吡啶(dmb)、4,4'-二-三級丁基-2,2'-聯吡啶(dbpy)、4,4',5,5'-四甲基-2,2'-聯吡啶(tmb)、2-苯基吡啶(ppy)、6-溴-2,2'-聯吡啶、6,6'-二溴-2,2'-聯吡啶、5-溴-2,2'-聯吡啶、6-胺基-2,2'-聯吡啶、6,6'-二胺基-2,2'-聯吡啶、2,2'-聯吡啶-6-甲腈、2,2'-聯吡啶-6,6'-雙(甲腈)、2,2'-聯吡啶-6-羧酸、2,2'-聯吡啶-6,6'-二羧酸和雙喹啉。
  4. 如請求項1之光反應性套組，其中該式( II)之釕基化合物為下列之一者： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、及彼等之衍生物。
  5. 如請求項1之光反應性套組，其中該光反應性部分包括下列部分： 、 、 、 、 、 、或彼等之衍生物。
  6. 如請求項1至5中任一項之光反應性套組，其中該連結子包括下列部分： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、或 。
  7. 如請求項1至6中任一項之光反應性套組，其中該連結子包括胺基酸、(PEG) n、寡核苷酸或肽之至少一者，其中n為1至20的整數。
  8. 如請求項1之光反應性套組，其中當該光反應性探針以雙光子光源在700 nm至1100 nm之波長範圍下經光活化且該主要目標探針藉由該經光活化之探針作用以形成經光激發之主要目標探針時，該經光激發之主要目標探針經配置與該樣品中的標的分子形成共價鍵。
  9. 如請求項1之光反應性套組，進一步其中當該光反應性探針以單一光源在300 nm至800 nm之波長範圍下經光活化且該主要目標探針藉由該經光活化之探針作用以形成經光激發之主要目標探針時，該經光激發之主要目標探針經配置與該樣品中的標的分子形成共價鍵。
  10. 如請求項1至6中任一項之光反應性套組，其中該可檢測的標籤部分為生物素衍生物、長葉毛地黃配質標籤、CLIP-標籤、鹵基標籤、SNAP-標籤、寡核苷酸、肽標籤和點擊化學標籤中至少一者，且該點擊化學標籤包含炔類部分或疊氮化物類部分。
  11. 如請求項1至6中任一項之光反應性套組，其中該光可激發的目標部分為下列中至少一者： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 (R’=CH 2CH 2OMe或Et)、 、 (X=N 2 +或Br)、 、及彼等之衍生物。
  12. 如請求項1至6中任一項之光反應性套組，其中該主要目標探針為去硫生物素-酚或生物素-酚。
  13. 如請求項1至6中任一項之光反應性套組，其中該光可激發的目標部分為 。
  14. 如請求項13之光反應性套組，其中該可檢測的標籤部分為生物素衍生物、點擊化學標籤、CLIP-標籤、長葉毛地黃配質標籤、鹵基標籤、寡核苷酸、肽標籤和SNAP-標籤中至少一者，且該光反應性部分包括下式部分： 。
  15. 如請求項1至6中任一項之光反應性套組，其另外包含連接子，其中該連接子可與該主要目標探針之該可檢測的標籤部分共軛。
  16. 如請求項15之光反應性套組，其中該連接子為螢光連接子。
  17. 如請求項15之光反應性套組，其另外包含標籤-酵素複合物，其中該標籤-酵素複合物可與該連接子共軛，且進一步其中該標籤-酵素複合物之該酵素包含過氧化酶。
  18. 如請求項1至6中任一項之光反應性套組，其另外包含： 連接子，其中該連接子可與該主要目標探針之該可檢測的標籤部分共軛； 標籤-酵素複合物，其中該標籤-酵素複合物之該標籤可與該連接子共軛，且進一步其中該標籤-酵素複合物之該酵素包含過氧化酶；及 附加的目標探針，其經配置與該標的分子藉由該標籤-酵素複合物之該過氧化酶的催化活性以形成附加的目標探針共價鍵。
  19. 如請求項18之光反應性套組，其中該附加的目標探針係與該主要目標探針相同或不同且包括附加的目標探針標籤部分和附加的目標探針目標部分。
  20. 如請求項18之光反應性套組，其中該連接子為螢光連接子。
  21. 如請求項1至6中任一項之光反應性套組，其中該光反應性探針的濃度範圍為0.1 ug/mL至100 ug/mL且該主要目標探針的濃度範圍為1 uM至20 mM。
  22. 一種光反應性套組，其包含： 以式( I)表示之光反應性探針： ( I) 其中 該C部分為單一化學鍵或連結子； 該B部分包括與該C部分結合之至少一個光反應性部分；且 該G部分包含與該C部分結合之誘餌分子；及 主要目標探針，其包含與光可激發的目標部分結合之可檢測的標籤部分， 其中該光反應性探針之該誘餌分子經配置與樣品中的第一分子共軛，且 其中當該光反應性探針經光活化且該主要目標探針藉由該經光活化之探針作用以形成經光激發之主要目標探針時，該經光激發之主要目標探針經配置與該樣品中的標的分子形成共價鍵。
  23. 如請求項22之光反應性套組，其中該誘餌分子包含下列中至少一者：抗體、抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白(neutravidin)、鏈黴抗生物素蛋白(streptavidin)、另一生物素結合蛋白、CLIP-標籤、鹵基標籤、SNAP-標籤、另一自行標記之蛋白質標籤、DNA或RNA螢光原位雜交(FISH)探針、另一RNA分子、另一核酸分子、蛋白質A、蛋白質G、蛋白質L、蛋白質A/G、蛋白質A/G/L、另一免疫球蛋白結合肽、藥物或另一小分子。
  24. 如請求項22之光反應性套組，其中該光反應性部分為下列中至少一者：核黃素、光黃素、另一黃素衍生物、螢光素或彼等之衍生物、亞甲藍或彼等之衍生物、miniSOG光敏感化蛋白質、殺手紅(Killer Red)光敏感化蛋白質、另一光敏感化蛋白質、喋呤或彼等之衍生物、釕基光觸媒和孟加拉玫紅或彼等之衍生物。
  25. 如請求項22之光反應性套組，其中該誘餌分子為抗體且複數個該光反應性部分係通過該C部分與該抗體結合，其中該複數個範圍為1至50。
  26. 如請求項22之光反應性套組，其中該光反應性部分經配置以容許該主要目標探針與該樣品的分子形成共價鍵。
  27. 如請求項25之光反應性套組，其中該光反應性部分係衍生自以式( II)表示之釕基化合物： ( II) 其中在式 (II)中： L 1、L 2、L 3和L 4各自獨立為配位基；且 X 1和X 2各自獨立為配位基，其中X 1和X 2中至少一者具有連結區域，其中該至少一個連結區域係與該光反應性探針之該C部分結合。
  28. 如請求項27之光反應性套組，其中X 1和X 2各自獨立地選自由下列所組成之群組：3-乙炔基吡啶、3-(溴甲基)吡啶、順丁烯二醯亞胺、4'-甲基-4-羧基聯吡啶-N-琥珀醯亞胺酯、菸鹼醛、l-(4-(吡啶-3-基)-lH-1,2,3-三唑-1-基)乙酮、4-戊炔腈和4-胺基丁炔。
  29. 如請求項27之光反應性套組，其中L 1與L 2接合以形成第一雙配位基且L 3與L 4接合以形成第二雙配位基，其中該第一雙配位基及該第二雙配位基係獨立地選自由下列所組成之群組：2,2'-聯吡啶基(bpy)、4,4'-二氰基-5,5'-二甲基-2,2'-聯吡啶(CN-Me-bpy)、4,4'-二甲基-2,2'-聯吡啶(dmb)、4,4'-二-三級丁基-2,2'-聯吡啶(dbpy)、4,4',5,5'-四甲基-2,2'-聯吡啶(tmb)、2-苯基吡啶(ppy)、6-溴-2,2'-聯吡啶、6,6'-二溴-2,2'-聯吡啶、5-溴-2,2'-聯吡啶、6-胺基-2,2'-聯吡啶、6,6'-二胺基-2,2'-聯吡啶、2,2'-聯吡啶-6-甲腈、2,2'-聯吡啶-6,6'-雙(甲腈)、2,2'-聯吡啶-6-羧酸、2,2'-聯吡啶-6,6'-二羧酸和雙喹啉。
  30. 如請求項27之光反應性套組，其中該式( II)之釕基化合物為下列中任一者： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、及彼等之衍生物。
  31. 如請求項22之光反應性套組，其中該光反應性部分包括下列部分： 、 、 、 、 、 、或彼等之衍生物。
  32. 如請求項22之光反應性套組，其中該連結子包括下列部分： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、或 。
  33. 如請求項22之光反應性套組，其中該連結子包括胺基酸、(PEG) n、寡核苷酸或肽之至少一者，其中n為1至20的整數。
  34. 如請求項22之光反應性套組，其中該光反應性部分以光源在200 nm至1100 nm之波長範圍下可經活化以容許該主要目標探針與該樣品中的該標的分子形成共價鍵。
  35. 如請求項22之光反應性套組，其中該光反應性部分以雙光子光源在700 nm至1100 nm之波長範圍下可經活化以容許該主要目標探針與該樣品中的該標的分子形成共價鍵。
  36. 如請求項27之光反應性套組，其中該光反應性部分以光源在300 nm至800 nm之波長範圍下可經活化以容許該主要目標探針與該樣品中的該標的分子形成共價鍵。
  37. 如請求項27之光反應性套組，其中該光反應性部分以雙光子光源在700 nm至1100 nm之波長範圍下可經活化以容許該主要目標探針與該樣品中的該標的分子形成共價鍵。
  38. 如請求項22之光反應性套組，其中該可檢測的標籤部分為生物素衍生物、CLIP-標籤、長葉毛地黃配質標籤、鹵基標籤、寡核苷酸、肽標籤、SNAP-標籤和點擊化學標籤中至少一者，且該點擊化學標籤包含炔系部分或疊氮化物系部分。
  39. 如請求項22之光反應性套組，其中該目標部分為下列中一或多者： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 (R’=CH 2CH 2OMe或Et)、 、 (X=N 2 +或Br)、 、及彼等之衍生物。
  40. 如請求項22之光反應性套組，其中該主要目標探針為去硫生物素-酚或生物素-酚。
  41. 如請求項27之光反應性套組，其中該光可激發的目標部分為 。
  42. 如請求項41之光反應性套組，其中該可檢測的標籤部分為生物素衍生物、點擊化學標籤、CLIP-標籤、長葉毛地黃配質標籤、鹵基標籤、寡核苷酸、肽標籤和SNAP-標籤中至少一者，且該光反應性部分包括下式部分： 。
  43. 如請求項22至42中任一項之光反應性套組，其另外包含連接子，其中該連接子可與該主要目標探針之該可檢測的標籤部分共軛。
  44. 如請求項43之光反應性套組，其中該連接子為螢光連接子。
  45. 如請求項43之光反應性套組，其另外包含標籤-酵素複合物，其中該標籤-酵素複合物可與該連接子共軛，且進一步其中該標籤-酵素複合物之該酵素包含過氧化酶。
  46. 如請求項37至42中任一項之光反應性套組，其另外包含： 連接子，其中該連接子可與該主要目標探針之該可檢測的標籤部分共軛； 標籤-酵素複合物，其中該標籤-酵素複合物之該標籤可與該連接子共軛，且進一步其中該標籤-酵素複合物之該酵素包含過氧化酶；及 附加的目標探針，其經配置與該標的分子藉由該標籤-酵素複合物之該過氧化酶的催化活性以形成附加的目標探針共價鍵。
  47. 如請求項46之光反應性套組，其中該附加的目標探針與該主要目標探針不同且包括附加的目標探針標籤部分和附加的目標探針目標部分。
  48. 如請求項46之光反應性套組，其中該連接子為螢光連接子。
  49. 如請求項22之光反應性套組，其中該光反應性探針的濃度範圍為0.1 ug/mL至100 ug/mL且該主要目標探針的濃度範圍為1 uM至20 mM。
  50. 一種用於光反應性標記之方法，該方法包含： 將如請求項22至33及40至42中任一項之光反應性套組之複數個光反應性探針遞送至樣品； 將該光反應性探針的第一部分之該誘餌分子與該樣品中的複數個第一分子經非共價共軛； 將如請求項22至33及40至42中任一項之光反應性套組之複數個主要目標探針遞送至該樣品； 以光輻射選擇性地照光該樣品的選定之關注區域，藉以活化複數個光反應性探針的該光反應性部分以在該選定之區域中形成複數個經光活化之光反應性探針； 將該主要目標探針之光可激發的目標部分經複數個經光活化之光反應性探針光激發以形成具有經光激發之目標部分的複數個經光激發之主要目標探針；及 在複數個該經光激發之主要目標探針與在該樣品中的該選定之關注區域中的複數個標的分子之間形成共價鍵，藉以使複數個該主要目標探針與複數個該標的分子結合。
  51. 如請求項50之方法，其中該光反應性探針的第一部分之該誘餌分子與該樣品中的複數個第一分子經非共價共軛的步驟留下未經共軛之該光反應性探針的第二部分，該方法另外包含以下步驟： 將該未經共軛之光反應性探針自該樣品移出。
  52. 如請求項50之方法，其另外包含以下步驟： 將複數個連接子遞送至該樣品；及 將複數個該連接子與複數個該主要目標探針之該可檢測的標籤部分共軛。
  53. 如請求項52之方法，其中複數個該連接子包含螢光連接子，該方法另外包含以下步驟： 檢測在該樣品中的複數個該螢光連接子的位置，且藉以鑑定複數個該主要目標探針及與彼等經共價結合之複數個該標的分子的位置。
  54. 如請求項50之方法，其中該光激發的步驟另外包含光激發該主要目標探針以形成複數個經光激發之各具有游離基的主要目標探針，且其中該形成共價鍵的步驟包含在複數個該經光激發之主要目標探針之各者與在該樣品中的該選定之關注區域中的複數個該標的分子之各者中的胺基酸之間形成共價鍵。
  55. 如請求項50之方法，其中該形成共價鍵的步驟包含在複數個該經光激發之主要目標探針之各者與在該樣品中的該選定之關注區域中的複數個該標的分子之各者中的胺基酸之間形成共價鍵。
  56. 如請求項54或55之方法，其中該胺基酸係選自由下列所組成之群組：丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺酸、天冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、蛋胺酸、苯基丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸和纈胺酸。
  57. 如請求項52或53之方法，其另外包含以下步驟： 將如請求項46或47之光反應性套組之該連接子遞送至該樣品，其中該連接子可與該主要目標探針之該可檢測的標籤部分共軛； 將如請求項46或47之光反應性套組之該標籤-過氧化酶複合物遞送至該樣品，其中該標籤-酵素複合物之該標籤可與該連接子共軛，且進一步其中該標籤-酵素複合物之該酵素包含過氧化酶； 將如請求項46或47之光反應性套組之附加的目標探針遞送至該樣品，其中該附加的目標探針經配置與該標的分子藉由該標籤-酵素複合物之該過氧化酶的催化活性以形成附加的目標探針共價鍵；及 將該標籤-過氧化酶複合物與該連接子共軛，其中該標籤-過氧化酶催化該附加的目標探針以在該附加的目標探針與該樣品之間形成共價鍵。
  58. 如請求項57之方法，其中該標籤-過氧化酶複合物活化該附加的目標探針以在該附加的目標探針之該目標部分具有游離基且在該附加的目標探針之該目標部分與該樣品的酪胺酸之間形成共價鍵。
  59. 一種分析方法，其包含： 將如請求項22至33及40至42中任一項之光反應性套組之複數個光反應性探針遞送至該樣品； 將該光反應性探針的第一部分之該誘餌分子與該樣品中的複數個第一分子經非共價共軛； 將如請求項22至33及40至42中任一項之光反應性套組之複數個主要目標探針遞送至該樣品；及 自影像導引系統之成像光源照光該樣品； 將該照光之樣品以相機成像； 以相機獲取在第一視野中的該樣品之至少一個亞細胞形態影像； 處理該至少一個影像且基於該經處理之影像以測定在該樣品中的關注區域； 獲得該關注區域的坐標訊息；且 根據坐標訊息，藉由光輻射選擇性地照明該關注區域以活化該光反應性部分，其中該經活化之光反應性部分容許該主要目標探針在該關注區域與該樣品形成共價鍵。
  60. 如請求項59之方法，其中該選擇性地照光的步驟包含照光10 us/像素至200 us/像素、25 us/像素至400 us/像素、50 us/像素至300 us/像素、75 us/像素至200 us/像素或400 us/像素至5000 us/像素的區域。
  61. 如請求項59之方法，其中該選擇性地照光的步驟包含以1µW至300 mW之功率強度照明。
  62. 如請求項59之方法，其中該選擇性地照明的步驟包含照光藉由點展開函數限定的區段。
  63. 如請求項59之方法，其另外包含將連接子與該主要目標探針共軛及藉由可檢測的標記之活性可檢測地鄰近標記與該標的分子鄰近的相鄰分子。
  64. 如請求項63之方法，其中該可檢測地鄰近標記的步驟包含鄰近標記直徑少於5 um、少於2 um、少於1 um、少於500 nm、少於300 nm、少於200 nm、少於100 nm、少於50 nm或少於20 nm的區域。
  65. 如請求項63之方法，其中該連接子包含催化標記。
  66. 如請求項59之方法，其中該樣品包含至少1、至少100、至少1000或至少10,000個活或固定細胞。
  67. 如請求項59之方法，其中該樣品包含固定細胞、固定組織、細胞萃取物或組織萃取物。
  68. 如請求項59之方法，其另外包含使該經選擇性地照光之樣品經質譜分析或測序分析的步驟。
  69. 如請求項59之方法，其中該經活化之光活化部分活化該主要目標探針，藉以具有游離基且在該選定之關注區域與該樣品之胺基酸形成共價鍵。
  70. 一種用於處理樣品以預測生物標誌之質譜實施方法，該方法包含： 將樣品分成光標記樣品組和非標記樣品組； 將如請求項22至49中任一項記載之光反應探針及主要目標探針遞送至該光標記樣品組和該非標記樣品組； 選擇性地照光該光標記樣品組的選定之關注區域且保持該非標記樣品組在暗處，其中該照光步驟容許該主要目標探針與該樣品形成共價鍵； 通過在該主要目標探針與複數個親和性磁珠之間的親和性沈澱以自該光標記樣品組和該非標記樣品組萃取複數個該經探針結合之蛋白質； 使該經萃取之蛋白質進行質譜分析； 根據該個別蛋白質之肽片段的強度值計算在該光標記樣品組與該非標記樣品組之間的經鑑定之蛋白質列表中的個別蛋白質之相對量化值； 測定在該光標記樣品組與該非標記樣品組之間的該相對量化值之閾值；及 在測定該閾值後，預測對應於超過該閾值之該個別蛋白質的該相對量化值之至少一種生物標誌。
  71. 如請求項70之方法，其另外包含將該誘餌分子與該樣品中的標的分子非共價共軛的步驟。
  72. 如請求項70之方法，其中該選擇性地照光該選定之關注區域的步驟另外包含活化在該選定之區域中的該光反應性部分的步驟，藉以容許該經活化之光反應性部分容許該主要目標探針與該選定之關注區域中的該樣品形成共價鍵。
  73. 如請求項70之方法，其另外包含將該光反應性探針之該誘餌分子遞送至該樣品的步驟。
  74. 如請求項70之方法，其另外包含自該樣品移出未經共軛之光反應性探針的步驟，藉以容許該光反應性探針引導在該選定之關注區域的該選擇性地照明。
  75. 如請求項70之方法，其另外包含將如請求項43及45至47中任一項之光反應性套組之該連接子遞送至該樣品及將該連接子通過在該連接子與該主要目標探針之間的親和性與該主要目標探針共軛的步驟。
  76. 如請求項75之方法，其中該連接子為用於鑑定與該主要目標探針經共價結合之該樣品的位置之螢光連接子。
  77. 如請求項72之方法，其中該經活化之光反應性部分活化該主要目標探針，藉以具有游離基且在該選定之關注區域與該樣品之胺基酸形成共價鍵。
  78. 如請求項77之方法，其中該胺基酸係選自由下列所組成之群組：丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺酸、天冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、蛋胺酸、苯基丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸和纈胺酸。
  79. 如請求項75或76之方法，其另外包含將如請求項46至47中任一項之光反應性套組之該標籤-過氧化酶遞送至該樣品及將該標籤-過氧化酶與該連接子共軛的步驟，藉以容許該標籤-過氧化酶催化該附加的目標探針以在該附加的目標探針與該樣品之間形成共價鍵。
  80. 如請求項79之方法，其中該標籤-過氧化酶活化該附加的目標探針以在該附加的目標探針之該目標部分具有游離基且在該附加的目標探針之目標部分與該樣品的酪胺酸之間形成共價鍵。
  81. 一種用於處理經光標記之樣品以鑑定生物標誌列表之質譜實施方法，該方法包含： 獲得樣品； 將如請求項22至49中任一項之光反應性套組遞送至該樣品； 選擇性地照光該生物樣品的選定之關注區域，藉以容許該主要目標探針標記在該選定之關注區域的該樣品之蛋白質； 通過在該主要目標探針與複數個親和性磁珠之間的親和性沈澱以自該樣品萃取複數個該經探針標記之蛋白質； 使該經萃取之蛋白質進行質譜分析；及 鑑定該樣品的該經萃取之蛋白質。
  82. 如請求項81之方法，其另外包含計算該樣品的經鑑定之蛋白質列表的各蛋白質之肽片段的強度值的步驟。
  83. 如請求項81之方法，其另外包含將該經鑑定之蛋白質列表根據各蛋白質的該強度值排序的步驟。
  84. 如請求項81之方法，其另外包含將該誘餌分子與該樣品中的標的分子非共價共軛的步驟。
  85. 如請求項81之方法，其中該選擇性地照光該選定之關注區域的步驟另外包含活化在該選定之區域中的該光反應性部分的步驟，藉以容許該經活化之光反應性部分容許該主要目標探針在該選定之關注區域與該樣品形成共價鍵。
  86. 如請求項81之方法，其另外包含將該光反應性探針之該誘餌分子遞送至該樣品的步驟。
  87. 如請求項81之方法，其另外包含自該樣品移出未經共軛之光反應性探針的步驟，藉以容許該光反應性探針引導在該選定之關注區域的該選擇性地照光。
  88. 如請求項81之方法，其另外包含將如請求項43及45至47中任一項之光反應性套組之該連接子遞送至該樣品及將該連接子通過在該連接子與該主要目標探針之間的親和性與該主要目標探針共軛的步驟。
  89. 如請求項88之方法，其中該連接子為用於鑑定與該主要目標探針經共價結合之該樣品的位置之螢光連接子。
  90. 如請求項85之方法，其中該經活化之光反應性部分活化該主要目標探針，藉以具有游離基且在該選定之關注區域與該樣品之胺基酸形成共價鍵。
  91. 如請求項90之方法，其中該胺基酸係選自由下列所組成之群組：丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺酸、天冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、蛋胺酸、苯基丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸和纈胺酸。
  92. 如請求項88或89之方法，其另外包含將如請求項46至47中任一項之光反應性套組之該標籤-過氧化酶遞送至該樣品及將該標籤-過氧化酶與該連接子共軛的步驟，藉以容許該標籤-過氧化酶催化該附加的目標探針以在該附加的目標探針與該樣品之間形成共價鍵。
  93. 如請求項92之方法，其中該標籤-過氧化酶活化該附加的目標探針以在該附加的目標探針之該目標部分具有游離基且在該附加的目標探針之目標部分與該樣品的酪胺酸之間形成共價鍵。
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