JP2015007652A - 検体中の測定対象成分の測定方法及び測定用キット - Google Patents
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Abstract
【解決手段】検体中の測定対象成分と、該測定対象成分に結合する第1抗体とを、脂肪酸アルカノールアミド存在下に反応させた後、該測定対象成分に結合する第2抗体に標識が結合した標識化第2抗体を反応させて、第1抗体、該測定対象成分、及び、標識化第2抗体からなる免疫複合体を生成させ、生成した該免疫複合体中の標識量を測定することを特徴とする、測定対象成分の測定方法、及び、当該測定方法に用いる検体中の測定対象成分の測定用キット。
【選択図】なし
Description
[2] 標識化第2抗体を、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤存在下に反応させる、[1]記載の方法。
[3] 検体中の測定対象成分と、該測定対象成分に結合する第1抗体とを反応させた後、該測定対象成分に結合する第2抗体に標識が結合した標識化第2抗体を、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤存在下に反応させて、第1抗体、該測定対象成分、及び、標識化第2抗体からなる免疫複合体を生成させ、生成した該免疫複合体中の標識量を測定することを特徴とする、測定対象成分の測定方法。
[4] 脂肪酸アルカノールアミドが、脂肪酸ジエタノールアミドである[1]又は[2]記載の方法。
[5] ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、及び、エチレンジアミンポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物からなる群より選ばれるポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤である[2]又は[3]記載の方法。
[6] 脂肪酸アルカノールアミドが、脂肪酸ジエタノールアミドであり、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、及び、エチレンジアミンポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物からなる群より選ばれるポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤である[2]記載の方法。
[8] 胆汁酸誘導体が、両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体である[7]記載の方法。
[9] 両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、3−[(3−コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]プロパンスルホネート又は3−[(3−コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]−2−ヒドロキシプロパンスルホネートである[8]記載の方法。
[10] 胆汁酸誘導体が、非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体である[7]記載の方法。
[11] 非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、N,N−ビス(3−グルコンアミドプロピル)コールアミド又はN,N−ビス(3−D−グルコンアミドプロピル)デオキシコールアミドである[10]記載の方法。
[12] 第1抗体が、不溶性担体に不動化されている[1]〜[11]のいずれかに記載の測定方法。
[13] 検体が、全血である[1]〜[12]のいずれかに記載の方法。
[14] 測定対象成分が、MxA蛋白質である[1]〜[13]のいずれかに記載の方法。
[16] 第2試薬が、更にポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤を含む[15]記載のキット。
[17] 測定対象成分に結合する第1抗体を含む第1試薬と、測定対象成分に結合する第2抗体に標識が結合した標識化第2抗体、及び、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤を含む第2試薬とを含むことを特徴とする、検体中の測定対象成分の測定用キット。
[18] 脂肪酸アルカノールアミドが、脂肪酸ジエタノールアミドである[15]又は[16]記載のキット。
[19] ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、及び、エチレンジアミンポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物からなる群より選ばれるポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤である[16]又は[17]記載のキット。
[20] 脂肪酸アルカノールアミドが、脂肪酸ジエタノールアミドであり、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、及び、エチレンジアミンポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物からなる群より選ばれるポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤である[16]記載のキット。
[22] 胆汁酸誘導体が、両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体である[21]記載のキット。
[23] 両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、3−[(3−コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]プロパンスルホネート又は3−[(3−コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]−2−ヒドロキシプロパンスルホネートである[22]記載のキット。
[24] 胆汁酸誘導体が、非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体である請[21]記載のキット。
[25] 非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、N,N−ビス(3−グルコンアミドプロピル)コールアミド又はN,N−ビス(3−D−グルコンアミドプロピル)デオキシコールアミドである[24]記載のキット。
[26] 第1抗体が、不溶性担体に不動化されている[15]〜[25]のいずれかに記載のキット。
[27] 検体が、全血である[15]〜[26]のいずれかに記載のキット。
[28] 測定対象成分が、MxA蛋白質である[15]〜[27]のいずれかに記載のキット。
本発明において使用される検体としては、本発明による測定を可能とする検体であれば特に制限はなく、例えば全血(血液)、血球、血清、血漿、髄液、尿、組織、培養細胞が挙げられる。尚、全血には、全血由来の血球分画に血漿が混合している検体も含まれる。全血としては、被検者より採取した血液そのものでもよいが、採取した血液を処理したものでもよく、処理した血液が好ましい。当該処理としては、例えば抗凝固処理、溶血処理等が挙げられ、これらの処理を組み合わせてもよい。
本発明における測定対象成分としては、本発明による測定を可能とする測定対象成分であれば特に制限はなく、例えば核酸、蛋白質、脂質、ビタミン、多糖類等が挙げられる。核酸としてはDNA、RNA、ATP、ADP、AMP、サイクリックAMP等が挙げられる。また、蛋白質としては酵素、ホルモン、各種ペプチド等が挙げられる。
本発明における脂肪酸アルカノールアミドとしては、例えば脂肪酸ジエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸N−メチルエタノールアミド、脂肪酸モノイソプロパノールアミド、脂肪酸ジイソプロパノールアミド等が挙げられ、脂肪酸ジエタノールアミドが好ましい。脂肪酸ジエタノールアミドとしては、例えばラウリン酸ジエタノールアミド、カプリン酸ジエタノールアミド、カプリル酸ジエタノールアミド、デカン酸ジエタノールアミド、ミリスチン酸ジエタノールアミド、パルミチン酸ジエタノールアミド、ステアリン酸ジエタノールアミド、イソステアリン酸ジエタノールアミド、オレイン酸ジエタノールアミド、リノール酸ジエタノールアミド、オクチルデカン酸ジエタノールアミド、ココナッツ油脂肪酸ジエタノールアミド、ヤシ脂肪酸ジエタノールアミド、牛脂脂肪酸ジエタノールアミド、アルキルアルカノールアミド、パーム核油脂肪酸ジエタノールアミドが挙げられる。これらの中で、オレイン酸ジエタノールアミド、ヤシ脂肪酸ジエタノールアミド、パーム核油脂肪酸ジエタノールアミドが好ましい。オレイン酸ジエタノールアミドの具体例(市販品)としては、例えばスタホームDO、スタホームDOS(以上、日油社製)等、ヤシ脂肪酸ジエタノールアミドの具体例(市販品)としては、スタホームF、スタホームDFC、スタホームDF4(以上、日油社製)等、パーム核油脂肪酸ジエタノールアミドの具体例(市販品)としては、アミノーンPK−02S、アミノーンPK−03S(以上、花王社製)等が挙げられる。
本発明におけるポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤は、本発明の測定方法を可能とするものであれば特に制限はなく、例えばポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物(以下、POE・POP縮合物と記す)、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル(以下、POE・POPアルキルエーテルと記す)、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルフェニルエーテル(以下、POE・POPアルキルフェニルエーテルと記す)、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル(以下、POE多環フェニルエーテルと記す)、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン多環フェニルエーテル(以下、POE・POP多環フェニルエーテルと記す)、または、エチレンジアミンポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物(以下、エチレンジアミンPOE・POP縮合物と記す)等が挙げられ、POE・POP縮合物、POE・POPアルキルエーテル、エチレンジアミンPOE・POP縮合物が好ましく、POE・POP縮合物が特に好ましい。
本発明における胆汁酸誘導体としては、本発明の測定を可能とするものであれば特に制限はないが、例えば両性界面活性剤作用を有する胆汁酸誘導体、非イオン性界面活性剤作用を有する胆汁酸誘導体等が挙げられる。両性界面活性剤作用を有する胆汁酸誘導体としては、例えば3−[(3−コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]プロパンスルホネート{3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonic acid}(以下、CHAPSと略記する)、3−[(3−コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]−2−ヒドロキシプロパンスルホネート{3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-2-hydroxypropanesulfonic acid}(以下、CHAPSOと略記する}等が挙げられる。
本発明における抗体としては、測定対象成分に特異的に結合する抗体であれば特に制限はなく、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれも使用できるが、モノクローナル抗体が好ましい。また、本発明における抗体としては、抗体をパパイン処理により得られるFab、ペプシン処理により得られるF(ab’)2、ペプシン処理−還元処理により得られるFab’等のFc部分を除去した抗体フラグメントも使用できる。抗体フラグメントとしては、F(ab’)2が好ましい。
本発明の測定方法は、検体中の測定対象成分と、該測定対象成分に結合する第1抗体とを、脂肪酸アルカノールアミド存在下に反応させた後、該測定対象成分に結合する第2抗体に標識が結合した標識化第2抗体を反応させて、第1抗体、該測定対象成分、及び、標識化第2抗体からなる免疫複合体を生成させ、生成した該免疫複合体中の標識量を測定することを特徴とする、測定対象成分の測定方法である。また、本発明の測定方法は、検体中の測定対象成分と、該測定対象成分に結合する第1抗体とを反応させた後、該測定対象成分に結合する第2抗体に標識が結合した標識化第2抗体を、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤存在下に反応させて、第1抗体、該測定対象成分、及び、標識化第2抗体からなる免疫複合体を生成させ、生成した該免疫複合体中の標識量を測定することを特徴とする、測定対象成分の測定方法である。本発明の測定方法の具体的態様を以下に示す。
(2)該測定対象成分と該測定対象成分に結合する第1抗体とを反応させ(第1反応工程)、次いで、該測定対象成分に結合する第2抗体に標識が結合した標識化第2抗体を、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤存在下に反応させて(第2反応工程)、第1抗体、該測定対象成分、及び、標識化第2抗体からなる免疫複合体を生成させ、生成した該免疫複合体中の標識量を測定する(検出工程)方法。
(3)該測定対象成分と該測定対象成分に結合する第1抗体とを、脂肪酸アルカノールアミド存在下に反応させ(第1反応工程)、次いで、該測定対象成分に結合する第2抗体に標識が結合した標識化第2抗体を、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤存在下に反応させて(第2反応工程)、第1抗体、該測定対象成分、及び、標識化第2抗体からなる免疫複合体を生成させ、生成した該免疫複合体中の標識量を測定する(検出工程)方法。
標識物質が酵素、アビジン、蛍光を発する蛋白質、フィコビリ蛋白質、タグ配列を含むポリペプチド等のポリペプチドである場合には、公知の遺伝子組換え技術(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)に従って、標識物質と抗体の融合蛋白質をコードするDNAを含む発現ベクターを作製し、発現ベクターを適当な宿主に導入して、宿主を培養することにより製造することができる。融合蛋白質をコードするDNAは、抗体および標識物質をそれぞれコードするDNAをPCR等でクローニングし、それぞれのDNAをリガーゼ反応で連結することにより得ることができる。
(4)測定対象成分を、脂肪酸アルカノールアミドの存在下、競合物質に標識が結合した標識化競合物質、及び、該測定対象成分と標識化競合物質の両者に結合する抗体と反応させ(競合反応工程)、生成した該標識化競合物質と該抗体の免疫複合体中の標識量を測定する(検出工程)方法。
(5)測定対象成分を、脂肪酸アルカノールアミドの存在下、競合物質、及び、該測定対象成分と該競合物質の両者に結合する抗体に標識が結合した標識化抗体と反応させ(競合反応工程)、生成した該競合物質と該標識化抗体の免疫複合体中の標識量を測定する(検出工程)方法。
本発明の測定用キットは、検体中の測定対象成分の免疫学的測定用キットであって、本発明の測定方法に使用することができる。
(2)測定対象成分に結合する第1抗体を含む第1試薬と、測定対象成分に結合する第2抗体に標識が結合した標識化第2抗体、及び、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤を含む第2試薬とを含む、検体中の測定対象成分の測定用キット。
(3)測定対象成分に結合する第1抗体、及び、脂肪酸アルカノールアミドを含む第1試薬と、測定対象成分に結合する第2抗体に標識が結合した標識化第2抗体、及び、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤を含む第2試薬とを含む、検体中の測定対象成分の測定用キット。
以下のようにして、エピトープの異なる2種類の抗ヒトMxA蛋白質モノクローナル抗体KM1124(WO96/05230)およびKM1135(WO96/05230)を調製した。なお、KM1124は、ヒトMxA蛋白質のアミノ末端から220〜297残基中に存在するエピトープ、KM1135はヒトMxA蛋白質のアミノ末端から10〜220残基中に存在するエピトープとそれぞれ結合するマウスモノクローナル抗体である。
ヒトMxA蛋白質をコードするcDNAを含むNdeI-BamHI断片(GenbankにBC032602として登録されている塩基配列を基に調製)を、ベクターpET-14b[ノバジェン(Novagen)、EMDバイオサイエンシズ(EMD Biosciences)社製]のNdeI-BamHI間に挿入して作製したヒトMxA蛋白質発現ベクターpET14b-MxA(Nucleic Acids Res, 32, 643-652, 2004)でEscherichia coli BL21 (DE3) pLysS株を形質転換した。この形質転換体は、N末端にHisタグが付加したMxA蛋白質を発現する。
接着性のヒトグリア芽細胞種由来の細胞株T98G(DSファーマバイオメディカル株式会社より購入、J. Cell. Physiol., 99, 43-54, 1979)を、10%ウシ胎児血清(FBS)、1%非必須アミノ酸(インビトロジェン社製)、1mmol/Lピルビン酸ナトリウム(インビトロジェン社製)を添加したE-MEM培地(和光純薬工業社製)10mLを添加した細胞培養用の10mLフラスコ内で、コンフルエントになるまで、炭酸ガス培養装置(5%CO2、37℃)を用いて2〜3日間培養した。細胞がコンフルエントになったところで、細胞を150cm2フラスコに移して同様に培養を行った。150cm2フラスコ内で細胞がコンフルエントになったところで、培地を吸引除去し、PBS(−)(カルシウム、マグネシウムを含まないリン酸緩衝液)で洗浄し、0.02%EDTAを加え洗浄した。次に0.25%トリプシン溶液を添加して細胞をはがした後、等量の培養用培地を加えてトリプシンの作用を止め、細胞を回収し、25℃3分間遠心分離(1,400rpm)した。細胞数をカウントし、新しい培養用培地を添加した150cm2フラスコに1×105細胞/mL程度に細胞を懸濁し、Interferon alpha A protein(フナコシ)を2,000U/mLになるよう添加した。24時間炭酸ガス培養装置を用いて培養し、培地を吸引除去し、PBS(−)洗浄し、0.02%EDTAを加え洗浄した。次に0.25%トリプシン溶液を添加して細胞をはがした後、等量の培養用培地を加えてトリプシンの作用を止め、細胞を回収し、25℃3分間遠心分離(1,400rpm)した。上清を除去し、0.5mLの低張緩衝液(10mmol/L HEPES、1.5mmol/L MgCl2、10mmol/L KCl)を添加して細胞を懸濁し溶液を回収し、使用するまで-80℃で保存した。
[1]で調製した抗MxA蛋白質モノクローナル抗体KM1135を5μg/mLになるように100mmol/L塩化ナトリウムを含む100mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.5)で希釈し、96ウェルマイクロタイタープレート[ナルジェンヌンクインターナショナル(Nalge Nunc International)社製]に100μL/ウェルの量で分注した。3日間放置後、上清を吸引除去し、1%ブロックエース(大日本製薬社製)、50mmol/L塩化ナトリウムを含むpH7.2リン酸緩衝液300μLを各ウェルに分注し室温で一晩静置しブロッキングした。ブロッキング液を除去した後、PBSで洗浄した。真空乾燥機で3日間乾燥したものを、抗MxA蛋白質モノクローナル抗体固相化プレートとして使用した。
[1]で調製した抗MxA蛋白質モノクローナル抗体KM1124を以下のようにしてマレイミド法でペルオキシダーゼ(以下、PODと略す)と結合させ、POD標識抗MxA蛋白質抗体を作製した。
以下の組成からなる検体希釈液を調製した。
HEPES(同仁化学研究所社製)(pH8.0) 0.1mol/L
CHAPS(同仁化学研究所社製) 4.9%
界面活性剤 (第1表に記載の種類と濃度)
塩化ナトリウム 1.5mol/L
BSA[インタージェン(InterGen)社製] 0.1%
アジ化ナトリウム 0.1%
前記[2]で調製したリコンビナントMxA蛋白質溶液を上記検体希釈液で希釈し、MxA蛋白質の0(検体希釈液のみ)、0.375, 0.75, 1.5, 3, 6, 12, 24ng/mLの各濃度の溶液を調製し、標準液とした。
前記[4]で作製した抗MxA蛋白質抗体(KM1135)固定化プレートに、[6]で作製した標準液100μLを添加し、1時間インキュベートし、抗体にMxA蛋白質を結合させた。反応液を除去した後、洗浄液[0.05%ツイーン20(関東化学社製)を含むPBS]を400μL添加して除去する洗浄操作を5回行った。次いで、[5]で作製したPOD標識抗MxA蛋白質抗体(KM1124)を、POD標識抗体希釈液(液状組成)緩衝液[50mmol/L Bis-Tris(同仁化学研究所社製)、0.1%BSA(インタージェン(InterGen)社製)、0.01%4−アミノアンチピリン(4−AA;埼京化成社製)、0.035%プロクリン300(シグマ社製)、0.1%ノニデットP40]にて800倍に希釈したものを調製し、これを100μL添加して30分間反応させた。反応液を除去し、前述の洗浄液を400μL添加してプレートを洗浄し、洗浄液を除去する洗浄操作を5回行った。暗所で、0.05%テトラメチルベンジジンおよび過酸化水素を含むPODの発色基質TMBlue[セロロジカル(Serological)社製]を100μL添加し、室温で10分間反応させた。0.5mol/L硫酸を100μL添加して室温で10分間インキュベーションして反応を停止させた。波長450nmでの吸光度をプレートリーダーで測定した。これらの一連の操作により、MxA蛋白質濃度と吸光度との関係を表す検量線を作製した。
前記[3]で使用した接着性のヒトグリア芽細胞種由来の細胞株T98Gをインターフェロンで刺激してMxA蛋白質を誘導させ、ネイティブMxA蛋白質を得た。得られたネイティブMxA蛋白質の反応性をリコンビナントMxA蛋白質と比較することにより、抗体のリコンビナントMxA蛋白質に対する反応性と、抗体のネイティブMxA蛋白質に対する反応性との相違について検討した。
実施例1の[6]の検体希釈液の組成中、界面活性剤を1.2%ノニデットP40(ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル)とすること以外は同じ組成の検体希釈液を用いて、実施例1と同様の方法により反応温度による測定値変動率を算出した。結果を第1表に示す。
ウイルス感染が認められMxA蛋白質陽性を示す患者5例からEDTA・2Na採血管を用いて採血した血液を検体として用いた。全血検体は試料希釈液で10倍希釈し、測定試料とした。
以下の組成からなるPOD標識抗体希釈緩衝液を調製した。
Bis−Tris(同仁化学研究所社製)(pH7.0)
50mmol/L
BSA(インタージェン(InterGen)社製) 0.1%
プロクリン300(シグマ社製) 0.035%
界面活性剤 (第3表に記載の種類と濃度)
4−AA(埼京化成社製) 0.01%
実施例1の[3]で作製したネイティブMxA蛋白質を実施例1の[6]の検体希釈液[但し、「界面活性剤」としてノニデットP40を使用]で20倍希釈し、30分間静置することで細胞の可溶化を行ない、さらに8倍に希釈して測定用試料とした。
実施例3のPOD標識抗体希釈緩衝液中の界面活性剤を0.1%ノニデットP40とすること以外は実施例3と同様の方法により二次反応温度による測定値変動率を算出した。結果を第3表に記す。
ウイルス感染が認められMxA蛋白質陽性を示す患者4例からEDTA・2Na採血管を用いて採血した血液を検体として用いた。全血検体は実施例1の[6]の検体希釈液[但し、「界面活性剤」としてノニデットP40(1.2%)を使用]で10倍希釈し、測定用試料とした。
ウイルス感染が認められMxA蛋白質陽性を示す患者5例からEDTA・2Na採血管を用いて採血した血液を検体として用いた。全血検体は実施例1の[6]の検体希釈液[但し、「界面活性剤」としてノニデットP40(1.2%)を使用]で10倍希釈し、測定用試料とした。
(a)抗MxA蛋白質抗体固定化プレート
実施例1[4]の方法に従い、抗MxA蛋白質抗体固定化プレートを次の方法で調製した。先ず、5μg/mLの抗MxA蛋白質モノクローナル抗体KM1135の、100mmol/L塩化ナトリウムを含む100mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.5)溶液を、96ウェルマイクロタイタープレート[ナルジェンヌンクインターナショナル(Nalge Nunc International)社製]に100μL/ウェルの量で分注し、3日間放置後、上清を吸引除去した。次いで、1%ブロックエース(大日本製薬社製)の、100mmol/L塩化ナトリウムを含む100mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.5)溶液を各ウェルに300μL分注し、室温で一晩静置しブロッキングした。ブロッキング液を除去した後、PBSで洗浄し、真空乾燥機で3日間乾燥し、抗MxA蛋白質モノクローナル抗体固相化プレートを調製した。
以下の組成からなる検体希釈液を調製した。
Tris(同仁化学研究所社製)(pH8.5) 0.1mol/L
CHAPS(同仁化学研究所社製) 2.5%
スタホームDO 1.2%
塩化ナトリウム 0.1mol/L
BSA(生化学工業社製) 0.1%
アジ化ナトリウム 0.1%
実施例1[5]の方法で調製されたPOD標識抗MxA蛋白抗体KM1124を、以下の組成からなるPOD標識抗MxA蛋白抗体希釈液で800倍希釈し、POD標識抗MxA蛋白抗体溶液を調製した。
Bis−Tris(同仁化学研究所社製)(pH7.0)
0.05mol/L
プロノン202B 0.1%
塩化ナトリウム 50mmol/L
BSA(生化学工業社製) 0.1%
4−AA(埼京化成社製) 0.01%
プロクリン300 0.035%
TMBlue(セロロジカル社製)
(e)反応停止液
0.5mol/L硫酸水溶液
(f)洗浄液
以下の洗浄液を調製した。
リン酸緩衝液(pH7.2) 10mmol/L
ツイーン20 0.05%
塩化ナトリウム 0.15mol/L
実施例1[2]で調製したリコンビナントMxA蛋白質を、リン酸緩衝液で希釈した後、凍結乾燥し、MxA蛋白質の標準物質を調製した。
調製した凍結乾燥状態の標準物質を上記(b)の検体希釈液で希釈し、0(検体希釈液のみ)、0.375, 0.75, 1.5, 3, 6, 12, 24 ng/mLの各濃度のMxA蛋白質溶液を調製し、これらを標準液とした。
以下の構成要素(a)〜(g)からなるMxA蛋白質測定用キットを調製した。
(a)抗MxA蛋白質抗体固定化プレート
実施例6の(a)と同じ抗MxA蛋白質抗体固定化プレート。
以下の組成からなる検体希釈液を調製した。
HEPES(同仁化学研究所社製)(pH8.0) 0.1mol/L
CHAPS(同仁化学研究所社製) 4.9%
ノニデットP40 1.2%
塩化ナトリウム 0.1mol/L
BSA(生化学工業社製) 0.1%
アジ化ナトリウム 0.1%
実施例1[5]の方法で調製されたPOD標識抗MxA蛋白抗体KM1124を、以下の組成からなるPOD標識抗MxA蛋白抗体希釈液で800倍希釈し、POD標識抗MxA蛋白抗体溶液を調製した。
Bis−Tris(同仁化学研究所社製)(pH6.0)
50mmol/L
ノニデットP40 0.1%
塩化ナトリウム 50mmol/L
BSA(生化学工業社製) 0.1%
4−AA(埼京化成社製) 0.01%
プロクリン300 0.035%
TMBlue(セロロジカル社製)
(e)反応停止液
0.5mol/L硫酸水溶液
(f)洗浄液
以下の洗浄液を調製した。
リン酸緩衝液(pH7.2) 10mmol/L
ツイーン20 0.05%
塩化ナトリウム 0.15mol/L
実施例1[2]で調製したリコンビナントMxA蛋白質を、リン酸緩衝液で希釈した後、凍結乾燥し、MxA蛋白質の標準物質を調製した。
調製した凍結乾燥状態の標準物質を上記(b)の検体希釈液で希釈し、0(検体希釈液のみ)、0.375, 0.75, 1.5, 3, 6, 12, 24ng/mLの各濃度のMxA蛋白質溶液を調製し、これらを標準液とした。
実施例6のキットの代わりに比較例3のキットを用いる以外は実施例7と同様の方法により測定を行い、MxA蛋白質濃度と吸光度との関係を表す検量線を作製した。
実施例7及び比較例4の測定の結果を第6表に示す。
Claims (30)
- 検体中の測定対象成分と、該測定対象成分に結合する第1抗体とを反応させた後、該測定対象成分に結合する第2抗体に標識が結合した標識化第2抗体を、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤存在下に反応させて、第1抗体、該測定対象成分、及び、標識化第2抗体からなる免疫複合体を生成させ、生成した該免疫複合体中の標識量を測定することを特徴とする、測定対象成分の測定方法。
- ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、及び、エチレンジアミンポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物からなる群より選ばれるポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤である請求項1記載の方法。
- 胆汁酸誘導体を添加して検体中の測定対象成分と、該測定対象成分に結合する第1抗体とを反応させる請求項1又は2記載の方法。
- 胆汁酸誘導体が、両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体である請求項3記載の方法。
- 両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、3−[(3−コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]プロパンスルホネート又は3−[(3−コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]−2−ヒドロキシプロパンスルホネートである請求項4記載の方法。
- 胆汁酸誘導体が、非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体である請求項3記載の方法。
- 非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、N,N−ビス(3−グルコンアミドプロピル)コールアミド又はN,N−ビス(3−D−グルコンアミドプロピル)デオキシコールアミドである請求項6記載の方法。
- 第1抗体が、不溶性担体に不動化されている請求項1〜7のいずれかに記載の測定方法。
- 検体が、全血である請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- 測定対象成分が、MxA蛋白質である請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
- 測定対象成分に結合する第1抗体を含む第1試薬と、測定対象成分に結合する第2抗体に標識が結合した標識化第2抗体、及び、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤を含む第2試薬とを含むことを特徴とする、検体中の測定対象成分の測定用キット。
- ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、及び、エチレンジアミンポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物からなる群より選ばれるポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤である請求項11記載のキット。
- 第1試薬が更に、胆汁酸誘導体を含む請求項11又は12記載のキット。
- 胆汁酸誘導体が、両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体である請求項13記載のキット。
- 両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、3−[(3−コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]プロパンスルホネート又は3−[(3−コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]−2−ヒドロキシプロパンスルホネートである請求項14記載のキット。
- 胆汁酸誘導体が、非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体である請求項13記載のキット。
- 非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、N,N−ビス(3−グルコンアミドプロピル)コールアミド又はN,N−ビス(3−D−グルコンアミドプロピル)デオキシコールアミドである請求項16記載のキット。
- 第1抗体が、不溶性担体に不動化されている請求項11〜17のいずれかに記載のキット。
- 検体が、全血である請求項11〜18のいずれかに記載のキット。
- 測定対象成分が、MxA蛋白質である請求項11〜19のいずれかに記載のキット。
- 検体中の測定対象成分と、該測定対象成分に結合する第1抗体とを反応させた後、該測定対象成分に結合する第2抗体に標識が結合した標識化第2抗体を反応させて、該測定対象成分に結合した標識量を測定する免疫測定法において、該測定対象成分に結合する第2抗体に標識が結合した標識化第2抗体をポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤存在下に反応させることを特徴とする、免疫測定法における反応温度の影響抑制方法。
- ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、及び、エチレンジアミンポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物からなる群より選ばれるポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤である請求項21記載の抑制方法。
- 胆汁酸誘導体を添加して検体中の測定対象成分と、該測定対象成分に結合する第1抗体とを反応させる請求項21又は22記載の抑制方法。
- 胆汁酸誘導体が、両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体である請求項23記載の抑制方法。
- 両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、3−[(3−コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]プロパンスルホネート又は3−[(3−コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]−2−ヒドロキシプロパンスルホネートである請求項24記載の抑制方法。
- 胆汁酸誘導体が、非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体である請求項23記載の抑制方法。
- 非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、N,N−ビス(3−グルコンアミドプロピル)コールアミド又はN,N−ビス(3−D−グルコンアミドプロピル)デオキシコールアミドである請求項26記載の抑制方法。
- 第1抗体が、不溶性担体に不動化されている請求項21〜27のいずれかに記載の抑制方法。
- 検体が、全血である請求項21〜28のいずれかに記載の抑制方法。
- 測定対象成分が、MxA蛋白質である請求項21〜29のいずれかに記載の抑制方法。
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