CN102534004A

CN102534004A - 用于多重连接扩增技术的探针制备方法

Info

Publication number: CN102534004A
Application number: CN2012100082479A
Authority: CN
Inventors: 黄劭
Original assignee: WUHAN JIXI BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Jiangxi Xinxing Medical Technology Co., Ltd.; Wuhan Jixi Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2012-01-12
Filing date: 2012-01-12
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2032-01-12
Also published as: CN102534004B

Abstract

本发明公开了可用于多重连接扩增技术（MLPA）的长探针的制备方法，包括以下步骤：1）选择与待测目标序列无关的载体作为模板，并根据目标核苷酸序列和目标探针长度设计引物；2）人工合成引物；3）PCR扩增；4）PCR产物纯化回收；5）使用Lambda外切酶对PCR产物进行消化；6）回收单链DNA。本发明所述MLPA探针制备方法成本低廉，只需要PCR仪即可完成扩增、酶切等全部操作，酶消化后使用专门的ssDNA回收试剂盒进行回收，排除了没有消化完全的dsDNA和核苷酸，提高MLPA实验时的杂交效率，通过充分的Lambda外切酶消化，可最大程度的将dsDNA变为ssDNA，从而提高了探针制备效率。

Description

用于多重连接扩增技术的探针制备方法

技术领域

本发明涉及寡核苷酸探针制备，具体为可用于多重连接扩增技术（MLPA）的长探针的制备方法。

背景技术

多重连接扩增技术(multiplex 1igation-dependent probe amplification，MLPA)是一种高通量的基因检测方法，该技术利用核酸杂交、连接反应和PCR扩增反应，可以在同一反应管内对多达45种不同的核苷酸序列进行检测和定量分析。

至今MLPA技术已应用于多种领域的研究及基因诊断，并且不断的有新的技术改进，尤其是在探针设计上，有采用M13单链噬菌体插入到衍生的序列两端涉及了限制性内切酶识别位点，以便获得采用双酶切获得长探针；

在申请号为200910108977.4，名称为“可用于多重连接扩增技术的长探针的制备方法”，文件中公开了一种采用PCR方法结合亲和素磁殊法制备可用于多重连接扩增技术的长探针，该公开的技术方法主要包括：针对目标核苷酸序列和用于制备长探针的与待检测靶片段无关的模板核苷酸序列设计一对PCR扩增引物，分别为通用引物和检测引物；通用引物的5’端标记生物素；以所述与待检测靶片段无关的模板核苷酸序列为模板进行PCR扩增，获得生物素标记的双链核苷酸序列；将生物素标记的双链核苷酸序列与亲和素标记的亲和素磁珠混合，使生物素标记的双链核苷酸序列与亲和素磁蛛相互吸附；使生物素标记的的双链核苷酸序列变性，解链形成单链；离心取上清，获得非生物素标记的单链核苷酸序列。该方法虽然操作简单，但是需要磁珠分离系统，成本较高，并且在磁珠分离过程中有磁珠结合不完全造成dsDNA残留，探针得率不高。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明旨在提供一种低成本、高得率的可用于多重连接扩增技术的探针制备方法。

用于多重连接扩增技术的探针制备方法，包括以下步骤：

1)设计一对与待测靶片段及长探针核苷酸序列无关的检测引物，分别为GP1和GP2，用于最后的PCR扩增检测，所述的GP1为5’端带荧光基团修饰，同时合成5’端带磷酸化修饰的右探针RPO-N，由目的右探针序列与GP2的反向互补序列组成；

2)确定一段与探针及通用引物无关的核苷酸序列S，并用于设计一对扩增左端长探针的引物，分别为GPL和LPO-N’，其中GPL是由GP1的序列与S序列的前18bp左右的序列组成，LPO-N’由目的左探针序列的反向互补序列与S序列中的18bp左右反向互补的序列组成，并且其5’端要带上磷酸化修饰；

3)用GPL和LPN以所述的一段与探针及通用引物无关的核酸序列为模板进行PCR扩增，获得互补链5’磷酸化修饰的双链核苷酸序列；

4）纯化回收PCR产物；

5）采用核酸Lamda外切酶对以上双链核苷酸序列进行消化，去除5’磷酸化标记的那条单链DNA；

6）采用ssDNA纯化回收试剂盒对消化产物进行回收，便得到左端长探针。

扩增左端探针的引物由两段核苷酸序列组成，一段根据探针检测目标的核苷酸序列设计，另一段根据与待检测靶片段无关的模版核苷酸序列设计。

所述PCR扩增得到的5’磷酸化修饰的双链核苷酸序列需先经过纯化再进行Lambda外切酶消化。

步骤5）所述的Lambda外切酶消化过程中，1μg双链DNA用1个单位Lambda外切酶消化。

本发明所述MLPA探针制备方法与采用M13噬菌体制备MLPA相比，具有以下优点：

1）PCR扩增引物简单，只需考虑引物Tm值和长度等一般性问题，通过结合目标核苷酸序列，针对模版设计一对引物即可。

2）利用简单的PCR和Lambda外切酶消化即可获得长探针，无需M13噬菌体培养，可一天内完成探针制备工作，大大降低了MLPA技术门槛。

3）无需进行克隆制备，无需特异性内切酶酶切，操作简单。

4）探针制备灵活性更强，可针对基因组DNA、质粒、人工基因序列等进行制备所需探针。

5）探针所需的填充序列来源方便，可使不同探针填充序列保持一致，也可根据需要选择不同模版扩增所需填充序列，降低杂交时的非特异性杂交，提高检测成功率。

本发明所述MLPA探针制备方法与采用链亲和素磁珠法制备MLPA相比，具有以下优点：

1）成本低廉，只需要PCR仪即可完成扩增、酶切等全部操作，无需添置单独的磁珠分离系统，且每μgDNA探针制备成本不到磁珠法1/10。

2）酶消化后使用专门的ssDNA回收试剂盒进行回收，排除了没有消化完全的dsDNA和核苷酸，保证得到的为所需单链探针，避免了磁珠分离过程中磁珠结合不完全造成的dsDNA残留，提高MLPA实验时的杂交效率。

3）探针得率高，通过充分的Lambda外切酶消化，可最大程度的将dsDNA变为ssDNA，避免了磁珠法中因为磁珠结合后DNA变性不完全造成的ssDNA得率下降，从而提高了探针制备效率。

附图说明

图1本发明的方法流程图；

图2本发明实施例中的琼脂糖凝胶电泳分析结果图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实例说明本发明的制备方法，具体为用多重连接扩增技术检测人基因组CECR1基因的长探针的制备及其检测，包括以下步骤：

1）设计一对与待测靶片段及长探针核苷酸序列无关的检测引物，分别为GP1（5’端带荧光基团修饰）和GP2，用于最后的PCR扩增检测；同时合成5’端带磷酸化修饰的右探针R-CECR1，由CECR1右探针序列与GP2的反向互补序列组成；

2)与待检测靶片段无关的模板核苷酸序列（S）的选择，并根据S和目标核苷酸序列设计引物；

3)人工合成引物GPL（由GP1的序列和S序列的前18nt组成）和L-CECR1’（由S序列下游23nt的反向互补序列+CECR1左探针序列的反向互补序列CECR1’组成），且在L-CECR1’的5’末端带上磷酸化修饰；

4)PCR扩增；

5)PCR产物纯化回收；

6)Lamda核酸外切酶对PCR纯化回收产物进行消化；

7)用ssDNA纯化回收试剂盒对Lamda核酸外切酶消化的PCR产物进行回收，即得到用于多重连接扩增技术左端的长探针，由GP1的序列、S序列和CECR1的左探针序列组成。

8)用上述得到的CECR1基因的左端长探针与合成的5'端磷酸化的右端短探针一起跟基因组DNA进行杂交反应，连接后PCR扩增，行琼脂糖凝胶电泳分析。

实施步骤1 引物的设计合成。

设计一对与待测靶片段及长探针核苷酸序列无关的易于进行PCR扩增的检测引物，分别为GP1（5’端带荧光基团修饰）和GP2，用于最后的PCR扩增检测，同时合成5’端带磷酸化修饰的右探针R-CECR1，由目的右探针序列与GP2的反向互补序列组成。

选择质粒pET-14b（购自Novagen）中一部分序列为与待检测靶片段无关的模板序列（S），并根据CECR1基因的左探针序列和S序列设计并人工合成左端长探针制备专用的通用引物GPL（由GP1的序列和S序列的前18nt组成）和制备CECR1基因左端长探针用的下游引物L-CECR1’（由S序列下游23nt的反向互补序列+CECR1左探针序列的反向互补序列CECR1’组成）。

上述引物的具体核苷酸序列为：

GP1：5'GGGTTCCCTAAGGGTTGGA3' 19nt 5'端FAM修饰（用于最后毛细管电泳检测）；

GP2：5' GTGCCAGCAAGATCCAATCTAGA 3'

GPL：5'GGGTTCCCTAAGGGTTGGACTGTCGCTTGCGGTATTC 3'（下划线部分为GP1的序列，剩余部分为S序列的前18nt）

L-CECR1'：

5'ATTTTGAGCGTCATGAGCCTCTCATTGGTGCTCGCCGAGGCGGCATAAATC3' 51nt （下划线部分为CECR1左探针序列的反向互补序列，剩余部分为S序列下游23nt的反向互补序列）

R-CECR1：

5'CGCTGAGATGAAGGAGGCCATGAGGACCCTGATATCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC3' 57nt 5'端磷酸化修饰（下划线部分为CECR1右探针序列，剩余部分为GP2的反向互补序列GP2'）

最终PCR扩增得到的左端长探针片段具体序列为：

GGGTTCCCTAAGGGTTGGA（GP1序列）

CTGTCGCTTGCGGTATTCGGAATCTTGCACGCCCTCGCTCAAGCCTTCGTCACTGGTCCCGCCACCAAACGTTTCGGCGAGAAGCAGGCCATTATCGCCGGCATGGCGGCCGACGCGCTGGGCTACGTCTTGCTGGCGTTCGCGACGCGAGGCTGGATGGCCTTCCCCATTATGATTCTTCTCGCTTCCGGCGGCATCGGGATGCCCGCGTTGCAGGCCATGCTGTCCAGGCAGGTAGATGACGACCATCAGGGACAGCTTCAAGGATCGCTCGCGGCTCTTACCAGCCTAACTTCGATCACTGGACCGCTGATCGTCACGGCGATTTATGCCGCCTCGGCGAGCA（S序列）

CCAATGAGAGGCTCATGACGCTCAAAAT（CECR1左探针序列）

实施步骤2 PCR扩增及其产物的纯化回收。

以质粒pET-14b为模板，用引物GPL和L-CECR1'进行PCR扩增。

1）PCR反应体系：

反应体系	体积（总体积50ml）	浓度
			10×PCR Buffer（Mg²⁺ Plus）	5ml	1×
dNTP Mixture（各2.5mM）	4ml	0.2mM
			模板（pET-14b）	2.5ng	0.05ng/ml
引物1（GPL）	1ml	0.4mM
			引物2（L-CECR1'）	1ml	0.4mM
TaKaRa Taq（5U/ml）	0.25ml	1U
			灭菌蒸馏水	Up to 50ml

2）PCR反应程序

① 94℃ 5min

② 94℃ 30s

③ 60℃ 30s

④ 72℃ 40s

⑤ go to ②，38 cycle

⑥ 72℃ 5min

⑦ 4℃ hold

3）PCR产物的纯化回收

使用TaKaRa公司Code DV807A的DNA片段纯化试剂盒对PCR产物进行回收。

实施步骤3 Lamda核酸外切酶消化纯化回收的PCR产物。

使用美国ZMYO RESEARCH公司D7011的ssDNA纯化试剂盒对Lamda核酸外切酶消化产物进行回收。

实施步骤4 ssDNA纯化回收。

用ssDNA纯化回收试剂盒对上述Lamda核酸外切酶消化的产物进行纯化回收，便得到用于MLPA实验的左端长探针。

实施步骤5 MLPA实验验证。

1）杂交

用上述得到的CECR1基因的左端长探针与合成的5'端磷酸化的右端短探针一起跟基因组DNA进行杂交反应。

反应体系：

杂交缓冲液： 1.5ml

探针： 1.5ml （30fmol each）

基因组DNA： 5ml （总量50ng以上）

反应条件：先将基因组DNA 95℃变性5min，然后加入杂交缓冲液和探针，95℃1min后，60℃杂交1-16小时。

2）连接

连接体系：

杂交产物： 8ml

Taq连接酶： 5U

10×Taq buffer： 3ml

灭菌蒸馏水： up to 30ml

连接条件：54℃反应15min后，95℃反应7min。

3）PCR扩增检测

PCR体系：

反应体系	体积（总体积50ml）	浓度
			10×PCR Buffer（Mg²⁺ Plus）	2ml	1×
dNTP Mixture（各2.5mM）	1.6ml	0.2mM
			模板（连接产物）	5ml
引物1（GP1）	0.5ml	0.4mM
			引物2（GP2）	0.5ml	0.4mM
TaKaRa Taq（5U/ml）	0.08ml	0.4U
			灭菌蒸馏水	Up to 20ml

PCR反应程序：

① 95℃ 5min

② 95℃ 30s

③ 60℃ 30s

④ 72℃ 40s

⑤ go to ②，38 cycle

⑥ 72℃ 5min

⑦ 4℃ hold

4）琼脂糖凝胶电泳分析

分析结果见图2，以100 μg正常人人基因组DNA为模版进行杂交并扩增，可得到片段大小为450 bp的产物，以水为模版的阴性对照没有PCR扩增产物，可证明本发明制备的探针可用于MLPA实验。

序列表

<110> 黄劭

<120>用于多重连接扩增技术的探针制备方法

<160> 5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAM修饰并与待测靶片段及长探针核苷酸序列无关的检测引物

<400> 1

gggttcccta agggttgga 19

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 与待测靶片段及长探针核苷酸序列无关的检测引物

<400> 2

gtgccagcaa gatccaatct aga 23

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 扩增长探针引物

<400> 3

gggttcccta agggttggac tgtcgcttgc ggtattc 37

<210> 4

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 左探针序列

<400> 4

attttgagcg tcatgagcct ctcattggtg ctcgccgagg cggcataaat c 51

<210> 5

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 磷酸化的右探针序列

<400> 5

cgctgagatg aaggaggcca tgaggaccct gatatctaga ttggatcttg ctggcac 57

Claims

1.用于多重连接扩增技术的探针制备方法，包括以下步骤：

1)设计一对与待测靶片段及长探针核苷酸序列无关的检测引物，分别为GP1（5’端带荧光基团修饰）和GP2，用于最后的PCR扩增检测，同时合成5’端带磷酸化修饰的右探针RPO-N，由目的右探针序列与GP2的反向互补序列组成；

3)用GPL和LPN以所述的一段与探针及通用引物无关的核酸序列为模板进行PCR扩增，获得互补链5’端磷酸化修饰的双链核苷酸序列；

4）纯化回收PCR产物；

2.根据权利要求 1 所述的用于多重连接扩增技术的探针制备方法，其特征在于，步骤2）所述的用于扩增左端探针的引物由两段核苷酸序列组成，一段根据探针检测目标的核苷酸序列设计，另一段根据与待检测靶片段无关的模版核苷酸序列设计。

3.根据权利要求 1 所述的用于多重连接扩增技术的探针制备方法，其特征在于，步骤3）所述PCR扩增得到的5’端磷酸化修饰的双链核苷酸序列需先经过纯化再进行Lambda外切酶消化。

4.根据权利要求 1 所述的用于多重连接扩增技术的探针制备方法，其特征在于，步骤5）所述的Lambda外切酶消化过程中，1μg双链DNA用1个单位Lambda外切酶消化。