CN103290115B - 一种肺炎链球菌血清型分型的检测方法 - Google Patents
一种肺炎链球菌血清型分型的检测方法 Download PDFInfo
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- CN103290115B CN103290115B CN201310180844.4A CN201310180844A CN103290115B CN 103290115 B CN103290115 B CN 103290115B CN 201310180844 A CN201310180844 A CN 201310180844A CN 103290115 B CN103290115 B CN 103290115B
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Abstract
本发明提供了一种利用MLPA对肺炎链球菌进行血清型分型的方法，该方法首先提取待测肺炎链球菌样本基因组DNA，使用PCR预扩增引物对提取的基因组DNA进行预扩增，使用MLPA探针对因组DNA的预扩增产物进行杂交,同时在反应体系中加入相应的荧光检测探针，用连接酶连接已杂交的MLPA探针,并以MLPA通用扩增引物PCR扩增已杂交并连接好的MLPA探针，使用多色荧光溶解曲线分析PCR产物，即可实现对肺炎链球菌进行血清型分型。本发明的检测方特异性、灵敏度高、可同时对10种血清型进行分型，仅需2-4小时，避免传统MLPA检测中的多次开盖操作，减少污染可能，可满足高通量样品检测，特别适合检验部门使用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及肺炎链球菌血清型分型的检测技术，具体将涉及一种肺炎链球菌的血清型分型检测方法，适合对肺炎链球菌血清型进行定性检测。
背景技术
肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)又称肺炎双球菌或肺炎球菌，革兰氏染色阳性，镜下观察一般呈双球状排列;有荚膜结构，荚膜是肺炎链球菌的主要毒力因子。根据荚膜多糖结构和成分的不同，肺炎链球菌目前可分成46个血清群、90多个不同的血清型。约20种血清型/群与常见的肺炎链球侵袭性疾病相关，大多数血清型都不对人体产生危害。目前在世界范围内，肺炎链球菌感染所导致的疾病依然是一个严重的公共卫生问题。肺炎链球菌能够引起所有年龄组高发病率和病死率，尤其是对儿童和老年人;在发达国家仍然是能够引起高病死率传染性疾病的少数几种细菌性病原之一。它可引起菌血症、脑膜炎和肺炎等侵袭性肺炎链球菌疾病。据估计全球范围内，每年由肺炎链球菌引起的脑膜炎病例大概为32500例、菌血症637000例、中耳炎1400万例、肺炎2000万例，每年全球大约至少要有100万左右5岁以下的儿童死于肺炎链球菌相关疾病，尤其对2岁以下的儿童和幼儿危害更为严重，绝大多数儿童和幼儿病例都出现在发展中国家或贫困国家。
对于病原的分离鉴定是肺炎链球菌基本信息的主要来源。而目前对于细菌性病原的鉴别，多依靠传统的细菌培养、血清分群和乳胶凝集检测方法。细菌培养被认为是实验室诊断金标准，但该方法耗时较长;而且对于那些在采样之前接受过抗生素治疗的病例，病原分离率会有一定程度的降低;另外，样品质量、培养条件等因素也会影响培养阳性率。随着分子生物学技术的发展，各种分子生物学手段越来越广泛的应用到病原微生物学的研究中来。其中PCR方法由于其灵敏性高、操作简便、成本相对较低等优点已经成为肺炎链球菌血清分群的重要手段，但同时针对多个血清型进行检测的多重PCR设计难度大，不同PCR产物扩增条件和效率不一致，因此一般只能同时对4-5个血清型进行检测。
多重连接扩增技术(multiplex 1igation-dependent probe amplification，MLPA)是一种高通量的基因检测方法，该技术包括杂交-连接-扩增三个步骤，其中杂交和连接步骤保证了检测的特异性，扩增步骤使用通用引物进行PCR扩增，保证不同目标产物在扩增时效率的一致，有效解决了多重PCR中扩增效率不一致和容易出现交叉反应的缺点，是一种方便、准确、廉价的多重核酸检测技术。已在遗传学、肿瘤学中获得广泛的应用。但传统的MLPA技术需要在操作过程中多次开盖，增加了核酸气溶胶污染的风险，且结果检测需要价格昂贵的毛细电泳测序仪，从而阻碍了其在临床检验中的应用。
专利申请201210008247.9公开了一种制备MLPA探针的方法，可根据需要快速方便的制备MLPA探针。
本发明利用专利申请201210008247.9所公开的方法制备MLPA探针，提供了一种针对肺炎链球菌血清型分型方法。
发明内容
本发明的任务是提供一种肺炎链球菌血清型分型的检测方法，使其具有快速、方便、经济、特异性强、灵敏度高、能避免核酸气溶胶污染风险、可满足高通量样品检测等特点。
实现本发明任务的技术方案是：
本发明提供的肺炎链球菌血清型分型的检测方法，包括以下步骤：
步骤一、提取待测肺炎链球菌样本基因组DNA，具体可以使用Qiagen公司的细菌DNA提取试剂盒提取待测肺炎链球菌样本基因组DNA。
步骤二、PCR预扩增：以步骤一提取的待测肺炎链球菌样本的基因组DNA作为模板，使用PCR预扩增引物对提取的肺炎链球菌标本基因组DNA进行预扩增；
步骤三、MLPA探针杂交、连接、扩增：使用MLPA探针对待测肺炎链球菌样本基因组DNA PCR预扩增产物进行杂交,同时在反应体系中加入相应的荧光检测探针；用连接酶连接已杂交的MLPA探针,并以MLPA通用扩增引物PCR扩增已杂交并连接好的MLPA探针；所述的MLPA通用扩增引物是：
GP1:gggttccctaagggttgga；GP2:tctagattggatcttgctggcac。
步骤四:MLPA产物检测：使用多色荧光溶解曲线分析PCR产物。
上述步骤二中所述的PCR预扩增引物是选自以下引物1至11中的一种、两种以上或全部：
引物1：
4型PF2：CTG TTA CTT GTT CTG GAC TCT CGA TAA TTG G
4型PR2：GCC CAC TCC TGT TAA AAT CCT ACC CGC ATT G
引物2：
6型PF3：AAT TTG TAT TTT ATT CAT GCC TAT ATC TGG
6型PR3：TTA GCG GAG ATA ATT TAA AAT GAT GAC TA
引物3：
19A型PF4：GAG AGA TTC ATA ATC TTG CAC TTA GCC A
19A型PR4：CAT AAT AGC TAC AAA TGA CTC ATC GCC
引物4：
9V/A型PF5:CTT CGT TAG TTA AAA TTC TAA ATT TTT CTA AG
9V/A型PR5：GTC CCA ATA CCA GTC CTT GCA ACA CAA G
引物5：
14型PF6：GAA ATG TTA CTT GGC GCA GGT GTC AGA ATT
14型PR6：GCC AAT ACT TCT TAG TCT CTC AGA TGA AT
引物6：
18C型PF7：CTT AAT AGC TCT CAT TAT TCT TTT TTT AAG CC
18C型PR7：TTA TCT GTA AAC CAT ATC AGC ATC TGA AAC
引物7：
19F型PF8：GTT AAG ATT GCT GAT CGA TTA ATT GAT ATC C
19F型PR8：GTA ATA TGT CTT TAG GGC GTT TAT GGC GAT AG
引物8：
23F型PF9：GAT ACA GTT GCT GTA GAG GGA ATT GGC TTT TC
23F型PR9：CAC AAC ACC TAA CAC TCG ATG GCT ATA TGA TTC
引物9：
15A/F型PF10：ATT AGT ACA GCT GCT GGA ATA TCT CTT C
15A/F型PR10：GAT CTA GTG AAC GTA CTA TTC CAA AC
引物10：
15B/C型PF11：TTG GAA TTT TTT AAT TAG TGG CTT ACC TA
15B/C型PR11：CAT CCG CTT ATT AAT TGA AGT AAT CTG AAC C；
引物11：
LytA PF1：GGCTACTGGTACGTACATTC；
LytA PR1：AATCAAGCCATCTGGCTCTA。
所述的内参基因MLPA探针及相应的荧光检测探针可以是：
上述步骤二中所述的使用PCR预扩增引物对提取的肺炎链球菌标本基因组DNA进行预扩增的反应程序为：
① 94℃ 5min
② 94℃ 30s
③ 55℃ 30s
④ 72℃ 40s
⑤ go to ②，33cycle
⑥ 72℃ 5min
⑦ 4℃ hold
上述步骤三所述的使用MLPA探针对待测肺炎链球菌样本基因组DNA的PCR预扩增产物进行杂交，同时在反应体系中加入相应的荧光检测探针，用连接酶连接已杂交的MLPA探针,并以MLPA通用扩增引物PCR扩增已杂交并连接好的MLPA探针的反应体系和反应条件是：
反应体系：
杂交缓冲液： 10μl
MLPA探针： 1μl （1-4fmol each）
荧光检测探针： 1μl （0.4μM）
预扩增PCR产物： 5μl
PCR酶： 1U
Taq Ligase： 1U
通用PCR引物（GP1、GP2）：1μl（0.4μM）
ddH2O: up to 20μl
反应条件：
① 54℃ 60min
② 95℃ 30s
③ 60℃ 30s
④ 72℃ 30s
⑤ go to ②，33 cycle
⑥ 72℃ 5min
⑦ 4℃ hold。
上述步骤三中所述的MLPA探针及相应的荧光检测探针选自以下1至11探针组中的一组、两组以上或全部：
探针组1
4L:gggttccctaagggttggaGGTCACATCTACTTCTTGCGTCACTGTATCTGA
4R:CGATAAAATTTGTAATCCCGATGCCTGAGCCTCGGCACAGCGATTGCGTTGAGGAGTCCGtctagattggatcttgctggcac
4detection probe：GGCACAGCGATTGCGTTGAGGAGTCCG
探针组2
6L:gggttccctaagggttggaGAGTATGGGAAGGTGTTGTTCTGCCCT
6R:
GAGCAACTGGTCTTGTATCGAAGACATGGACTCCGTCCTTAGAGTCCGCTtctagattggatcttgctggcac
6detection probe:TCCGTCCTTAGAGTCCGCT
探针组3
19A L:gggttccctaagggttggaCTACCAGTTATGAAGGTGAGCTAACAGTGCGAA
19A R:
CTTCGATTCGGGTCCTCATTCGTATCATTGACGGGTCTTCGCCCAGAAGCTtctagattggatcttgctggcac
19A detection probe：GGTCTTCGCCCAGAAGCT
探针组4
9V/A L:gggttccctaagggttggaCCGTTCGAGCAAGTATATCTAGTAAGGTATTGTGT
9V/A R:
GCGGAGTTAACGATAATCCCATTTGTCCAAGCATCTCCACAGGTAAATCTtctagattggatcttgctggcac
9V/A detection probe：TCTCCACAGGTAAATCT
探针组5
14L:gggttccctaagggttggaTCTACTGTAGAGGGAATTCTGACACCT
14R:GCGCCAAGTAACATTTCCATTCCAACTAGGAGAGTGGTCAtctagattggatcttgctggcac
14detection probe：ACTAGGAGAGTGGTCA
探针组6
18C L:gggttccctaagggttggaGTGGGTTGTTTTAGTGATTACAATGGGCTGTGC
18C R:
TTTCGGTTTAGCAGGAGTTTCTGCAACCTTTGCAGCCAGAGTGGTCTTAATGtctagattggatcttgctggcac18C detection probe：AGCCAGAGTGGTCTTAATG
探针组7
19F L:gggttccctaagggttggaCGAGTTATGAAGGTGAATTGACAGTGCGAACTTTT
19F R:
ATTCGAGTTCTCATTCGTGTTATTGACGTATCTGCCATGCCTAATGGTCCAGTtctagattggatcttgctggcac19F detection probe：CATGCCTAATGGTCCAGT
探针组8
23F L:gggttccctaagggttggaTAACGCCAGTAAAGAGATGACTATTGTCGT
23F R:
TGCTGTCACTACCAGTCTATGCTCTTCAGGTCGTTACGTGGATTAGCGGTCtctagattggatcttgctggcac
23F detection probe：CAGGTCGTTACGTGGATTAGCGGTC
探针组9
15A/F L:gggttccctaagggttggaGTCCCATAGGAAGGAAATAGTATTTGTTCGTCC
15A/F R:
CGCAAACTCTGTCCTATTCTCATATGATAATGCCACGGATGCAATAGAACTCTTCGCGCtctagattggatcttgctggcac
15A/F detection probe：ACGGATGCAATAGAACTCTTCGCGC
探针组10
15B/C L:gggttccctaagggttggaGGAAGAAGCTTATTAGGTTGGGACGGATTCGTA
15B/C R:
TCAGCTACCAGTTACGGAGTAAGATATGCAGGAGCCGTGCTGACCGTTCTCGTATGTGCGtctagattggatcttgctggcac
15B/C detection probe：GCCGTGCTGACCGTTCTCGTATGTGCG。
探针组11
LytA L:gggttccctaagggttggaTACTGGTTCGACAACTCAGGCGAAATGG;
LytA R:
AGCCTGTTCCGTCCGCTGACTGGATAAACTCAGCTGAGTCCGCTCCGACAGCAGGCACTATATTCtctagattggatcttgctggcac;
LytA detection probe：tctagattggatcttgctggcac。
本发明方法可同时检测样本中包含的多个亚型，通过不同Tm值的溶解曲线进行区分。在本发明的实施中，模版为混合的4、6、19A细菌基因组DNA，每种DNA均为2.5ng，使用多色荧光溶解曲线分析PCR产物结果见图2，图2中可见80度、60度、65度、75度有四个明显的溶解峰，分别代表19F、6、4这3种不同的亚型和一个Lyt基因内参（见表1）。说明本发明提供了一种利用MLPA对肺炎链球菌进行血清型分型的有效方法，本发明的检测方法特异性强，灵敏度高，可同时对10种血清型进行分型，仅需2-4小时，MLPA的杂交、连接、扩增、检测均在一管内完成，无需开盖操作，避免了核酸气溶胶污染风险，可满足高通量样品检测，特别适合检验部门使用。
表1：MLPA产物长度和荧光探针Tm值：
| MLPA产物血清型 | 荧光法Tm值 | 荧光染料 |
| Lyt基因 | 78 | ROX |
| 4 | 75 | ROX |
| 6 | 65 | ROX |
| 9V/A | 55 | Cy5 |
| 14 | 55 | ROX |
| 18C | 60 | Cy5 |
| 19F | 60 | ROX |
| 23F | 70 | ROX |
| 19A | 65 | Cy5 |
| 15A/F | 70 | Cy5 |
| 15B/C | 75 | Cy5 |
附图说明
图1：本发明流程图。
图2：实施例1同时检测混杂多个亚型的样本结果图，本方法可同时检测样本中包含的多个亚型，通过不同Tm值的溶解曲线进行区分。反应条件见实施例1，模版为混合的4、6、19A细菌基因组DNA，每种DNA均为2.5ng。图2中可见80度、60度、65度、75度有四个明显的溶解峰。代表19F、6、4这3种不同的亚型和一个Lyt基因内参。
具体实施方式
实施例1同时检测混杂多个亚型的肺炎链球菌样本
本方法可同时检测样本中包含的多个亚型，通过不同Tm值的溶解曲线进行区分。模版为混合的纯化后4、6、19F肺炎链球菌基因组DNA，每种DNA均为2.5ng。
反应条件为：
PCR预扩增：
| 反应体系 | 体积（总体积50μl） | 浓度 |
| 10×PCR Buffer（Mg2+Plus） | 5μl | 1× |
| dNTP Mixture（各2.5mM） | 4μl | 0.2mM |
| 模板（细菌基因组DNA） | 2.5ng | 0.05ng/μl |
| 引物1（PF1-PF11） | 1μl | 各0.2μM |
| 引物2（PR1-PR11） | 1μl | 各0.4μM |
| TaKaRa Taq（5U/μl） | 0.25μl | 1U |
| 灭菌蒸馏水 | Up to50μl |
反应程序：
① 94℃ 5min
② 94℃ 30s
③ 55℃ 30s
④ 72℃ 40s
⑤ go to ②，33 cycle
⑥ 72℃ 5min
⑦ 4℃ hold
MLPA反应：
| 反应体系 | 体积（总体积20μl） | 浓度 |
| MLPA缓冲液 | 10μl | 1 |
| MLPA探针 | 1μl | 0.05-0.2nM each |
| 荧光检测探针 | 1μl | 0.2μM |
| 预扩增PCR产物 | 5μl | |
| 热启动Takara Taq酶 | 1μl | 1U |
| Taq DNA Ligase | 1μl | 1U |
| 通用PCR引物（GP1、GP2） | 1μl | 0.2μM |
| ddH2O: | up to20μl |
反应程序：
① 54℃ 60min
② 95℃ 30s
③ 60℃ 30s
④ 72℃ 30s
⑤ go to ②，33 cycle
⑥ 72℃ 5min
⑦ 4℃ hold。
结果检测：
设置检测荧光通道为
ROX：470nm-540nm
Cy5：470nm-660nm
反应条件为
① 95℃ 1min
② 45℃-85℃溶解曲线分析，速度0.2℃/s
判读阈值：dF/dT>0.2
结果见图2，可见Rox通道上有80度、60度、65度、75度四个明显的溶解峰。代表3种不同的亚型和一个Lyt基因内参。
序列表
<110> 武汉缉熙生物科技有限公司
<120> 一种肺炎链球菌血清型分型的检测方法
<160> 57
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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ggctactggt acgtacattc 20
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aatcaagcca tctggctcta 20
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ctgttacttg ttctggactc tcgataattg g 31
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gcccactcct gttaaaatcc tacccgcatt g 31
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aatttgtatt ttattcatgc ctatatctgg 30
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ttagcggaga taatttaaaa tgatgacta 29
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gagagattca taatcttgca cttagcca 28
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cataatagct acaaatgact catcgcc 27
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gccaatactt cttagtctct cagatgaat 29
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agcctgttcc gtccgctgac tggataaact cagctgagtc cgctccgaca gcaggcacta 60
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
gggttcccta agggttggag tgggttgttt tagtgattac aatgggctgt gc 52
<210> 42
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
tttcggttta gcaggagttt ctgcaacctt tgcagccaga gtggtcttaa tgtctagatt 60
ggatcttgct ggcac 75
<210> 43
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
agccagagtg gtcttaatg 19
<210> 44
<211> 54
<212> DNA
<213>
<400> 44
gggttcccta agggttggac gagttatgaa ggtgaattga cagtgcgaac tttt 54
<210> 45
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
attcgagttc tcattcgtgt tattgacgta tctgccatgc ctaatggtcc agttctagat 60
tggatcttgc tggcac 76
<210> 46
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
catgcctaat ggtccagt 18
<210> 47
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
gggttcccta agggttggat aacgccagta aagagatgac tattgtcgt 49
<210> 48
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
tgctgtcact accagtctat gctcttcagg tcgttacgtg gattagcggt ctctagattg 60
gatcttgctg gcac 74
<210> 49
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
caggtcgtta cgtggattag cggtc 25
<210> 50
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
gggttcccta agggttggag tcccatagga aggaaatagt atttgttcgt cc 52
<210> 51
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
cgcaaactct gtcctattct catatgataa tgccacggat gcaatagaac tcttcgcgct 60
ctagattgga tcttgctggc ac 82
<210> 52
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
acggatgcaa tagaactctt cgcgc 25
<210> 53
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
gggttcccta agggttggag gaagaagctt attaggttgg gacggattcg ta 52
<210> 54
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
tcagctacca gttacggagt aagatatgca ggagccgtgc tgaccgttct cgtatgtgcg 60
tctagattgg atcttgctgg cac 83
<210> 55
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 55
gccgtgctga ccgttctcgt atgtgcg 27
<210> 56
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 56
gggttcccta agggttgga 19
<210> 57
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 57
tctagattgg atcttgctgg cac 23
Claims (3)
1.一种用于非诊断目的的肺炎链球菌血清型分型的检测方法，包括以下步骤：
步骤一、提取待测肺炎链球菌样本基因组DNA；
步骤二、PCR预扩增：以步骤一提取的待测肺炎链球菌样本的基因组DNA作为模板，使用PCR预扩增引物对提取的肺炎链球菌标本基因组DNA进行预扩增；
步骤三、MLPA探针杂交、连接、扩增：使用MLPA探针对待测肺炎链球菌样本基因组DNA PCR预扩增产物进行杂交,同时在反应体系中加入相应的荧光检测探针；用连接酶连接已杂交的MLPA探针,并以MLPA通用扩增引物PCR扩增已杂交并连接好的MLPA探针；
步骤四:MLPA产物检测：使用多色荧光溶解曲线分析PCR产物；
步骤二中所述的PCR预扩增引物与步骤三中所述的MLPA探针及相应的荧光检测探针是选自以下引物与探针组1至3中的一组、两组或全部：
引物与探针组1：
①PCR预扩增引物：
4型PF2：CTG TTA CTT GTT CTG GAC TCT CGA TAA TTG G；
4型PR2：GCC CAC TCC TGT TAA AAT CCT ACC CGC ATT G；
②MLPA探针：
4L:gggttccctaagggttggaGGTCACATCTACTTCTTGCGTCACTGTATCTGA；
4R:CGATAAAATTTGTAATCCCGATGCCTGAGCCTCGGCACAGCGATTGCGTTGAGGAGTCCGtctagattggatcttgctggcac；
③荧光检测探针：
4detection probe：GGCACAGCGATTGCGTTGAGGAGTCCG；
引物与探针组2：
①PCR预扩增引物：
6型PF3：AAT TTG TAT TTT ATT CAT GCC TAT ATC TGG；
6型PR3：TTA GCG GAG ATA ATT TAA AAT GAT GAC TA；
②MLPA探针：
6L:gggttccctaagggttggaGAGTATGGGAAGGTGTTGTTCTGCCCT；
6R:
GAGCAACTGGTCTTGTATCGAAGACATGGACTCCGTCCTTAGAGTCCGCTtctagattggatcttgctggcac；
③荧光检测探针：
6detection probe:TCCGTCCTTAGAGTCCGCT；
引物与探针组3：
①PCR预扩增引物：
19F型PF8：GTT AAG ATT GCT GAT CGA TTA ATT GAT ATC C；
19F型PR8：GTA ATA TGT CTT TAG GGC GTT TAT GGC GAT AG；
②MLPA探针：
19F L:gggttccctaagggttggaCGAGTTATGAAGGTGAATTGACAGTGCGAACTTTT；
19F R:
ATTCGAGTTCTCATTCGTGTTATTGACGTATCTGCCATGCCTAATGGTCCAGTtctagattggatcttgctggcac；
③荧光检测探针：19F detection probe：CATGCCTAATGGTCCAGT；
步骤二中所述的使用PCR预扩增引物对提取的肺炎链球菌标本基因组DNA进行预扩增的反应程序为：
步骤三中所述的使用MLPA探针对待测肺炎链球菌样本基因组DNA PCR预扩增产物进行杂交，同时在反应体系中加入相应的荧光检测探针，用连接酶连接已杂交的MLPA探针,并以MLPA通用扩增引物PCR扩增已杂交并连接好的MLPA探针的反应体系和反应条件是：
反应体系：
反应条件：
2.根据权利要求1所述的肺炎链球菌血清型分型的检测方法，其特征在于，步骤一所述的提取待测肺炎链球菌样本基因组DNA，是使用Qiagen公司的细菌DNA提取试剂盒提取待测肺炎链球菌样本基因组DNA。
3.根据权利要求1所述的肺炎链球菌血清型分型的检测方法，其特征在于还使用了LytA内参引物对和LytA内参探针，所述的LytA内参引物对为：LytA PF1：GGCTACTGGTACGTACATTC；LytA PR1：AATCAAGCCATCTGGCTCTA；所述的LytA内参探针为：
LytA L：gggttccctaagggttggaTACTGGTTCGACAACTCAGGCGAAATGG；
LytA R：
AGCCTGTTCCGTCCGCTGACTGGATAAACTCAGCTGAGTCCGCTCCGACAGCAGGCACTATATTCtctagattggatcttgctggcac；
LytA detection probe：tctagattggatcttgctggcac。
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| 联合应用高分辨率熔解曲线和多重连接依赖探针扩增技术对PAH基因突变筛选研究;季春燕等;《中华医学遗传学杂志》;20111231;摘要、第650页左栏第1段 * |
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