CN102449169A

CN102449169A - 化学连接依赖性的探针扩增(clpa)

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Publication number: CN102449169A
Application number: CN2010800234466A
Authority: CN
Inventors: R·特布吕根
Original assignee: DX TERITY DIAGNOSTICS Inc
Current assignee: DX TERITY DIAGNOSTICS Inc
Priority date: 2009-04-01
Filing date: 2010-03-29
Publication date: 2012-05-09
Anticipated expiration: 2030-03-29
Also published as: JP2012531887A; EP2414544A4; EP2765205A1; US20100267585A1; HK1201081A1; AU2010232972B2; ES2469092T3; US9976177B2; CN102449169B; US20190106739A1; HK1167269A1; DK2414544T3; EP2414544A1; EP2414544B1; WO2010114599A1; CA2757300C; AU2010232972A1; CA2757300A1; EP2765205B1; SMT201400108B

Abstract

本发明提供了用于检测样品中存在的一种或多种核酸靶物的组合物、仪器和方法。本发明的方法包括：使用2种或更多种寡核苷酸探针，所述探针彼此紧密靠近地可逆地结合靶核酸，并具有互补的反应性连接部分。当这样的探针已经以适当取向结合靶物时，它们能够发生自发的化学连接反应，该反应产生连接的寡核苷酸产物。在一个方面，所述连接产物具有与特定靶物有关的可变长度。在化学连接以后，通过毛细管电泳或微阵列分析，可以放大和检测探针。

Description

化学连接依赖性的探针扩增(CLPA)

相关申请

本申请要求2009年4月1日提交的美国临时申请号61/165,839的优先权，其整个公开内容通过引用并入本文，如同在本文中予以完整阐述。

技术领域

本发明涉及使用化学连接检测样品中的核酸的组合物和方法。

背景技术

本发明涉及用于检测样品中存在的一种或多种核酸靶物的组合物、仪器和方法。特定核酸的检测是诊断医学和分子生物学研究的一种重要工具。

基因探针测定法目前在下述方面起作用：鉴别传染性生物体诸如细菌和病毒、探测正常基因和突变基因的表达以及鉴别与疾病或损伤有关的基因(诸如癌基因)、在组织移植之前分型组织的相容性、匹配用于法医学的组织或血液样品、对紧急响应情形(如核事故或流行性流感暴发)做出响应、测定疾病预后或病因、和探查来自不同物种的基因之间的同源性。

理想地，基因探针测定法应当是灵敏的、特异性的和可容易地自动化的(关于综述，参见Nickerson，Current Opinion in Biotechnology(1993)4：48-51)。通过开发聚合酶链式反应(PCR)和允许研究人员在分析之前指数地扩增特定核酸序列的其它扩增技术，已经极大地减轻了对灵敏度(即低检测限)的要求(关于综述，参见Abramson等人，Current Opinionin Biotechnology，(1993)4：41-47)。例如，已经证实，对SNP基因座进行多重PCR扩增并随后与寡核苷酸阵列杂交，是同时对数百个SNP进行基因分型的准确的且可靠的方法(参见Wang等人，Science，(1998)280：1077；也参见Schafer等人，Nature Biotechnology，(1989)16：33-39)。

特异性也是许多目前可利用的基因探针测定法的一个问题。探针和靶物之间的分子互补性程度决定了相互作用的特异性。杂交反应中探针、靶物和盐的组成和浓度的变化以及反应温度和探针长度都可以改变探针/靶物相互作用的特异性。

在有些情况下，区分具有精确互补性的靶物和具有错配的靶物是可能的，尽管在使用传统技术的情况下这通常是非常困难的，因为反应条件的小变动会改变杂交。对于错配检测具有必要的特异性的更新的技术包括探针消化测定法(其中错配会建立探针切割位点)和DNA连接测定法(其中单点错配会阻止连接)。

多种酶的和非酶的方法可用于检测序列变动。基于酶的方法的实例包括Invader^TM、寡核苷酸连接测定法(OLA)、单碱基延伸方法、等位基因PCR、和竞争探针分析(例如通过杂交进行竞争测序)。酶法DNA连接反应是本领域众所周知的(Landegren，Bioessays(1993)15(11)：761-5；Pritchard等人，Nucleic Acids Res.(1997)25(17)：3403-7；Wu等人，Genomics，(1989)4(4)：560-9)，且已经广泛地用于SNP检测、酶扩增反应和DNA修复。

已经开发了许多非酶的或模板介导的化学连接方法，它们可以用于检测序列变动。这些方法包括化学连接方法，该方法使用偶联剂，诸如N-氰基咪唑、溴化氰、和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺氢氯化物。参见Metelev，V.G.，等人，Nucleosides & Nucleotides(1999)18：2711；Luebke，K.J.，和Dervan，P.B.J.Am.Chem.Soc.(1989)111：8733；和Shabarova，Z.A.，等人，Nucleic Acids Research(1991)19：4247，它们各自通过引用整体并入本文。

Kool(美国专利号7,033,753，它通过引用整体并入本文)描述了化学连接和荧光共振能量转移(FRET)用于检测遗传多态性的应用。在该方法中，读数是基于荧光强度的溶液相变化。

Terbrueggen(美国专利申请60/746,897，它通过引用整体并入本文)描述了化学连接方法、组合物和试剂用于通过微阵列检测来检测核酸的应用。

其它化学连接方法使5’-甲苯磺酸酯或5’-碘代基团与3’-硫代磷酸酯基团反应，产生用硫替代成桥的磷酸二酯氧原子之一的DNA结构。参见Gryanov，S.M.，和Letsinger，R.L.，Nucleic Acids Research(1993)21：1403；Xu，Y.和Kool，E.T.Tetrahedron Letters(1997)38：5595；和Xu，Y.和Kool，E.T.，Nucleic Acids Research(1999)27：875，它们各自通过引用整体并入本文。

使用非酶方法进行核酸靶物检测的一些优点包括：对非天然的DNA类似物结构的更低灵敏度，能够使用RNA靶序列，在不同条件下更低的成本和更大的稳健性。Letsinger等人(美国专利号5,780,613，通过引用整体并入本文)以前已经描述了邻近的模板-结合的寡核苷酸的不可逆的、非酶的、共价的自连接(autoligation)，其中一个寡核苷酸具有5’可取代的基团，另一个寡核苷酸具有3’硫代磷酰基基团。

PCT申请WO 95/15971、PCT/US96/09769、PCT/US97/09739、PCT US99/01705、WO96/40712和WO98/20162(它们都特别地通过引用整体并入本文)描述了新颖的组合物，其包含含有电子转移部分的核酸，包括电极，其可以实现新颖的核酸杂交检测方法。

已经获得增加的重要性的一种技术包括使用DNA阵列(Marshall等人，Nat Biotechnol.(1998)16(1)：27-31)，特别是对于包括同时测量多种核酸靶物的用途。DNA阵列最经常用于基因表达监测，其中同时测量1至100,000个核酸靶物(mRNA)的相对浓度。DNA阵列是小装置，其中核酸锚定探针以在生产时就已知的独特方式连接在表面上(Marshall等人，Nat Biotechnol.(1998)16(1)：27-31)，或可以在以后准确地译解，诸如在珠子阵列的情况下(Steemers等人，Nat Biotechnol.(2000)18(1)：91-4；和Yang等人，Genome Res.(2001)11(11)：1888-98.)。在一系列上游处理步骤后，使目标样品接触DNA阵列，样品中的核酸靶物与表面上的锚定寡核苷酸杂交，并测定样品中靶核酸的同一性，且经常测定样品中靶核酸的浓度。

许多目前使用的核酸检测方法具有阻碍它们的广泛适用性的特征和/或限制。例如，在DNA微阵列的情况下，在使样品接触微阵列之前，通常必须对样品进行一系列处理步骤。尽管这些步骤随阵列的生产商和/或用于读出阵列的技术(荧光、电化学、化学发光、磁阻、悬臂梁偏转、表面等离子体共振)而异，这些处理步骤通常归入一些总类别：核酸分离和纯化、酶扩增、可检测标记掺入、和扩增后净化。其它常见的步骤是样品浓缩、扩增的靶物片段化(从而减小核酸靶物的平均大小)、和外切核酸酶消化(以将PCR扩增的靶物转化成单链物质)。

对于使DNA阵列接触样品之前的许多上游处理步骤的需求，可以显著增加通过这些方法来检测核酸靶物的时间和成本。还对得到的数据的质量具有显著影响。例如，有些扩增操作对靶物降解是非常敏感的，如果输入的核酸材料没有较好地保藏，则会表现得较差(Foss等人，DiagnMol Pathol.(1994)3(3)：148-55)。可以消除或减少上游处理步骤的数目和/或复杂性的技术，能够显著降低成本，并提高从DNA阵列实验得到的结果的质量。一种用于减少上游处理步骤的方法包括，使用连接反应来增加信号强度和提高特异性。

仍然需要用于有效的且特异性的核酸检测的方法和组合物。因此，本发明为非酶的化学连接反应提供了方法和组合物，它们会提供非常快速的靶物检测，并极大地简化检测和测量核酸靶物的过程。

发明内容

因此，在一个方面，本发明涉及一种方法，所述方法包括：提供连接底物和第一连接探针和第二连接探针，所述连接底物包含至少含有第一靶结构域和第二靶结构域的靶核酸序列。所述连接探针可以包含可变长度和/或序列的填充序列。所述第一连接探针包含与所述第一靶结构域基本上互补的第一探针结构域和5’-连接部分。所述第二连接探针包含与所述第二靶结构域基本上互补的第二探针结构域和3’连接部分。任选地，所述第一靶结构域和所述第二靶结构域被至少一个核苷酸隔开。任选地，所述第一连接探针和所述第二连接探针中的至少一个包含锚序列和/或标记，包括标记探针结合序列。在没有外源加入的连接酶存在下，连接所述第一连接探针和第二连接探针，以形成连接产物。所述连接的产物可以任选地被捕获在基质上并进行检测，所述基质包含与所述锚序列基本上互补的捕获探针。通过毛细管电泳、微阵列分析、或任意其它合适的方法，可以扩增和检测连接产物。

附图说明

图1.CLPA-CE试验的一个实施方案的示意图。

图2.CLPA-MDM试验的一个实施方案的示意图。

图3.该示意图显示了2-探针和3-探针CLPA反应的一个实施方案。

图4.DNA合成树脂的示意图，所述DNA合成树脂可以用于生产具有3’-DABSYL离去基团的DNA。

图5.CLPA-CE试验的一个实施方案的方法流程的示意图。

图6.该示意图显示了用于CLPA试验的探针设计，其中掺入了大小不同的填充序列。

图7.通过CLPA-CE分析的样品的电泳分离曲线。

图8.靶物浓度和峰高在CLPA-CE分析中的线性关系。

具体实施方式

除非另有说明，本发明的实践可以采用有机化学、聚合物技术、分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学、生物化学、和免疫学的常规技术和描述，它们都在本领域的技能范围内。这样的常规技术包括聚合物阵列合成、杂交、连接、和使用标记检测杂交。通过参考下文的实施例，可以获得适当技术的具体实例。但是，也可以使用其它等效的常规操作。这样的常规技术和描述可以参见标准的实验室手册，诸如GenomeAnalysis：A Laboratory Manual Series(第I-IV卷)，Using Antibodies：ALaboratory Manual，Cells：A Laboratory Manual，PCR Primer：ALaboratory Manual，and Molecular Cloning：A Laboratory Manual(都由Cold Spring Harbor Laboratory Press出版)，Stryer，L.(1995)Biochemistry(第4版)Freeman，New York，Gait，“OligonucleotideSynthesis：A Practical Approach”1984，IRL Press，London，Nelson andCox(2000)，Lehninger，Principles of Biochemistry第3版，W.H.FreemanPub.，New York，N.Y.和Berg等人(2002)Biochemistry，第5版，W.H.Freeman Pub.，New York，N.Y.，它们都通过引用为了所有目的整体并入本文。此外，在本申请中引用的所有参考文献都通过引用为了所有目的整体并入本文。

概述

本发明提供了用于检测样品中的一种或多种核酸靶物(包括DNA和RNA靶物)的组合物、仪器和方法。此外，所述样品无需进行纯化。实际上，本发明的一个方面涉及分析不纯的样品，包括身体样品，例如、但不限于全血。本发明提供了使用2种或更多种寡核苷酸探针的方法，所述探针彼此紧密靠近地可逆地结合靶核酸，并具有互补的反应性连接部分(应当指出，如本文另外所述，所述反应部分在本文中称作“连接部分”)。当探针已经以适当取向结合靶物时，它们能够发生自发的化学连接反应，该反应产生连接的寡核苷酸产物。在连接以后，产生新的产物，其可以通过酶或化学反应进行扩增。在优选的实施方案中，化学连接反应会连接在它们上具有PCR引物位点的2种探针，例如通用的PCR引物。另外，在本发明的一个实施方案中，一种或两种连接探针含有填充序列或可变的间隔序列，其设计成对于每个探针集合(即每个靶序列)具有不同长度，由此产生具有靶物-特异性的长度的连接产物。在连接以后，现在可以通过PCR指数地扩增确定长度的寡核苷酸。根据本发明的一个方面，所述探针可以具有可检测的标记(荧光标记、电化学标记、磁珠、纳米颗粒、生物素)，以辅助鉴别、纯化、定量或检测连接的寡核苷酸产物。所述探针还可以在它们的结构中任选地包括：用于以后捕获在固体支持物(微阵列、微珠、纳米颗粒)上的锚定寡核苷酸序列、促进连接的产物的浓缩或操作的分子手柄(磁性颗粒、寡核苷酸编码序列)、和促进连接的产物的后续第二次扩增(通过酶，如DNA或RNA聚合酶)的启动子序列。本发明的连接反应快速进行，对目标靶物是特异性的，且可以产生每种靶物的连接产物的多个拷贝，导致可检测信号的放大(有时在本文中称作“产物周转”)。本发明的连接反应不要求存在外源加入的连接酶，也不要求额外的酶，尽管有些第二反应可能依赖于诸如聚合酶等酶的使用，如下面所述。从许多以前描述的化学部分，可以选择连接化学试剂。优选的化学试剂是这样的试剂，其可以容易地整合进常规生产技术，在储存期间是稳定的，并在整合进适当设计的连接探针集合中时表现出对靶物特异性连接的大偏好。另外，对于包括以后通过酶进行扩增的实施方案，产生可以通过酶来有效地处理的连接产物的连接化学试剂和探针设计(包括非天然的核苷酸类似物)是优选的。靶物的扩增还可以包括连接产物的周转，其中所述连接产物对模板或靶核酸具有比单个连接探针更低的或相当的亲和力。因而，在连接杂交的探针以后，连接产物从靶物释放出来，释放出靶物以用作新的连接反应的模板。

在一个实施方案中，本发明的连接反应包括转移反应。在该实施方案中，所述探针与靶序列杂交，但是，不是寡核苷酸探针连接到一起形成连接产物，而是发生核酸-指导的分子实体(包括报告分子诸如荧光团、猝灭剂等)从一个寡核苷酸探针转移至其它寡核苷酸探针。该转移反应类似于连接反应，但是不是连接2个或更多个探针，而是一个探针连接至转移分子，另一个探针是化学反应的“离去基团”。我们使用术语“转移”反应来区分得到的终产物的不同性质。重要的是，类似于连接反应，通过转移探针在核酸靶物上的近端结合，会促进转移反应，使得只有在探针已经彼此足够紧密靠近(例如，在邻近位点，以发生转移反应)地与靶核酸杂交的情况下，才可检测到显著的信号。

样品

因此，在一个方面，本发明提供了用于检测靶序列在样品中是否存在的组合物和方法。本领域技术人员会理解，样品溶液可以包含任意数目的物质，包括、但不限于，体液(包括、但不限于基本上任意生物体的血液、尿、血清、淋巴、唾液、肛门和阴道分泌物、汗和精液，其中哺乳动物样品是优选的，人样品是特别优选的)；环境样品(包括、但不限于，空气、农业、水和土壤样品)；植物材料；生物战剂样品；研究样品(例如，样品可以是扩增反应(例如基因组DNA的一般扩增)的产物)；纯化的样品，诸如纯化的基因组DNA、RNA、蛋白等；粗样品(细菌、病毒、基因组DNA等)；本领域技术人员会理解，可以已经对样品进行了基本上任意的实验操作。有些实施方案使用siRNA和microRNA作为靶序列(Zhang等人，J Cell Physiol.(2007)210(2)：279-89；Osada等人，Carcinogenesis.(2007)28(1)：2-12；和Mattes等人，Am JRespir Cell Mol Biol.(2007)36(1)：8-12，它们各自通过引用整体并入本文)。

本发明的有些实施方案使用来自储存的(例如冷冻的和/或存档的)或新鲜的组织的核酸样品。石蜡包埋的样品特别适用于许多实施方案，因为对于诸如诊断和预后，这些样品可以是非常有用的，这是由于存在与样品有关的额外数据。本文所述的固定的和石蜡包埋的组织样品表示可储存的或可存档的组织样品。大多数来自患者的病理学样品常规地被固定和石蜡包埋，以允许进行组织学分析和随后的可存档的储存。这样的样品经常不可用于传统的核酸检测方法，因为这样的研究要求核酸样品的高完整性，才能准确地测量核酸表达。经常，石蜡-包埋的样品中的基因表达研究限于定性监测，其中使用免疫组织化学染色来监测蛋白表达水平。

本发明的方法和组合物可以用于检测来自石蜡-包埋的样品的核酸，因为在石蜡中固定和包埋的过程经常导致样品的核酸的降解。本发明能够扩增和检测甚至降解的样品，诸如在石蜡-包埋的样品中发现的那些。

存在许多用于纯化来自固定的石蜡-包埋的样品的核酸的技术，如在WO 2007/133703中所述，其整个内容通过引用并入本文。

在一个优选的实施方案中，靶分析物是核酸。“核酸”或“寡核苷酸”或语法等同描述在本文中是指至少2个共价地连接到一起的核苷酸。本发明的核酸通常含有磷酸二酯键(例如在靶序列的情况下)，尽管在下述的某些情况下，包括核酸类似物，它们可能具有替代主链(特别对于与连接探针一起使用)，所述主链包含，例如，磷酰胺(Beaucage等人，Tetrahedron(1993)49(10)：1925和其中的参考文献；Letsinger，J.Org.Chem.(1970)35：3800；Sprinzl等人，Eur.J.Biochem.(1977)81：579；Letsinger等人，Nucl.Acids Res.(1986)14：3487；Sawai等人，Chem.Lett.(1984)805；Letsinger等人，J.Am.Chem.Soc.(1988)110：4470；和Pauwels等人，Chemica Scripta(1986)26：141)、硫代磷酸酯(Mag等人，Nucl.Acids Res.(1991)19：1437；和美国专利号5,644,048)、二硫代磷酸酯(Briu等人，J.Am.Chem.Soc.(1989)111：2321)、O-甲基亚磷酰胺连接(参见Eckstein，Oligonucleotides and Analogues：A Practical Approach，Oxford University Press)、和肽核酸主链和连接(参见Egholm，J.Am.Chem.Soc.(1992)114：1895；Meier等人，Chem.Int.Ed.Engl.(1992)31：1008；Nielsen，Nature，(1993)365：566；Carlsson等人，Nature(1996)380：207，它们都通过引用整体并入本文)。其它类似物核酸包括具有二环结构的那些，包括锁定的核酸(Koshkin等人，J.Am.Chem.Soc.(1998)120：13252 3)；正主链(Denpcy等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)92：6097；非离子型主链(美国专利号5,386,023、5,637,684、5,602,240、5,216,141和4,469,863；Kiedrowshi等人，Angew.Chem.Intl.Ed.English(1991)30：423；Letsinger等人，J.Am.Chem.Soc.(1988)110：4470；Letsinger等人，Nucleoside & Nucleotide(1994)13：1597；第2和3章，ASCSymposium Series 580，Y.S.Sanghui和P.Dan Cook编；Mesmaeker等人，Bioorganic & Medicinal Chem.Lett.(1994)4：395；Jeffs等人，J.Biomolecular NMR(1994)34：17；Xu等人，Tetrahedron Lett.(1996)37：743)和非核糖主链，包括在下述文献中所述的那些：美国专利号5,235,033和5,034,506，和第6和7章，ASC Symposium Series 580，Y.S.Sanghui和P.Dan Cook编。在核酸的定义内也包括含有一个或多个碳环糖的核酸(参见Jenkins等人，Chem.Soc.Rev.(1995)第169-176页)。几种核酸类似物描述在：Rawls，C & E News Jun.2，1997第35页。所有这些参考文献特别地通过引用并入本文。可以进行核糖-磷酸酯主链的这些修饰，以便利标记或其它部分的添加，以增加或减小这样的分子在生理环境中的稳定性和半衰期等。

本领域技术人员会理解，所有这些核酸类似物可以用于本发明中。另外，可以制备天然存在的核酸和类似物的混合物；例如，在连接部分位点处，可以使用类似物结构。或者，可以制备不同的核酸类似物的混合物，和天然存在的核酸和类似物的混合物。

核酸类似物可以包括，例如，肽核酸(PNA，WO 92/20702，通过引用整体并入本文)和锁定的核酸(LNA，Koshkin AA等人Tetrahedron(1998)54：3607-3630.，Koshkin AA等人J.Am.Chem.Soc.(1998)120：13252-13253.，Wahlestedt C等人PNAS(2000)97：5633-5638，它们各自通过引用整体并入本文)。在有些应用中，这类的类似物主链可以表现出提高的杂交动力学、提高的热稳定性和提高的对错配序列的灵敏度。

所述核酸可以是单链的或双链的(如指出的)，或含有双链序列或单链序列的一部分。所述核酸可以是DNA(基因组DNA和cDNA)、RNA或杂合体，其中所述核酸含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的任意组合和碱基的任意组合，包括天然存在的核苷碱基(尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤)和非天然存在的核苷碱基(肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、5-甲基胞嘧啶、假异胞嘧啶、2-硫代尿嘧啶和2-硫代胸腺嘧啶、2-氨基嘌呤、N9-(2-氨基-6-氯嘌呤)、N9-(2，6-二氨基嘌呤)、次黄嘌呤、N9-(7-脱氮-鸟嘌呤)、N9-(7-脱氮-8-氮杂-鸟嘌呤)和N8-(7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤)。5-丙炔基-尿嘧啶、2-硫代-5-丙炔基-尿嘧啶)等。本文使用的术语“核苷碱基”包括“核苷”和“核苷酸”和核酸类似物的单体。因而，例如，肽核酸的单个单位(各自含有碱基)在本文中称作核苷碱基。

在一个方面，本发明的连接探针是这样的任意聚合物质：其能够以序列特异性的方式与核酸靶物相互作用，并具有允许所述探针与具有互补化学部分的另一聚合物质发生自发化学连接反应的化学部分。在一个实施方案中，所述寡核苷酸探针可以是DNA、RNA、PNA、LNA、前述物质的修饰形式和/或它们的任意杂合体(例如DNA/RNA杂合体、DNA/LNA杂合体、DNA/PNA杂合体)。在一个优选的实施方案中，所述寡核苷酸探针是DNA或RNA寡核苷酸。

在检测或杂交之前，通常使在靶序列区域不以单链状态存在的核酸样品(例如靶序列)在这样的区域成为单链。通常，使用热变性，可以使核酸样品在靶序列区域成为单链。对于通过扩增得到的多核苷酸，适用于产生单链扩增产物的方法是优选的。适用于产生单链扩增产物多核苷酸的扩增方法的非限制性实例包括、但不限于：T7 RNA聚合酶失控转录、RCA、不对称的PCR(Bachmann等人，Nucleic Acid Res.(1990)18：1309)和不同步PCR(WO 01/94638)。通常已知的使双链多核苷酸区域成为单链的方法，诸如使用PNA打开剂(美国专利号6,265,166)，也可以用于在多核苷酸上产生单链靶序列。

在一个方面，本发明提供了检测靶序列的方法。“靶序列”或“靶核酸”或语法等同描述在本文中是指核酸单链上的核酸序列。靶序列可以是基因的一部分、调节序列、基因组DNA、cDNA、RNA(包括mRNA、MicroRNA和rRNA)或其它。如本文所述，靶序列可以是来自样品的靶序列或第二靶物，诸如扩增反应产物等。它可以是任意长度，应当理解，序列越长，特异性越大。本领域技术人员会理解，互补靶序列可以是许多形式。例如，它可以被包含在更大的核酸序列(即全部或一部分基因或mRNA、质粒或基因组DNA的限制片段以及其它)内。

在有些实施方案中，所述靶序列包含不同类型的靶结构域。例如，样品靶序列的第一靶结构域可以与第一连接探针杂交，靶序列中的第二靶结构域可以与第二连接探针杂交。其它靶结构域可以与基质(诸如阵列)上的捕获探针或标记探针等杂交。

如下面更完整地描述的，靶结构域可以是相邻的或隔开的(如指出的)。在某些情况下，当检测是基于连接且应用需要放大信号时，连接探针可以利用连接物，且可以被靶序列的一个或更多个核苷碱基隔开，以赋予连接的产物杂交不稳定性。在其它应用中，例如在单核苷酸多态性(SNP)检测中，或在转移反应中，所述连接探针可以与靶序列的邻近核苷碱基杂交。除非指出，术语“第一”和“第二”无意赋予关于靶序列的5′-3′取向的序列取向。例如，假定互补靶序列的5′-3′取向，第一靶结构域可以位于第二结构域的5′侧或第二结构域的3′。为了容易参照，且非限制性地，这些结构域有时称作“上游”和“下游”，常规约定是，靶序列以5’至3’取向放置。

将探针设计成，使得当所述探针在空间上紧密靠近地结合靶多核苷酸的一部分时，在探针之间发生化学连接反应。一般而言，所述探针包含化学反应部分(在本文中通常称作“连接部分”)，并以特定取向结合靶多核苷酸，使得化学反应部分在空间上紧密靠近，从而导致自发的连接反应。

探针组分

在一个实施方案中，本发明提供了连接探针集合，通常是第一连接探针和第二连接探针的集合，尽管如本文所述，有些实施方案使用超过两种。另外，如本文指出的，在有些情况下，进行转移反应而不是连接；“连接探针”包括“转移探针”。每个连接探针包含核酸部分，有时在本文中称作“探针结构域”，其与靶结构域之一基本上互补。本发明的探针设计成与靶序列互补，使得发生靶序列和本发明的探针的杂交。如本文所述，该互补性不需要是精确的；可能存在任意数目的碱基对错配，它们会干扰靶序列和本发明的探针之间的杂交。但是，如果突变的数目过大使得在甚至最低严谨性的杂交条件下也不能发生杂交，所述序列不是互补序列。因而，“基本上互补的”在本文中是指，所述探针与靶序列充分互补，以在正常反应条件下杂交。“同一的”序列是这样的序列：在较短的核苷碱基序列的长度范围内，存在精确的互补性。

在本发明的一个方面，将探针的长度设计成随着靶序列的长度、需要的特异性、反应(例如连接或转移)和杂交和洗涤条件而变化。通常，在该方面，连接探针是约5至约150个核苷碱基，其中约15至约100个是优选的，约25至约75个是特别优选的。一般而言，这些长度同样适用于连接和转移探针。

在本发明的另一个实施方案(在本文中称作“CLPA-CE”，在下面更完整地描述)中，将探针长度设计成随每种目标靶物而变化，从而产生可以基于长度差异而鉴别和分析的连接产物。

多种杂交条件可以用于本发明中，包括高、中和低严谨性条件；参见例如Maniatis等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，1989，和Ausubel，等人，Short Protocols in Molecular Biology，通过引用并入本文。如本领域已知的，当使用非离子型主链(例如PNA)时，杂交条件也可以变化。

连接部分

除了连接结构域以外，本发明的连接探针具有连接部分。因此，在一个方面，本发明涉及化学连接方法，所述方法包括：在使得第一连接探针和第二连接探针的连接部分能够自发地反应的条件下，至少使第一连接探针和第二连接探针结合靶核酸，以形成“连接底物”，从而在没有外源性的连接酶存在下(也就是说，没有向反应物中加入外源性的连接酶)，将探针连接到一起。在转移反应的情况下，这可以称作“连接底物”或“转移底物”。“连接底物”在本文中是指包含至少一个靶核酸序列和两个或更多个连接探针的化学连接底物。类似地，在“连接底物”的定义内包括“转移底物”，其包含至少一个靶核酸序列和两个或更多个转移探针。

在本发明的有些实施方案中，例如当需要额外的特异性时，可以使用超过两个连接探针。在该实施方案中，“中间的”连接探针也可以是邻近的，或被靶序列的一个或多个核苷碱基隔开。在一个优选的实施方案中，所述连接反应不要求存在连接酶，并在没有任何添加(例如外源的)连接酶存在下在结合的探针之间自发地发生。

本发明的寡核苷酸探针被设计成是对多核苷酸靶物特异性的。这些探针会在空间上彼此紧密靠近地结合靶物，并以使化学反应部分在空间上紧密靠近的方式取向。在一个方面，2个或更多个探针被设计成结合靶多核苷酸上的邻近位点。在一个优选的实施方案中，2个探针结合靶物，使得在一个寡核苷酸探针的5’末端处的连接部分能够与在其它探针的3’末端处的连接部分相互作用。

在适当条件下，化学连接可以自发地发生，无需加入任何额外的活化剂或刺激。或者，可以使用“活化”剂或外部刺激来促进化学连接反应。活化剂的实例包括、但不限于：碳二亚胺、溴化氰(BrCN)、咪唑、1-甲基咪唑/碳二亚胺/胱胺、N-氰基咪唑、二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)和其它还原剂以及外部刺激如紫外光、热和/或压力变化。

如本文所述，本发明的连接部分可以采取多种构型，这取决于许多因素。本文所述的大部分化学试剂被用于亚磷酰胺反应中，该反应通常以3’至5’方向进行。也就是说，树脂含有这样的化学试剂，其允许在分子的5’末端连接亚磷酰胺。但是，如本领域已知的，亚磷酰胺可以用于以5’至3’方向进行；因而，本发明包括具有与本文所述的那些相反的取向的部分。

每个连接探针(或转移探针)集合含有一组第一连接部分和第二连接部分。这些连接部分对的鉴别依赖于要使用的连接的化学试剂。另外，如本文所述，在探针结构域和一个或两个连接探针的连接部分之间可以存在连接物(包括但不限于去稳定化连接物)。一般而言，为了便于讨论，本文的描述可以使用术语“上游”和“下游”连接探针，尽管这无意进行限制。

卤素离去基团化学试剂

在本发明的一个实施方案中，所述化学试剂是基于5’卤素离去基团技术，诸如一般地描述在：Gryanov，S.M.，和Letsinger，R.L.，(1993)Nucleic Acids Research，21：1403；Xu，Y.和Kool，E.T.(1997)TetrahedronLetters，38：5595；Xu，Y.和Kool，E.T.，(1999)Nucleic Acids Research，27：875；Arar等人，(1995)，BioConj.Chem.，6：573；Kool，E.T.等人，(2001)Nature Biotechnol 19：148；Kool，E.T.等人，(1995)Nucleic Acids Res，23(17)：3547；Letsinger等人，美国专利号5,476,930；Shouten等人，美国专利号6,955,901；Andersen等人，美国专利号7,153,658，它们都特别地通过引用并入本文。在该实施方案中，所述第一连接探针在它的5’末端处包括具有5’离去基团的核苷，且所述第二连接探针在它的3’末端处包括具有3’亲核基团(诸如3’硫代磷酰基)的核苷。所述5’离去基团可以包括本领域技术人员已知的许多常见的离去基团，包括，例如卤素物质(I、Br、Cl)和基团，诸如Abe和Kool，J.Am.Chem.Soc.(2004)126：13980-13986(通过引用整体并入本文)所述的那些。在本发明的该方面的一个更优选的实施方案中，所述第一连接探针具有通过柔性连接物连接的5’离去基团和具有3’硫代磷酰基的下游寡核苷酸。该构型会导致反应速率的显著提高，并导致针对每个靶物产生连接产物的多个拷贝。

“上游”寡核苷酸(按照多核苷酸模板的5′至3′方向被定义为结合在模板的“上游”侧(即，左侧或5′侧)的寡核苷酸)包括5′-离去基团作为它的5′末端。可以使用能够参与S_N2反应的任意离去基团，所述S_N2反应包含硫、硒、或碲作为亲核体。离去基团是这样的原子或基团：其连接在碳上，使得在修饰的磷酰基的亲核体(硫、硒或碲)对碳原子进行亲核攻击以后，所述离去基团作为阴离子离开。合适的离去基团包括，但不限于：卤化物(诸如碘化物、溴化物或氯化物)、甲苯磺酸酯、苯磺酸酯或对硝基苯基酯以及RSO₃，其中R是苯基或被1至5个原子或基团取代的苯基，所述原子或基团包括F、Cl、Br、I、烷基(C1-C6)、硝基、氰基、磺酰基和羰基，或R是具有1至6个碳的烷基。所述离去基团优选地是碘化物，且在DNA的情况下，在上游寡核苷酸的5′末端处的核苷是5′-脱氧-5′-碘-2′-脱氧核苷。合适的5′-脱氧-5′-碘-2′-脱氧核苷的实例包括、但不限于：5′-脱氧-5′-碘胸苷(5′-I-T)、5′-脱氧-5′-碘-2′-脱氧胞苷(5′-I-dC)、5′-脱氧-5′-碘-2′-脱氧腺苷(5′-I-dA)、5′-脱氧-5′-碘-3-脱氮-2′-脱氧腺苷(5′-I-3-脱氮-dA)、5′-脱氧-5′-碘-2′-脱氧鸟苷(5′-I-dG)和5′-脱氧-5′-碘-3-脱氮-2′-脱氧鸟苷(5′-I-3-脱氮-dG)、和它们的亚磷酰胺衍生物(参见图2)。在RNA寡核苷酸的情况下，合适的5′-脱氧-5′-碘核苷的类似实例包括、但不限于：5′-脱氧-5′-碘尿嘧啶(5′-I-U)、5′-脱氧-5′-碘胞苷(5′-I-C)、5′-脱氧-5′-碘腺苷(5′-I-A)、5′-脱氧-5′-碘-3-脱氮腺苷(5′-I-3-脱氮-A)、5′-脱氧-5′-碘鸟苷(5′-I-G)和5′-脱氧-5′-碘-3-脱氮鸟苷(5′-I-3-脱氮-G)、和它们的亚磷酰胺衍生物。在一个优选的实施方案中，上游连接探针含有2′-脱氧核糖核苷酸，但是在5′末端上的修饰的核苷酸(其包含5′离去基团)是核糖核苷酸。上游核苷酸的该实施方案是有利的，因为倒数第二位的2′-脱氧核糖核苷酸和末端5′核糖核苷酸之间的键对使用碱的切割是敏感的。这允许潜在地重复使用寡核苷酸探针，所述探针例如结合在固体支持物上，如下面更详细地描述的。参照下面更完整地描述的CLPA试验，“上游”探针的5’离去基团最优选地是DABSYL。

“下游”寡核苷酸(其结合在上游寡核苷酸“下游”(即，3′侧)的多核苷酸模板)包括具有连接在它的3′羟基上的下述基团的核苷作为它的3′末端：硫代磷酸酯基团(即，“3′-硫代磷酸酯基团”)、硒代磷酸酯基团(即，“3′-硒代磷酸酯基团)、或碲代磷酸酯基团(即，“3′-碲代磷酸酯基团”)。用于自动连接的化学试剂因而是硫-介导的、硒-介导的、或碲-介导的。自-连接产生这样的连接产物：其含有5′桥连的硫代磷酸酯(--O--P(O)(O.sup.-)--S--)、硒代磷酸酯(--O--P(O)(O.sup.-)--Se--)或碲代磷酸酯(--O--P(O)(O.sup.-)--Te--)，如构成下游寡核苷酸的3′末端的基团所指示的。该非天然的、非手性的桥连二酯位于两个邻近的核苷酸之间，并替代天然存在的5′桥连的磷酸二酯。令人惊奇地，硒-介导的连接速率是硫-介导的连接的3-4倍，且含有硒的连接产物是非常稳定的，尽管Se--P键的键强度更低。此外，预见到桥连的硒代磷酸酯以及桥连的碲代磷酸酯在非常温和的条件下可被银或汞离子选择性地切割(参见Mag等人，Nucleic Acids Res.(1991)19：14371441)。

在一个实施方案中，下游寡核苷酸含有2′-脱氧核糖核苷酸，但是在3′末端上的修饰的核苷酸(其包含3′硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、或碲代磷酸酯)是核糖核苷酸。上游核苷酸的该实施方案是有利的，因为倒数第二位的2′-脱氧核糖核苷酸和末端核糖核苷酸之间的键对使用碱的切割是敏感的，这允许潜在地重复使用寡核苷酸探针，所述探针例如结合在固体支持物上。参照下面更完整地描述的CLPA试验，“下游”探针最优选地在它的3’末端处包括3’-硫代磷酸酯。

应当指出，“上游”和“下游”寡核苷酸可以任选地构成单个寡核苷酸的两个末端，在该情况下，连接会产生环状连接产物。在线性前体寡核苷酸的5′和3′末端上的结合区必须通过许多插入核苷酸进行连接，所述插入核苷酸足以允许5′和3′结合区与多核苷酸靶物结合。

本发明提供的组合物包括：5′-脱氧-5-′碘-2′-脱氧核苷，例如5′-脱氧-5′-碘胸苷(5′-I-T)、5′-脱氧-5′-碘-2′-脱氧胞苷(5′-I-dC)、5′-脱氧-5′-碘-2′-脱氧腺苷(5′-I-dA)、5′-脱氧-5′-碘-3-脱氮-2′-脱氧腺苷(5′-I-3-脱氮-dA)、5′-脱氧-5′-碘-2′-脱氧鸟苷(5′-I-dG)和5′-脱氧-5′-碘-3-脱氮-2′-脱氧鸟苷(5′-I-3-脱氮-dG)、和它们的亚磷酰胺衍生物，以及包含本发明的5′-脱氧-5′-碘-2′-脱氧核苷作为它的5′末端的寡核苷酸。本发明提供的组合物另外包括：5′-脱氧-5′-碘核苷，诸如5′-脱氧-5′-碘尿嘧啶(5′-I-U)、5′-脱氧-5′-碘胞苷(5′-I-C)、5′-脱氧-5′-碘腺苷(5′-1-A)、5′-脱氧-5′-碘-3-脱氮腺苷(5′-I-3-脱氮-A)、5′-脱氧-5′-碘鸟苷(5′-I-G)和5′-脱氧-5′-碘-3-脱氮鸟苷(5′-I-3-脱氮-G)、和它们的亚磷酰胺衍生物，以及包含本发明的5′-脱氧-5′-碘核苷作为它的5′末端的寡核苷酸。本发明也包括：含有3′-硒代磷酸酯基团或3′-碲代磷酸酯基团的核苷，和包含含有3′-硒代磷酸酯基团或3′-碲代磷酸酯基团的核苷作为它的3′末端的寡核苷酸。本发明也包括：含有这些种类的修饰的核苷中的任一种或两种的寡核苷酸，以及制备不同的核苷和寡核苷酸的方法。根据本发明在5′或3′末端中的任一个或两个处被修饰的寡核苷酸任选地、但不一定包括可检测的标记，优选放射性标记、荧光能供体或受体基团、受激子标记、或它们的任意组合。

另外，在某些情况下，取代基也可以是保护基(有时在本文中称作“PG”)。合适的保护基取决于要保护的原子和所述部分将要暴露的条件。多种保护基是已知的；例如，DMT经常被用作亚磷酰胺化学法(如在附图中所描绘的)中的保护基；但是，在这些实施方案中，DMT可以被其它保护基替换。多种保护基是合适的；关于保护基和有关的化学法，参见例如，Greene′s Protective Groups in Organic Synthesis，它通过引用并入本文。

“烷基”或语法等同描述在本文中是指直链或支链烷基，其中直链烷基是优选的。如果是分支的，它可以在一个或多个位置处分支，且除非指出，在任意位置处分支。烷基可以具有约1至约30个碳原子(C1-C30)，一个优选的实施方案使用约1至约20个碳原子(C1-C20)，其中约C1至约C12至约C15是优选的，且C1至C5是特别优选的，尽管在有些实施方案中，烷基可以大得多。在烷基的定义内也包括环烷基，诸如C5和C6环和含有氮、氧、硫或磷的杂环。烷基也包括杂烷基，其中硫、氧、氮、和硅杂原子是优选的。烷基包括取代的烷基。“取代的烷基”在本文中是指另外含有一个或多个上面定义的取代部分“R”的烷基。

“氨基”或语法等同描述在本文中是指NH₂、--NHR和--NR₂基团，其中R如本文所定义。在有些实施方案中，例如在肽连接反应的情况下，伯胺和仲胺具有特定用途，其中伯胺通常表现出更快的反应速率。

“硝基”在本文中是指--NO₂基团。

“含有硫的部分”在本文中是指含有硫原子的化合物，所述硫原子包括但不限于，硫杂-、硫代-和磺基-化合物、硫醇(--SH和--SR)、和硫化物(--RSR--)。含有硫的部分的一种具体类型是硫代酸酯(-(CO)-S-)，通常作为取代的硫代酸酯(-(CO)-SR)存在。“含有磷的部分”在本文中是指含有磷的化合物，所述磷包括、但不限于膦和磷酸盐。“含有硅的部分”在本文中是指含有硅的化合物。

“醚”在本文中是指--O--R基团。优选的醚包括烷氧基，其中--O--(CH₂)₂CH₃和--O--(CH₂)₄CH₃是优选的。

“酯”在本文中是指--COOR基团。

“卤素”在本文中是指溴、碘、氯、或氟。优选的取代的烷基是部分地或完全地卤代的烷基，诸如CF₃等。

“醛”在本文中是指--RCOH基团。

“醇”在本文中是指--OH基团和烷基醇--ROH。

“酰氨基”在本文中是指--RCONH--或RCONR--基团。

“乙二醇”在本文中是指--(O--CH₂--CH₂)_n--基团，尽管亚乙基的每个碳原子也可以是单取代的或双取代的，即--(O--CR₂--CR₂)_n--，其中R如上所述。用其它杂原子替代氧的乙二醇衍生物(即--(N--CH₂--CH₂)_n--或--(S--CH₂--CH₂)_n--或含有取代基团)也是优选的。

另外，在有些实施方案中，所述R基团可以是官能团，包括猝灭剂、去稳定化部分和荧光团(如下面所定义)。在该实施方案中特别有用的荧光团包括、但不限于：荧光素和它的衍生物、TAMRA(四甲基-6-羧基罗丹明)、Alexa染料、和菁染料(例如Cy3和Cy5)。

猝灭剂部分或分子是本领域已知的，且通常是可以灭活另一分子的激发态的芳族多环化合物。荧光团-猝灭剂对是本领域众所周知的。合适的猝灭剂部分包括、但不限于：Dabsyl(二甲氨基(偶氮苯)磺酰基)、Dabcyl(二甲氨基(偶氮苯)羰基)、遮蔽猝灭剂(Glen Research Catalog)和来自Biosearch Technologies的黑洞猝灭剂(BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3)。

合适的去稳定化部分在下面予以讨论，包括、但不限于：导致寡核苷酸向它的靶部位的总结合能降低的分子实体。潜在的实例包括、但不限于：烷基链、带电荷的复合物、和环结构。

亲核体连接部分

在该实施方案中，其它的连接探针包含含有亲核体(诸如胺)的连接部分。含有硫醇和胺的连接部分特别适用于某些反应。一般而言，亲核体连接部分可以包括多种潜在的氨基、硫醇化合物，只要所述亲核体连接部分含有在伯氨基或仲氨基附近的硫醇基，且相对定位使得，在S至N酰基转移过程中，可以实现至少5或6元环过渡态。

因此，包含1，2或1，3胺硫醇基的亲核体连接分子特别适用。当反应时间比较重要时，伯胺可以用于有些实施方案中，因为伯胺的反应时间通常比仲胺更快，尽管仲胺可以用于下面讨论的促成去稳定化的酰基转移酶反应。氨基和硫醇基之间的碳可以被非氢的R基团取代，尽管每个碳通常仅使用一个非氢的R基团。另外，邻近的R基团(在图^*CC中描绘为R’和R”)可以连接在一起以形成环状结构，包括取代的和未取代的环烷基和芳基，包括杂环烷基和杂芳基，和它们的取代的和未取代的衍生物。在使用1，2氨基硫醇基并连接邻近的R基团的情况下，通常优选的是邻近的R基团形成环烷基(包括杂环烷基和它们的取代的衍生物)，而不是芳基。

在该实施方案中，为了去稳定化而造成链的4σ键收缩，置换连接部分依赖于酰基转移酶反应。

连接物

在许多实施方案中，可以任选地在连接探针内的多个位置处包括连接物(有时在本文中显示为“L”或“-(连接物)_n-，其中n是0或1)。合适的连接物包括烷基和芳基，包括杂烷基和杂芳基，和它们的取代衍生物。在有些情况下，例如当进行天然的肽连接反应时，连接物可以是基于氨基酸的和/或含有酰胺键。如本文所述，有些连接物允许连接探针被一个或多个核苷碱基隔开，从而在连接产物内形成无碱基位点，它们用作如下所述的去稳定化部分。

去稳定化部分

根据本发明的一个方面，希望在没有酶辅助下，为每个靶物分子生产连接产物的多个拷贝。实现该目的的一种方法包括，在化学连接反应以后，使连接的产物脱离靶物，以允许新的探针集合结合靶物。为了增加连接产物周转，增加产物从靶物分子脱离的探针设计、仪器使用、和化学连接反应化学法是合乎需要的。

以前的工作已经证实了一种实现产物脱离和增加产物周转的方法是“热循环”反应混合物。热循环是改变反应温度、从而促进希望的结果的过程。最常见地，热循环采取下述形式：简单地升高反应混合物的温度，使得反应温度高于连接产物的解链温度短时间段，从而造成产物脱离靶物。在冷却后，一组新的探针能够结合靶物，并发生另一个连接反应。该热循环操作已经广泛地用于酶反应，如PCR。

尽管热循环是实现产物周转的一种方法，可以设计探针，使得在没有热循环下存在显著的产物周转。通过减少反应循环的产物抑制，有助于降低连接产物的解链温度的探针设计和连接化学会增加产物周转。

因此，在一个方面，将探针设计成包括这样的元件(例如去稳定化部分)，其在连接探针后，用于去稳定化连接产物与靶序列的杂交。结果，在连接后，连接的底物脱离，从而导致连接产物(例如包含从靶序列脱离的2个连接探针的连接产物)的周转，而释放出靶序列以用于与另一个探针集合杂交。

另外，提高游离的(例如未杂交的)连接探针的浓度，也可以帮助驱动向连接产物(或转移产物)从靶序列的释放的平衡。因此，本发明的有些实施方案使用比靶物浓度高1,000,000倍的探针浓度，而在其它实施方案中，探针浓度比靶物浓度高10,000至100倍。本领域技术人员会理解，提高游离探针的浓度可以单独使用，或与本文所述的任意实施方案一起使用，以实现产物周转(例如扩增)。尽管提高探针浓度可以导致增加的产物周转，它也可以导致显著的脱靶反应，诸如探针水解和非靶物介导的连接。

在一个方面，探针元件包括降低连接产物的解链温度的结构。在有些实施方案中，将探针元件设计成与非邻近的靶物核苷碱基杂交，例如在2个杂交的但是未连接的探针之间存在“缺口”。一般而言，这通过在探针结构域和连接部分之间使用一个或两个连接物来实现。也就是说，在第一探针结构域和第一连接部分之间可以存在连接物，在第二探针结构域和第二连接部分之间可以存在连接物，或两种情况都存在。在有些实施方案中，所述缺口包含单个核苷碱基，尽管也可以根据需要使用更多个核苷碱基。本领域技术人员会理解，在反应动力学和连接物长度之间可以存在折衷；如果连接物的长度太长，使得在动力学上不利于产生连接的接触，则可能需要更短的连接物。但是，在某些情况下，当动力学不重要时，缺口的长度和得到的连接物可以更长，以允许跨1至10个核苷碱基的缺口。通常，在该实施方案中，重要的是，连接物的长度与缺口中核苷碱基的数目大致对应。

在本发明的该实施方案的另一个方面，与靶序列相比无碱基位点在连接产物中的形成用于去稳定化双链体。例如，Abe和Kool(J.Am.Chem.Soc.(2004)126：13980-13986)对比了当使2种不同的8-聚体寡核苷酸探针(Bu42和DT40)与相同的7-聚体探针(Thio 4)连接时的周转。当使Thio4与DT40连接时，形成具有几乎天然的DNA结构的连续的15-聚体寡核苷酸探针，其与DNA靶物精确匹配。但是，当使Thio4与Bu42连接时，形成15-聚体寡核苷酸探针，但是当该探针结合靶物时，它在中间具有被烷烃连接物跨过的无碱基位点。对比这两种探针当结合靶物时的解链温度(Tm)，显示出解链温度相差大约12℃(Bu42s是58.5℃，而DT40是70.7℃)。解链温度的该12℃差异导致当探针集合(10,000-倍过量，10μM浓度)相对于靶物(1nM)而言非常过量地存在时在25℃的产物周转增加约10-倍(91.6-Bu42，8.2DT40)。类似地，Dose等人(Dose2006)证实，两个相同序列、化学连接的PNA探针的Tm的4℃降低(53℃和57℃)导致产物周转增加大约4-倍。

近期的工作已经证实了基于化学连接的猝灭的自动-连接(QUAL)探针用于监测RNA表达和检测细菌和人细胞内的单碱基错配的应用(WO2004/0101011，通过引用并入本文)。

在一个实施方案中，去稳定化部分是基于稳定化部分的去除。也就是说，如果连接探针含有稳定化它与靶物的杂交的部分，在连接和释放稳定化部分以后，连接产物的稳定性存在下降。因此，一种用于减少产物抑制的一般方案是开发这样的探针：其在最初的化学连接反应过程中或在连接后的后续反应以后，释放出分子实体，如小沟结合分子。根据寡核苷酸序列，小沟结合剂如Kutyavin(Kutyavin 1997和Kutyavin2000)所述的二氢吡咯并吲哚三肽(DPI₃)可以使与寡核苷酸探针的末端缀合时双链体核酸的Tm提高最多40℃。相比而言，DPI3的未连接形式仅使相同双链体的Tm提高了2℃左右。因而，小沟结合剂可以用于产生具有增强的结合强度的探针集合，但是，如果小沟结合剂在反应过程中被释放，结合增强会损失，且连接产物会表现出比小沟结合剂仍然连接的探针降低的Tm。

合适的小沟结合分子包括、但不限于：二氢吡咯并吲哚三肽(DPI₃)、偏端霉素A、和吡咯-咪唑聚酰胺类(Gottesfeld，J.M.，等人，J.Mol.Biol.(2001)309：615-629)。

除了小沟结合分子以外，连接的嵌入剂和有关的分子也可以显著提高寡核苷酸双链体的解链温度，且该稳定作用在未连接的状态时明显更小(Dogan，等人，J.Am.Chem Soc.(2004)126：4762-4763和Narayanan，等人，Nucleic Acids Research，(2004)32：2901-2911)。

类似地，本领域技术人员会理解，具有连接的能够形成三螺旋的寡核苷酸片段(DNA、PNA、LNA等)的探针可以用作稳定化部分，其在释放后，导致连接产物对靶序列的稳定作用减小(Pooga，M，等人，Biomolecular Engineering(2001)17：183-192)。

另一个用于通过降低连接产物的结合强度来减少产物抑制的一般方案是，在连接点处掺入无碱基位点。该方案以前已经被Abe(J.Am.Chem.Soc.(2004)126：13980-13986)证实，但是，还可以设计后续探针重排，以进一步放大Tm的降低，这通过强化连接的探针和靶物之间的比对来实现。例如，Dose等人(Org.Letters(2005)7：20 4365-4368)证实，将PNA碱基之间的间隔从理想的12σ键变成13的连接后重排，导致Tm降低了4℃。更大的重排和干扰产物与靶物的结合或导致寡核苷酸碱基减少的后续反应，可以进一步降低Tm。

本发明提供了用于连接反应的方法和组合物，所述连接反应导致重排过程中最多4σ键的链收缩，与使用Dose所述的化学法的1碱基放大相比，这对重排后Tm具有显著影响。该化学法是基于以前已经描述的酰基转移反应(acyl transfer auxiliary)(Offer等人，J Am Chem Soc.(2002)124(17)：4642-6)。在链收缩结束后，产生游离的硫醇，其能够与单独的分子或与它自身发生另一个反应。例如，该硫醇可以与内部的硫代酸酯反应，以严重地扭结寡核苷酸，并从而进一步降低连接产物的结合靶物的能力。

因而，在该实施方案中，释放出会与连接产物发生第二反应的官能团的连接反应，可以降低连接产物和靶序列的杂合体的稳定作用。

连接探针的其它官能团

除了靶结构域、连接部分、和任选的连接物以外，一个或多个本发明的连接探针可以具有额外的官能团，包括、但不限于：启动子和引物序列(或其互补序列(complement)，取决于试验)、标记(包括标记探针结合序列和锚序列)。在下文中参照CLPA试验，描述了其它官能团，包括可变间隔序列(也称作填充序列)。

在本发明的一个方面，上游寡核苷酸探针可以具有启动子位点或引物结合位点，用于后续的酶扩增反应。在一个实施方案中，所述上游探针含有RNA聚合酶(例如T7、SP6或T3)的启动子序列。在另一个实施方案中，上游和下游寡核苷酸都含有引物结合序列。启动子和引物结合序列被设计成不会在任何可察觉的程度上与核酸靶物相互作用。在一个优选的实施方案中，当同时检测多种靶物时，在反应物中的所有寡核苷酸探针集合被设计成含有相同的启动子或引物对结合位点，使得在适当的连接和纯化以后，所有连接产物可以使用相同的酶和/或相同的引物同时扩增。

在一个实施方案中，一个或多个连接探针包含启动子序列。在采用启动子序列的实施方案中，启动子序列或它的互补序列具有足以允许适当的聚合酶与它相互作用的长度。除了其它地方以外，在Sambrook和Russell中，可以发现对于聚合酶相互作用而言足够长的序列的详细描述。在某些实施方案中，扩增方法包括至少一个扩增循环，例如、但不限于，下述的先后操作：使聚合酶与启动子相互作用；使用聚合酶，以模板-依赖性的方式合成核苷酸链；和变性新形成的核酸双链体，以分离链。

在另一个实施方案中，一种或两种连接探针包含引物序列。如下所述，本发明的连接产物可以用于其它反应诸如酶扩增反应中。在一个实施方案中，所述连接探针包括引物序列，所述引物序列设计成允许额外的扩增水平。本文使用的术语“引物”表示这样的核苷酸序列，无论是天然存在的(如在纯化的限制性消化中)，还是合成地产生的：当置于一定条件下时，所述核苷酸序列能够作为核酸序列合成的起点，在所述条件中会诱导合成与核酸链互补的引物延伸产物，即存在在适当缓冲液(“缓冲液”包括pH、离子强度、辅因子等)中的不同的三磷酸核苷酸和聚合酶，并在合适的温度。可以修饰引物的一个或多个核苷酸，例如，通过添加甲基、生物素或地高辛配基部分、荧光标签或通过使用放射性的核苷酸。引物序列不需要反映精确的模板序列。例如，可以将非互补的核苷酸片段连接至引物的5′末端，剩余的引物序列与靶物链基本上互补。

通过使用几种引发序列和引物，第一连接产物可以用作其它连接产物的模板。这些引物序列可以用作PCR反应的引发位点，所述PCR反应可以用于扩增连接产物。除了PCR反应以外，其它扩增方法可以利用引发序列，包括但不限于连接酶链反应、Invader^TM、通过切口平移实现的定位扩增(NICK)、引物延伸/切口平移、和本领域已知的其它方法。本文使用的“扩增”表示特定核酸的拷贝数的增加。在体外在扩增反应中制备的特定核酸的拷贝称作“扩增子”或“扩增产物”。

扩增也可以通过第二连接反应而发生，其中引物位点用作新的连接探针集合的杂交位点，所述连接探针可能包含或不包含与产生最初连接产物的第一连接探针集合相同的序列。因而通过在随后的扩增循环中扩增连接产物，可以指数地扩增靶序列。

在本发明的该方面的另一个实施方案中，所述引物序列用于嵌套的连接反应。在这样的嵌套的连接反应中，使用本文所述的方法，实现第一连接反应，使得连接产物可以被捕获(例如通过使用生物素化的引物)到希望的链上，和捕获在用抗生蛋白链菌素包被的珠子(特别是磁珠)上。在捕获连接产物以后，通过使连接探针与在一部分连接产物内的引物序列杂交而实现第二连接反应，所述一部分连接产物在空间上分离自连接在捕获珠、探针等上的连接产物的末端(即，在其下游)。第二连接反应的至少一种引物序列将位于与连接探针互补的连接产物区内，所述连接探针不是包括锚序列或捕获序列的连接探针。来自该第二连接反应的连接产物因而必然地仅源自从第一化学连接成功地形成的那些序列，从而从扩增反应去除了任何“假阳性”。在另一个实施方案中，在第二反应中使用的引物序列可以是其它类型扩增反应(诸如PCR)的引物位点。

在一个实施方案中，一个或多个连接探针包含锚序列。”锚序列”在本文中是指这样的连接探针组分：其允许为了检测目的将连接产物连接到支持物上。合适的检测方法包括：具有与其相连的适当捕获部分的支持物。通常，这样的连接会通过锚序列与捕获探针的杂交而发生，所述捕获探针与所述锚序列基本上互补。

在本发明的该方面的一个实施方案中，将上游寡核苷酸设计成具有额外的核苷酸区段，所述区段不会结合目标靶物，但是将会用于以后将连接产物捕获在合适的固体支持物或某些种类的装置上。在本发明的该方面的一个优选的实施方案中，下游寡核苷酸具有与它相连的可检测标记，使得在连接以后，得到的产物含有固体支持物的捕获序列(在它的3’末端)和可检测标记(在它的5’末端)，且仅连接的产物会含有所述捕获序列和所述标记。

在涉及多路靶物检测的本发明的另一个方面，探针集合的每个上游探针可以被设计成在它的3’末端处具有独特序列，该序列与DNA阵列上的不同位置相对应。探针集合的每个下游探针可以任选地含有与其它下游探针相同的可检测标记，但是含有与它各自的靶物相对应的独特靶物结合序列。在与DNA阵列杂交以后，仅具有地址序列(上游探针)和标记(下游探针)的连接的探针是可观察到的。

在本发明的另一个方面，可以将可检测标记连接至上游探针上，且捕获序列可以是下游探针的一部分，使得连接产物具有更靠近3’末端的可检测标记和更靠近连接产物的5’末端的捕获序列。通过考虑合成的容易性以及以后用于后续检测连接的反应产物的装置的特征，可以最佳地测定精确构型。

锚序列可以具有核酸部分和非核酸部分。因而，例如，可以使用柔性连接物(诸如烷基，包括聚乙二醇连接物)来提供锚序列的核酸部分和支持物表面之间的空间。当连接产物较大时，这可能是特别有用的。

另外，在某些情况下，可以使用与“通用阵列”的捕获探针相对应的锚序列集合。如本领域已知的，使用合成的一般序列作为捕获探针，可以制备阵列，所述捕获探针被设计成与要分析的样品的靶序列不互补，但是与连接探针集合的阵列结合序列互补。这些“通用阵列”可以用于多类样品和诊断实验，因为探针的相同的阵列结合序列可以重复使用/与不同的靶物识别序列配对。

在一个实施方案中，一个或多个连接探针包含标记。”标记”或“标记的”在本文中是指，化合物具有至少一个连接的元件、同位素或化合物，以实现化合物的检测，例如使得连接探针或连接产物或转移产物可使用已知的检测方法检测出，例如，电子的、光谱的、光化学的、或电化学发光的方法。一般而言，标记分为3类：a)同位素标记，其可以是放射性的或重同位素；b)磁性的、电的、热的；和c)有色的或发光的染料；尽管标记还包括酶和颗粒诸如磁性颗粒。所述染料可以是生色团或磷光体，但是优选荧光染料，这是由于它们的强信号会提供好的信噪比。适用于本发明中的染料包括、但不限于：荧光的镧系元素复合物(包括铕和铽的那些)、荧光素、异硫氰酸荧光素、羧基荧光素(FAM)、二氯三嗪基胺荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明、伞形酮、曙红、赤藓红、香豆素、甲基-香豆素、芘、Malacite绿、Cy3、Cy5、均二苯代乙烯(stilbene)、萤光黄、Cascade Blue^TM、德克萨斯红、alexa染料、丹磺酰氯、藻红蛋白、绿色荧光蛋白和它的波长偏移变体、bodipy、和本领域已知的其它染料，诸如在下述文献中描述的那些：Haugland，Molecular Probes Handbook，(Eugene，Oreg.)第6版；The Synthegen catalog(Houston，Tex.)，Lakowicz，Principles of Fluorescence Spectroscopy，第2版，PlenumPress New York(1999)，和在Richard P.Haugland的Molecular ProbesHandbook第6版中描述的其它染料，它们都特别地通过引用并入本文。其它标记包括在美国系列号09/315,584中描述的纳米晶体或Q-点，特别地通过引用并入本文。

在一个优选的实施方案中，所述标记是第二标记，所述第二标记是结合配偶体对的一部分。例如，所述标记可以是半抗原或抗原，其会结合它的结合配偶体。在一个优选的实施方案中，所述结合配偶体可以连接至固体支持物上，以允许分离延长的和未延长的引物。例如，合适的结合配偶体对包括、但不限于：抗原(诸如蛋白(包括肽))和抗体(包括其片段(FAb等))；蛋白和小分子，包括生物素/抗生蛋白链菌素；酶和底物或抑制剂；其它蛋白--蛋白相互作用对；受体-配体；和碳水化合物和它们的结合配偶体。核酸--核酸结合蛋白对也是有用的。一般而言，所述对中的较小者被连接至NTP上，用于掺入引物中。优选的结合配偶体对包括、但不限于：生物素(或亚氨基-生物素)和抗生蛋白链菌素、地高辛配基和Ab和Prolinx^TM试剂。

在一个优选的实施方案中，所述结合配偶体对包含生物素或亚氨基-生物素和抗生蛋白链菌素。亚氨基-生物素是特别优选的，因为亚氨基-生物素在pH 4.0缓冲液中会脱离抗生蛋白链菌素，而生物素需要苛刻的变性剂(例如6M盐酸胍pH 1.5或90％甲酰胺，95℃)。

在一个优选的实施方案中，所述结合配偶体对包含主要检测标记(例如，连接至连接探针上)和会特异性地结合主要检测标记的抗体。“特异性地结合”在本文中是指，所述配偶体以足以区分该对和体系的其它组分或污染物的特异性进行结合。所述结合应当足以在试验条件(包括去除非特异性结合的洗涤步骤)下保持结合。在有些实施方案中，所述对的解离常数小于约10^-4至10^-6M^-1，其中小于约10^-5至10^-9M^-1是优选的，10^-9M^-1是特别优选的。

在一个优选的实施方案中，所述第二标记是化学可修饰的部分。在该实施方案中，将包含反应官能团的标记掺入核酸中。然后可以用主要标记随后标记官能团。合适的官能团包括、但不限于：氨基、羧基、马来酰亚胺基、桥氧基和硫醇基，其中氨基和硫醇基是特别优选的。例如，含有氨基的主要标记可以连接至包含氨基的第二标记上，例如使用连接物，这是本领域已知的；例如，同-或杂-双功能连接物也是众所周知的(参见1994 Pierce Chemical Company目录，关于交联剂的技术部分，第155200页，通过引用并入本文)。

在该实施方案中，所述标记还可以是标记探针结合序列或其互补序列。“标记探针”在本文中是指，与结合序列基本上互补且通常被直接地标记的核酸。

合成方法

通常使用已知的合成技术，制备本发明的组合物。一般而言，基于标准的亚磷酰胺化学法的方法在本发明的一个方面特别适用，尽管如本领域技术人员会理解的，多种核酸合成反应是已知的。

制备具有卤素离去基团的探针的方法是本领域已知的；参见例如Abe等人，Proc Natl Acad Sci U S A(2006)103(2)：263-8；Silverman等人，Nucleic Acids Res.(2005)33(15)：4978-86；Cuppolletti等人，BioconjugChem.(2005)16(3)：528-34；Sando等人，J Am Chem Soc.(2004)4；126(4)：1081-7；Sando等人，Nucleic Acids Res Suppl.(2002)2：121-2；Sando等人，J Am Chem Soc.(2002)124(10)：2096-7；Xu等人，NatBiotechnol.(2001)19(2)：148-52；Xu等人，Nucleic Acids Res.(1998)26(13)：3159-64；Moran等人，Proc Natl Acad Sci U S A(1997)94(20)：10506-11；Kool，美国专利号7,033,753；Kool，美国专利号6,670,193；Kool，美国专利号6,479,650；Kool，美国专利号6,218,108；Kool，美国专利号6,140,480；Kool，美国专利号6,077,668；Kool，美国专利号5,808,036；Kool，美国专利号5,714,320；Kool，美国专利号5,683,874；Kool，美国专利号5,674,683；和Kool，美国专利号5,514,546，它们各自通过引用整体并入本文。

如本领域已知的，通常掺入诸如标记、引物序列、启动子序列等其它组分。荧光团和猝灭剂的添加间距也是众所周知的。

第二反应

在检测连接或转移反应产物之前，可以存在额外的扩增反应。次要扩增反应可以用于增加靶序列的检测信号；例如通过增加每个靶物拷贝生成的连接产物的数目。在一个实施方案中，可以在连接产物上进行任意数目的标准扩增反应，包括、但不限于：链置换扩增(SDA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、连接扩增和聚合酶链式反应(PCR)；包括PCR的许多变体，包括“定量竞争PCR”或“QC-PCR”、“任意引发的PCR”或“AP-PCR”、“免疫-PCR”、“Alu-PCR”、“PCR单链构象多态性”或“PCR-SSCP”、“逆转录酶PCR”或“RT-PCR”、“生物素捕获PCR”、“人造载体PCR”、“锅柄样PCR”、和“PCR选择cDNA减法”以及其它。在一个实施方案中，所述扩增技术不是PCR。根据某些实施方案，可以使用连接技术诸如缺口-填充连接，包括、但不限于，缺口-填充OLA和LCR、成桥寡核苷酸连接、FEN-LCR、和修正连接。除了其它地方以外，这些技术的描述，可以参见：美国专利号5,185,243，公开的欧洲专利申请EP 320308和EP 439182，公开的PCT专利申请WO 90/01069，公开的PCT专利申请WO 02/02823，和美国专利申请系列号09/898,323。

除了标准的酶扩增反应以外，可以设计这样的探针方案，其中最初生成的连接产物本身可以是后续化学连接反应的靶物。

此外，可以在起始样品核酸上进行“预扩增反应”，以制备更多靶序列用于化学反应连接。例如，可以进行全基因组扩增。

试验

本领域技术人员会理解，利用本发明的方法和组合物的试验可以采取多种构型，这取决于目标用途，且可以包括原位试验(类似于FISH)、基于溶液的试验(例如荧光团和/或猝灭剂的转移/去除)、和异质试验(例如利用固体支持物进行操作、去除和/或检测，诸如使用高密度阵列)。另外，试验可以包括额外的反应，诸如靶序列的预扩增和已经发生连接以后的后续扩增反应，如本文所述。

如本文所述，属于本发明该方面的试验可以依赖于信号的增加，例如荧光或化学发光的产生。但是，本领域技术人员会理解，依赖于这样的信号的减小的试验也是可以的。

在一个实施方案中，与FISH反应类似，“在原位”(在不同的测定形式中也称作“在体外”和/或“离体”，取决于样品)进行测定反应。由于不需要加入外源酶，可以将试剂加给细胞(活细胞、电穿孔的细胞、固定的细胞等)，诸如用于测定靶序列存在的组织学样品，特别是与疾病状态或其它病理学有关的那些。

另外，可以进行“体外”测定，其中靶序列提取自样品。可以处理样品(例如对于石蜡包埋的样品，可以制备样品)，加入试剂，并使反应进行，随后进行检测(如本领域所进行的)。

在一个实施方案中，使用固体支持物，检测连接的产物。例如，使用锚探针/捕获探针杂交或其它结合技术，诸如使用结合配偶体对(例如生物素和抗生蛋白链菌素)，可以将连接产物连接至珠子上。在一个实施方案中，转移反应导致生物素部分从第一连接探针转移至包含标记的第二连接探针。使包含抗生蛋白链菌素的珠子接触样品，并检查珠子上标记的存在，例如使用FACS技术。

在其它实施方案中，使用异质试验，检测连接的产物。也就是说，所述反应是在溶液中进行，并将产物加给固体支持物，诸如阵列或珠子。通常，一个连接探针包含锚序列或结合对配偶体(例如生物素、半抗原等)，且另一个包含标记(例如荧光团、标记探针结合序列等)。将连接产物加给固体支持物，并任选地洗涤支持物。在该实施方案中，仅连接产物被捕获和标记。

在本发明的另一个方面，寡核苷酸探针之一具有连接的磁珠或某种其它标记(生物素)，其允许容易地操作连接产物。使用本文所述的任意数目的构型，可以将所述磁珠或标记连接在上游或下游探针上。

如本文所述，也可以进行第二反应，其中加入额外的功能部分(例如锚序列、引物、标记等)。类似地，如本文所述，可以进行第二扩增反应。

检测系统是本领域已知的，包括光学试验(包括荧光和化学发光的试验)、酶试验、放射性标记、表面等离子体共振、磁阻、悬臂梁偏转、表面等离子体共振等。在有些实施方案中，连接产物可以用于其它测定技术中，例如，如在2006/0068378(它通过引用并入本文)中所述，连接产物可以用作光散射颗粒(诸如胶体)之间的连接物，在有连接产物存在下导致颜色变化。

在有些实施方案中，可以在样品收集管内包含检测系统；例如，血液收集装置可以具有整合进管中的试验或允许检测病原体或疾病的装置。

固体支持物

如上所述，所述试验可以以多种方式运行。在利用在固体支持物上的检测的试验中，存在多种可以用于本发明中的固体支持物，包括阵列。

在有些实施方案中，诸如珠子等固体支持物可以用于本发明中。例如，结合配偶体对(一个在连接产物上，一个在珠子上)可以如上所述用于去除未连接的反应物。在该实施方案中，磁珠是特别优选的。

在本发明的有些实施方案中，将捕获探针连接至固体支持物上进行检测。例如，可以将捕获探针连接至珠子上，随后使用任意合适的技术(例如FACS)进行分析。类似地，可以使用如下所述的珠阵列。

在一个实施方案中，本发明提供了阵列，每个阵列位置最少包含共价连接的核酸探针，通常称作“捕获探针”。“阵列”在本文中是指阵列形式的多个核酸探针；阵列的大小取决于阵列的组成和最终的用途。可以制备含有约2个至数千个不同捕获配体的阵列。通常，对于基于电极的试验，阵列包含2至多达100,000个或更多，取决于电极的大小、以及阵列的最终用途。优选的范围是约2至约10,000，约5至约1000是优选的，约10至约100是特别优选的。在有些实施方案中，本发明的组合物可以不是阵列形式；也就是说，对于有些实施方案，还可以制备包含单个捕获探针的组合物。另外，在有些阵列中，可以使用多种基质，无论是不同的组成还是相同的组成。因而，例如，大阵列可以包含多个更小的基质。核酸阵列是本领域已知的，且可以以多种方式分类；包括有序阵列(例如在离散位点处分辨化学试剂的能力)和随机阵列(例如珠阵列)。有序阵列包括、但不限于：使用光刻技术(例如Affymetrix GeneChip

)、印迹技术(Synteni等)、印刷技术(Hewlett Packard和Rosetta)制备的那些、电极阵列、三维“凝胶垫”阵列和液体阵列。

在一个优选的实施方案中，所述阵列存在于基质上。“基质”或“固体支持物”或其它语法等同描述在本文中是指，可以修饰成含有离散的单个位点的任意物质，所述位点适用于连接或结合核酸。本领域技术人员会理解，所述基质可以包含多种物质，包括、但不限于玻璃、塑料、聚合物、金属、类金属、陶瓷制品、和有机物。当固体支持物是珠子时，多种基质是可行的，包括但不限于磁性材料、玻璃、硅、葡聚糖、和塑料。

硬件

微流体

在本发明的另一个方面，使用与Liu(2006)所述的那些类似的流体装置来自动化本发明所述的方法。关于组件，参见例如美国专利号6,942,771(通过引用并入本文)，所述组件包括但不限于药筒、装置、泵、孔、反应室、和检测室。流体装置还可以包括用于捕获磁性颗粒的区域、分离过滤器和树脂，包括用于细胞分离的膜(即来自Pall的Leukotrap^TM)。所述装置可以包括：用于实时PCR扩增过程中产生的荧光信号(即SYBR绿，Taqman，Molecular Beacons)的药筒内成像的检测室，以及用于在装置上分离和检测反应产物(扩增子和连接产物)的毛细管电泳通道。在一个优选的实施方案中，所述毛细管电泳通道可以模铸在塑料基质中，并用筛分聚合物基质(来自Applied Biosystems的POP-7^TM)填充。含有未筛分基质的通道也可以与适当设计的探针集合一起使用。

在一个优选的实施方案中，本发明的装置包括液体处理组件，包括用于在每个站或站集合装载和卸载液体的组件。液体处理系统可以包括自动系统，所述自动系统包括任意数目的组件。另外，可以自动化本文所述的任意或所有步骤；因而，例如，所述系统可以完全地或部分地自动化。

本领域技术人员会理解，存在多种可以使用的组件，包括、但不限于：一个或多个自动臂；用于定位微量培养板的平板操作器；具有药筒和/或帽的托架；自动化的盖或帽操作器，其用于去除和更换在无交叉污染平板上的孔的盖；使用一次性尖头进行样品分布的尖头组件；用于样品分布的可洗涤的尖头组件；96孔装载块；冷却试剂支架；微孔滴定板吸管位置(任选地冷却)；平板和尖头的堆叠塔；和计算机系统。

完全自动的系统或微流体系统包括自动化的液体-、颗粒-、细胞-和生物体-操作，包括高通量吸液，以进行筛选应用的所有步骤。这包括液体、颗粒、细胞、和生物体操作，诸如抽吸、分配、混合、稀释、洗涤、准确的容量转移；吸管尖头的安装和抛弃；和重复吸量相同体积以用于从单次样品抽吸实现多个递送。这些操作是没有交叉污染的液体、颗粒、细胞、和生物体转移。该仪器实现微量培养板样品向过滤器、膜、和/或子代平板的自动化复制、高密度转移、全平板系列稀释、和高容量操作。

在一个优选的实施方案中，使用化学地衍生化的颗粒、平板、药筒、试管、磁性颗粒、或对试验组分具有特异性的其它固相基质。微量培养板、试管或任意固相基质的结合表面包括非极性表面、高度极性的表面、促进共价结合的修饰的葡聚糖涂层、抗体涂层、结合融合蛋白或肽的亲和介质、表面-固定的蛋白诸如重组蛋白A或G、核苷酸树脂或包衣剂、和其它亲和基质可用于本发明中。

在一个优选的实施方案中，用于多孔平板、多管、托架、药筒、微型管、深孔平板、微量离心机试管、冷冻管、方孔平板、过滤器、芯片、光学纤维、珠子、和其它固相基质的平台或具有不同容积的平台，被安置在可升级的模块平台上，以实现额外的容量。该模块平台包括可变速的定轨摇床和用于来源样品、样品和试剂稀释、试验平板、样品和试剂蓄池、吸管尖头和有效洗涤站的多位置工作床面。

在一个优选的实施方案中，将热循环仪和热调节系统用于稳定热交换器(诸如控制块或平台)的温度，以提供从0℃至100℃的温育样品的准确温度控制；这是站式热控制器的替代或附加。

在一个优选的实施方案中，具有单个或多个磁性探针、亲和探针、或吸管的可互换的吸管头(单通道或多通道)自动地操作液体、颗粒、细胞、和生物体。多孔或多管磁性分离器或平台会以单个或多个样品形式操作液体、颗粒、细胞、和生物体。

在有些实施方案中，仪器包括检测器，其可以是多种不同的检测器，取决于标记和试验。在一个优选的实施方案中，有用的检测器包括：具有多个荧光通道的显微镜；平板读数器，以提供荧光的、电化学的和/或电阻抗分析仪；具有单和双波长端点和动力学能力的紫外线和可见光分光光度测量检测；荧光共振能量转移(FRET)，发光，猝灭，双光子激发，和强度重新分布；CCD照相机，以捕获和变换数据和图像为可计量的形式；毛细管电泳系统，质谱仪和计算机工作站。

这些仪器可以安装在无菌的层流或通风柜中，或是封闭的、自含式系统，用于多孔平板或试管中的细胞培养生长和转化，和用于危险操作。可以在受控的生长条件下培养活细胞，对于活细胞试验的时间序列，控制温度、湿度、和气体。自动化的细胞转化和自动化的菌落挑选器可以促进目标细胞的快速筛选。

流式细胞术或毛细管电泳形式可以用于磁珠和其它珠子、颗粒、细胞、和生物体的单个捕获。

灵活的硬件和软件可以实现多种用途的仪器适应性。软件程序模块允许建立、修改、和运行该方法。系统诊断模块允许仪器比对、校正连接、和自动操作(motor operation)。定制的工具、实验室器具、和液体、颗粒、细胞和生物体转移模式允许实现不同的用途。数据库允许进行方法和参数储存。自动界面和计算机界面允许仪器之间通信。

在一个优选的实施方案中，自动仪器包括中央处理器，其通过总线与存储器和一组输入/输出装置(例如，键盘、鼠标、监视器、打印机等)通信。另外，如下所述，这可以是用于本发明的多路化装置的CPU的替代或附加。中央处理器、存储器、输入/输出装置、和总线之间的一般相互作用是本领域已知的。因而，在CPU存储器中储存了多种不同的规程，这取决于要运行的实验。

这些自动液体处理系统可以利用任意数目的不同试剂，包括缓冲液、试剂、样品、洗液、试验组分诸如标记探针等。

试剂盒

在本发明的另一个方面，生产了用于预定的核酸靶物集合的常规检测的试剂盒，其利用本文所述的探针、技术、方法、和化学连接反应作为检测方法的一部分。所述试剂盒可以包括探针、靶序列、说明书、缓冲液、和/或其它试验组分。

化学连接依赖性的探针扩增(CLPA)

在另一个实施方案中，本发明涉及化学连接依赖性的探针扩增(CLPA)技术。CLPA是基于靶物特异性的寡核苷酸探针的化学连接，以形成连接产物。该连接产物随后用作酶扩增反应的模板，以产生随后使用任意合适的方法进行分析的扩增子。CLPA可以用于多种目的，包括但不限于复合体基因标志模式的分析。不像利用酶连接反应的其它技术诸如DASL(Bibikova，M.，等人，American Journal of Pathology，(2004)，165：5，1799-1807)和MLPA(Schouten，美国专利6,955,901)，CLPA使用化学连接反应。

在一个实施方案中，所述CLPA试验包括使用掺入反应部分的寡核苷酸探针对，所述反应部分当在靶序列上适当定位时可以自连接。在一个优选的实施方案中，在一个探针上的3’-硫代磷酸酯部分与其它探针上的5’-DABSYL离去基团反应(参见方案1和图6)。

方案1：3’硫代磷酸酯寡核苷酸(S-探针)和5’DABSYL修饰的寡核苷酸(L-探针)之间的化学连接反应。

5’-DABSYL基团的反应速率是其它部分(例如碘)的约4倍，也会简化合成过程中探针的纯化。

与其它基于序列的杂交技术相比，CLPA具有几个独特优点。首先，CLPA可以直接应用于RNA分析，不需要预先制备DNA拷贝。其次，CLPA对样品污染物是相对不敏感的，且可以直接应用于不纯样品，包括身体样品，诸如血液、尿、唾液和粪便。第三，CLPA包含比其它已知方法更少的步骤，因而减少了得到结果所需的时间。此外，CLPA探针可以干燥地储存，且在有互补靶序列存在下，适当设计的系统会自发地反应，以连接2个或更多个寡核苷酸。化学连接反应表现出优良的序列选择性，且可以用于辨别单核苷酸多态性。

重要的是，不像酶连接方法，CLPA对DNA和RNA靶物显示出几乎相同的反应性，如下面更完整地描述的，使得CLPA比其它已知的系统更有效，并拓展了CLPA可以被利用的应用范围。

有利地，CLPA试验会减少得到结果所需的步骤的数目，这会提供在明显更短的时间段内得到结果的潜力。例如，标准的逆转录酶(RT)-多路连接酶-依赖性的探针连接(MLPA)的一般方法流程包括下述步骤：

1.分离总RNA。

2.使用逆转录酶来制备cDNA拷贝。

3.使MLPA探针集合与cDNA靶物杂交过夜。

4.加入DNA连接酶，以连接靶物-结合的探针。

5.扩增连接的探针，例如使用Taq聚合酶和荧光地标记的PCR引物进行PCR扩增。

6.分析样品，例如，通过CE。

不像标准的RT-MLPA，CLPA使分析能够直接在细胞和血液裂解物上和在RNA靶物上进行。因而，不像RT-MLPA，CLPA避免了下述需要：在连接之前，必须分离RNA，然后进行反转录以制备cDNA拷贝。这会缩短得到结果所需的时间，并提供达到更快分析的方法。

CLPA的另一个优点是，将捕获部分整合在一个探针上，能够实现快速且特异性的从粗样品纯化得到的连接产物的方法，所述粗样品不含有下面关于生物素-标记的探针所描述的所有杂质和非靶核酸物质。在有大量过量的非靶核酸存在下发现靶核酸的应用中，诸如在传染物(细菌、真菌、病毒)的检测中，该能力是特别有利的。在该情况下，大量宿主核酸的存在需要使用高容量提取方法，由于大量非靶核酸和/或抑制性污染物的携带污染，这又会导致靶核酸的无效扩增。

在本发明的该方面的另一个实施方案中，通过用更高的探针浓度驱动杂交反应，可以进一步促进更快的反应时间。因而，例如，输入探针集合可以以相对高的浓度整合进CLPA反应中，例如，比在MLPA反应中通常使用的那些高大约100-倍。升高探针浓度，会显著减小杂交步骤所需的时间，通常从过夜至约15分钟至约1小时。

当使用更高的探针浓度时，通常优选地，在扩增之前，整合纯化步骤，特别是对于高多路分析(例如大于约5种靶物)。在本发明的该方面的一个实施方案中，可以采用基于固体支持物的捕获方法，包括膜捕获、磁珠捕获和/或颗粒捕获。在一个优选的实施方案中，在连接以后，且在酶扩增之前，采用生物素/抗生蛋白链菌素磁珠纯化方法。在有些情况下，磁性颗粒可以直接加入扩增主混合物中，而不干扰随后的扩增反应。在其它情况下，优选地，从珠子释放出捕获的寡核苷酸，并随后在没有捕获颗粒或表面存在下，扩增释放的寡核苷酸溶液。

在一个优选的实施方案中，CLPA包括探针集合与核酸靶序列的杂交，使得所述探针在没有加入连接酶的情况下可以发生自-连接。在产生连接产物以后，扩增通常是优选的，以便利产物的检测和分析。为此目的，探针优选地设计成掺入PCR引物，例如，通用的PCR引物。在一个优选的实施方案中，在反应的连接部分完成之前，没有加入通用引物，且在表面捕获纯化以后，与聚合酶一起加入引物，经常作为PCR主混合物的一部分。

CLPA探针具有反应部分，所述反应部分放置成，使得当CLPA探针与核酸靶物结合时，所述反应部分处于紧密的空间取向，且能在没有加入酶的情况下发生连接反应。在一个优选的实施方案中，选择化学连接部分，从而产生连接的反应产物，其可以被扩增酶有效地扩增，所述扩增酶经常是DNA聚合酶。不受理论的约束，产生更接近地类似于底物(所述底物已知能够被DNA和RNA聚合酶扩增)的反应产物的化学连接化学法和探针集合设计更可能产生可以用于CLPA试验中的有效的探针集合。特别优选的反应化学试剂是这样的化学部分，其产生接近地类似于天然DNA的反应产物，诸如在包含3’-硫代磷酸酯和5’DABSYL离去基团之间的反应的方案1中所述的。在另一个优选的实施方案中，探针集合包含3’-二硫代磷酸酯(Miller，G.P.等人，Bioorganic andMedicinal Chemistry，(2008)16：56-64)和5’-DABSYL离去基团。

CLPA探针也掺入填充序列(在本文中也称作可变间隔序列)，以调节连接产物的长度。如下面进一步描述的，长度变化会提供便利连接产物的分析的方便方法。填充片段可以位于任一个探针上，尽管为了方便，它通常掺入在S探针(3’-硫代磷酸酯探针)上。

在本发明的该方面的一个实施方案中，CLPA-CE，填充序列的长度会变化，以便产生一种或多种可变长度连接产物，它们会提供基于长度变化来检测和鉴别特定靶序列的基础。在一个优选的实施方案中，通过毛细管电泳(CE)来分析可变长度连接产物。通常，包括填充序列，使得不同连接产物的长度在下述范围内变化：至少1个碱基对至约10个碱基对；优选1个碱基对至4个碱基对。在一个优选的实施方案中，不同连接产物的长度在下述范围内变化：大约80个碱基对至约400个碱基对；优选地在约100个碱基对至约300个碱基对范围内；更优选地在约100个碱基对至约200个碱基对范围内。

在另一个实施方案中，CLPA探针还可以含有其它任选的元件，以便利连接产物的分析和检测。例如，优选地，用于本文称作CLPA-MDM的实施方案中的探针之一掺入了阵列结合序列，以结合在微阵列平台上的适当的捕获序列。对于CLPA-MDM，不同的CLPA反应产物不是通过大小差异进行分离，而是通过阵列结合序列的差异进行分离。在该实施方案中，阵列结合序列的序列会变化，使得每个CLPA探针结合DNA微阵列上的独特位点。CLPA-MDM中的阵列结合序列的长度通常是15至150个碱基，更具体地20至80个碱基，最具体地25至50个碱基。在有些实施方案中，CLPA探针优选地还包括便利纯化和/或分析的其它元件，包括但不限于标记诸如荧光标记和半抗原部分，例如，用于纯化或检测连接产物的生物素。例如，可以在任意合适的抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素平台(包括珠子)上，纯化掺入生物素的探针和/或连接产物。尽管生物素/抗生物素蛋白捕获系统是优选的，可以使用其它半抗原系统(例如地高辛配基(DIG)标记)，也可以使用杂交/寡核苷酸捕获。当希望在以后的阶段从珠子释放捕获产物时，杂交/寡核苷酸捕获是一种优选的方法。除了磁珠以外，可以使用抗-半抗原标记的支持物(滤纸、多孔滤器、表面捕获)。

CLPA探针-标记可以是在任一个探针上，在末端或在内部。优选地，生物素掺入硫代磷酸酯(S-探针)的5’末端。

通常，以每种探针250纳摩尔(nM)至0.01pM(皮摩尔)的浓度，在反应中掺入CLPA探针。通常，浓度是约1nM至约1pM。当选择探针浓度时，要考虑的因素包括具体试验和要分析的靶物。含有S-或硫代磷酸酯或亲核体探针和L-或离去基团或DABSYL的探针以等于或超过靶物浓度的浓度掺入。S-和L-探针的总浓度可以高达10微摩尔(uM)。作为一个非限制性实例，1nM每种S和L探针x 250个CLPA探针对等于500nm(1nm每种探针x 2个探针/对x 250个靶物)，10nM的每种探针是指5uM的总浓度。

靶物浓度范围通常是约10微克总RNA至约10纳克，但是它可以少至单个基因拷贝。

在CLPA技术的一个优选的实施方案中，CLPA探针集合由2个具有互补反应基团的寡核苷酸探针组成(图1和2)。在另一个实施方案中，所述CLPA探针集合可以由3个或更多个探针组成，所述探针彼此邻近地结合在靶物上。在3-探针CLPA反应的一个优选的实施方案中，外面的探针被设计成含有酶扩增引物结合位点，内部的探针被设计成跨其它探针之间的靶物区域。在一个更优选的实施方案中，外面的探针具有不互补的反应基团，使得它们在没有内部(中间)探针存在下不能彼此反应(图3)。在有些情况下，两个外面的探针可以具有类似的反应部分，但是一个基团是在一个探针的5’末端和另一个探针的3’-末端，且L-探针化学法也可以彼此类似，但是定位在探针上。如本领域技术人员已知的，与用于2-探针CLPA系统的探针相比，可能需要不同的化学试剂和方法来操作用于3-探针CLPA反应的探针。

在3-探针CLPA系统的一个优选的实施方案中，一个外面的探针含有3’硫代磷酸酯(3’S-探针)，另一个外面的探针含有5’-硫代磷酸酯(5’-S-探针)，且中间的探针含有3’-和5’-DABSYL离去基团。以前已经报道了5’-DABSYL离去基团探针的生产(Sando等人，J.Am.Chem.Soc.，(2002)，124(10)2096-2097)。我们最近开发了一种新的DNA合成试剂，其允许常规地掺入3’-DABSYL离去基团(图4)。

CLPA-CE

在一个实施方案中，通过在筛分基质上的大小区分毛细管电泳(CE)，或通过平板凝胶电泳，检测CLPA连接产物。CLPA-CE的示意图如图1所示。在该实施例中，在通过任意适当的方法(包括化学方法、机械方法或渗透方法)进行细胞裂解并加入适当地设计的探针后，直接地在血液样品上进行分析。在一个优选的实施方案中，使用细胞的化学裂解。图6提供了用于CLPA-CE分析的探针集合的设计的一般示意图。在该实施例中，将S探针设计成包括：用于随后扩增连接产物的通用PCR引物；设计成具有与特定靶物相对应的长度的填充序列；和靶物结合序列。同样地，L-探针包括靶物结合序列和通用引物。所述探针通常用荧光团(FAM、Cy3、Cy5等)进行标记，但是它们也可以在没有荧光标记存在下进行检测。使用荧光地标记的PCR引物，进行标记。

在CLPA-CE探针的该实施例中，S探针也包括在5’末端处的生物素部分，以促进未连接的探针的纯化和去除。在扩增连接产物以后，各自具有独特的长度，通过CE或其它合适的大小分离技术，分离反应混合物。每种产物的峰高或强度会反映靶序列表达，即样品中的靶物水平(图1和图7)。

CLPA-MDM

在本发明的该方面的另一个实施方案中，通过微阵列分析，分析/检测CLPA连接产物(CLPA-MDM)。在图2中提供了CLPA-MDM的一个示意图。CLPA-MDM与CLPA-CE的差别至少在于下述方面。第一，探针集合的设计存在差异。例如，CLPA-MDM探针集合的一般表示如图2所示。与CLPA-CE探针一样，CLPA-MDM探针集合可以包括用于扩增连接产物的通用引物。它们还包括靶物特异性的序列以及用于不依赖酶的连接的连接部分。另外，CLPA-MDM探针也可以包括填充序列，但是，该填充序列的目的是，调节CLPA-MDM的大小至相同的长度，以便标准化酶扩增效率。扩增子大小的标准化不是必要条件，而是一个优选的实施方案。CLPA-CE和CLPA-MDM探针集合的设计之间的第二个差异是，后者包括独特的阵列结合序列，以用于与适当的微阵列平台一起使用。

关于本发明的CLPA-MDM方面，将微阵列结合位点(ABS序列)掺入探针设计中，以与“通用”微阵列平台一起用于检测。类似于CLPA-CE系统，优选地用荧光团标记探针，例如通过使用荧光地标记的PCR引物。或者，例如，可以将夹心试验标记技术用于最终的读出。夹心试验包括：用替代或附加填充序列的普通的(一般的)标记结合位点(LBS)来设计探针，并使用在阵列杂交步骤中结合该位点的第二探针。当希望用化学发光的系统(如辣根过氧化物酶(HRP)标记的寡核苷酸)或用电化学检测系统来标记阵列时，该方法是特别有用的。通常，采用平面的微阵列(例如印迹在载玻片或电路板上的微阵列)进行读出。但是，也可以使用珠子微阵列，诸如可从Luminex和Illumina得到的那些(例如Luminex xMAP/xtag)。

实施例1

5种靶物的定量多路检测

使用组合在一个反应中的五(5)种DNA靶物模仿物(对应于MOAP1(SEQ ID NO：5)、PCNA(SEQ ID NO：9)、DDB2(SEQ ID NO：12)、BBC3(SEQ ID NO：16)和BAX(SEQ ID NO：19)基因的部分)，在有它们各自的CLPA探针(表1)(S和L探针各自在1nM)存在下，进行多路CLPA反应。以不同的浓度合并的靶物模仿物如表2所示。在PCR缓冲液(1X PCR缓冲液是1.5mM MgCL2、50mM KCl、10mM Tris-HClpH8.3)中在50℃温育靶物模仿物、S探针和L探针1小时。使用每种反应混合物的1ul等分试样作为PCR扩增的模板，所述PCR扩增使用Dynamo SYBR绿PCR混合物，在有通用引物(SEQ ID NO 1和2,300nM)存在下。将样品PCR循环27个循环(95℃15min，随后是27个95℃(10s)、60℃(24s)、72℃(10s)的循环)。PCR扩增以后，使样品变性，并注射进ABI 3130DNA测序仪(毛细管电泳仪器)。3个样品的来自ABI的CE迹线、以及峰相对于PCNA的靶物模仿物浓度的图如图7所示，PCNA的信号随着输入浓度而变化的线性响应图如图8所示。

表1.探针和靶序列信息。

L＝DABSYL连接部分

S＝硫代磷酸酯部分

表2.样品浓度

样品	靶物模仿物浓度
		1	所有靶物模仿物在10pM终浓度
2	MOAP1、DDB2和BBC3在10pM，PCNA在5pM，BAX在2pM
		3	MOAP1、DDB2和BBC3在10pM，PCNA在1pM，BAX在0.5pM

实施例2。

使用MOAP1和DDB2 DNA和RNA靶物模仿物的CLPA反应

如表3所示，一式两份地制备反应物，其中使用MOAP1和DDB2基因的DNA或RNA靶物模仿物和设计成靶向所述序列的CLPA探针集合。探针编号是指在表1中的SEQ ID NO。以表4所示的浓度和体积，加入试剂。在0.2mL PCR试管中，将各个S-探针、L-探针和靶物模仿物加热至50℃60分钟，然后，将2.5μl CLPA反应物用作实时PCR反应的模板，进行40个扩增循环。取一式两份样品的实时PCR数据平均值，并显示在表3中(Ct值列)。观察到RNA和DNA靶物模仿物之间的Ct值的微小差异，这指示对RNA和DNA底物的类似的探针连接效率。

表3.CLPA探针集合。

表4.试剂表-实施例1

^*1X PCR缓冲液是：1.5mM MgCL2，50mM KCl，10mM Tris-HCl pH8.3

实施例3

在裂解缓冲液和裂解的血液中的DDB2 RNA转录物的直接分析

使用购自Ambion的体外转录试剂盒和购自Origene(SC122547)的cDNA载体质粒，制备DDB2信使RNA(mRNA)。使用购自invitrogen的PicoGreen RNA试验试剂盒，测定mRNA的浓度。使用加入水或全血中的不同浓度的DDB2 mRNA转录物，测试DDB2探针集合(表5)。反应混合物组分列在表5中。样品1-4由在水中的10ng、1ng、0.1ng和0.01ng的DDB2转录物组成，样品5-8由加入全血中的相同浓度范围组成。遵循类似的反应方案，例外是，将蛋白水解酶K加入血液样品中，以便减少蛋白凝固。操作如下：以表5中的浓度和体积加入试剂。将S-探针、mRNA转录物、盐酸胍裂解缓冲液以及水(样品1-4)或全血(样品5-8)加热至80℃5分钟，然后将它们移至55℃加热块。加入L-探针、洗涤缓冲液、抗生蛋白链菌素珠子和蛋白水解酶K，将反应物在55℃温育60分钟。从加热块取出样品，并使用dynal MPC 96S磁性捕获板捕获磁珠。去除上清液，用洗涤缓冲液洗涤珠子3次。将DyNamo SYBR绿PCR主混合物(25ul，1x)和通用引物(SEQ ID NO 1和2，300nM)加给珠子，并使用Stratagene MX4000实时PCR仪器对样品进行热循环30个循环(95℃15分钟，30个95℃(10s)、60℃(24s)、72℃(10s)的循环)。记录Ct值，并将扩增的样品注射进Agilent Bioanalyzer 2100，以便验证扩增子的长度。所有扩增子表现出正确的大小(～96碱基对)，且血液和水样品的表现相当，这证实了直接在裂解的血液中分析RNA的能力。结果总结在下面的表7中。

表5.CLPA探针集合。

表6.DDB2反应混合物。

a)盐酸胍裂解缓冲液(1X)是：3M盐酸胍，20mM EDTA，5mM DTT，1.5％Triton，30mMTris pH 7.2)。

b)洗涤缓冲液是：100mM Tris(pH 7.4)，0.01％Triton。

表7.水和血液的总结结果

试验	DDB2浓度	Ct值	样品
				1	10ng	13.5	水
2	1ng	17	水
				3	0.1ng	20.2	水
4	0.01ng	24	水
				5	10ng	13.5	血液
6	1ng	16	血液
				7	0.1ng	19.2	血液
8	0.01ng	23.5	血液

实施例4

3-探针CLPA-CE试验

如表8所示，一式两份地制备反应物，其中使用DNA靶物模仿物探针SEQ ID NO 23和3-探针CLPA探针集合(SEQ ID NO 20、21和22)。探针编号是指在表1中的SEQ ID NO。以表9所示的浓度和体积，加入试剂。在0.2mL PCR试管中，将S-探针、L-探针和靶物模仿物加热至50℃60分钟，然后，将2.5μl CLPA反应物用作Dynamo SYBR绿PCR反应的模板，进行25个扩增循环。取一式两份样品的实时PCR数据平均值，并显示在表8中(Ct值列)。然后通过Agilent Bioanalyzer 2100，分析每个反应的1μl样品，以测定反应产物的大小。

表8.CLPA探针集合。

探针在1nM浓度；靶物模仿物在10pM浓度。

表9.试剂表-实施例1

^*1X PCR缓冲液是：1.5mM MgCL2，50mM KCl，10mM Tris-HCl pH8.3

实施例5

mRNA的多路实时CLPA检测

在0.2ml PCR试管中，加入4组CLPA试剂，所述试剂被设计成具有不同颜色双标记的探针的独特结合位点。如表10和表11所指出的，制备反应物。CLPA探针集合和双标记的探针对应着表1中的SEQ ID NO25至36。将S和失控转录物mRNA(GAPDH、PCNA和DDB2)加给2X裂解缓冲液(盐酸胍裂解缓冲液(1X)是：3M盐酸胍，20mM EDTA，5mM DTT，1.5％Triton，30mM Tris pH 7.2)，并加热至80℃5min。在冰上冷却样品，并加入抗生蛋白链菌素包被的磁珠(DYNAL M-270)和L-探针。将样品在50℃加热1小时。将磁珠捕获在DYNAL MPC板上，并用洗涤缓冲液洗涤2次。重新捕获珠子，向dynamo PCR 1x标准混合物中加入4种不同的双标记的探针和通用PCR引物(25ul总体积)。使用Stratagene MX4000实时PCR仪器对样品进行热循环30个循环(95℃15分钟，30个95℃(10s)、60℃(24s)、72℃(10s)的循环)，用适当的滤光片监测FAM、Cal Fluor orange 560、Cal Fluor Red 610、和Quasar 670通道的荧光。记录观察到的每个通道的Ct值，如表10所示。

表10.在实施例5中使用的多路试剂。

表11.在实施例5中使用的其它试剂。

盐酸胍裂解缓冲液(2X)	12.5μl
		S-探针(各0.25nM储备液)	5μl
mRNA(250ng tRNA+/-mRNA)	5μl
		水	2.5μl
80℃加热5min，在冰上冷却
		水	18μl
L-探针(各0.25nM储备液)	5μl
		珠子	2μl
共计	50μl

50℃温育1小时

Claims

1.一种用于检测包含多种不同序列的样品核酸的样品中至少一种特定靶核酸序列的存在的方法，所述至少一种特定靶核酸序列包含第一靶结构域和第二靶结构域，所述结构域的位置基本上彼此邻近，所述方法包括下述步骤：

a)使所述样品核酸接触多个不同的探针集合，每个探针集合包含

i.第一连接探针，其包含：

1)与所述第一靶结构域基本上互补的第一探针结构域；和

2)与所述靶核酸基本上不互补的第一非互补区，

3)5′-连接部分；和

ii.第二连接探针，其包含：

1)与所述第二靶结构域基本上互补的第二探针结构域；

2)与所述靶核酸基本上不互补的第二非互补区，

3)3′连接部分；

其中所述连接探针中的至少一个包含可变间隔序列；和

b)在没有连接酶存在下，连接所述第一连接探针和第二连接探针，以形成连接产物；

c)扩增所述连接产物；和

d)检测所述连接产物的存在。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述靶序列是RNA和/或DNA。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述靶序列包含未纯化的RNA。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述样品源自哺乳动物体，所述哺乳动物体选自血液、尿、唾液和粪便。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述检测步骤是通过毛细管电泳。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述检测步骤是通过微阵列分析。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述检测步骤是通过荧光或实时荧光分析。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述检测步骤是通过质谱法。

9.如权利要求1所述的方法，其中在所述第一连接探针上的所述5’连接部分是DABSYL部分，在所述第二连接探针上的所述3’连接部分是3-硫代磷酸酯部分。

10.如权利要求1所述的方法，其中所述第一连接探针和第二连接探针各自另外包含用于扩增所述连接产物的通用引物序列。

11.如权利要求10所述的方法，其中结合所述引物序列的通用引物之一含有可检测的标记。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述可检测的标记选自：荧光标记、化学发光标记、电化学标记和磁性标记。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述标记是选自下述的荧光标记：荧光素和它的衍生物、TAMRA(四甲基-6-羧基罗丹明)、Alexa染料、Quasar染料和菁染料(例如Cy3和Cy5)。

14.一种用于检测包含多种不同序列的样品核酸的样品中至少一种特定靶核酸序列的存在的方法，所述至少一种特定靶核酸序列包含第一靶结构域和第二靶结构域，所述结构域的位置基本上彼此邻近，所述方法包括下述步骤：

i)第一连接探针，其包含：

1)与所述第一靶结构域基本上互补的第一探针结构域；和

2)与所述靶核酸基本上不互补的第一非互补区，

3)5′-连接部分；和

ii)第二连接探针，其包含：

1)与所述第二靶结构域基本上互补的第二探针结构域；

2)与所述靶核酸基本上不互补的第二非互补区；和

3)3′连接部分；

其中所述第一连接探针和第二连接探针中的至少一个另外包含锚序列；

b)将所述连接产物捕获在微阵列基质上，所述微阵列基质包含与所述锚序列基本上互补的捕获探针；和

c)检测所述连接产物的存在。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述第一连接探针和第二连接探针各自另外包含用于扩增所述连接产物的通用引物序列，其中结合所述引物序列的通用引物之一含有可检测的标记，其中所述可检测的标记选自：荧光标记、电化学标记和磁性标记。

16.一种用于检测包含多种不同序列的样品核酸的样品中至少一种特定靶核酸序列的存在的方法，所述至少一种特定靶核酸序列包含第一靶结构域和第二靶结构域以及位于所述第一靶结构域和第二靶结构域之间的第三结构域，所述结构域的位置基本上彼此邻近，所述方法包括下述步骤：

i.第一连接探针，其包含：

1)与所述第一靶结构域基本上互补的第一探针结构域；和

2)与所述靶核酸基本上不互补的第一非互补区，

3)5′-连接部分；和

ii.第二连接探针，其包含：

1)与所述第二靶结构域基本上互补的第二探针结构域；

2)与所述靶核酸基本上不互补的第二非互补区，

3)3′连接部分；

iii.第三连接探针，其包含：

1)与所述第三靶结构域基本上互补的第三探针结构域；

2)3’和5’连接部分；

b)在没有连接酶存在下，连接所述第一连接探针、所述第二连接探针、和所述第三连接探针，以形成连接产物；

c)扩增所述连接产物；和

c)检测所述连接产物的存在。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述靶序列是RNA和/或DNA。

18.如权利要求16所述的方法，其中所述样品源自哺乳动物体，所述哺乳动物体选自血液、尿、唾液和粪便。

19.如权利要求16所述的方法，其中所述检测步骤是通过毛细管电泳。

20.如权利要求16所述的方法，其中所述检测步骤是通过微阵列分析。

21.如权利要求16所述的方法，其中所述检测步骤是通过荧光检测或实时荧光检测。

22.如权利要求16所述的方法，其中所述检测步骤是通过质谱法。

23.如权利要求16所述的方法，其中所述第一连接探针和第二连接探针各自另外包含用于扩增所述连接产物的通用引物序列。

24.如权利要求16所述的方法，其中结合所述引物序列的通用引物之一含有可检测的标记。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述可检测的标记选自：荧光标记、化学发光标记、电化学标记和磁性标记。

26.如权利要求25所述的方法，其中所述标记是选自下述的荧光标记：荧光素和它的衍生物、TAMRA(四甲基-6-羧基罗丹明)、Alexa染料、Quasar染料和菁染料(例如Cy3和Cy5)。

27.一种用于检测目标核酸序列的流体装置，所述流体装置包括：

i)至少一个样品处理孔，其包括孔入口和孔出口；

ii)第一微通道，以允许在所述样品入口和所述样品处理孔之间发生流体接触；

iii)一个或多个下述元件：流体控制阀、流体泵送机构、温度控制元件、检测室或通道和废物容纳室；

且所述装置被用于自动化如权利要求1所述的方法。

28.如权利要求27所述的流体装置，其具有毛细管电泳检测通道。

29.如权利要求27所述的流体装置，其具有空气压力控制的泵和阀。

30.一种用于检测核酸序列的试剂盒，所述试剂盒包括连接探针集合，所述集合包含：

i)第一连接探针，其包含：

1)与第一靶结构域基本上互补的第一探针结构域；和

2)5′-连接部分；和

ii)第二连接探针，其包含：

1)与第二靶结构域基本上互补的第二探针结构域；和

2)3′连接部分；

其中所述连接探针中的至少一个包含可变间隔序列，且其中所述第一连接探针和第二连接探针在没有外源地加入的连接酶存在下能够结合所述靶序列并发生自-连接。

31.如权利要求30所述的试剂盒，其中所述探针集合另外包含第三连接探针，所述第三连接探针包含：

i)第三探针结构域，其与位于所述第一靶结构域和第二靶结构域之间的第三靶结构域基本上互补；和

ii)3’和5′-连接部分；并且

其中所述第一连接探针、第二连接探针、和第三连接探针在没有外源地加入的连接酶存在下能够结合所述靶序列并发生自-连接。