CN104017895B - 26个y染色体短串联重复序列的复合扩增试剂盒 - Google Patents

26个y染色体短串联重复序列的复合扩增试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种同时分析多个Y-STR基因座的复合扩增系统，其特征在于：复合扩增26个Y染色体基因座：DYS19、DYS388、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS385a、DYS385b、DYS437、DYS438、DYS439、DYS448、DYS456、DYS458、DYS635、DYS460、DYS481、DYS533、DYS549、DYS570、DYS576、DYS643、DYS449和Y-GATA-H4。本发明还涉及同时分析DNA样品的方法和试剂盒，以及它们的用途。

Description

26个Y染色体短串联重复序列的复合扩增试剂盒
技术领域：
本发明涉及生物技术领域。进一步，本发明涉及检测人类基因组中具有多态性的遗传标记基因。本发明特别涉及用聚合酶链式反应在一个扩增体系中同时扩增多个短串联重复基因座。
背景技术：
短串联重复序列(简称STR)也称为微卫星或简单序列重复(SSR)，是一类广泛存在于真核生物基因组中的DNA串联重复序列，核心序列为2-6个碱基重复单位。STR基因座数量大，分布广泛，约占整个基因组的3％(InternationalHumanGenomeSequencingConsortium，2001)，而且多态性高，其多态性主要源自核心序列重复次数在个体间的差异，并且这种差异在遗传过程中遵循孟德尔遗传规律。因此，STR扩增检测技术被广泛用于个体识别、亲缘鉴定和群体遗传学研究。
Y-STR指男性Y染色体上存在的短串联重复序列，Y-STR只存在于Y染色体上，所以是父系遗传，由于Y-STR的特性，在人类遗传学中有很多重要的应用：法庭证据调查、侵权鉴定、历史调查、通过男性家系追溯人类迁移模式以及家系研究等。
目前Y-STR复合扩增技术为法医个体识别和亲子鉴定的主要辅助手段，在性侵案件、混合样本区分、通过Y-STR进行家系排查等案例中发挥着重要作用。随着发展，Y-STR数据库的建设也逐渐受到更多的重视，很多国家利用这一技术建立Y-STR的DNA数据库，也就是对在押犯人和犯罪嫌疑人的Y-STR数据分析并录入到数据库中，便于进行比对和排查等工作。
早期的Y-STR复合扩增技术能够实现在一个反应体系中扩增12个左右的Y-STR基因座，随着应用的广泛、数据比对的增加、Y-STR父系遗传的特性，12个基因座提供的信息不能满足要求，国内外的厂家开发出新的更多基因座的产品，比如美国ABI公司的AmpFISTRYfiler试剂盒可以扩增17个基因座，基点认知技术(北京)有限公司的Goldeneye20Y试剂盒可以扩增20个基因座。
但是，近年来随着DNA作为鉴定手段的应用越来越广，用户对试剂盒的基因座数量、信息含量和兼容性有了更高的要求。作为在某些遗传鉴定中，需要更多的基因座提供更多的信息量。比如亲子鉴定、失踪人口比对时，检测的基因座数量少的话，可能发生误判(STR基因座在二联体亲子鉴定中的应用分析，张文红等，《法医学杂志》，2008年第24卷第6期)，往往需要通过加测Y-STR数据辅助做出正确判断。目前的做法通常是选择ABI公司AmpFISTRYfiler试剂盒和Promega公司的PowerplexY试剂盒作为辅助，联合使用，以达到做出正确判断的目的。而国内Y-STR基因座试剂盒目前还处于空白，如果我们可以开发出一款多位点的Y-STR基因座试剂盒，不仅可以填补国内在Y-STR检测试剂上的空白，还能弥补目前Y-STR检测位点过少的缺点。
另外，在DNA数据库建设方面，对于试剂盒兼容性也提出了新的要求。我国的目前DNA数据库中有200万份左右，我国将在DNA数据库建设方面进一步加速，到2013年DNA数据库中的数据将超过1000万份，英国等发达国家的数据库中约有占总人口10％的数据(http：//www.forensic.gov.uk，Asplen，2004)。随着我国DNA数据库建设规模将不断扩大，数据比对的作用越来越重要。数据比对是建立在STR复合扩增分析得到的数据基础之上，需要各个STR试剂盒在基因座位上具有兼容性(中国法庭科学DNA数据库，《中国法医学杂志》，姜先华，2006年第12卷第5期)。然而目前并没有规定Y-STR基因座的核心位点，所采用的试剂盒大多以ABI和Promega两家公司试剂盒中出现的位点为为基础，在此基础只是选择增加其他基因座，各厂商试剂盒基因座信息见表1。所以，如果采用不同生产商的Y-STR试剂盒，导入到Y-DNA数据库中的数据是有基因座差异的。这样在比对的时候，不是所有数据都有效，只是相同基因座部分的数据可以比对，而不同的部分就无法应用。所以，由于各Y-STR试剂盒基因座不同，导致了Y-DNA数据库部分数据资源浪费，并且有效性不够。
因此，DNA鉴定领域需要具有一个反应扩增更多基因座、能提供更多信息量和具有更好兼容性的Y-STR复合扩增体系。
表1：各主流生产商试剂盒的基因座位信息
注：+表示被包括的基因座，-表示不包括的基因座
发明内容：
本发明是针对上述需求，首先建立了一次检测26Y-STR基因座的复合扩增体系，这些STR基因座包含了目前国内外各个生产商主流试剂盒所采用的全部基因座位。
所述的基因座为DYS19、DYS388、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS385a、DYS385b、DYS437、DYS438、DYS439、DYS448、DYS456、DYS458、DYS635、DYS460、DYS481、DYS533、DYS549、DYS570、DYS576、DYS643、DYS449和Y-GATA-H4。
本发明的扩增体系包含引物混合物、反应缓冲液和热启动TaqDNA聚合酶等。
首先针对上述26个基因座在其重复序列的侧翼分别设计特异性引物。引物设计采用Primer3软件，每条引物退火温度接近或高于60℃。不能产生引物二聚体、其它相互作用或交叉反应，扩增产物长度在65-430bp之间。对每对引物进行扩增测试并优化，直至得到清晰单一扩增条带。引物序列见下表2。
表2复合扩增体系各基因座引物序列
根据扩增片段长度等将上述基因座分为4组，第一组：DYS456、DYS549、DYS439、DYS19、DYS392、DYS643、Y-GATA-H4；第二组：DYS391、DYS388、DYS570、DYS635、DYS448、DYS437、DYS533；第三组：DYS393、DYS389I、DYS390、DYS389II、DYS438、DYS576；第四组：DYS460、DYS458、DYS481、DYS385a、DYS385b、DYS449。每组分别由不同荧光素标记，每组之中各基因座扩增产物根据长度差异分开，两个基因座不能有重叠。分别对每组引物进行复合扩增试验。确定该组没有非特异扩增现象，无交叉反应等情况后，调整每对引物的浓度，使组内各个片段峰值均衡性达到40％以上。
将4组引物分别用蓝色、绿色、黄色和红色荧光素标记。每对引物中只标记一条链，标记在引物的5’端。蓝色标记可选择5-FAM(5-羧基荧光素)，6-FAM(6-羧基荧光素)或相近光谱的荧光素分子，绿色标记可选择HEX(六氯-6-甲基荧光素)，JOE(6-羧基-4，5-二氯-2，7-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯)或相近光谱的荧光素分子，黄色标记可选择TMR(4-甲基-6-羧基-罗丹明)或相近光谱的荧光素分子，红色标记可选择ROX(羧基-X-罗丹明)或相近光谱的荧光素分子。将4组26个基因座复合扩增，根据产物峰高情况调整各基因座引物浓度，使各基因座峰值整体均衡性达到30％以上。得到的引物混合物可以用于上述26个基因座复合扩增。
本发明的PCR扩增反应可在一定的缓冲体系中进行。缓冲体系中包括：50mMKCI，10mMTris-HCI(pH8.3，25℃)，2.0mMMgCl2，0.1mg/mlBSA(牛血清白蛋白)和各0.2mM的dNTP。dNTP是四种脱氧核糖核苷酸(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)等摩尔混合物。
反应所需的TaqDNA聚合酶为热启动DNA聚合酶，抗体封闭修饰或化学修饰的都可以。本发明的每个扩增体系(25μl)需要2U至4U的TaqDNA聚合酶。
扩增体系在各种反应热循环仪上(如ABI9700、ABI9600、ABI2720、Bio-RadiCycler、Bio-RadC1000等)采用以下的程序可以得到较好的结果：96℃保温2分钟；98℃保温2秒钟，60℃保温40秒钟，68℃保温20秒钟，该步骤运行30个循环；4-10℃保温。
本发明中的模板DNA为人类男性基因组DNA。由各种常规方法，比如磁珠法、酚氯仿法、树脂纯化等方法(《分子克隆实验手册》第三版，冷泉港出版社)提取的模板DNA均可以得到较好的结果。DNA可以由以下组织或细胞制备：血液(血斑)、精液(精斑)、骨骼、毛发、唾液(唾液斑)、汗液、含有胎儿细胞的羊水等。DNA模板量优选在0.5ng至4ng的范围内能够得到较好的扩增结果，模板量太低可能导致某些基因座位检测不出，模板量太高会导致非特异性的扩增产物产生，对于女性基因组DNA检测不出。
在上述反应缓冲体系中按照指定的反应程序扩增模板DNA，可以得到各基因座混合的扩增产物。本发明由于采用了荧光标记的引物，扩增产物也带有荧光标记物，并且标记物可以在激光激发下发出可以通过测序仪(如ABI377、310DNAsequencer)或遗传分析仪(如ABI3130、3100geneticanalyzer)识别的光信号，所以扩增产物可以通过测序仪或遗传分析仪等仪器上进行电泳和检测分析。
在测序仪或遗传分析仪上进行检测的时候，扩增产物与分子量内标(marker，internallanestandard)、甲酰胺按照一定比例混合，进入仪器毛细管或凝胶中电泳分离。分子量内标是由多条已知长度的荧光标记DNA片段组成，用来计算PCR扩增产物片段长度，从而可以判断基因分型以及与等位基因阶梯比对。
电泳后的数据可以在GeneMapper、GeneMarker、GeneScan等数据分析软件上分析，得到STR基因分型图谱和数据。
本发明涉及
1.一种同时分析多个Y-STR基因座的复合扩增系统，其特征在于：复合扩增26个基因座：DYS456、DYS549、DYS439、DYS19、DYS392、DYS643、Y-GATA-H4、DYS391、DYS388、DYS570、DYS635、DYS448、DYS437、DYS533、DYS393、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS438、DYS576、DYS460、DYS458、DYS481、DYS385a、DYS385b和DYS449。
2.根据项1所述的复合扩增系统，其特征在于：复合扩增是利用聚合酶链式反应进行的，其中，DYS389I和DYS389II的扩增引物相同，DYS385a和DYS385b的扩增引物相同，所述26个Y-STR基因座对应的上下游引物序列依次如SEQIDNO：1-48所示。
3.根据项1所述的复合扩增系统，其中所述的基因座分为下述组合：第一组：DYS456、DYS549、DYS439、DYS19、DYS392、DYS643、Y-GATA-H4；第二组：DYS391、DYS388、DYS570、DYS635、DYS448、DYS437、DYS533；第三组：DYS393、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS438、DYS576；第四组：DYS460、DYS458、DYS481、DYS385a、DYS385b、DYS449。
4.根据项2所述的复合扩增系统，其中在一个复合扩增反应体系中同时扩增26个基因座。
5.根据项3所述的复合扩增系统，其中基因座被位于该基因座两侧的一对引物扩增，其中每对引物中有一个引物的5’端进行荧光素标记。
6.根据项5所述的复合扩增系统，其中，四组基因座的引物分别用蓝色、绿色、黄色和红色荧光素标记，蓝色标记选择5-FAM、6-FAM或相近光谱的荧光素分子，绿色标记选择HEX、JOE或相近光谱的荧光素分子，黄色标记选择TMR或相近光谱的荧光素分子，红色标记选择ROX或相近光谱的荧光素分子。
7.一种同时分析DNA样品的方法，其特征在于应用前述任一项所述的复合扩增系统检测DNA。
8.根据项7所述的方法，其中DNA样品包括血液、血斑、精液、精斑、骨骼、毛发、唾液、唾液斑、汗液和羊水中的一种或多种。
9.一种具有SEQIDNO：1-48所示的用于复合扩增体系的引物序列或者所述引物序列的混合物。
10.一种用于同时分析多个STR基因座的试剂盒，所述基因座为DYS19、DYS388、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS385a、DYS385b、DYS437、DYS438、DYS439、DYS448、DYS456、DYS458、DYS635、DYS460、DYS481、DYS533、DYS549、DYS570、DYS576、DYS643、DYS449和Y-GATA-H4，其包含SEQIDNO：1-48所示的引物。
本发明还提供具有选自SEQIDNO：1-48所示的引物序列，其中一个或多个，优选1-15个，优选1-10，优选1-5个核苷酸被取代、删除和/或添加而得到的经修饰的序列。
本发明还涉及上述的引物序列，试剂盒和/或复合扩增系统用于分析多个STR基因座的用途。
利用本发明的体系可以一次操作得到26个Y-STR基因座信息，这一体系具有很高的个体识别率和很高的兼容性。
附图说明
图1-1和图1-2为DNA样本采用本发明扩增后的分析图谱的两部分，图1-1的右边与图1-2的左边有重叠，两者可以拼合为一幅完整的图谱。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明。下面的实施例仅仅是为了说明的目的，而并非限制本发明的范围。
实施例1复合扩增26个基因座位并分析其基因型
购买9948细胞株。模板DNA由细胞株中用chelex-100方法提取。扩增反应在ABI9700热循环仪上进行，电泳及检测在ABI3100遗传分析仪上进行，数据分析采用GeneMapperIDv3.2软件。本发明所用的试剂和材料诸如等位基因阶梯(ladder)均为本领域技术人员常用的常规材料。
1.1.chelex-100方法提取DNA(具体方法参考《ForensicDNAProtocol》，HumanaPress，1998)
1)取3μl细胞株于500μl离心管中
2)振荡混匀chelex溶液，使chelex充分悬浮，每管加195μl5％的chelex-100(100-200mesh，购自Bio-Rad公司)，再加入5μl蛋白酶K(20mg/ml，购自天根生化科技有限公司)
3)振荡样品，恒温金属浴上56℃温浴2小时后，取出样品振荡2分钟，
4)煮沸8-10分钟，13000rpm离心3分钟
5)小心吸出约150μl上清，转移至新管中，10μlPCR反应体系取1μl作为模板
1.2.聚合酶链式反应(PCR)扩增
1)取缓冲液、引物混合物，按照下表配成混合液，振荡混匀后分装至PCR反应管中，每管25μl，加入模板DNA。
2)按照下面的反应条件设置热循环仪增仪(ABI9700PCR仪)，将PCR反应管放入仪器中开始扩增基因片段。96℃保温2分钟；98℃保温2秒钟，60℃保温40秒钟，68℃保温20秒钟，运行30个循环；4℃持续保温，直至取出样品。
1.3.扩增反应结束后，取出反应管，用ABI3100遗传分析仪进行电泳和检测
1)取(0.5μl分子量内标+10μl去离子甲酰胺)×(样品数)配成混合液
2)混匀后分装，每管10μl，再分别加入1μl扩增产物和等位基因阶梯(ladder)，简短离心将液体收集到离心管管子底部
3)样品95℃变性4分钟，然后迅速冰上冷却4分钟，使DNA完全变性并且保持变性状态
4)将样品放入基因分析仪的样品托盘中，设置仪器参数(进样电压3kV，进样时间10秒钟)，开始电泳检测
5)大约40分钟后，电泳结束，用GeneMapper软件分析实验数据得到图谱和分型结果(见图1-1和图1-2，该图谱清晰的分型结果表明本发明具有很高的个体识别率和很高的兼容性)。
发明效果：
随着复合基因座数目的增加，由于竞争的影响，各基因座的相对平衡控制难度加大，本发明通过多次的实验，首先建立了一次检测26个Y-STR基因座的复合扩增体系，这些STR基因座整合了目前国内外各个生产商所采用的全部基因座位。利用这个扩增体系可以一次性检测26个基因座，DYS19、DYS388、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS385a、DYS385b、DYS437、DYS438、DYS439、DYS448、DYS456、DYS458、DYS635、DYS460、DYS481、DYS533、DYS549、DYS570、DYS576、DYS643、DYS449和Y-GATA-H4。
利用该体系可以一次操作得到26个基因座信息，因此这一体系具有很高的个体识别率，高于同时利用2-3个其他同类产品得到的信息总和，无论在PCR扩增和遗传分析仪检测环节，都节省了成本和人力，提高了工作效率。在扩增环节，将以前两种或者3种试剂盒扩增减少为1种试剂盒的扩增，节约了50％以上的试剂成本，时间缩短68％。检测环节，采用2种或3种试剂盒需要分别上样检测，采用本发明只需要一次检测，操作时间、检测时间和检测试剂成本都减少50％或更多。
采用本发明具有很高的兼容性，使用本发明不用担心之前数据兼容性的问题。由于这26个基因座包含了目前国内和之前使用的主流产品的全部基因座，具有很好的兼容性，不仅能够兼容目前我国DNA数据库中已有的全部数据，并且对新一代产品也有很高的兼容性。
可以理解的是，上面的描述仅是本发明的示例，因而本发明权利要求所保护的范围并不仅仅以此处公开的特定实施方案来限定。任何等同的实施方案将被认为在本发明的范围之内。事实上，根据前面的描述，对本发明进行有关的修改和变化对于本领域技术人员来讲都将是可能的，因而，这种修改和变化也将落在本发明所附的权利要求的范围之内。

Claims (6)

1.一种同时分析多个Y-STR基因座的复合扩增系统，其特征在于：
在一个复合扩增反应体系中同时扩增26个基因座，复合扩增26个基因座：DYS456、DYS549、DYS439、DYS19、DYS392、DYS643、Y-GATA-H4、DYS391、DYS388、DYS570、DYS635、DYS448、DYS437、DYS533、DYS393、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS438、DYS576、DYS460、DYS458、DYS481、DYS385a、DYS385b和DYS449；
所述的基因座分为下述四组，每组分别由不同荧光素标记：
第一组：DYS456、DYS549、DYS439、DYS19、DYS392、DYS643、Y-GATA-H4；
第二组：DYS391、DYS388、DYS570、DYS635、DYS448、DYS437、DYS533；
第三组：DYS393、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS438、DYS576；
第四组：DYS460、DYS458、DYS481、DYS385a、DYS385b、DYS449；
针对上述分组在基因座重复序列的侧翼分别设计特异性引物，所述26个Y-STR基因座对应的上下游引物序列依次如SEQIDNO：1-48，使得基因座组内各个片段峰值均衡性达到40％以上，
将上述四组基因座复合扩增，根据产物峰高情况调整各基因座引物浓度，使各基因座峰值整体均衡性达到30％以上。
2.根据权利要求1所述的复合扩增系统，其中基因座被位于该基因座两侧的一对引物扩增，其中每对引物中有一个引物的5’端进行荧光素标记。
3.根据权利要求1所述的复合扩增系统，其特征在于，该复合扩增系统的每个25μl扩增体系包括5μl上述引物混合物、12.5μl反应缓冲液和2U～4U的热启动TaqDNA聚合酶。
4.根据权利要求1所述的复合扩增系统，其特征在于，采用以下程序进行：
1)制作模板DNA；
2)聚合酶链式反应(PCR)扩增，
每25μl扩增体系配成混合液，混匀后分装至PCR反应管中，将2.5μl模板DNA加入PCR反应管中；
按照下面的反应条件设置热循环仪，将PCR反应管放入热循环仪中开始扩增基因片段，96℃保温2分钟；98℃保温2秒钟，60℃保温40秒钟，68℃保温20秒钟，运行30个循环；4-10℃持续保温直至取出样品；
3)电泳、检测
取0.5μl分子量内标和10μl去离子甲酰胺，乘以样品数，配成混合液；
以每管10μl混合液加入1μl扩增产物和等位基因阶梯，离心将液体收集到离心管的底部；
样品95℃变性4分钟，然后迅速冰上冷却4分钟，使DNA完全变性并保持变性状态；
将样品放在基因分析仪中开始电泳检测；
电泳结束，分析实验数据得到图谱和基因分型结果。
5.一种如权利要求1所述的复合扩增系统的对应基因座分组的具有SEQIDNO：1-48所示的用于复合扩增体系的引物序列或者所述引物序列的混合物。
6.一种应用权利要求1所述复合扩增系统的复合扩增试剂盒，所述基因座为DYS19、DYS388、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS385a、DYS385b、DYS437、DYS438、DYS439、DYS448、DYS456、DYS458、DYS635、DYS460、DYS481、DYS533、DYS549、DYS570、DYS576、DYS643、DYS449和Y-GATA-H4，其包含SEQIDNO：1-48所示的引物。
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