CN103397086A

CN103397086A - 转基因玉米品系mlpa检测的探针及制备长探针的引物

Info

Publication number: CN103397086A
Application number: CN2013102529621A
Authority: CN
Inventors: 凌杏园; 陈枝楠; 潘广; 章桂明; 向才玉; 康林; 程颖慧; 龙海; 郑耘; 陈菲
Original assignee: Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center of Shenzhen Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Current assignee: Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center of Shenzhen Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Priority date: 2013-06-24
Filing date: 2013-06-24
Publication date: 2013-11-20
Anticipated expiration: 2033-06-24
Also published as: CN103397086B

Abstract

本申请公开了转基因玉米品系MLPA检测的探针，制备长探针的引物，以及该探针的应用。本申请的转基因玉米品系MLPA检测的探针由检测十个转基因玉米品系的MLPA探针中的至少一组组成，每一组探针中都含有长探针和短探针，并且长探针的5’端具有磷酸化修饰。本申请的制备长探针的引物，能够通过不对称PCR扩增出任意需要长度的长探针。本申请的MLPA检测探针以及基于此的转基因玉米品系MLPA检测方法，扩展性能好、特异性强，为转基因玉米检测提供了一种简单、方便、有效、可靠的高通量检测方法，特别适合用于检验检疫等部门。

Description

转基因玉米品系MLPA检测的探针及制备长探针的引物

技术领域

本申请涉及核酸分子检测领域，特别是涉及一种用于转基因玉米品系MLPA检测的探针，制备该探针引物，以及该探针的应用。

背景技术

玉米转基因品系多，已知商业化的至少有64个单品系，我国已批准的品系有12个，它们分别是转基因玉米品系MOM810、BT176、BT11、GA21、T25、MON88017、NK603、MIR604、MON863、59122、TC1507和MON89034。美国和阿根廷是全球最大的两个玉米种植和出口大国，种植的玉米大部分，约80％以上都是转基因的，且品系多。2010年起我国从美国就进口了150万吨玉米，现逐年增加。因此，必须对进口玉米进行转基因品系检测。

我国现行的转基因玉米品系检测以常规的PCR技术为主，检测快速、灵敏度高、结果准确、可靠。然而，常规PCR方法单管只能分析一个基因，效率低。当前要对如众多转基因品种和品系的转基因玉米逐一筛查，工作量太大，成本高。因此，基因检测急需一种高通量检测方法。常见的高通量基因检测技术有基因芯片、多通道毛细管电泳和DHPLC分离技术等。然而，这些方法仍然是以常规的单重PCR或多重PCR为基础的，检测能力有限，以多重PCR为基础的基因芯片，需要多套引物进行扩增，操作步骤繁琐，并不适合大规模的高通量检测。

多重连接依赖探针扩增技术（Multiplex Ligation dependent PrimersAmplification MLPA）由荷兰的Dr．Schouten JP于2002年报道,最初应用于医学检测目的。其原理是针对不同的感兴趣基因位点设计长度各不相同的探针对，探针对两序列的一端具基因特异性，它们与各自目标基因区域复性后，彼此之间没有碱基空隙，因此，在连接酶的作用下，探针对的两条探针可以，连接成一条完整的序列，与此同时所有探针对中与目的基因不杂交的一端都接有相同的碱基序列，既通用序列，用于PCR。这样当探针对与目标区特异性的复性后，并在连接酶的作用下相连成完整的探针序列，该完整的探针序列本身作为PCR扩增的模板，并由一对公用引物对各完整的探针序列进行扩增，从而放大检测信号，由于针对不同的感兴趣基因位点设计的探针对长度各不相同，经分离PCR产物大小，不须测序，便可知道是否有目标基因的存在，在并能进行相对定量分析。其中，探针中与目标基因区域复性的部分序列保障了探针的特异性。

MLPA技术包括探针的设计、探针和靶序列DNA进行杂交，之后通过连接、PCR扩增，产物通过琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳分离及数据收集等过程。具有经济（不需昂贵设备）、特异性高(探针复性及连接酶识别)及高通量(单管可测多达40多个基因)的特点。此外，该法检测所针对的基因目标区可短至40-50bp,特别适于DNA高度降解样品的检测。至今，MLPA技术已应用于很多领域，如单核苷酸多态性和基因突变检测、基因片段缺失和重复、染色体数目异常、基因甲基化检测及mRNA分析等。目前，在转基因玉米品系的检测中尚没有比较完整的MLPA检测探针。

发明内容

本申请的目的是提供一种新的转基因玉米品系MLPA检测的探针及其应用。

本申请的另一目的是提供一种适用于不对称PCR方法制备长探针的引物，该引物能够用于不对称PCR方法，制备出本申请的部分长探针。

为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：

本申请公布了一种转基因玉米品系MLPA检测的探针，该探针包括第一组探针至第十组探针中的至少一组，每组探针中分别含有长探针和短探针，长探针的5’端具有磷酸化修饰；第一组探针的短探针含有Seq ID No.1所示序列，长探针含有Seq ID No.2所示序列；第二组探针的短探针含有Seq ID No.3所示序列，长探针含有Seq ID No.4所示序列；第三组探针的短探针含有Seq ID No.5所示序列，长探针含有Seq ID No.6所示序列；第四组探针的短探针含有Seq IDNo.7所示序列，长探针含有Seq ID No.8所示序列；第五组探针的短探针含有Seq ID No.9所示序列，长探针含有Seq ID No.10所示序列；第六组探针的短探针含有Seq ID No.11所示序列，长探针含有Seq ID No.12所示序列；第七组探针的短探针含有Seq ID No.13所示序列，长探针含有Seq ID No.14所示序列；第八组探针的短探针含有Seq ID No.15所示序列，长探针含有Seq ID No.16所示序列；第九组探针的短探针含有Seq ID No.17所示序列，长探针含有Seq IDNo.18所示序列；第十组探针的短探针含有Seq ID No.19所示序列，长探针含有Seq ID No.20所示序列。需要说明的是，本申请的第一组探针至第十组探针中每组探针都是针对某个转基因成分设计的，在实际检测中，可以根据实际要求选用其中部分或者全部。

本申请中，第一组探针至第十组探针依序为检测转基因玉米品系TC1507、Bt176、T25、NK603、MON863、MON89034、MIR604、GA21、Bt11和59122的探针。

本申请的另一面还公开了一种转基因玉米品系的MLPA检测方法，该检测方法采用本申请的探针以受检样品的DNA为模板进行杂交。需要说明的是，本申请的探针包括第一组探针至第十组探针中的至少一组，并且各组探针都是分别针对一个转基因玉米品系设计的，因此，本申请的检测方法在检测具体转基因玉米品系时，可以选择性的采用相应的某组或某几组探针进行检测，或者，采用十组探针同时进行。

本申请的检测方法进一步的，还包括采用一对通用引物对杂交后连接起来的长探针和短探针进行PCR扩增，通用引物的上游/下游引物分别含有Seq IDNo.21和Seq ID No.22所示序列。需要说明的是，在MLPA检测的过程中，首先是长探针和短探针与检测靶标序列复性杂交，然后通过连接酶将长探针和短探针连接起来，最后以连接起来的探针为模板进行PCR扩增，使得检测信号放大，便于检测；其中以连接起来的探针为模板的PCR扩增即采用通用引物进行的，实现采用一对引物即可对所有不同的探针进行扩增。

本申请的再一面公开了一种本申请的长探针的引物，该引物包括第一引物组至第七引物组中的至少一组，每个引物组中分别含有非限定引物和限定引物，非限定引物的5’端具有磷酸化修饰；第一引物组的非限定引物含有Seq ID No.23所示序列，限定引物含有Seq ID No.24所示序列；第二引物组的非限定引物含有Seq ID No.25所示序列，限定引物含有Seq ID No.26所示序列；第三引物组的非限定引物含有Seq ID No.27所示序列，限定引物含有Seq ID No.28所示序列；第四引物组的非限定引物含有Seq ID No.29所示序列，限定引物含有Seq IDNo.30所示序列；第五引物组的非限定引物含有Seq ID No.31所示序列，限定引物含有Seq ID No.32所示序列；第六引物组的非限定引物含有Seq ID No.33所示序列，限定引物含有Seq ID No.34所示序列；第七引物组的非限定引物含有Seq ID No.35所示序列，限定引物含有Seq ID No.36所示序列。

本申请的制备长探针的引物中，第一引物组至第七引物组依序为制备第四组探针至第十组探针的长探针的引物组。需要说明的是，本申请的制备长探针的引物，是用于不对称PCR扩增方法的，即利用其中的非限定引物扩增出单链的产物，回收该单链产物即获得本申请的长探针。还需要说明的是，本申请的制备长探针的引物包括第一引物组至第七引物组中的至少一组，可以理解，根据具体检测要求，可以选择性的采用第一组探针至第十组探针中的某几组进行，所以，也可以选择性的只采用其中相应的某几组引物制备相应的长探针；并且，本申请的采用引物的不对称PCR扩增制备长探针的方法并不是长探针的唯一制备方法，比如第一组探针至第三组探针中的长探针就可以采用化学合成法直接合成。

本申请的再一面公开了一种用于转基因玉米品系MLPA检测的试剂盒，该试剂盒中含有本申请的探针。

进一步的，用于转基因玉米品系MLPA检测的试剂盒中还含有一对通用引物，该通用引物的上游/下游引物分别含有Seq ID No.21和Seq ID No.22所示序列。需要说明的是，此处的通用引物即本申请的检测方法中所使用的通用引物；可以理解，为了检测方便，可以将MLPA检测的探针以及引物都统一放在一个试剂盒中，也可以仅在试剂盒中放探针，而通用引物则另外在引物合成公司合成。

进一步的，用于转基因玉米品系MLPA检测的试剂盒中还含有DNA杂交缓冲液、DNA连接酶和PCR反应缓冲液中的至少一种。需要说明的是，DNA杂交缓冲液、DNA连接酶和PCR反应缓冲液这些都可以采用实验室常规使用的试剂即可。

本申请的再一面还公开了一种用于制备本申请的长探针的试剂盒，该试剂盒中含有本申请中用于制备长探针的引物。

由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：

本申请的转基因玉米品系MLPA检测的探针以及转基因玉米品系MLPA检测方法，为转基因玉米品系的检测提供了一种简单、方便、有效、可靠和扩展性好的高通量检测方法，为转基因玉米的多靶标检测奠定了基础，特别适合用于口岸检验检疫等部门使用。

附图说明

图1是本申请实施例中MLPA长探针制备示意图和制备的长探针示意图，其中引物扩增的模板为PUC18质粒，P为磷酸化修饰，T2为与检测靶标序列特异性配合的区域，UT1和UT2为与PUC18质粒结合的区域，P2’为通用引物结合区域，UT为UT1和UT2扩增区间内的插入到长探针中的插入序列；

图2是本申请实施例中MLPA检测示意图，其中杂交连接的模板为转基因玉米检测靶标序列，P1为短探针的通用引物结合区域，T1为短探针与靶标序列特异性结合区域，T2为长探针与靶标序列特异性结合区域，UT为长探针的插入序列，P2为长探针中与通用引物结合区域；

图3是本申请实施例中内源基因Zein的MLPA检测毛细管电泳结果图，图中所示峰1-11为GeneScan^TM500LIZ Size Standard，片段分别为:75、100、139、150、160、200、250、300、340、350、400bp，12为Zein基因的检测峰值91bp；

图4是本申请实施例中品系MON810的MLPA检测毛细管电泳结果图，图中所示峰1-13为GeneScan^TM500LIZ Size Standard，片段分别为:100、139、150、160、200、250、300、340、350、400bp、450、490、500bp，14为品系MON810的检测峰值170bp；

图5是本申请实施例中品系MON88017的MLPA检测毛细管电泳结果图，图中所示峰1-11为GeneScan^TM500LIZ Size Standard，片段分别为:75、100、139、150、160、200、250、300、340、350、400bp，12为品系MON88017的检测峰值252bp；

图6是本申请实施例中品系TC1507的MLPA检测毛细管电泳结果图，图中所示峰1-13为GeneScan^TM500LIZ Size Standard，片段分别为:100、139、150、160、200、250、300、340、350、400bp、450、490、500bp，14为品系TC1507的检测峰值109bp；

图7是本申请实施例中品系Bt176的MLPA检测毛细管电泳结果图，图中所示峰1-13为GeneScan^TM500LIZ Size Standard，片段分别为:100、139、150、160、200、250、300、340、350、400bp、450、490、500bp，14为品系Bt176的检测峰值128bp；

图8是本申请实施例中品系T25的MLPA检测毛细管电泳结果图，图中所示峰1-13为GeneScan^TM500LIZ Size Standard，片段分别为:100、139、150、160、200、250、300、340、350、400、450、490、500bp，14为T25的检测峰值148bp；

图9是本申请实施例中品系NK603的MLPA检测毛细管电泳结果图，图中所示峰1-13为GeneScan^TM500LIZ Size Standard，片段分别为:100、139、150、160、200、250、300、340、350、400、450、490、500bp，14为NK603的检测峰值191bp；

图10是本申请实施例中品系MON863的MLPA检测毛细管电泳结果图，图中所示峰1-13为GeneScan^TM500LIZ Size Standard，片段分别为:100、139、150、160、200、250、300、340、350、400、450、490、500bp，14为MON863的检测峰值211bp；

图11是本申请实施例中品系MON89034的MLPA检测毛细管电泳结果图，图中所示峰1-13为GeneScan^TM500LIZ Size Standard，片段分别为:100、139、150、160、200、250、300、340、350、400、450、490、500bp，14为MON89034的检测峰值230bp；

图12是本申请实施例中品系MIR604的MLPA检测毛细管电泳结果图，图中所示峰1-13为GeneScan^TM500LIZ Size Standard，片段分别为:100、139、150、160、200、250、300、340、350、400、450、490、500bp，14为MIR604的检测峰值271bp；

图13是本申请实施例中品系GA21的MLPA检测毛细管电泳结果图，图中所示峰1-13为GeneScan^TM500LIZ Size Standard，片段分别为:100、139、150、160、200、250、300、340、350、400、450、490、500bp，14为GA21的检测峰值291bp；

图14是本申请实施例中品系Bt11的MLPA检测毛细管电泳结果图，图中所示峰1-13为GeneScan^TM500LIZ Size Standard，片段分别为:100、139、150、160、200、250、300、340、350、400、450、490、500bp，14为Bt11的检测峰值309bp；

图15是本申请实施例中品系59122的MLPA检测毛细管电泳结果图，图中所示峰1-13为GeneScan^TM500LIZ Size Standard，片段分别为:100、139、150、160、200、250、300、340、350、400、450、490、500bp，14为品系59122的检测峰值330bp；

图16是本申请实施例中内源基因Zein和MON88017双重MLPA检测的毛细管电泳结果图，图中所示峰1-13为GeneScan^TM500LIZ Size Standard，片段分别为:100、139、150、160、200、250、300、340、350、400bp、450、490、500bp，14为Zein峰值91bp，15为MON88017峰值251bp；

图17是本申请实施例中内源基因Zein、MON88017和MON810三重MLPA检测的毛细管电泳结果图，图中所示峰1-13为GeneScan^TM500LIZ SizeStandard，片段分别为:100、139、150、160、200、250、300、340、350、400bp、450、490、500bp，14为Zein峰值91bp，15为MON810的峰值170bp，16为MON88017峰值251bp；

图18是本申请实施例中内源基因Zein、MON88017、MON810和NK603四重MLPA检测的毛细管电泳结果图，图中所示峰1-13为GeneScan^TM500LIZSize Standard，片段分别为:100、139、150、160、200、250、300、340、350、400bp、450、490、500bp，14为Zein峰值91bp，15为MON810的峰值170bp，16为NK603峰值191bp，17为MON88017峰值251bp；

图19是本申请实施例中内源基因Zein、MON88017、MON810、NK603和MIR604五重MLPA检测的毛细管电泳结果图，图中所示峰1-13为GeneScan^TM500LIZ Size Standard，片段分别为:100、139、150、160、200、250、300、340、350、400bp、450、490、500bp，14为Zein峰值91bp，15为MON810的峰值170bp，16为NK603峰值191bp，17为MON88017峰值251bp，18为MIR604峰值271bp；

图20是本申请实施例中内源基因Zein、MON88017、MON810、NK603、MIR604和MON863六重MLPA检测的毛细管电泳结果图，图中所示峰1-13为GeneScan^TM500LIZ Size Standard，片段分别为:100、139、150、160、200、250、300、340、350、400bp、450、490、500bp，14为Zein峰值91bp，15为MON810的峰值170bp，16为NK603峰值191bp，17为MON863峰值211bp，18为MON88017峰值251bp，19为MIR604峰值271bp；

图21是本申请实施例中内源基因Zein、MON88017、MON810、NK603、MIR604、MON863和GA21七重MLPA检测的毛细管电泳结果图，图中所示峰1-13为GeneScan^TM500LIZ Size Standard，片段分别为:100、139、150、160、200、250、300、340、350、400bp、450、490、500bp，14为Zein峰值91bp，15为MON810的峰值170bp，16为NK603峰值191bp，17为MON863峰值211bp，18为MON88017峰值251bp，19为MIR604峰值271bp，20为GA21峰值291bp；

图22是本申请实施例中内源基因Zein、MON88017、MON810、NK603、MIR604、MON863、GA21和BT11八重MLPA检测的毛细管电泳结果图，图中所示峰1-13为GeneScan^TM500LIZ Size Standard，片段分别为:100、139、150、160、200、250、300、340、350、400bp、450、490、500bp，14为Zein峰值91bp，15为MON810的峰值170bp，16为NK603峰值191bp，17为MON863峰值211bp，18为MON88017峰值251bp，19为MIR604峰值271bp，20为GA21峰值291bp，21为BT11峰值309bp；

图23是本申请实施例中内源基因Zein、MON88017、MON810、NK603、MIR604、MON863、GA21、BT11和品系59122九重MLPA检测的毛细管电泳结果图，图中所示峰1-13为GeneScan^TM500LIZ Size Standard，片段分别为:100、139、150、160、200、250、300、340、350、400bp、450、490、500bp，14为Zein峰值91bp，15为MON810的峰值170bp，16为NK603峰值191bp，17为MON863峰值211bp，18为MON88017峰值251bp，19为MIR604峰值271bp，20为GA21峰值291bp，21为BT11峰值309bp，22为59122峰值330bp；

图24是本申请实施例中内源基因Zein、MON88017、MON810、NK603、MIR604、MON863、GA21、BT11、品系59122和TC1507十重MLPA检测的毛细管电泳结果图，图中所示峰1-13为GeneScan^TM500LIZ Size Standard，片段分别为:100、139、150、160、200、250、300、340、350、400bp、450、490、500bp，14为Zein峰值91bp，15为TC1507峰值109bp，16为MON810的峰值170bp，17为NK603峰值191bp，18为MON863峰值211bp，19为MON88017峰值251bp，20为MIR604峰值271bp，21为GA21峰值291bp，22为BT11峰值309bp，23为59122峰值330bp；

图25是本申请实施例中内源基因Zein、MON88017、MON810、NK603、MIR604、MON863、GA21、BT11、品系59122、TC1507和BT176十一重MLPA检测的毛细管电泳结果图，图中所示峰1-13为GeneScan^TM500LIZ SizeStandard，片段分别为:100、139、150、160、200、250、300、340、350、400bp、450、490、500bp，14为Zein峰值91bp，15为TC1507峰值109bp，16为BT176峰值128bp，17为MON810的峰值170bp，18为NK603峰值191bp，19为MON863峰值211bp，20为MON88017峰值251bp，21为MIR604峰值271bp，22为GA21峰值291bp，23为BT11峰值309bp，24为59122峰值330bp；

图26是本申请实施例中内源基因Zein、MON88017、MON810、NK603、MIR604、MON863、GA21、BT11、品系59122、TC1507、BT176和T25十二重MLPA检测的毛细管电泳结果图，图中所示峰1-13为GeneScan^TM500LIZ SizeStandard，片段分别为:100、139、150、160、200、250、300、340、350、400bp、450、490、500bp，14为Zein峰值91bp，15为TC1507峰值109bp，16为BT176峰值128bp，17为T25峰值148bp，18为MON810的峰值170bp，19为NK603峰值191bp，20为MON863峰值211bp，21为MON88017峰值251bp，22为MIR604峰值271bp，23为GA21峰值291bp，24为BT11峰值309bp，25为59122峰值330bp；

图27是本申请实施例中内源基因Zein、MON88017、MON810、NK603、MIR604、MON863、GA21、BT11、品系59122、TC1507、BT176、T25和MON89034十三重MLPA检测的毛细管电泳结果图，图中所示峰1-13为GeneScan^TM500LIZSize Standard，片段分别为:100、139、150、160、200、250、300、340、350、400bp、450、490、500bp，14为Zein峰值91bp，15为TC1507峰值109bp，16为BT176峰值128bp，17为T25峰值148bp，18为MON810的峰值170bp，19为NK603峰值191bp，20为MON863峰值211bp，21为MON89034峰值230bp，22为MON88017峰值251bp，23为MIR604峰值271bp，24为GA21峰值291bp，25为BT11峰值309bp，26为59122峰值330bp。

具体实施方式

本申请的转基因玉米品系MLPA检测探针中，第一组探针针对转基因玉米品系TC1507设计，第二组探针针对品系Bt176设计，第三组探针针对品系T25设计，第四组探针针对品系NK603设计，第五组探针针对品系MON863设计，第六组探针针对品系MON89034设计，第七组探针针对品系MIR604设计，第八组探针针对品系GA21设计，第九组探针针对品系Bt11设计，第十组探针针对品系59122设计；各组探针分别用于特异性的检测其对应的转基因玉米品系。各组探针中，都包含长探针和短探针；长探针从5’端到3’端依次包括T2、UT、P2区段（图1），其中T2为与检测靶标序列匹配的检测区域，UT为与检测靶标序列无关的插入序列，P2为MLPA通用引物对的结合区域；短探针从5’端到3’端依次包括P1和T1区段，P1为MLPA通用引物对的结合区域，T1为与检测靶标序列匹配的检测区域。其中，UT区域为插入序列，可以理解，在长探针比较短的时候，比如本申请的第一组探针至第三组探针，其长探针中也可以没有插入序列，即不需要UT区域，仅有T2和P2区段。另外，也可以理解，在短探针本身序列不是很长的情况下，在短探针中也可以插入UT区域，从而使得长探针和短探针连接后达到要求的长度，即短探针从5’端到3’端依次包括P1、UT和T1区段；并且，短探针在插入UT区域后，只要短探针整体不大于100bp或120bp，都可以采用化学合成法直接合成。需要说明的是，此处小于100bp或者120bp是因为，一般的化学合成的DNA的长度为该长度，随着化学合成技术的发展，该长度可能会更长，即即便大于120bp也可以化学合成。

需要说明的是，由于MLPA长探针在与检测靶标序列杂交时，位于靶标序列的下游，因此需要对长探针5’端进行磷酸化修饰。并且，在不对称PCR中，最终扩增出的单链DNA产物，即长探针，是由非限定引物所引导的，所以，非限定引物的5’端进行了磷酸化修饰。

还需要说明的是，本申请中用于制备本申请的长探针的引物，其具体使用方法是本申请的发明人在专利公开号102399873A中公布的不对称PCR法。具体的，如图1所示，采用引物对以一个与检测靶标无关的模板进行不对称PCR扩增，将一段不影响靶标序列的MLPA检测的序列插入到长探针中，以满足制备不同长度的长探针的需求；不对称PCR中，非限定引物扩增出单链的产物，回收该单链的产物即获得长探针。

此外，可以理解，采用不对称PCR扩增制备长探针是为了获得较长序列的长探针；而短探针由于序列不是很长，所以可直接合成。本申请中，第一组探针、第二组探针和第三组探针中长探针的序列均小于100bp，可以直接采用化学合成，因此，无形采用不对称PCR方法制备，也没有相应的引物。

另外，本领域技术人员可以理解，如果长探针在与检测靶标序列杂交时，位于靶标序列的上游，则不需要对其5’端进行磷酸化修饰，其结构也会改变，即从5’端到3’端依次包括与MLPA通用引物结合区域、插入片段、特异性检测区域。同时，合成长探针的引物也会相应的改变。

本申请的长探针制备方法借鉴专利102399873A中的不对称PCR扩增方法，并且，本申请的对转基因玉米品系检测的探针，其设计的通用引物也是与专利102399873A中的序列相同的，因此，可以理解，在本申请的探针的基础上，结合专利102399873A中的探针，可以实现转基因玉米品系的更多重的检测。另外，也可以理解，在本申请的探针和引物的基础上，完全可以将其制备成粉剂或高浓度溶液，以作为试剂盒售卖。

本申请的一个实现方式中，不对称PCR扩增长探针的基本方法是，如图1所示，由T2和UT1区段构成的并且在5’端具有磷酸化修饰的非限定引物，和由P2’和UT2区段构成的限定引物，在不对称PCR时，两条引物的UT1或UT2分别与不对称PCR的模板，即PUC18质粒匹配，然后进行扩增，扩增产物中会产生一个双链的DNA和一个单链的DNA，然后采用酶切将双链的DNA消化，回收单链的DNA即本申请的长探针。

下面通过具体实施例并结合附图对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅仅对本申请进行进一步的说明，不应理解为对本申请的限制。

实施例1转基因玉米MLPA长探针的制备

1.材料和设备

（1）不对称PCR扩增反应试剂：10×高保真PCR缓冲液、2.5mmol/L的dNTP混合液、50mmol/L的MgSO4溶液、10μmol/L的上游引物、1μmol/L的下游引物、5U/μL的PlantinumTaq酶高保真DNA聚合酶、1ng/μL的PUC18质粒溶液、灭菌蒸馏水；

（2）电泳检测试剂：Takara DL500分子量标记、6×Loading Buffer、10mg/mL的溴化乙锭（EB）、琼脂糖、1×TAE缓冲液；

（3）PCR产物纯化试剂盒：QIAquick PCR Purification kit（QIAGEN）；

（4）凝胶回收试剂盒：QIAquick Gel Extraction kit（QIAGEN）；

（5）材料:转基因玉米品系MON810和MON88017；

（6）主要仪器设备：PCR仪（Biometra T）、电泳仪（BioRad300Xi型）、紫外交联仪（Spectronics，XJ-1000）、凝胶图像分析仪（CEE，GAS7001X）、微量紫外光分光光度计ND-3300（NANOdrop）、ABI3100测序仪。

2.MLPA检测探针的设计

本例中分别根据转基因玉米品系TC1507、Bt176、T25、NK603、MON863、MON89034、MIR604、GA21、Bt11和59122的设计了特异性的MLPA检测长探针和短探针。详见表1。

表1转基因玉米品系MLPA检测探针

其中，所有短探针均采用化学法直接合成，第一组探针至第三组探针的长探针也采用化学法直接合成，而第四组探针至第十组探针的长探针均采用不对称PCR扩增方法扩增制备。本例中，采用化学法直接合成的探针，均在宝生生物工程有限公司合成。

3.通用引物设计

在MLPA检测方法中，所有长探针中均设计有相同序列的通用引物结合区，所有短探针中也都设计了相同序列的通用引物结合区，以便采用一对引物，就可对所有的探针进行扩增。本例中，为了保持转基因玉米品系检测的统一性，借鉴本申请的发明人在另外一个专利102399873A中公布的通用引物序列。详见表2。

表2通用引物序列

引物名称	引物序列（方向为5’to3’）	Seq ID No.
			上游引物	GGGTTCCCTAAGGGTTGGA	21
下游引物	GCGCCAGCAAGATCCAATCTAGA	22

4.不对称PCR引物设计和合成

根据转基因玉米品系的特异性序列和PUC18质粒设计制备长探针的上游引物，使得上游引物的5’端为带有磷酸化修饰的与转基因玉米品系特异性序列互补配对的序列，3’端含有与PUC18质粒互补的序列；并根据MLPA检测的通用引物和PUC18质粒设计制备长探针的下游引物，使得下游引物的5’端含有MLPA通用引物结合的位点，3’端含有与PUC18质粒下游序列互补配合的序列。根据上述原理，本例分别设计了用于不对称PCR扩增制备转基因玉米品系NK603、MON863、MON89034、MIR604、GA21、Bt11和59122的MLPA长探针的引物对。引物序列详见表3。本例的引物均在宝生生物工程有限公司合成。

表3不对称PCR所用引物

5.不对称PCR扩增反应

（1）PCR反应液总体积50μL，其中包括：10×高保真PCR缓冲液5μL、2.5mmol/L的dNTP混合液4μL、50mmol/L的MgSO₄5μL、10μmol/L的上游引物25μL、1μmol/L的下游引物5μL、5U/μL的PlantinumTaq酶高保真DNA聚合酶0.4μL、1ng/μL的PUC18质粒1μL，然后加灭菌蒸馏水至反应液总体积50μL。

（2）PCR反应条件为，先94℃预变性1min，然后进入35个循环：94℃变性20sec、65℃退火30sec、72℃延伸20sec，循环完成后最后72℃延伸10min。

（3）PCR产物的纯化：PCR产物的纯化采用QIAGEN公司的QIAquick PCRPurification kit，参考试剂盒说明书，纯化步骤如下：

A）在PCR产物中加入PCR产物5倍体积的Buffer PBI，混合均匀；

B）将QIAquick column放入一个2mL的收集管；

C）将步骤A）的混合样品加入到QIAquick column中，离心30～60sec，弃滤液；

D）在经过步骤C）的QIAquick column中加入0.75mL Buffer PE，离心30-60sec，弃滤液，离心1min；

E）将QIAquick column转移到一个新的1.5mL的离心管上；

F）加入50μL Buffer AE洗脱，室温下放置1min，离心1min，收集滤液，即纯化的PCR产物。

6.MLPA长探针的获得

（1）酶切反应

采用HindⅢ限制性内切酶消化经过纯化的不对称PCR扩增产物，酶切反应液的总体积为50μL，其中包括：上述纯化的不对称PCR扩增产物44.75μL、10×HindⅢ缓冲液5μL、9U/μL的HindⅢ酶0.25μL。将上述酶切反应液混匀后，37℃恒温处理1h。

（2）电泳及切胶回收

采用3-4%的琼脂糖凝胶进行琼脂糖凝胶电泳约20～60min后，割取预期片段大小的DNA带，用QIAGEN公司提供的琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒（QIAquick Gel Extraction kit）回收DNA，参考试剂盒说明书，具体回收步骤如下：

A）切取含DNA片段的胶带，按1：6加入溶液QG（1mg凝胶加入300μL溶液）；

B）50℃水浴10-20min，涡旋2-3次；

C）加10μL3mol/L的NaAC，混匀；

D）按胶带（mg）：异戊醇（mL）比例1:1的量加入异戊醇；

E）将步骤D）的溶液转入QIAquick spin column中，13000rpm离心60sec；

F）弃滤液，再加500μL溶液QG到QIAquick spin column中，13000rpm离心60sec；

G）弃滤液，加750μL溶液PE至QIAquick spin column中，13000rpm离心30-60sec；

H）弃滤液，再13000rpm离心60sec；

I）将QIAquick spin column置于一个新的1.5mL的离心管中，加入50μL溶液EB或水，室温静置1min，8000rpm离心1min，即制备的MLPA长探针。

实施例2转基因玉米品系MLPA检测

1.MLPA检测条件和程序

MLPA检测的流程如图2所示，长探针和短探针先与检测靶标序列杂交复性，然后通过连接酶将长探针和短探针连接起来，最后采用通用引物进行PCR扩增，放大信号。

（1）模板与探针复性

先将各被检测基因的探针混合，使各探针的最终浓度为10fmol/μl。模板DNA按要检测的样品预先混合，先95℃变性5分钟后冷却到25℃，再加入混合探针。反应体系总体积4μl，其中包括DNA模板2μl，混合探针0.75μl，MLPA buffer0.75μl，ddH₂O0.5μl，先95℃变性1分钟，再60℃复性过夜。

（2）连接反应

在模板与探针复性后，采用连接酶将短探针和长探针连接起来。反应液总体积为20μL，其中包括，1.5μL的Ligase－65bufferA、1.5μL的Ligase－65bufferB、0.5μL的Ligase－65连接酶、12.5μL的灭菌蒸馏水，最后加入步骤（1）模板与探针复性的产物4μL。混匀反应液，在54℃下恒温反应15min，然后98℃处理5min灭活连接酶。

（3）PCR扩增反应

将上述步骤（2）的连接反应产物进行PCR扩增。反应液总体积为25μL，其中包括：SALSA PCR buffer2μL，步骤（2）连接反应的产物5μL，灭菌蒸馏水13μL，10pmol/μL的MLPA通用引物1μL，DNA聚合酶稀释缓冲液1μL，5U/μL的DNA聚合酶0.25μL，灭菌蒸馏水2.75μL。

PCR反应条件为，直接进入35次循环：95℃变性30s、60℃复性30s、72℃延伸60s，循环完成后72℃延伸20min。

（4）PCR产物

反应产物分别用QIAxcel全自动核酸毛细管分析仪和ABI公司ABI3100Sequence Analyzer片段分析功能分离。

2.单个靶标检测

采用本申请设计的第一组探针至第十组探针，分别对转基因玉米品系TC1507、Bt176、T25、NK603、MON863、MON89034、MIR604、GA21、Bt11和59122进行MLPA检测。同时，引入专利102399873A中公布的转基因玉米品系MON810和MON88017的探针，以及玉米内源基因Zein的探针，分别进行试验，具体序列见表4。其中，MON810和MON88017的长探针2-MON810和2-MON88017采用不对称PCR方法制备，不对称PCR的引物参见专利102399873A；其短探针和内源基因Zein的长探针和短探针均采用化学合成法直接合成。

表4转基因玉米品系MON810和MON88017、内源基因Zein的探针

检测结果如图3-图15，结果显示，本申请的MLPA探针能够特异性的检测出相应的靶标序列，而对其它品系没有检测信号，比如品系TC1507的探针仅能检测出TC1507品系，而对其它品系没有检测信号，具有很好的特异性。

3.多重靶标检测

采用本申请的探针以及转基因玉米品系MON810和MON88017的探针、内源基因Zein的探针分别进行多重靶标检测，检测靶标设计如表5所示。其中，检测所用的探针与检测对象相对应。

表5多重靶标检测

检测结果如图16-27所示，各多重检测中均有特异性的检测出其靶标序列，可见，本申请的探针不仅具有良好的特异性，还能够与其它探针组合有效的进行多靶标检测。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护范围。

Claims

1.一种转基因玉米品系MLPA检测的探针，其特征在于：所述探针包括第一组探针至第十组探针中的至少一组，每组探针中分别含有长探针和短探针，长探针的5’端具有磷酸化修饰；

第一组探针的短探针含有Seq ID No.1所示序列，长探针含有Seq ID No.2所示序列；

第二组探针的短探针含有Seq ID No.3所示序列，长探针含有Seq ID No.4所示序列；

第三组探针的短探针含有Seq ID No.5所示序列，长探针含有Seq ID No.6所示序列；

第四组探针的短探针含有Seq ID No.7所示序列，长探针含有Seq ID No.8所示序列；

第五组探针的短探针含有Seq ID No.9所示序列，长探针含有Seq ID No.10所示序列；

第六组探针的短探针含有Seq ID No.11所示序列，长探针含有Seq ID No.12所示序列；

第七组探针的短探针含有Seq ID No.13所示序列，长探针含有Seq ID No.14所示序列；

第八组探针的短探针含有Seq ID No.15所示序列，长探针含有Seq ID No.16所示序列；

第九组探针的短探针含有Seq ID No.17所示序列，长探针含有Seq ID No.18所示序列；

第十组探针的短探针含有Seq ID No.19所示序列，长探针含有Seq ID No.20所示序列。

2.根据权利要求1所述的探针，其特征在于：所述第一组探针至第十组探针依序为检测转基因玉米品系TC1507、Bt176、T25、NK603、MON863、MON89034、MIR604、GA21、Bt11和59122的探针。

3.一种转基因玉米品系的MLPA检测方法，其特征在于：采用权利要求1或2所述的探针以受检样品的DNA为模板进行杂交。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：还包括采用一对通用引物对杂交后连接起来的长探针和短探针进行PCR扩增，所述通用引物的上游/下游引物分别含有Seq ID No.21和Seq ID No.22所示序列。

5.一种制备权利要求1或2所述的长探针的引物，其特征在于：所述引物包括第一引物组至第七引物组中的至少一组，每个引物组中分别含有非限定引物和限定引物，非限定引物的5’端具有磷酸化修饰；

第一引物组的非限定引物含有Seq ID No.23所示序列，限定引物含有Seq IDNo.24所示序列；

第二引物组的非限定引物含有Seq ID No.25所示序列，限定引物含有Seq IDNo.26所示序列；

第三引物组的非限定引物含有Seq ID No.27所示序列，限定引物含有Seq IDNo.28所示序列；

第四引物组的非限定引物含有Seq ID No.29所示序列，限定引物含有Seq IDNo.30所示序列；

第五引物组的非限定引物含有Seq ID No.31所示序列，限定引物含有Seq IDNo.32所示序列；

第六引物组的非限定引物含有Seq ID No.33所示序列，限定引物含有Seq IDNo.34所示序列；

第七引物组的非限定引物含有Seq ID No.35所示序列，限定引物含有Seq IDNo.36所示序列。

6.根据权利要求5所述的引物，其特征在于：所述第一引物组至第七引物组依序为制备第四组探针至第十组探针的长探针的引物组。

7.一种用于转基因玉米品系MLPA检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有权利要求1或2所述的探针。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有一对通用引物，所述通用引物的上游/下游引物分别含有Seq ID No.21和Seq ID No.22所示序列。

9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有DNA杂交缓冲液、DNA连接酶和PCR反应缓冲液中的至少一种。

10.一种用于制备权利要求1或2所述的长探针的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有权利要求5或6所述的引物。