CN103642922A - Pna检测母体血液中的循环胎儿dna的应用及方法 - Google Patents

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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Abstract

本发明公开了PNA在检测母体血液中的循环胎儿DNA上的应用及一种用PNA检测母体血液中的循环胎儿DNA的方法，其步骤包括：（1）针对待测基因设计合成引物序列及相对应的PNA序列；（2）提取母体样品中的DNA；（3）酶切；（4）扩增，以酶切后的DNA作为模板，加入引物及PNA进行扩增，检测扩增结果。本发明选择了仅对非甲基化DNA起作用的限制性内切酶，并设计引物序列及PNA序列，本发明方法可以选择性的扩增母体血液中的循环胎儿DNA而将母体DNA的影响排除，达到快速、灵敏的检测母体血液中的循环胎儿DNA的目的。

Description

PNA检测母体血液中的循环胎儿DNA的应用及方法
技术领域
本发明涉及到PNA在检测母体血液中的循环胎儿DNA上的应用及PNA检测母体血液中的循环胎儿DNA的方法。
背景技术
1997年Lo等人发现胎儿DNA会在母体血液中循环，由于其潜在的诊断应用前景，引起了很多科研人员的兴趣。循环胎儿DNA已经被用于非侵入性产前评估胎儿的遗传性状,如胎儿性别评估、胎儿恒河猴D因子检测、发现来自父亲的基因突变等等。 
 人们进行了无数次研究，以探讨其生物学机理，开发新的方法对其进行检测。几种方法，如常规方法、嵌套法、实时法、荧光PCR法均能在胎儿DNA不是特别富集的情况下对循环胎儿DNA进行分析。最近，一些新的先进技术也用在了分析循环胎儿DNA上，例如MALDI-TOF质谱分析技术和微芯片。但是，由于母体血液中存在高背景的母体DNA，而理想的循环胎儿DNA的分析需要高灵敏度和特异性，因此，直到现在，也没有一个方法能同时满足快速、灵敏的要求。
此外，目前缺乏普遍性的标记用来评价女性胎儿的循环胎儿DNA。目前，人们发现母体血液中的循环胎儿DNA中的maspin基因表现为低甲基化，并通过对DNA样品进行亚硫酸氢转换后通过实时甲基化限制PCR（MSP）来分析循环胎儿DNA，但是DNA样品进行亚硫酸氢转换耗时长、需要的DNA量大（通常100ng-1mg），而且需要设计特别的引物。
肽核酸(PNA)是具有类多肽骨架的DNA类似物，PNA的主链骨架是由N(2-氨基乙基)-甘氨酸与核酸碱基通过亚甲基羰基连接而成的。PNA可以特异性地与DNA或RNA杂交，形成稳定的复合体。PNA有3个特点：1、PNA与DNA的结合能力胜于DNA与DNA的结合能力；2、DNA/PNA双链比DNA/DNA双链的稳定性高；3、PNA对核酸酶的抗性高。由于PNA不能作为PCR引物，因此， PNA-PCR主要用于点突变的基因检测，它能与未突变的基因完美结合，阻止引物与未突变的基因结合，与突变的基因则不能结合，但引物可与突变的基因结合，从而扩增。
发明内容
本发明的目的是提供一种能快速、灵敏的检测出母体血液中的循环胎儿DNA的方法。
本发明提供了PNA在检测母体血液中的循环胎儿DNA上的应用。
本发明还提供了一种用PNA检测母体血液中的循环胎儿DNA的方法，其步骤包括：
（1）、针对待测基因设计合成引物序列及相对应的PNA序列，在引物及PNA序列中包括限制性内切酶位点，所述限制性内切酶为仅对非甲基化DNA起作用的限制性内切酶，且待测基因内有该酶的特异性位点，所述待测基因选取在母体表现为非甲基化DNA，在胎儿表现为甲基化DNA的基因；
（2）、提取母体样品中的DNA；
（3）、将提取的DNA酶切；
（4）、扩增，以酶切后的DNA作为模板，加入引物及PNA进行扩增，检测扩增结果。
作为本发明优选的技术方案，步骤（1）中待测基因为Maspin，其中引物序列为：
Maspin-PF0：5’-TGTCTGAGA AATTTGTAGTGTTAC-3’ （SEQ ID NO：1）
Maspin-PR0：5’-G TACAGACAT GCG TAC GGC-3’ （SEQ ID NO：2）
PNA序列为：
Maspin-PNA-F：5’-H2N-CCAACG TGTCTGAGA-Lys-CONH2-3’ （SEQ ID NO：3）
Maspin-PNA-R ：5’-H2N-CATACG TACAGACAT-Lys-CONH2-3’ （SEQ ID NO：4）
 步骤（3）中限制性内切酶为HpyCH4。
作为本发明优选的技术方案，步骤（1）中引物序列也可以为：
Maspin-PF1: 5’-G TGTCAGAGA AATTTGTAGTGTTAC-3’ （SEQ ID NO：5）
Maspin-PR1: 5’- G TACAAACAT GCG TAC GGC-3’ （SEQ ID NO：6）或者5’- CG TACAAACAT GCG TAC GGC-3’ （SEQ ID NO：7）。
作为本发明优选的技术方案，步骤（4）中所述检测扩增结果的方法为凝胶电泳后紫外光检测。
作为本发明优选的技术方案，步骤（1）中还设计有Maspin 的TaqMan-MGB探针，其序列为：
TaqMan-MGB-Maspin：5’- CGAATATTTCACCTTCC-3’，其中5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团，步骤（4）中以酶切后的DNA作为模板，加入引物、PNA及TaqMan-MGB-Maspin进行荧光定量PCR。
作为本发明优选的技术方案，所述荧光基团为6-FAM，淬灭基团为MGB。
本发明选取在母体表现为非甲基化DNA，在胎儿表现为甲基化DNA的基因，并选用仅对非甲基化DNA起作用的限制性内切酶，并设计引物序列及PNA序列，使引物序列及PNA序列包括限制性内切酶的酶切位点，由于PNA的严格匹配，PNA将不会与被酶切的DNA结合，而引物则可与被酶切的DNA结合，从而将其扩增，而不被酶切的DNA则被PNA结合，使得引物不能再结合上去，从而不会被扩增，因此本发明方法可以选择性的扩增母体血液中的循环胎儿DNA而将母体DNA的影响排除，达到快速、灵敏的检测母体血液中的循环胎儿DNA的目的。
附图说明
图1为本发明原理图。
图2为实时荧光定量PCR检测结果图，其中PLN指胎盘DNA，BC指母体白细胞DNA。
图3为PCR产物电泳图，其中泳道1、14：DNA标准物；
泳道2、8：空白对照；
泳道3、9：孕妇1的产后血浆DNA（阴性对照）；
泳道4、10：孕妇2的产后血浆DNA（阴性对照）；
泳道5、11：胎盘DNA；
泳道6、12：孕妇1的怀孕12周血浆DNA；
泳道7、13：孕妇2的怀孕12周血浆DNA；
泳道2-7中没有添加PNA，8-13中加入了PNA。
具体实施方式
下列实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：试验手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。
实施例一：
1、引物设计及合成：在maspin 基因启动子的–247 及–135处存在HpyCH4的酶切位点CpG位点，根据这两个位点分别设计引物的上游及下游序列，其序列为：
Maspin-PF0：5’-TGTCTGAGA AATTTGTAGTGTTAC-3’ （SEQ ID NO：1）
Maspin-PR0：5’-G TACAGACAT GCG TAC GGC-3’ （SEQ ID NO：2）
PNA序列为：
Maspin-PNA-F：5’-H2N-CCAACG TGTCTGAGA-Lys-CONH2-3’ （SEQ ID NO：3）
Maspin-PNA-R ：5’-H2N-CATACG TACAGACAT-Lys-CONH2-3’ （SEQ ID NO：4）
其中引物及PNA的上游序列相同的序列为TGTCTGAGA，下游序列相同的序列为TACAGACAT。在maspin 基因启动子的–247至–135之间选取特异性序列设计TaqMan-MGB-Maspin，其序列为：
TaqMan-MGB-Maspin：5’- CGAATATTTCACCTTCC-3’，其中5’标记6-FAM，3’标记MGB。
2、样本收集和DNA准备：怀孕妇女样本从威尔斯亲王医院妇产科招募取得，在剖腹产前收集其外周血样本，在剖腹产后收集其胎盘样本。
离心收集外周血细胞（主要是白细胞），然后用血细胞核酸DNA提取试剂盒提取DNA，该试剂盒购自英国GE医疗集团，用QIAamp组织试剂盒从胎盘组织中提取DNA，该试剂盒购自德国Qiagen公司。
3、酶切：限制性内切酶采用HpyCH4，酶切体系的buffer采用PH值为8.0的NEB buffer 1，酶切体系在37 oC放置2h，然后迅速加热到65 oC放置20min以终止反应。
4、PCR：实时荧光定量PCR采用美国AB公司的ABI PRISM 7900仪器，探针由美国AB公司合成，引物、PNA由美国IDT公司合成，50mL的反应体系中包括1ng的DNA模板，50 nmol/L的探针和250 nmol/L的引物。反应体系在50 oC、2min；95 oC、10min；然后95 oC、30sec，再57 oC 、1 min进行45个循环。每个样本的实时荧光定量PCR至少重复一次，结果分析使用美国AB公司的序列检测软件V2.1，结果见图2。可以看出，未加入PNA进行PCR扩增的情况下，母体白细胞DNA及胎盘DNA在PCR过程中均能大量扩增，在PCR体系中加入PNA后，母体白细胞DNA的扩增基本被抑制，而胎盘DNA能大量扩增。
    实施例二：
    步骤1、
引物设计成Maspin-PF1: 5’-G TGTCAGAGA AATTTGTAGTGTTAC-3’ （SEQ ID NO：5）
Maspin-PR1: 5’- G TACAAACAT GCG TAC GGC-3’ （SEQ ID NO：6）或者5’- CG TACAAACAT GCG TAC GGC-3’ （SEQ ID NO：7）；
PNA序列为：
Maspin-PNA-F：5’-H2N-CCAACG TGTCTGAGA-Lys-CONH2-3’ （SEQ ID NO：3）
Maspin-PNA-R ：5’-H2N-CATACG TACAGACAT-Lys-CONH2-3’ （SEQ ID NO：4）
步骤2、样本收集和DNA准备：怀孕妇女样本从威尔斯亲王医院妇产科招募取得，在剖腹产前、后收集其外周血样本，样本处理与实施例1一致。
步骤3与实施例1的步骤3一致。
步骤4、，PCR体系在95 oC、 30 s； 56 oC、 30 s ，然后 72 oC、 30 s，循环32次；对PCR产物凝胶电泳后观察结果，其结果见图3，可以看出，HpyCH4酶切后，在没有添加PNA的情况下，所有样本都成功扩增出PCR产物；而在加入了PNA的情况下，孕妇产后的血浆中已经没有胎儿DNA，故不能实现扩增，而孕中的血浆DNA中由于存在胎儿的DNA，因此胎儿DNA被选择性的扩增。
 
<110>  
<120>  PNA检测母体血液中的循环胎儿DNA的应用及方法
<130>
<160>  8  
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  24
<212>  DNA
<213> 人工序列
<400>1
tgtctgagaa atttgtagtg ttac                                                                 24
<210>  2
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  2
gtacagacat gcgtacgc                                                                        18
<210>  3
<211>  15
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  3
ccaacgtgtc tgaga                                                                              15
<210>  4
<211>  15
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  4
catacgtaca gacat                                                                            15
<210>  5
<211>  25
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  5
gtgtcagaga aatttgtagt gttac                                                              25
<210>  6
<211>  19
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  6
gtacaaacat gcgtacggc                                                                     19
<210>  7
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  7
cgtacaaaca tgcgtacggc                                                                       20
<210>  8
<211>  17
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  8
cgaatatttc accttcc                                                                           17

Claims (7)

1.PNA在检测母体血液中的循环胎儿DNA上的应用。
2.一种用PNA检测母体血液中的循环胎儿DNA的方法，其步骤包括：
（1）、针对待测基因设计合成引物序列及相对应的PNA序列，在引物及PNA序列中包括限制性内切酶位点，所述限制性内切酶为仅对非甲基化DNA起作用的限制性内切酶，且待测基因内有该酶的特异性位点，所述待测基因选取在母体表现为非甲基化DNA，在胎儿表现为甲基化DNA的基因；
（2）、提取母体样品中的DNA；
（3）、将提取的DNA酶切； 
（4）、扩增，以酶切后的DNA作为模板，加入引物及PNA进行扩增，检测扩增结果。
3.根据权利要求2所述的PNA检测母体血液中的循环胎儿DNA的方法，其特征在于： 
步骤（1）中待测基因为Maspin，其中引物序列为：
Maspin-PF0：5’-TGTCTGAGA AATTTGTAGTGTTAC-3’ （SEQ ID NO：1）
Maspin-PR0：5’-G TACAGACAT GCG TAC GGC-3’ （SEQ ID NO：2）
PNA序列为：
Maspin-PNA-F：5’-H2N-CCAACG TGTCTGAGA-Lys-CONH2-3’ （SEQ ID NO：3）
Maspin-PNA-R ：5’-H2N-CATACG TACAGACAT-Lys-CONH2-3’ （SEQ ID NO：4）
 步骤（3）中限制性内切酶为HpyCH4。
4.根据权利要求3所述的PNA检测母体血液中的循环胎儿DNA的方法，其特征在于：步骤（1）中引物序列也可以为：
Maspin-PF1: 5’-G TGTCAGAGA AATTTGTAGTGTTAC-3’ （SEQ ID NO：5）
Maspin-PR1: 5’- G TACAAACAT GCG TAC GGC-3’ （SEQ ID NO：6）或者5’- CG TACAAACAT GCG TAC GGC-3’ （SEQ ID NO：7）。
5.根据权利要求3或4所述的PNA检测母体血液中的循环胎儿DNA的方法，其特征在于：步骤（4）中所述检测扩增结果的方法为荧光定量PCR。
6.根据权利要求3或4所述的PNA检测母体血液中的循环胎儿DNA的方法，其特征在于：步骤（1）中还设计有Maspin 的TaqMan-MGB探针，其序列为：
TaqMan-MGB-Maspin：5’- CGAATATTTCACCTTCC-3’ （SEQ ID NO：8），其中5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团，步骤（4）中以酶切后的DNA作为模板，加入引物、PNA及TaqMan-MGB-Maspin进行荧光定量PCR。
7.根据权利要求6所述的PNA检测母体血液中的循环胎儿DNA的方法，其特征在于：所述荧光基团为6-FAM，淬灭基团为MGB。
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