CN101809171A - 原位杂交以检测rna和dna标记 - Google Patents

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Abstract

本发明提供在第二探针特异性结合靶细胞的染色体DNA的条件下特异性结合靶细胞，例如胎儿细胞的mRNA从而能目测观察该靶细胞的探针、试剂盒和方法。

Description

原位杂交以检测RNA和DNA标记
相关申请的交叉引用
本申请要求2007年8月3日提交的名为“In-situ Hybridization to DetectRNA and DNA Markers(原位杂交以检测RNA和DNA标记)”的美国临时专利申请序列号60/953,812的优先权。
发明背景
胎儿细胞生物标记基本上有两类；胎儿细胞表面抗原及胞质蛋白的抗体，和优先在胎儿细胞而非母体细胞中表达的基因的基因表达标记。抗体标记可作直接或间接标记，采用荧光技术目测观察。然而，该方法的两个主要问题是血红素的自发荧光干扰抗体结合阳性染色的胎儿细胞的荧光信号；和通常与母体细胞上的抗原交叉反应的抗体的非特异性，这种非特异性产生极大的背景(信号)从而严重干扰胎儿细胞产生的信号。基因表达标记本身也有问题-所靶向的RNA通常不稳定，因此不能用于结合配体。
目测观察胎儿细胞的目前已知方法包括染色该细胞。用于此目的的染色剂有干扰，从而对于采用荧光原位杂交(FISH)作进一步分析造成了问题。
需要开发更多方法，例如非侵入性方法来检测胎儿细胞，特别是胎儿细胞相关的遗传学和/或基因标记。
发明概述
本发明部分依据发现可以在同一细胞中，特别是在允许原位检测RNA标记以及DNA标记的条件下检测RNA标记以及DNA标记。因此，本发明提供可用于检测RNA和DNA标记以及与之相关的遗传学疾病的探针、试剂盒和方法。
本发明的一个实施方式提供检测细胞中mRNA和染色体DNA的方法。该方法包括第一探针和第二探针与含有一种或多种靶细胞的生物学样品原位杂交。所述杂交在允许所述第一探针与靶细胞中其mRNA靶标特异性杂交，而所述第二探针与靶细胞中其染色体DNA靶标特异性杂交的条件下发生。所述第一探针与其mRNA靶标之间形成的双链体的Tm通常是至少约80℃。或者，所述第一探针的GC含量至少约40％。
本发明的另一实施方式提供检测胎儿的遗传学疾病的方法。该方法包括使第一探针和第二探针与含有胎儿的一种或多种胎儿细胞的生物学样品原位杂交。所述杂交在允许所述第一探针与胎儿细胞中其mRNA靶标特异性杂交，而所述第二探针与胎儿细胞中其染色体DNA靶标特异性杂交的条件下发生。所述第一探针与其mRNA靶标之间形成的双链体的Tm通常是至少约80℃，或者，所述第一探针的GC含量至少约40％。所述第一探针与其mRNA靶标和所述第二探针与其染色体DNA靶标的杂交表示胎儿的遗传学疾病。
本发明还有另一实施方式提供与胎儿细胞中mRNA靶标特异性杂交的探针。
本发明的另一实施方式提供装有本发明探针的试剂盒。
附图简述
图1显示了探针与细胞中mRNA的原位杂交以及对结合有mRNA的探针的检测。
图2显示了包含在特异性结合mRNA靶标的探针中的示范性修饰核苷酸。
图3是本发明示范性探针和它们某些特征的清单。小写字母表示正常的DNA碱基，而大写字母表示锁定核酸(LNA)碱基。
图4是原位mRNA杂交和随后检测胎儿细胞的示范性流程图。
图5A和5B是mRNA和FISH双阳性的胎儿细胞的荧光图。图5A表示用DIG标记的ε-mRNA-探针染色4个胎儿nRBC，其中所述DIG结合于抗-DIG-单克隆抗体与德克萨斯-红的偶联物。图5B表示用DAPI染色后4个相同nRBC的FISH信号。
图6A和6B是mRNA和FISH双阳性的胎儿细胞的荧光图。图6A表示3个ε-mRNA-探针染色的胎儿nRBC，而图6B显示用DAPI染色后3个相同细胞的FISH XY信号。
发明详述
本文所用的以下术语应具有以下意义：
术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”具有相同的意义并且可在通篇互换使用。它们指由2个以上核苷酸亚单位从5’-端向3’-端共价连接在一起而构成的单链、定向核苷酸聚合物。
本说明书用于指代包含特定核碱基序列的多核苷酸或核酸的缩写是常规的单字母缩写。因此，当包含在多核苷酸中时，最常见的天然产生编码核碱基缩写成：腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)。除非另有指定，以一系列单-字母缩写表示单链核酸序列。
当两条序列中的一条与另一条以反平行的意义杂交从而形成“双链体”或“双链”时，称该两条序列“互补”，其中各序列的3’-端结合另一序列的5’-端，而一条序列的A、T(U)、G和C分别与另一序列的T(U)、A、C和G各自配对。
参考文献中全面解释了本领域技术人员已知的分子生物学和核酸化学的常规技术。参见，例如Sambrook等，1989，Molecular Cloning--A LaboratoryManual(分子克隆-实验室手册)，冷泉港实验室，冷泉港，纽约；Oligonucleotide Synthesis(寡核苷酸合成)(M.J.Gait编.，1984)；和NucleicAcid Hybridization(核酸杂交)(B.D.Hames和S.J.Higgins编，1984)。
本发明部分依据发现可以在同一细胞中，特别是在允许原位检测RNA标记以及DNA标记的条件下检测RNA标记以及DNA标记。因此，本发明提供可用于检测RNA和DNA标记以及与之相关的遗传学疾病的探针、试剂盒和方法。
本发明一方面提供在检测条件下，例如允许原位形成稳定的RNA/探针双链体以及DNA/探针双链体的条件下，通过杂交探针检测同一细胞中的一种或多种RNA标记以及DNA标记的方法。
根据本发明，这种检测条件包括使得探针杂交，例如原位杂交其各自RNA和DNA靶标的任何合适手段。在一个实施方式中，本发明的检测条件包括利用能在DNA标记的FISH试验所需的变性条件下，形成热稳定RNA/探针双链体的RNA标记的探针。例如，这种探针可以是Tm至少为70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、85℃或90℃的探针。在另一实施方式中，这种探针可以是GC含量至少为20％、25％、30％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、70％或75％的探针。
本发明探针通常可以是具有修饰的和/或非修饰核(苷)酸的任何寡核苷酸或多核苷酸。例如，本发明探针可包含修饰的和/或非修饰脱氧核苷酸或核糖脱氧核苷酸。示范性的修饰核酸包括但不限于：锁定核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、含有2’-OMe核苷酸的核酸、含有膦酸甲酯的核酸、含有硫代磷酸酯的核酸和含有吗啉子基的核酸。
与非修饰的核酸相比，修饰的核酸与其互补核酸的相互作用通常更稳定。因此，本发明探针中所含修饰核酸的程度取决于探针的稳定性要求，例如热稳定性要求等因素。在一个实施方式中，本发明探针是嵌合型探针，包含脱氧核苷酸或核糖脱氧核苷酸以及修饰的脱氧核苷酸或核糖脱氧核苷酸。在另一实施方式中，修饰的核酸位于本发明探针的一端或两端。在还有另一实施方式中，修饰的核酸位于本发明探针的始终。在还有另一实施方式中，本发明探针含有约10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或80％的修饰核酸。在还有另一实施方式中，本发明探针含有约10％、15％、20％、25％、30％、35％或40％的修饰核酸。
本发明探针的长度可根据其靶标和影响本发明检测条件的其它因素而有所不同。在一个实施方式中，本发明探针针对RNA标记，其长度是约10个核苷酸-约50、100、200、300或400个核苷酸。在另一实施方式中，本发明探针针对RNA标记，其长度是约20个核苷酸-约25、26或27个核苷酸。在还有另一实施方式中，本发明探针针对RNA标记，其长度是约30个核苷酸-约40、45或46个核苷酸。针对DNA标记，例如核DNA标记的本发明探针通常可以是适于FISH试验的任何探针，例如用于FISH检测遗传基因座的任何探针混合物。
通常用可检测实体直接或间接标记本发明探针。例如，可以在末端，例如在一端或两端，或者在内部，例如在整个探针上标记本发明探针。在一个实施方式中，可利用通过任何机制，例如通过激发-发射机制或化学发光机制而发光的直接或间接可检测实体标记本发明探针。在另一实施方式中，用直接标记物标记本发明探针，所述直接标记物选自但不限于：荧光素；Cy3；Cy5；Cy7；德克萨斯红；StarBright绿；StarBright橙；罗丹明绿；俄勒冈绿(OregonGreen)；氟硼荧(bodipy)荧光团；发射350-750am荧光的Alexa荧光染料；和它们的组合。
在还有另一实施方式中，用间接标记物标记本发明探针，所述间接标记物选自但不限于：洋地黄毒苷；生物素；荧光黄；二硝基苯(DNP)；酶分子，例如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、荧光素酶或半乳糖苷酶；丹酰基；和它们的组合。可用链霉亲和素(对于生物素化探针)或与荧光团相偶连的抗体(例如，用于洋地黄毒苷探针的抗-DiG-抗体)目测观察这种探针。类似地，如果用酶分子标记探针，可利用合适的酶荧光底物目测观察这种探针。
按照本发明，这种探针可与其靶标完美匹配，或者对于其靶标可含有一个或多个错配，例如1％、2％、3％、4％或5％的错配。针对DNA标记的本发明探针通常是用于遗传标记或基因座的FISH试验的探针混合物。对于针对RNA标记的本发明探针，其可靶向任何RNA标记，例如表示靶细胞的起源、性质、身份或阶段的RNA标记。
在一个实施方式中，本发明探针包括靶向胎儿细胞中一种或多种RNA标记以及DNA标记，例如遗传标记或基因座的探针。在另一实施方式中，本发明探针包括针对胎儿细胞中RNA标记的探针以及针对遗传学疾病相关DNA标记的探针。在还有另一实施方式中，本发明探针包括针对胎儿某些发育阶段的相关RNA标记，例如通常在7-11周龄胎儿中表达的ε-或ζ-血红蛋白mRNA或通常在11周以上胎儿中表达的γ-血红蛋白mRNA的探针。在还有另一实施方式中，本发明探针包括针对胞质内mRNA标记的探针，所述标记能用于细胞的细胞学和形态学鉴定。在还有另一实施方式中，本发明探针包括针对在某些妊娠期，即在第一、第二或第三个三月期间表达的mRNA标记的探针。在还有另一实施方式中，本发明探针包括针对妊娠第一个三个月期胎儿中表达的mRNA标记的探针。在还有另一实施方式中，本发明探针包括针对妊娠约第5、6或7周-约第11、12或13周之间胎儿表达的mRNA标记的探针。
胎儿细胞的示范性RNA标记包括但不限于：ε-血红蛋白mRNA；ζ-血红蛋白mRNA；γ-血红蛋白mRNA；Y染色体特异性锌指蛋白mRNA(ZFY-mRNA)；胎儿甲胎蛋白(AFP)mRNA；γ-谷氨酰-转肽酶(GGT)mRNA；人胎盘催乳素1、2、3和4(hPL，aka PLAC-1-4)mRNA；妊娠相关血浆蛋白-A(PAPP-A)mRNA；促肾上腺皮质素释放因子(CRH)mRNA；组织因子通道抑制剂2(TFPI-2)mRNA；KISS-1转移-抑制剂mRNA；和PLAC-1mRNA；妊娠特异性β-1-糖蛋白-2、3、4、5、6、7和9mRNA；绒毛膜生长催乳激素2和变体(v1、v2、v3、v4、v5)mRNA；生长激素变体mRNA；α-解聚素和金属蛋白酶结构域变体mRNA；二肽基肽酶7mRNA；衰老关键蛋白(fibulin)mRNA；s100钙结合蛋白mRNA；前列腺分化因子mRNA；和细胞色素P450，亚家族xix mRNA。针对胎儿细胞的RNA标记的本发明示范性探针包括但不限于：包含选自SEQ ID NO.1-40的核酸序列的探针。
按照本发明，针对RNA标记的本发明探针可在针对DNA标记的探针的同时或之后与其靶标杂交，例如，RNA标记的探针可在DNA标记的探针杂交其靶标之前、期间和/或之后与其靶标杂交。针对RNA标记和DNA标记的本发明探针通常可在相同条件下处理，例如，它们可在相同的变性、杂交和洗涤条件下与其靶标杂交。在一个实施方式中，在RNA标记的一种或多种探针能与其RNA靶标杂交并维持，同时一种或多种探针与其DNA靶标杂交的条件下发生杂交。
按照本发明的另一实施方式，本发明的检测条件包括杂交条件、洗涤条件、洗涤缓冲液、细胞固定、变性条件等相关条件中的一种或组合。在一个实施方式中，本发明的检测条件包括在约30℃、35℃、37℃-约45℃、50℃、55℃、60℃或65℃温度下最少杂交至少1、2、3、4、5或6个小时。在另一实施方式中，本发明的检测条件包括严谨性较低的杂交后洗涤过程，例如低温洗涤(例如，从室温到约80℃不等)，利用1X或2X SSC的洗涤溶液，和含或不含常规使用洗涤剂及任选约25％到约75％甲酰胺。
在还有另一实施方式中，本发明检测条件包括杂交前固定细胞，例如至少15、20、25、30、35或40分钟。例如，可在约25℃-约37℃，用PBS配制的约1％-约4％低聚甲醛处理细胞约30-约60分钟。在另一例子中，可在约室温下，用PBS配制的约4％低聚甲醛处理细胞至少30分钟。在还有另一例子中，初步处理后，可在约25℃-约37℃，任选用约0.01％-约1％Triton X-100处理细胞约2-约30分钟以使它们透化。在还有另一例子中，可在各种条件下(例如，pH 2-7)，用约0.01％-约5％蛋白酶K处理一段时间以使细胞透化。
在还有另一实施方式中，本发明检测条件包括利用一种或多种封闭剂以防止或降低非特异性杂交。例如，通常可在检测探针与其靶标杂交之前进行该步骤。能防止或尽量减少非特异性背景杂交检测的任何化合物适合该目的。试剂的示范性清单包括但不限于：BSA、酪蛋白、皮尔斯公司的超级封闭剂(Perice’sSuperblock)和Fc封闭剂。
根据本发明，可在生物学样品的任何靶细胞中实施检测RNA以及DNA标记的本发明方法。在一个实施方式中，生物学样品是细胞或，例如怀疑或可能含有一种或多种靶细胞的组织样品。在另一实施方式中，生物学样品是体液，包括但不限于：血液、血浆、血清、唾液、尿液、脊髓液、骨髓或宫颈粘膜样品。在另一实施方式中，生物学样品是可能或怀疑含有肿瘤细胞，例如一种或多种肿瘤或癌细胞的任何样品。
在还有另一实施方式中，靶细胞是胎儿的细胞，例如nRBC、淋巴细胞、营养细胞等，生物学样品是含有一种或多种胎儿细胞的胎儿的母体宿主的样品。已知或后来发现含有胎儿细胞的任何母体宿主样品可用于本发明。例如，可用作胎儿细胞来源的母体宿主样品包括但不限于：血液、血浆、血清、唾液、尿液或宫颈粘膜样品。
在还有另一实施方式中，靶细胞是胎儿的胎儿细胞，生物学样品是已富集了胎儿细胞的胎儿的母体宿主的样品。可以从已知或后来发现含有胎儿细胞的任何母体生物学样品获得这种胎儿细胞富集样品，包括但不限于血液、血浆、血清、唾液、尿液和宫颈粘膜。在一个实施方式中，从胎儿的母体宿主的血液样品获得胎儿细胞富集样品。
可通过目前已知或后来发现的任何方式富集母体宿主的生物学样品的胎儿细胞。在一个实施方式中，将母体生物学样品与优先结合母体细胞而非胎儿细胞的配体接触。因此，配体除去生物学样品中的母体细胞，从而富集了该生物学样品的胎儿细胞。在另一实施方式中，将母体生物学样品与优先结合胎儿细胞而非母体细胞的配体接触。然后可利用适合分离配体与胎儿细胞的条件和缓冲液，将胎儿细胞从所结合的配体洗脱而获得富含胎儿细胞的样品。这种条件和缓冲液是本领域技术人员已知的。
按照本发明的另一方面，可采用检测RNA标记以及DNA标记的本发明方法检测遗传标记相关的任何疾病，特别是用于检测需要同时鉴定或确认细胞类型的细胞的任何遗传疾病。在一个实施方式中，可采用本发明方法检测遗传标记相关的肿瘤疾病。例如，针对RNA标记的本发明探针可以是靶细胞的细胞类型的RNA标记探针，而针对DNA标记的探针可以是对同一靶细胞的肿瘤状态敏感或表明该肿瘤状态的遗传疾病的探针。
在另一实施方式中，可采用本发明方法检测遗传标记相关的胎儿疾病。例如，针对RNA标记的本发明探针可以是用于鉴定胎儿细胞的探针，而针对DNA标记的探针可以是胎儿的遗传状态的探针，例如胎儿的染色体组成或遗传组成。在还有另一实施方式中，可采用本发明方法检测胎儿的遗传疾病。例如，可按照本发明方法利用针对胎儿细胞的一种或多种RNA标记和遗传疾病相关的DNA标记的本发明探针检测胎儿的一种或多种遗传疾病，例如染色体缺失、添加、易位和基因突变、缺失、复制等。
示范性遗传疾病包括但不限于：囊性纤维化、镰状细胞贫血、苯丙酮酸尿、塔-莎病(Tay-Scabs Disease)、肾上腺增生、范科尼贫血、脊柱肌萎缩、杜兴氏肌营养不良、亨廷顿病、β珠蛋白生成障碍性贫血、强直性肌营养不良、脆性X综合征、唐氏综合征、爱德华兹综合征、帕塔综合征、克兰费尔特综合征、三X染色体综合征、XYY综合征、三体性8、三体性16、特纳综合征、罗伯逊易位、盎格曼综合征(Angelman syndrome)、迪格奥尔格综合征、沃尔夫-赫施恩综合征(Wolf-Hirschhorn Syndrome)、和RhD综合征。
按照本发明，可在妊娠期的任何时候，即在第一个、第二个或第三个三月期间检测胎儿的遗传疾病。在一个实施方式中，在妊娠期的第一个三个月期检测遗传疾病。在另一实施方式中，在妊娠期的约第5、6或7周到约第11、12或13周之间检测遗传疾病。在还有另一实施方式中，在胎儿至少5周、或6周或7周龄时检测遗传疾病。
在本发明方法中，探针与其RNA靶标和探针与其DNA靶标的杂交通常表明与靶标之一或二者相关的疾病。在一个实施方式中，探针与其各自靶标杂交表示RNA靶标或DNA靶标或二者存在表明了与靶标之一或二者相关的疾病。在另一实施方式中，杂交信号或模式表示RNA靶标或DNA靶标或二者存在的强度或数量，例如杂交信号的数量或强度表明了与靶标之一或二者相关的疾病。例如，探针可含有识别，例如与RNA靶标或DNA靶标中疾病或病症相关序列杂交的序列。或者，探针可含有识别，例如与RNA靶标或DNA靶标中的序列杂交的序列，其中与正常拷贝数相比，这种序列存在多或少与某种疾病或病症相关。例如，正常胎儿细胞应含有两拷贝的染色体21。采用本发明方法的任何杂交表示有3拷贝的染色体21，则表明了具有过多拷贝的染色体21的相关遗传疾病，例如唐氏综合征。
本发明的另一方面提供可用于本发明方法的试剂盒。在一个实施方式中，本发明试剂盒装有一种或多种本发明探针。例如，本发明试剂盒可装有针对特定细胞类型的RNA标记的一种或多种探针，还任选装有针对DNA标记的一种或多种探针，例如装有已知和/或可用的DNA FISH探针，如遗传疾病相关基因的FISH探针或染色体13、18、21、X和Y的FISH探针。
在另一实施方式中，本发明试剂盒装有针对一种或多种RNA标记的一种或多种探针和联用这种探针与针对一种或多种DNA标记的一种或多种探针的使用说明书，例如按照本发明方法。
在还有另一实施方式中，本发明试剂盒装有一种或多种本发明探针和用于本发明方法的一种或多种缓冲液。例如，本发明试剂盒可装有一种或多种本发明探针和用于，例如本发明方法的固定、变性、杂交和/或洗涤过程的缓冲液。本发明试剂盒还可装有一种或多种封闭试剂或可用于本发明方法的任何其它试剂。
在还有另一实施方式中，本发明试剂盒装有一种或多种本发明探针和富集了感兴趣的特定细胞类型，例如从母体生物学样品富集的胎儿细胞或从宿主对象的生物学样品富集的肿瘤细胞的样品。
实施例
以下实施例用于说明而非明确或暗示将本发明限制于任何方式、形状或形式。虽然它们是可以采用的那些典型实施例，但也可采用本领域技术人员已知的其它工艺、方法或技术。
实施例1：胎儿mRNA的原位杂交和胎儿细胞的检测
胎儿细胞的原位mRNA杂交和后续检测的示范性流程图见图4。将血液样品收集在Cyto-Chex和/或TransFix(1∶1)中。这些细胞稳定剂对于细胞及其内容物的稳定性是必不可少的，可按照生产商的使用说明书使用。按照该流程图进行以下步骤。
步骤1：胎儿细胞富集：按照以下方案，利用Histopaque 1.083-1.190(西格玛公司(Sigma))或Percoll 1.13，通过密度梯度离心分离收集在细胞稳定剂(s)Cyto-Chex(斯特莱克实验室(Streck Labs))和/或TransFix(1；1)(细胞标记有限公司(Cytomark Ltd.))中的10ml母体血液的单核的细胞：
将含1％BSA的1X PBS加入各血液试管至终体积为30ml。上下抽吸几次使之混合。
利用25ml血清学移液管将样品小心地叠加在20ml Histopaque1.083-1.119或Percoll 1.13上，确保不要打散Histopaque层。
以400×g离心样品45分钟，确保制动器关闭。
利用25ml血清学移液管取出并弃去各试管的顶层，从而留下上层的约1-2ml并且不要打散第一和第二层界面处的单层。
利用移液管取出界面和菲可(Ficoll)层，小心转移入适当标记的预封闭50ml试管。在红细胞(RBC)层上留下约1ml菲可。
*采用圆周运动从顶层边缘吸取
*利用25ml血清学移液管将含1％BSA的PBS加入各试管(含有界面和菲可层)至终体积为50ml。
上下抽吸数次使之混合。
*以400×g离心样品45分钟，将制动器设置为1，加速设置为FAST。
利用家庭真空吸引系统(house vacuum aspiration system)小心地吸出上清液，在各试管中留下约5ml。
*用1000μl移液管小心地重悬沉淀物(10次，缓慢地)。
利用25ml血清学移液管将含1％BSA的PBS加入各试管至终体积为50ml。上下抽吸数次使之混合。
*以400×g离心样品45分钟，将制动器设置为1，加速设置为FAST。
利用家庭真空吸引系统小心地吸出上清液，在各试管中留下约5ml。
用移液管小心地吸出剩余上清液，在细胞沉淀物上留下约800μl。
步骤2：捕捉胎儿的有核红细胞(fnRBC)：使以上界面和菲可层的细胞通过用胎儿细胞表面抗原的抗体包被的专有细胞捕捉装置。通过引用全文纳入本文的美国申请号11/458,668和11/331,988描述了细胞捕捉装置。所用的抗体包括但不限于：抗-血型糖蛋白A抗体(GPA)、抗-转铁蛋白-受体抗体(CD71)、抗-HLA-G233抗体和/或干细胞捕捉抗体，例如抗-CD34抗体。一般通过亲水性聚合物将抗-血型糖蛋白A抗体连接于细胞捕捉装置。细胞捕捉后，使该装置接触0.155M NH4Cl 1-2分钟以裂解大多数红细胞，然后进行PBS洗涤以除去裂解液。
步骤3：细胞固定和透化：室温下用PBS配制的4％低聚甲醛处理以上步骤2的被捕捉细胞30分钟。
PBS洗涤后，室温下用0.5％Triton X-100处理细胞10分钟以使它们透化。用PBS再次洗涤细胞，然后依次用70％、90％和100％乙醇洗涤以使之脱水。
步骤4：原位mRNA和核DNA(FISH)杂交：制备以下组成的杂交缓冲液(HB)：
50％去离子甲酰胺
0.3M氯化钠
20mM Tris.HCl，pH8.0
5mM EDTA
10mM磷酸钠
10％葡聚糖
1X Denhardt
mRNA和FISH探针混合物：
30uMε-血红蛋白探针的储备液＝2μl
30uMζ-血红蛋白探针的储备液＝2μl
CEP-X图谱绿FISH探针＝1μl(维丝公司(Vysis))
CEP-Y图谱橙FISH探针＝1μl(维丝公司)
HB＝14μl
总体积＝20μl
在典型的原位杂交实验中，将20μl以上探针混合物加入细胞捕捉装置内的固定细胞。
步骤5：变性：将该装置在80℃加热7分钟实施变性。
步骤6：杂交：在37℃-45℃杂交4-14小时。
步骤7：洗涤：如下所示依次洗涤杂交后过量未使用的探针：
洗涤i＝45℃，2X SSC配制的50％甲酰胺，5分钟
洗涤ii＝45℃，2X SSC，2分钟
洗涤iii＝室温，2X SSC，5分钟
步骤8：封闭：为尽可能降低非特异性背景，在37℃用PBS配制的5％酪蛋白或皮尔斯公司的超级封闭剂封闭细胞1小时。
步骤9：胎儿mRNA和核染色体DNA的目测观察：用2X SSC洗去步骤8的封闭溶液后，用偶联于选择荧光团，即，德克萨斯红、Alexa荧光等的1μg/μl链霉亲和素溶液(对于生物素化的探针)或抗-DIG(对于DIG标记的探针)处理细胞。该处理在37℃进行1小时，随后在37℃用2X SSC多次(3-5)洗涤洗去过量的试剂。
稳定DIG-抗-DIG复合物：需要通过交联于交联剂，例如4％低聚甲醛，或其它双功能交联剂，例如皮尔斯公司的磺基-EGS(乙二醇二(琥珀酰亚胺琥珀酸酯))来稳定DIG-抗-DIG复合物。可用于保留mRNA信号的其它交联剂可以具有以下通用结构：R-(CH2-CH2-0)n-R，其中n＝2-80和R＝磺基-NHS，亚氨酸酯。
无此步骤，mRNA信号随时间衰减。我们将此归因于在FISH后施加于细胞以目测观察它们的核的DAPI-抗褪色溶液存在时，抗-DIG-DIG复合物不稳定。
室温下，pH7.0 PBS配制的1-5％交联剂溶液通常与细胞反应1小时。然后洗去过量的接头。
步骤10：目测观察mRNA和FISH信号：引入20μl商品化DAPI-抗褪色溶液后，利用荧光显微镜分析细胞。mRNA和FISH双阳性的胎儿细胞的典型荧光图像见图5A和5B。
虽然已参考目前优选的实施方式描述了本发明，但应该知道可作出本领域技术人员显而易见的各种改变和改进而不脱离本发明的构思。因此，本发明仅受随附权利要求的限制。

Claims (49)

1.一种检测细胞中mRNA和染色体DNA的方法，所述方法包括：
在允许第一探针与靶细胞中其mRNA靶标特异性杂交，和第二探针与靶细胞中其染色体DNA靶标特异性杂交的条件下，使所述第一探针和所述第二探针与含有一种或多种靶细胞的生物学样品原位杂交，
其中所述第一探针的Tm至少约80℃，或者，GC含量至少约40％。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一探针是所述靶细胞的mRNA标记的探针。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶细胞是胎儿细胞。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一探针是胎儿细胞的mRNA标记的探针。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一探针是选自下组的胎儿细胞mRNA标记的探针：ε-血红蛋白mRNA；ζ-血红蛋白mRNA；γ-血红蛋白mRNA；Y染色体特异性锌指蛋白mRNA(ZFY-mRNA)；胎儿甲胎蛋白(AFP)mRNA；γ-谷氨酰-转肽酶(GGT)mRNA；人胎盘催乳素1、2、3和4(hPL，aka PLAC-1-4)mRNA；妊娠相关血浆蛋白-A(PAPP-A)mRNA；促肾上腺皮质素释放因子(CRH)mRNA；组织因子通道抑制剂2(TFPI-2)mRNA；KISS-1转移-抑制剂mRNA；和PLAC-1 mRNA；妊娠特异性β-1-糖蛋白-2、3、4、5、6、7和9mRNA；绒毛膜生长催乳激素2和变体(v1、v2、v3、v4、v5)mRNA；生长激素变体mRNA；α-解聚素和金属蛋白酶结构域变体mRNA；二肽基肽酶7mRNA；衰老关键蛋白mRNA；s100钙结合蛋白mRNA；前列腺分化因子mRNA；和细胞色素P450，亚家族xixmRNA。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一探针包含一个或多个修饰的核苷酸。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一探针包含至少约30％修饰的核苷酸。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一探针包含选自下组的一个或多个修饰的核苷酸：锁定核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、含有2’-OMe核苷酸的核酸、含有膦酸甲酯的核酸、含有硫代磷酸酯的核酸、含有吗啉子基的核酸和它们的组合。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一探针包含约20-约50个核苷酸。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，用可检测实体标记所述第一探针。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，用生物素标记所述第一探针。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二探针是用于原位杂交的荧光标记探针。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物学样品是血液或宫颈粘膜样品。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶细胞是胎儿的胎儿细胞，所述生物学样品是胎儿的母体宿主的血液样品。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶细胞是胎儿的胎儿细胞，所述生物学样品是从胎儿的母体宿主获得的胎儿细胞富集样品。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶细胞是肿瘤细胞。
17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，生物学样品中的细胞经处理而适于原位杂交。
18.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在室温下，用PBS配制的约4％低聚甲醛处理生物学样品中的细胞至少30分钟。
19.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一探针和所述第二探针先在变性条件下与生物学样品温育再进行杂交。
20.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述条件包括在约37℃-约45℃杂交约4小时-约14小时。
21.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述第一探针和第二探针的杂交后实施洗涤过程，所述洗涤过程包括在从室温到80℃不等的温度下洗涤。
22.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗涤溶液包含1XSSC、甲酰胺和任选的一种或多种洗涤剂。
23.如权利要求1所述的方法，其特征在于，先加入一种或多种封闭剂再检测所述第一探针与其mRNA靶标和所述第二探针与其染色体DNA靶标的杂交。
24.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶细胞是胎儿细胞，所述第一探针包含选自SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：40的核酸序列。
25.如权利要求1所述的方法，其特征在于，同时进行所述第一探针与其mRNA靶标和所述第二探针与其染色体DNA靶标的杂交。
26.如权利要求1所述的方法，其特征在于，同时检测所述第一探针与其mRNA靶标和所述第二探针与其染色体DNA靶标的杂交。
27.一种检测胎儿的遗传疾病的方法，所述方法包括：
在允许第一探针与胎儿细胞中其mRNA靶标特异性杂交，和第二探针与胎儿细胞中其染色体DNA靶标特异性杂交的条件下使所述第一探针和所述第二探针与含有胎儿的一种或多种胎儿细胞的生物学样品原位杂交，
其中所述第一探针的Tm是至少约80℃，或者，其GC含量至少约40％，和
其中所述第一探针与其mRNA靶标和所述第二探针与其染色体DNA靶标的杂交表示该胎儿的遗传疾病。
28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述遗传疾病选自：囊性纤维化、镰状细胞贫血、苯丙酮酸尿、塔-莎病、肾上腺增生、范科尼贫血、脊柱肌萎缩、杜兴氏肌营养不良、亨廷顿病、β珠蛋白生成障碍性贫血、强直性肌营养不良、脆性X综合征、唐氏综合征、爱德华兹综合征、帕塔综合征、克兰费尔特综合征、三X染色体综合征、XYY综合征、三体性8、三体性16、特纳综合征、罗伯逊易位、盎格曼综合征、迪格奥尔格综合征、沃尔夫-赫施恩综合征和RhD综合征。
29.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述生物学样品是来自胎儿的母体宿主的血液样品。
30.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述生物学样品是从胎儿母体宿主的生物学样品获得的胎儿细胞富集样品。
31.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述染色体DNA靶标与选自下组的遗传疾病相关：囊性纤维化、镰状细胞贫血、苯丙酮酸尿、塔-莎病、肾上腺增生、范科尼贫血、脊柱肌萎缩、杜兴氏肌营养不良、亨廷顿病、β珠蛋白生成障碍性贫血、强直性肌营养不良、脆性X综合征、唐氏综合征、爱德华兹综合征、帕塔综合征、克兰费尔特综合征、三X染色体综合征、XYY综合征、三体性8、三体性16、特纳综合征、罗伯逊易位、盎格曼综合征、迪格奥尔格综合征、沃尔夫-赫施恩综合征和RhD综合征。
32.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述mRNA靶标是胎儿细胞的mRNA靶标。
33.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述胎儿是至少7周龄。
34.一种探针，其包含选自SEQ ID NO 1-40的核酸序列。
35.如权利要求34所述的探针，其特征在于，所述探针含有一个或多个修饰的核苷酸。
36.如权利要求34所述的探针，其特征在于，所述探针包含至少约30％修饰的核苷酸。
37.如权利要求34所述的探针，其特征在于，所述探针包含选自下组的一个或多个修饰的核苷酸：锁定核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、含有2’-OMe核苷酸的核酸、含有膦酸甲酯的核酸、含有硫代磷酸酯的核酸、含有吗啉子基类似物的核酸和它们的组合。
38.如权利要求34所述的探针，其特征在于，所述探针包含约20-约50个核苷酸。
39.如权利要求34所述的探针，其特征在于，用可检测实体标记所述探针。
40.如权利要求34所述的探针，其特征在于，利用通过激发-发射机制或化学发光机制而发光的直接或间接可检测实体标记所述探针。
41.如权利要求34所述的探针，其特征在于，所述探针用选自下组的直接标记物作标记：荧光素、Cy3、Cy5、Cy7、德克萨斯红、StarBright绿、StarBright橙、罗丹明绿、俄勒冈绿；氟硼荧(bodipy)荧光团、发出350-750nm荧光的Alexa荧光染料和它们的组合。
42.如权利要求34所述的探针，其特征在于，所述探针用选自下组的间接标记物作标记：洋地黄毒苷、生物素、荧光黄、二硝基苯(DNP)、丹酰基和它们的组合。
43.一种装有权利要求34所述探针的试剂盒。
44.如权利要求43所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还装有胎儿细胞中染色体DNA靶标的第二探针。
45.如权利要求43所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还装有与胎儿中遗传疾病相关的染色体DNA靶标的第二探针。
46.如权利要求43所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还装有适于所述探针与其mRNA靶标杂交的缓冲液。
47.如权利要求43所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还装有胎儿细胞中染色体DNA靶标的第二探针和适于所述探针与其mRNA靶标杂交以及所述第二探针与其染色体DNA靶标杂交的缓冲液。
48.如权利要求47所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还装有洗涤缓冲液和封闭试剂。
49.如权利要求48所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还装有用于处理细胞样品从而使得该样品适于原位杂交的试剂。
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