CN110438216B - 一种用于性别鉴定的基因试剂盒及21号染色体综合症辅助鉴定用试剂盒 - Google Patents

一种用于性别鉴定的基因试剂盒及21号染色体综合症辅助鉴定用试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于性别鉴定的基因试剂盒包括两对qPCR引物，如SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4所示。本发明提供的21号染色体综合症辅助鉴定用试剂盒，包括五对引物，如、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4所示。本发明直接提取外周血或羊水穿刺物中的胎儿细胞的基因组DNA进行检测，不经过细胞增殖培养，且单个样本也可以检测，不用凑样，有效降低了成本。

Description

一种用于性别鉴定的基因试剂盒及21号染色体综合症辅助鉴 定用试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物医学技术领域，具体涉及一种用于性别鉴定的基因试剂 盒及21号染色体综合症辅助鉴定用试剂盒。
背景技术
在一些特殊情况下，需要进行性别鉴定：(1)如父母的染色体因有遗传疾病， 而且是性别遗传，则需要做胎儿性别鉴定的。如有一类遗传病与胎儿性别有关， 男性发病，而女性却不发病，这就是X连锁隐性遗传病，如血友病、假性肥大 型进行性肌营养不良、蚕豆病、先天性丙种球蛋白血症等。为了切断致病基因的 遗传，保障优生则需要做胎儿性别鉴定。(2)对于一些成年人，仅通过外观检查 仅能初步鉴定测定对象的外生殖器性别，对于患有性发育异常疾病或进行过手术 治疗或变性手术或伪装性别作弊等情况下的测定对象则无法予以全面、科学的评 估，如对运动员的性别鉴定。
对羊水穿刺物的检测是确证胎儿性别和21号染色体三体的“金标准”，对于 成年人可取外周血进行染色体检测，具体的检测技术有核型分析、CMA和基因 芯片。但是存在以下不足：
(1)检测的材料成本都比较高，据粗略计算，都超过了500元人民币/人份；
(2)核型分析检测的时间成本高(至少12天出结果)，细胞在增殖过程中 可能发生染色体状况的变化，需要熟练的操作者；
(3)CMA和基因芯片检测虽然时间成本相对低，但是存在较多的凑样等待 时间，因为出于成本考虑，它们需要凑足芯片要求的最低样本数后，才能进行检 测。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：传统的性别鉴定方法存在材料成本和时间成 本较高问题，本发明提供了解决上述问题的一种用于性别鉴定的基因试剂盒及 21号染色体综合症辅助鉴定用试剂盒。
本发明通过下述技术方案实现：
一种用于性别鉴定的基因试剂盒，包括两对qPCR引物，依次如下：
CXCR3-X-F：正向引物如SEQ ID NO 1所示；
CXCR3-X-B：反向引物如SEQ ID NO 2所示；
TSPY1-Y-F：正向引物如SEQ ID NO 3所示；
TSPY1-Y-B：反向引物如SEQ ID NO 4所示。
进一步地，所述第一对引物基于X染色体的CXCR3基因设计。
进一步地，所述第二対qPCR引物基于Y染色体的TSPY1基因设计。
上述一种用于性别鉴定的基因试剂盒使用方法，包括以下步骤：
步骤1，基于X染色体上的CXCR3和Y染色体上的TSPY1基因设计两对 qPCR引物：CXCR3-X-F：正向引物如SEQ ID NO 1所示；CXCR3-X-B：反向 引物如SEQ ID NO 2所示；TSPY1-Y-F：正向引物如SEQ ID NO 3所示； TSPY1-Y-B：反向引物如SEQ ID NO 4所示。
步骤2，从成人外周血或孕妇子宫羊水穿刺物中提取的基因组DNA为模板， 分别用上述两对引物，进行Sybr Green的qPCR检测
步骤3，qPCR检测后获得CT值，以CT值计算得到CXCR3基因和TSPY1 基因产物的量；
步骤4，计算比值CXCR3/TSPY1，比值大于1，被检测成人或胎儿为女性，比值小于1，被检测成人或胎儿为男性。
21号染色体综合症辅助鉴定用试剂盒，包括五对引物，依次如下：
引物IL10-1#-F：正向引物如SEQ ID NO 5所示；
引物IL10-1#-B：反向引物如SEQ ID NO 6所示；
引物STAT1-2#-F：正向引物如SEQ ID NO 7所示；
引物STAT1-2#-B：反向引物如SEQ ID NO 8所示；
引物Sumo3-21#-F：正向引物如SEQ ID NO 9所示；
引物Sumo3-21#-B：反向引物如SEQ ID NO 10所示；
引物CXCR3-X-F：正向引物如SEQ ID NO 1所示；
引物CXCR3-X-B：反向引物如SEQ ID NO 2所示；
引物TSPY1-Y-F：正向引物如SEQ ID NO 3所示；
引物TSPY1-Y-B：反向引物如SEQ ID NO 4所示。
进一步地，所述引物IL10-1#-F和IL10-1#-B基于1号染色体上的IL10基因 设计；所述引物STAT1-2#-F和STAT1-2#-B基于2号染色体上的STAT1基因设 计；所述引物Sumo3-21#-F和Sumo3-21#-B基于21号染色体上Sumo3基因设计； 引物CXCR3-X-F和CXCR3-X-B基于X染色体的CXCR3基因设计；引物 TSPY1-Y-F和TSPY1-Y-B基于Y染色体的TSPY1基因设计。
上述21号染色体综合症辅助鉴定用试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
步骤1，基于1号染色体上的IL10基因、2号染色体上的STAT1基因、21 号染色体上Sumo3基因、X染色体上的CXCR3和Y染色体上的TSPY1基因设 计引物SEQ ID NO 5、SEQ IDNO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4；
步骤2，从成人外周血或孕妇子宫羊水穿刺物中提取的基因组DNA为模板， 分别用上述引物，进行Sybr Green的qPCR检测；
步骤3，qPCR检测后获得CT值，以CT值计算得到IL10基因、STAT1基 因、Sumo3基因、CXCR3和TSPY1基因产物的量。
进一步地，还包括步骤4，对步骤3获得的IL10基因、STAT1基因、Sumo3 基因、CXCR3和TSPY1基因产物的量进行二次处理用于辅助鉴定21号染色体综 合症。
本发明具有如下的优点和有益效果：
本发明针对外周血或羊水穿刺物，提供了一种新的性别鉴定和辅助21号染 色体三体鉴定的试剂盒及相应的使用方法，是基于使用Sybr Green的定量PCR (qPCR)改进获得，具有如下优势：
(1)直接提取外周血或羊水穿刺物中的胎儿细胞的基因组DNA进行检测， 不经过细胞增殖培养，节约了时间；
(2)单个样本也可以检测，不用凑样，无凑样等待时间；
(3)结果判定只需根据事前设定好的阈值进行比较，客观性好，操作方便；
(4)最后，本发明提供的试剂盒及其使用方法是用于辅助核型分析、CMA 和基因芯片检测进行判断，不是取代核型分析、CMA和基因芯片方法，而是对 核型分析、CMA和基因芯片方法的补充。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本 发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明， 并不作为对本发明的限定。
实施例1
本实施例提供一种用于性别鉴定的基因试剂盒及其使用方法：
(一)用于性别鉴定的基因试剂盒，包括两对qPCR引物，依次如下：
CXCR3-X-F：正向引物如SEQ ID NO 1所示；
CXCR3-X-B：反向引物如SEQ ID NO 2所示；
TSPY1-Y-F：正向引物如SEQ ID NO 3所示；
TSPY1-Y-B：反向引物如SEQ ID NO 4所示。
引物CXCR3-X-F和引物CXCR3-X-B是基于X染色体的CXCR3基因设计； 引物TSPY1-Y-F和引物TSPY1-Y-B基于Y染色体的TSPY1基因设计。
此外还包括缓冲液、检测探针。
(二)上述的用于性别鉴定的基因试剂盒使用方法，包括以下步骤：
步骤1，基于X染色体上的CXCR3和Y染色体上的TSPY1基因设计两对 qPCR引物：CXCR3-X-F：正向引物如SEQ ID NO1所示；CXCR3-X-B：反向引 物如SEQ ID NO2所示；TSPY1-Y-F：正向引物如SEQ ID NO3所示；TSPY1-Y-B： 反向引物如SEQ ID NO4所示。
步骤2，从成人外周血或孕妇子宫羊水穿刺物中提取的基因组DNA为模板， 分别用上述两对引物，进行Sybr Green的qPCR检测
步骤3，qPCR检测后获得CT值，使用2-CT法计算得到CXCR3基因和TSPY1 基因产物的量；
步骤4，计算比值CXCR3/TSPY1，比值大于1，被检测成人或胎儿为女性，比值小于1，被检测成人或胎儿为男性，进而可保障优生。
实施例2
本实施例提一种供21号染色体综合症辅助鉴定用试剂盒及其使用方法：
(一)一种供21号染色体综合症辅助鉴定用试剂盒包括五对引物，依次如 下：
引物IL10-1#-F：正向引物如SEQ ID NO 5所示；
引物IL10-1#-B：反向引物如SEQ ID NO 6所示；
引物STAT1-2#-F：正向引物如SEQ ID NO 7所示；
引物STAT1-2#-B：反向引物如SEQ ID NO 8所示；
引物Sumo3-21#-F：正向引物如SEQ ID NO 9所示；
引物Sumo3-21#-B：反向引物如SEQ ID NO 10所示；
引物CXCR3-X-F：正向引物如SEQ ID NO 1所示；
引物CXCR3-X-B：反向引物如SEQ ID NO 2所示；
引物TSPY1-Y-F：正向引物如SEQ ID NO 3所示；
引物TSPY1-Y-B：反向引物如SEQ ID NO 4所示。
所述引物IL10-1#-F和IL10-1#-B基于1号染色体上的IL10基因设计；所述 引物STAT1-2#-F和STAT1-2#-B基于2号染色体上的STAT1基因设计；所述引 物Sumo3-21#-F和Sumo3-21#-B基于21号染色体上Sumo3基因设计；引物 CXCR3-X-F和CXCR3-X-B基于X染色体的CXCR3基因设计；引物TSPY1-Y-F 和TSPY1-Y-B基于Y染色体的TSPY1基因设计。
(二)上述21号染色体综合症辅助鉴定用试剂盒的使用方法，包括以下步 骤：
步骤1，基于1号染色体上的IL10基因、2号染色体上的STAT1基因、21 号染色体上Sumo3基因、X染色体上的CXCR3和Y染色体上的TSPY1基因设 计引物SEQ ID NO 5、SEQ IDNO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4；
步骤2，从成人外周血或孕妇子宫羊水穿刺物中提取的基因组DNA为模板， 分别用上述引物，进行Sybr Green的qPCR检测；
步骤3，qPCR检测后获得CT值，使用2-CT法计算得到IL10基因、STAT1 基因、Sumo3基因、CXCR3和TSPY1基因产物的量。
步骤4，对步骤3获得的IL10基因、STAT1基因、Sumo3基因、CXCR3和 TSPY1基因产物的量进行二次处理用于辅助鉴定21号染色体综合症：具体处理 方法可如下所示：
步骤41，计算比值CXCR3/TSPY1，若比值大于1，判断被检测成人或胎儿为女性；若比值小于1，判断被检测成人或胎儿为男性。
步骤42，分别依据步骤3计算获得的基因产物量计算Index-M和Index-F；
Index-M＝(SUMO3)4/(IL10×STAT1×CXCR3×TSPY1)；
Index-F＝(SUMO3)3/(IL10×STAT1×CXCR3)。
步骤43，依据步骤42的计算数值进行判断：
对于判断被检测成人或胎儿为男性时，若Index-M>10，则患有21号染色体 三体综合症的可能性较大；若Index-M≤6，则患有21号染色体三体综合症的可 能性较小；
对于判断被检测成人或胎儿为女性时，若Index-F>35，则患有21号染色体 三体综合症的可能性较大，若Index-F≤25，则患有21号染色体三体综合症的可 能性较小。
实施例3
基于实施例1和实施例2给出的方法进行实际案例测试：
(一)测试样本：
1份从21号染色体三体的女性胎儿的羊水穿刺物制备的基因组DNA；
1份从染色体正常的女性胎儿的羊水穿刺物制备的基因组DNA；
1份从21号染色体三体的男性胎儿的羊水穿刺物制备的基因组DNA；
4份从染色体正常的男性胎儿的羊水穿刺物制备的基因组DNA；
2份从正常女性的外周血制备的基因组DNA；
11份从正常男性的外周血制备的基因组DNA。
(二)qPCR引物入表1所示，qPCR反应条件如表2所示：
表1qPCR引物
Figure GDA0003922374690000061
Figure GDA0003922374690000071
表2qPCR反应条件
Figure GDA0003922374690000072
(三)检测结果
1、根据比值CXCR3/TSPY1可以判定胎儿和正常成年人的性别：
(1)羊水穿刺物的CXCR3/TSPY1比值如表3所示。由表3可见，女性胎儿 的比值都大于1，而男性胎儿的比值都远小于1。
表3羊水穿刺物的CXCR3/TSPY1比值
Figure GDA0003922374690000073
(2)正常成年人的CXCR3/TSPY1比值如表4所示。由表4可可见，成年女 性的比值都大于1，而成年男性的比值都远小于1。
表4正常成年人的CXCR3/TSPY1比值
Figure GDA0003922374690000081
2、对于上述判定为女性的胎儿和成年女性，采用(Sumo3/IL10)× (Sumo3/STAT1)×(Sumo3/CXCR3)数值判断21号染色体三体的存在与否：
(1)羊水穿刺物的(Sumo3/IL10)×(Sumo3/STAT1)×(Sumo3/CXCR3) 数值如表5所示。由表5可见，存在21号染色体三体的女性胎儿的数值大于35， 而21号染色体数目正常的女性胎儿的数值在20左右。
表5羊水穿刺物的(Sumo3/IL10)×(Sumo3/STAT1)×(Sumo3/CXCR3)数值
Figure GDA0003922374690000082
(2)正常成年女性的外周血的(Sumo3/IL10)×(Sumo3/STAT1)× (Sumo3/CXCR3)数值如表6所示。由表6可见对于正常成年女性，该数值小于 15。
表6正常成年女性外周血的(Sumo3/IL10)×(Sumo3/STAT1)×(Sumo3/CXCR3) 数值
Figure GDA0003922374690000091
3、对于上述判定为男性的胎儿和成年男性，采用(Sumo3/IL10)× (Sumo3/STAT1)×(Sumo3/CXCR3)×(Sumo3/TPSY1)数值判定21号染色体 三体的存在与否：
(1)羊水穿刺物的(Sumo3/IL10)×(Sumo3/STAT1)×(Sumo3/CXCR3) ×(Sumo3/TPSY1)数值如表7所示。由表7可见，存在21号染色体三体的男 性胎儿的数值大于10，而21号染色体数目正常的男性胎儿的数值在6左右或者 更低。
表7羊水穿刺物的(Sumo3)4/(IL10×STAT1×CXCR3×TSPY1)数值
Figure GDA0003922374690000092
(2)正常成年男性的外周血的(Sumo3/IL10)×(Sumo3/STAT1)× (Sumo3/CXCR3)×(Sumo3/TPSY1)数值如表8所示。由表8可见，对于正常 成年男性，该数值小于4或者更低。
表8正常成年男性外周血的(Sumo3)4/(IL10×STAT1×CXCR3×TSPY1)数值
案例 (Sumo3)<sup>4</sup>/(IL10×STAT1×CXCR3×TSPY1)数值
1号正常成年男性 0.88
2号正常成年男性 0.52
3号正常成年男性 3.09
4号正常成年男性 0.31
5号正常成年男性 1.03
6号正常成年男性 0.20
7号正常成年男性 1.04
8号正常成年男性 0.13
9号正常成年男性 1.16
10号正常成年男性 2.65
11号正常成年男性 0.46
综上所述，对于女性，由于不存在Y染色体，所以(Sumo3/IL10)× (Sumo3/STAT1)×(Sumo3/CXCR3)数值更接近实际情况；同时，Sumo3代 表21号染色体，IL10代表1号染色体，STAT1代表2号染色体，CXCR3代表 X染色体，如果21号染色体存在三体，Sumo3的量会略微大于代表其它染色体 的基因的量，然而，如果只考虑一个比值，差异可能由于太小而被掩盖，但是 如果几个比值连乘，差异就会被放大，以至于可以轻松发现数值不同之处，同时通过几个比值连乘也可以消除某些随机误差。
对于男性，由于存在Y染色体，所以(Sumo3/IL10)×(Sumo3/STAT1) ×(Sumo3/CXCR3)×(Sumo3/TPSY1)数值更接近实际情况；同时，Sumo3 代表21号染色体，IL10代表1号染色体，STAT1代表2号染色体，CXCR3代 表X染色体，TSPY1代表Y染色体，如果21号染色体存在三体，Sumo3的量 会略微大于代表其它染色体的基因的量，然而，如果只考虑一个比值，差异可 能由于太小而被掩盖，但是如果几个比值连乘，差异就会被放大，以至于可以 轻松发现数值不同之处，同时通过几个比值连乘也可以消除某些随机误差。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进 一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并 不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修 改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 成都新生命霍普医学检验实验室有限公司
<120> 一种用于性别鉴定的基因试剂盒及21号染色体综合症辅助鉴定用试剂盒
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(1)
<400> 1
acatagttca tgccacccag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(2)
<400> 2
ccgacaggaa gatgaagtct 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(3)
<400> 3
agctttctcc accttgtcct 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(4)
<400> 4
tattccttgg taatcacttt 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(5)
<400> 5
tgagctgcat gctggggaga 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(6)
<400> 6
gtatttgtat gtgcacattt 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(7)
<400> 7
gatattccta aatgctttgg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(8)
<400> 8
tgtttaacca ttaatttggc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(9)
<400> 9
agaagggcag cgtctttgag 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(10)
<400> 10
taaaaaagaa aaaaaagttt 20

Claims (5)

1.一种用于性别鉴定的基因试剂盒，其特征在于，包括两对qPCR引物，依次如下：
CXCR3-X-F：正向引物如SEQ ID NO：1所示；
CXCR3-X-B：反向引物如SEQ ID NO：2所示；
TSPY1-Y-F：正向引物如SEQ ID NO：3所示；
TSPY1-Y-B：反向引物如SEQ ID NO：4所示。
2.根据权利要求1所述的一种用于性别鉴定的基因试剂盒，其特征在于，所述第一对引物基于X染色体的CXCR3基因设计。
3.根据权利要求1所述的一种用于性别鉴定的基因试剂盒，其特征在于，所述第二对qPCR引物基于Y染色体的TSPY1基因设计。
4.21号染色体综合症辅助鉴定用试剂盒，其特征在于，包括五对引物，依次如下：
引物IL10-1#-F：正向引物如SEQ ID NO：5所示；
引物IL10-1#-B：反向引物如SEQ ID NO：6所示；
引物STAT1-2#-F：正向引物如SEQ ID NO：7所示；
引物STAT1-2#-B：反向引物如SEQ ID NO：8所示；
引物Sumo3-21#-F：正向引物如SEQ ID NO：9所示；
引物Sumo3-21#-B：反向引物如SEQ ID NO：10所示；
引物CXCR3-X-F：正向引物如SEQ ID NO：1所示；
引物CXCR3-X-B：反向引物如SEQ ID NO：2所示；
引物TSPY1-Y-F：正向引物如SEQ ID NO：3所示；
引物TSPY1-Y-B：反向引物如SEQ ID NO：4所示。
5.根据权利要求4所述的21号染色体综合症辅助鉴定用试剂盒，其特征在于，所述引物IL10-1#-F和IL10-1#-B基于1号染色体上的IL10基因设计；所述引物STAT1-2#-F和STAT1-2#-B基于2号染色体上的STAT1基因设计；所述引物Sumo3-21#-F和Sumo3-21#-B基于21号染色体上Sumo3基因设计；引物CXCR3-X-F和CXCR3-X-B基于X染色体的CXCR3基因设计；引物TSPY1-Y-F和TSPY1-Y-B基于Y染色体的TSPY1基因设计。
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