CN104995309B - 多重核酸检测方法 - Google Patents

多重核酸检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104995309B
CN104995309B CN201380072327.3A CN201380072327A CN104995309B CN 104995309 B CN104995309 B CN 104995309B CN 201380072327 A CN201380072327 A CN 201380072327A CN 104995309 B CN104995309 B CN 104995309B
Authority
CN
China
Prior art keywords
different
probe
nucleic acids
target nucleic
target
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201380072327.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104995309A (zh
Inventor
E·奥利瓦瑞斯
J·索伦森
T·兰德斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Invitae Corp
Original Assignee
Invitae Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Invitae Corp filed Critical Invitae Corp
Publication of CN104995309A publication Critical patent/CN104995309A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104995309B publication Critical patent/CN104995309B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2537/00—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature
    • C12Q2537/10—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature the purpose or use of
    • C12Q2537/16—Assays for determining copy number or wherein the copy number is of special importance

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

用于多重连接依赖性探针扩增方法包括(a)提供含有不同靶核酸的样品组织，(b)针对每个靶核酸提供不同的探针组，每个探针组包含具有第一接头序列和第一靶特异性部分的第一基因座特异性探针及具有第二接头序列和邻近所述第一靶特异性部分的第二靶特异性部分的第二基因座特异性探针，(c)将所述探针组与所述靶序列杂交以形成杂交复合体；(d)连接所述杂交复合体以形成连接的探针，(e)扩增连接的探针以形成扩增子，和(f)通过对每个扩增子进行测序在检测系统中检测扩增子。

Description

多重核酸检测方法
背景技术
本文所公开的实施方式涉及核酸，更特别地是涉及靶核酸序列多重检测的方法。
多重连接依赖性探针扩增(MLPA)是允许在单次实验中评估特别是多种靶核酸的拷贝数的多重PCR技术。在MLPA中，所查询的每个靶核酸是通过连接的探针的扩增来检测。连接的探针是通过探针组的杂交和连接产生，所述探针组包含一对设计为沿目标靶核酸序列彼此邻近定位的半探针(half-probe)。只有在半探针与靶核酸杂交时，才发生连接和随后的扩增。
图1示出了典型的MLPA分析的流程图。该分析起始于DNA样品的变性和探针组与它们的靶核酸序列的杂交。在杂交后，连接邻近的半探针，并使得到的连接的探针组经历PCR扩增。然后通过毛细管电泳(CE)分析所扩增的连接的探针组。CE读出结果的峰高度作为基因组靶拷贝数的读出结果。
如图1中所指示的，每个探针组由具有靶特异性序列和通用引物序列的5'和3'半探针组成，允许同时多重PCR扩增所有连接的探针组。另外，半探针中的一个(如图1所示)或两者进一步包括填充序列(stuffer sequence)，其使得更容易区分通过CE进行的扩增探针的检测。使用使得基于核酸长度的CE检测成为可能的这些填充序列对于可在单次运行中查询(query)的靶核酸数量造成限制。目前，该限制是约40个靶核酸。由于与MLPA相关的低成本、高通量潜力和检测小重排的能力，扩增可在单次运行中查询的靶核酸序列的数量是有益的。本公开提供了用于查询数量扩增的这样的方法并也提供相关的优势。
发明内容
根据在本文中说明的实施方式，提供了增加可在多重连接依赖性探针扩增(MLPA)分析中查询的靶核酸数量的方法。
在一些方面，本文所公开的实施方式提供了用于多重连接依赖性探针扩增的方法，其包括(a)提供样品组织以查询多个不同的靶核酸；(b)为所述多个不同靶核酸中的每一个提供多个不同的探针组，其中每个探针组包含：第一基因座(locus)特异性探针，其包含第一接头(adapter)序列和第一靶特异性部分；和第二基因座特异性探针，其包含第二接头序列，和邻近所述第一靶特异性部分的第二靶特异性部分；(c)将所述多个不同探针组与所述多个不同靶序列杂交以形成多个杂交复合体；(d)连接所述多个杂交复合体以形成多个连接的探针；(e)扩增所述多个连接的探针以形成多个扩增子，其中所述扩增步骤使用第一通用引物和第二通用引物进行，所述第一通用引物包含与所述第一接头序列互补的区域，所述第二通用引物包含与所述第二接头序列互补的区域；和(h)通过对所述多个扩增子的每一个进行测序，在检测系统中与长度无关地检测所述多个扩增子。
在其他方面，本文所公开的实施方式提供了方法，其包括提供检测系统，所述检测系统包括配置为在包含多个扩增子的阵列上进行合成测序循环的流体处理系统，所述检测系统被配置为将辐射从源引导至所述阵列并将荧光发射从所述阵列引导至照相机，和包括配置为自动改变所述检测系统以增加引导至所述阵列的所述辐射的暴露水平和在所述增加的暴露下检测从所述阵列到所述照相机的荧光发射的系统控制界面；通过多重连接依赖性探针扩增提供所述多个扩增子；和测定所述多个扩增子的序列。
附图说明
为更好地理解本实施方式，可参考附图。
图1示出了采用毛细管电泳检测系统的多重连接依赖性探针扩增(MLPA)的流程图。
图2示出了根据本文所公开的实施方式的MLPA-合成测序(SBS)的流程图。
图3示出了根据本文所公开的实施方式的采用索引的MLPA-SBS的流程图。
图4示出了根据本文所公开的实施方式，与进行性假肥大性肌营养不良(DuchenneMuscular Dystrophy，DMD)基因有关的79个外显子的阅读片段计数对外显子数量的图，说明了使用单运行MLPA-SBS系统检测男性、女性和对照样品中的拷贝数变异。
图5示出了标准化阅读片段计数对DMD基因中的外显子数目的如图4中的另一个实例。女性样品在上面，男性样品在下面示出。方框中强调的是来自具有外显子3到17的缺失的男性(卡瑞尔DNA样品编号NA03782)的阅读片段计数。
图6示出了标准化阅读片段计数对DMD基因中的外显子数量的如图5中的另一个实例。方框中强调的是来自具有外显子46到50的缺失的男性(卡瑞尔DNA样品编号NA03929)的阅读片段计数。
图7示出了标准化阅读片段计数对DMD基因中的外显子数量的如图5中的另一个实例。方框中强调的是来自具有外显子49到52的缺失的女性(卡瑞尔DNA样品编号NA04099)的阅读片段计数。
图8示出了标准化读数对DMD基因中的外显子数量的如图5中的另一个实例。方框中强调的是来自具有外显子49到52的缺失的男性(卡瑞尔DNA样品编号NA04100，NA04099的儿子)的阅读片段计数。
图9示出了标准化阅读片段计数对DMD基因中的外显子数量的如图5中的另一个实例。方框中强调的是来自具有外显子44的缺失的女性(卡瑞尔DNA样品编号NA04315)的阅读片段计数。
图10示出了标准化阅读片段计数对DMD基因中的外显子数量的如图5中的另一个实例。方框中强调的是来自具有外显子5到7的重复的男性(卡瑞尔DNA样品编号NA04327)的阅读片段计数。
图11示出了标准化阅读片段计数对DMD基因中的外显子数量的如图5中的另一个实例。方框中强调的是来自具有外显子51到55的缺失的男性(卡瑞尔DNA样品编号NA04364)的阅读片段计数。
图12示出了标准化阅读片段计数对DMD基因中的外显子数量的如图5中的另一个实例。方框中强调的是来自具有外显子45到53的缺失的男性(卡瑞尔DNA样品编号NA04981)的阅读片段计数。
发明详述
在以下描述中，应理解可以使用其他实施方式并且可以进行结构和操作的改变而不背离本文所公开的本实施方式的范围。
根据本文所公开的实施方式，提供了可允许将可以在多重连接依赖性探针扩增(MLPA)分析中查询的靶核酸数量从每运行约40个靶核酸序列的当前限制大幅增加的方法。例如，使用用于检测扩增产物的合成测序(SBS)系统可以消除由基于CE的检测系统设置的查询数量限制。实际上，本文所公开的方法中查询的靶序列数量只需要受到适合探针组的可获得性的限制。
而且，通过消除对于作为区分扩增的探针产物的手段的填充序列的需求，采用SBS检测系统可以简化探针组设计，并因此可以减少与开发探针组有关的成本。SBS检测系统可以以与扩增探针的长度无关的方式利用探针组的任选的索引。有利地，采用具有索引的SBS检测系统可以帮助例如同时查询多个患者/组织样品。最后，SBS检测可以提供增强的检测灵敏度，允许相对于基于CE的技术减小样品大小。
在一些实施方式中，提供了用于多重连接依赖性探针扩增的方法，其包括(a)提供样品组织以查询多个不同的靶核酸；(b)针对所述多个不同靶核酸中的每一个提供多个不同的探针组，其中每个探针组包含：第一基因座特异性探针，其包含第一接头序列和第一靶特异性部分；和第二基因座特异性探针，其包含第二接头序列，和邻近所述第一靶特异性部分的第二靶特异性部分；(c)将所述多个不同探针组与所述多个不同靶序列杂交以形成多个杂交复合体；(d)连接所述多个杂交复合体以形成多个连接的探针；(e)扩增所述多个连接的探针以形成多个扩增子，其中所述扩增步骤使用第一通用引物和第二通用引物进行，所述第一通用引物包含与所述第一接头序列互补的区域，所述第二通用引物包含与所述第二接头序列互补的区域；和(f)通过对所述多个扩增子的每一个进行测序，在检测系统中与长度无关地检测所述多个扩增子。
本文所公开的实施方式提供了多种不同的核酸作为引物和探针/探针组。本文中使用的“核酸”或语法等同词语是指共价地连接在一起的至少两个核苷酸。核酸一般含有磷酸二酯键，虽然在一些情况下，特别是对于用于探针的情况，可具有替代性骨架的核酸类似物可以被包括在内，所述替代性骨架包括，例如，磷酰胺(Beaucage等，Tetrahedron 49(10):1925(1993)及其中的参考文献；Letsinger，J.Org.Chem.35:3800(1970)；Sprinzl等，Eur.J.Biochem.81:579(1977)；Letsinger等，Nucl.Acids Res.14:3487(1986)；Sawai等，Chem.Lett.805(1984)，Letsinger等，J.Am.Chem.Soc.110:4470(1988)；和Pauwels等，Chemica Scripta 26:1419(1986))、硫代磷酸酯(Mag等，Nucleic Acids Res.19:1437(1991)；和美国专利号5644048)、二硫代磷酸酯(Briu等，J.Am.Chem.Soc.111:2321(1989))、O-甲基亚磷酰胺(O-methylphophoramidite)连接(参见Eckstein，Oligonucleotides and Analogues；A Practical Approach，Oxford University Press)以及肽核酸骨架和连接(参见Egholm，J.Am.Chem.Soc.114:1895(1992)；Meier等，Chem.Int.Ed.Engl.31:1008(1992)；Nielsen，Nature，365:566(1993)；Carisson等，Nature380:207(1996)，所有这些通过引用并入)。其他类似核酸包括具有带正电荷的骨架(Denpcy等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:6097(1995))、非离子性骨架(美国专利号5386023、5637684、5602240、5216141和4469863；Kiedrowshi等，Angew.Chem.Intl.Ed.English 30:423(1991)；Letsinger等，J.Am.Chem.Soc.110:4470(1988)；Letsinger等，Nucleoside&Nucleotide 13:1597(1994)；第2和第3章，ASC Symposium Series 580，"CarbohydrateModifications in Antisense Research"，Ed.Y.S.Sanghui和P.Dan Cook；Mesmaeker等，Bioorganic&Medidicinal Chem.Lett.4:395(1994)；Jeffs等，J.Biomolecular NMR 34:17(1994)；Tetrahedron Lett.37:743(1986))和非核糖骨架的那些，包括那些在美国专利号5235033和5034506，和第6和7章，ASC Symposium Series 580，"CarbohydrateModifications in Antisense Research"，Ed.Y.S.Sanghui和P.Dan Cook中描述的。含有一个或多个碳环糖的核酸也包括在核酸的定义内(参见Jenkins等，Chem.Soc.Rev.(1995)，第169-176页)。几种核酸类似物在Rawls，C&E News Jun.2，1997，第35页中描述。核酸也可以是“锁核酸”。所有这些参考文件都通过引用在此明确并入全文。可以进行核糖-磷酸酯骨架的修饰以使得例如，利于添加标记或者提高这样的分子在生理环境中的稳定性和半衰期。如本领域技术人员将意识到的，所有这些核酸类似物都可作为探针用于本文所公开的方法。另外，可以制备天然存在的核酸和类似物的混合物。或者，可以采用不同核酸类似物的混合物，以及天然存在的核酸和类似物的混合物。
如本领域技术人员将意识到的，本文所公开的方法中采用的引物和探针核酸的大小可以随每个通用引物和半探针的每个部分和半探针的总长度一般在约5到约500个核苷酸的长度之间变化。探针组中的半探针的每个部分的长度可以在约10到约100个核苷酸、约15到约50个核苷酸、或者约10到约35个核苷酸的范围内，包括其间的全部子范围。例如，半探针的接头序列的长度可以在15-25个核苷酸的范围内，通常为20个核苷酸。每个半探针的靶特异性部分的长度可以在约15到约50个核苷酸，或者约30到约40个核苷酸的范围内，包括其间的全部子范围。因此，连接的产物(两个半探针的连接)中靶序列的总长度可以在约30到约100个核苷酸，或者约60到约80个核苷酸的范围内，包括其间的全部子范围。
本文所公开的方法提供了多个靶探针组。“探针组”包括在MLPA分析中使用的多个基因座特异性半探针对。在这种情况下，多个是指至少两个或至少10个或至少50个，或至少100个等等，其取决于该分析方法、样品和测试目的。
在此“通用引发位点(priming site)”是指将结合PCR引物以进行扩增的序列。每个半探针包含提供上游通用引发位点(UUP)或者下游引发位点(DUP)的接头序列。“上游”和“下游”不是要表达特定的5'-3'方向，而是取决于系统的定向。另外，接头序列一般位于半探针或连接的产物的5'和3'端，因为只有这样的引发序列(priming sequence)侧翼的序列才会被扩增。
另外，通用引发序列一般考虑到特定试验和宿主基因组选择为尽可能独特的，以确保分析的特异性。一般来说，通用引发序列大小可以在约5到约35个核苷酸的范围内，通常为约20个核苷酸。
如本领域技术人员将意识到的，连接的探针组中的两个引发位点的定向是不同的。也就是说，一个PCR引物将直接与第一接头序列杂交(第一通用引发位点)，而另一个PCR引物将与第二接头序列的互补序列杂交(第二通用引发位点)。换句话说，第一引发位点是沿正义方向，而第二引发位点是沿反义方向。
除了作为引物位点使用的接头序列以外，半探针包含至少第一基因座特异性序列，其与靶核酸的一部分基本上互补。如下文所述，连接探针各自包含基因座特异性序列的单独的部分。如本领域技术人员将意识到的，取决于探针的使用，基因座特异性序列可呈现多种多样的形式。虽然提到“半探针”，但这并不旨在表示跨越查询靶核酸的两个半探针需要与靶核酸的靶标的恰好一半互补。例如，两个半探针可设计为将查询靶核酸分为包含与靶核酸的约三分之一互补的序列的第一基因座特异性部分，而第二基因座特异性部分可与靶核酸的约三分之二互补。而且，两个半探针不需要必然地跨越整个靶核酸序列。本领域技术人员将意识到，适合半探针的精确设计选择可以通过特别是计算方法帮助。
在一些实施方式中，基因座特异性序列可以跨越目标剪接点。如本文中所述，基因座特异性序列可以设计为与单保可选外显子末端的序列基本上互补。本文中基本上互补是指探针与靶序列充分互补以在正常反应条件下杂交，并提供必要的退火特异性。由于外显子被内含子分隔开，检测序列可以存在于RNA分子的不同部分上。因此基因座特异性序列可以包含两个部分：上游部分，与第一外显子的末端互补，和下游部分，与第二外显子的末端互补。只有在发生剪接并且介于其间的内含子被切除的情况下，靶特异性序列在分析条件下与靶核酸序列杂交。
在多个实施方式中，基因座特异性探针可以包含等位基因特异性探针。因此，第一基因座特异性探针和第二基因座特异性探针两者可以是等位基因特异性探针。
本发明中可以使用多种多样的杂交条件，包括高、中和低严格性条件；参见例如Maniatis等，Molecular Cloning；A Laboratory Manual，第2版，1989，和Short Protocolsin Molecular Biology，Ausubel等，在此通过引用引入。严格条件是序列依赖性的，且在不同情况下存在不同。较长的序列在更高的温度下特异性杂交。核酸杂交的广泛指导可见于Tijssen，Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization withNucleic Acid Probes，“Overview of principles of hybridization and the strategyof nucleic acid assays”(1993)中。一般来说，严格条件选择为比特定序列在限定的离子强度和pH下的热熔点(Tm)低约5到约10℃。Tm是(在限定的离子强度、pH和核酸浓度下的)与靶互补的探针的50％在平衡状态下与靶序列杂交(由于靶序列过量存在，在Tm下，50％的探针在平衡状态下被占据)的温度。严格条件包括其中在pH 7.0到8.3下盐浓度小于约1.0M钠离子，通常为约0.01到1.0M钠离子浓度(或者其他盐)，并且对于短探针(例如，10到50个核苷酸)温度为至少约30℃和对于长探针(例如，超过50个核苷酸)为至少约60℃的那些条件。严格条件还可以利用加入螺旋去稳定剂例如甲酰胺来实现。当使用本领域已知的非离子型骨架(即使用PNA)时，杂交条件也可以变化，另外在靶结合后可以加入交联剂以交联(即共价连接)杂交复合体的两条链。
因此，MLPA分析一般在允许仅在靶的存在下形成杂交复合体的严格条件下运行。严格性可通过改变作为热力学变量的步骤参数来控制，包括，但不限于，温度、甲酰胺浓度、盐浓度、离液盐浓度、pH、有机溶剂浓度等。这些参数也可用于控制非特异性结合，如在美国专利号5681697中所一般性概述的。因此，可能期望的是在较高严格性条件下进行某些步骤以减少非特异性结合。
在形成杂交复合体后，半探针连接，且可以扩增连接的产物以形成随后被检测的扩增子。这可以通过例如PCR扩增来完成。在一些实施方式中，可以将标记引入扩增子中。
许多本领域已知的连接酶可适用于本文所公开的方法，例如Lehman，Science，186；790-797(1974)；Engler等，DNA Ligases，第3-30页，Boyer，editor，The Enzymes，第15B卷(Academic Press，New York，1982)等。一些连接酶包括T4DNA连接酶、T7DNA连接酶、E.coli DNA连接酶、Taq连接酶、Pfu连接酶和Tth连接酶。它们的使用方案是公知的，例如Sambrook等(在上文中引用)；Barany，PCR Methods an Applications，1；5-16(1991)；Marsh等，Strategies，5；73-76(1992)等。一般来说，连接酶要求存在5'磷酸酯基团以连接到邻接链的3'羟基。在一些实施方式中，连接酶包括热稳定或(嗜热性的)连接酶，例如pfu连接酶、Tth连接酶、Taq连接酶和AMPLIGASETM DNA连接酶(Epicentre Technologies，Madison，Wis.)。AMPLIGASETM具有低平端连接活性。
在一些实施方式中，连接酶是具有最少错配连接的连接酶。可以通过用较高特异性的NAD+依赖性连接酶例如E.coli连接酶和(热稳定的)Taq连接酶来替换较低特异性的T4DNA连接酶来增加连接酶的特异性。NAD类似物在连接反应中的使用进一步增加了连接反应的特异性。参见美国专利号5508179，Wallace等。
在一些实施方式中，扩增技术是PCR。聚合酶链式反应(PCR)被广泛地使用和描述，并涉及使用与热循环结合的引物扩增来扩增靶序列；参见美国专利号4683195和4683202，和PCR Essential Data，J.W.Wiley&sons，Ed.C.R.Newton，1995，所有这些通过引用全文并入。
一般来说，PCR可以简单描述如下。通常通过提高温度将双链的连接的探针组变性，然后在过量PCR引物的存在下冷却，所述引物然后与第一接头序列杂交。然后DNA聚合酶起作用以使用dNTP延伸引物，导致形成杂交复合体的新链的合成。然后再次加热样品以解离杂交复合体，并重复该过程。通过使用用于与第二接头序列杂交的互补靶链的第二PCR引物，发生快速的和指数式的扩增。因此PCR步骤是变性、退火和延伸。PCR的细节是公知的，且包括使用热稳定的聚合酶例如Taq I聚合酶和热循环。适合的DNA聚合酶包括，但不限于，DNA聚合酶I的Klenow片段、SEQUENASE 1.0和SEQUENASE 2.0(U.S.Biochemical)、T5DNA聚合酶和Phi29DNA聚合酶。
可以通过将连接的探针组引入到包含通用引物、聚合酶和一组核苷酸的溶液中来启动PCR反应。这里所说的“核苷酸”是指脱氧核苷-三磷酸酯(也称为脱氧核苷酸或dNTP，例如dATP、dTTP、dCTP和dGTP)。在一些实施方式中，如下文所概述的，一种或多种核苷酸可包含可检测标记，其可以是一级或二级标记。另外，取决于系统构造，核苷酸可以是核苷酸类似物。类似地，引物可包含一级或二级标记。
因此，PCR反应利用两种PCR引物(正向和反向)、聚合酶和一组dNTP。如本文中所述，引物可包含标记，或者一种或多种dNTP可包含标记。在一些实施方式中，第一通用引物和第二通用引物中的至少一种进一步包含索引序列(indexing sequence)。使用索引序列，例如在申请WO05068656(其内容通过引入在此全文并入)中所述的那些，允许多个不同的样品在同一测序操作中分析而同时保持各个样品本身。
在一些实施方式中，扩增子可以用检测标记来标记。这里所说的“检测标记”是指允许检测的部分(moiety)。在一些实施方式中，检测标记是一级标记。一级标记是可以被直接检测的标记，例如荧光团。一般来说，标记分为三类：a)同位素标记，其可以是放射性的或者是重同位素；b)磁、电、热标记；和c)有色或发光染料。标记还可以包括酶(辣根过氧化物酶等)和磁性颗粒。标记包括生色团或磷光体，和荧光染料。适用于本文所公开的方法的染料包括，但不限于，荧光镧系复合物，包括铕和铽的那些、荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明、曙红、赤藓红、香豆素、甲基香豆素、量子点(也称为“纳米晶体”；参见美国序列号09/315584，通过引用在此并入)、芘、Malacite绿、芪、荧光黄、CASCADE BLUETM、德州红、Cy染料(Cy3、Cy5等)、alexa染料、藻红蛋白、氟硼二吡咯(bodipy)和在Molecular Probes Handbook，Richard P.Haugland，第6版(通过引用全文明确引入)中所述的其他物质。
在PCR扩增步骤产生的扩增子可以以独立于长度的方式以多种方法分析。在一些实施方式中，扩增子可通过合成测序(SBS)方法表征。测序可使用任意适合的“合成测序”技术进行，其中核苷酸依次添加到通常由测序引物的退火提供的自由3'羟基基团，导致沿5'到3'方向的多核苷酸链的合成。添加的核苷酸的种类可以在每次添加后测定。
可在本发明的方法中使用的一种适合的测序方法依赖于可作为链终止剂起作用的修饰核苷酸的使用。一旦修饰的核苷酸被引入到与被测序的连接的探针区域互补的增长的多核苷酸链中，则没有自由3'-OH基团可用于指引进一步的序列延伸，且因而聚合酶不能添加进一步的核苷酸。一旦已经确定引入增长的链中的碱基的性质，可以移除3'封闭以允许添加下一个相继的核苷酸。通过使用这些修饰的核苷酸来对衍生的产物定序，有可能推断出连接的探针的核酸序列。如果每个修饰的核苷酸连接已知对应于特定碱基的不同标记以利于区分在每个引入步骤添加的碱基，这样的反应可以在单一实验中完成。或者，可以分别地进行含有各种修饰的核苷酸的单独的反应。
修饰的核苷酸可以携带标记以利于它们的检测。在一些这样的实施方式中，这可以是荧光标记。每个核苷酸类型可以携带不同的荧光标记。然而，可检测标记不需要是荧光标记。可以使用允许检测核苷酸到核酸序列中的引入的任何标记。
检测荧光标记的核苷酸的一种方法包括使用具有对于被标记的核苷酸特异性的波长的辐射，或者使用其他适合的照明源。可以通过CCD照相机或者其他适合的检测手段来检测来自核苷酸上标记的荧光。
本文中描述的方法不限于使用上文概述的测序方法，而是可以与实质上依赖于将核苷酸顺序引入到多核苷酸链中的任意测序方法联用。适合的技术包括，例如PYROSEQUENCINGTM、FISSEQ(荧光原位测序)、MPSS(大规模平行签名测序)和通过基于连接的方法测序。在一些实施方式中，有可能制备连接的探针组的阵列。通过使用阵列，有可能平行地测序具有相同或不同序列的多个靶。
参考图2，根据本文所公开的实施方式，示出了总结MLPA-SBS分析的示例性方法的流程图。如图2中所指示的，DNA的查询样品与包含5'和3'半探针(左探针和右探针)的探针组杂交，其在整个基因组靶上杂交。半探针选择为在基因组靶上彼此邻近，因而允许探针组的连接。还提供具有将在PCR扩增中使用的接头序列的半探针。在连接后，连接的探针组在修饰的正向和反向引物的协助下进行PCR扩增。这些是选择以与在半探针的靶特异性部分侧翼的接头序列互补的通用引物。然后可以测序通过PCR扩增产生的扩增子。在一些实施方式中，适合的测序方法可以包括通过使用可获自Illumina，Inc.(San Diego，CA)的
Figure BDA0000775102710000121
或者
Figure BDA0000775102710000122
系统平台开发的下一代测序(NGS)系统。在一些实施方式中，这样的检测系统可包括配置为在包含多个扩增子的阵列上进行合成测序循环的流体处理系统，所述检测系统被配置为将辐射从源引导至所述阵列并将荧光发射从所述阵列引导至照相机，并包括配置为自动改变所述检测系统以增加引导至所述阵列的所述辐射的暴露水平和在所述增加的暴露下检测从所述阵列到所述照相机的荧光发射的系统控制界面。图3示出了与如图2中所示方法类似的方法的流程图，其中在修饰的反向引物中提供索引序列。流程图的顺序是相同的，但是索引序列在得到的扩增子中出现，帮助识别来自多个源的靶核酸。
在一些实施方式中，本文所公开的方法可用于在单次运行中查询多于约100个的多个不同的靶核酸。在一些实施方式中，本文所公开的方法可用于在单次运行中查询在约50到约100个靶核酸范围内的多个不同的靶核酸。在一些实施方式中，本文所公开的方法可用于在单次运行中查询在约100到约500个靶核酸范围内的多个不同的靶核酸。在一些实施方式中，本文所公开的方法可用于在单次运行中查询在约100到约1000个靶核酸范围内的多个不同的靶核酸。在一些实施方式中，本文所公开的方法可用于在单次运行中查询在约100到约108个靶核酸范围内的多个不同的靶核酸。原则上，可查询的靶核酸数量可以仅受适合探针组的可获得性限制。
在一些实施方式中，本文所公开的方法可包括测定多个不同靶核酸中的每一个的拷贝数。在一些这样的实施方式中，来自合成测序的读数可以直接提供拷贝数信息。在一些实施方式中，测定拷贝数可以在对照的存在下进行，且每个查询的靶核酸可以基于这个对照对于拷贝数进行标准化。在一些实施方式中，测定拷贝数可用于评估与异常拷贝数变异(CNV)相关的遗传疾病的存在。因此，在一些实施方式中，提供了检测与异常CNV相关的疾病或失调的方法，其包括测定一种或多种靶核酸的拷贝数。在一些这样的实施方式中，疾病或失调可包括，但不限于，进行性假肥大性肌营养不良(DMD)、贝克肌营养不良(BMD)、脊髓性肌萎缩症(SMA)、腓骨肌萎缩症(CMT)、遗传性压迫易感性神经病(HNNP)、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、家族性腺瘤性息肉病(FAP)、和非息肉病性结直肠癌(HNPCC)。本领域技术人员将认识到这些仅仅是示例性疾病/失调且异常拷贝数变异可以在导致多种其他疾病病症的任何基因中发生。
在一些实施方式中，CNV测定可用于诊断和/或监控癌症进展的方法中。将正常细胞转化为癌细胞的遗传事件的潜在进展可通过从二倍体转变为非整倍体状态表征(Albertson等(2003)，Nat Genet，第34卷，第369-76页和Lengauer等，(1998)，Nature，第396卷，第643-9页)。由于基因组不稳定性，癌细胞从点突变到全染色体畸变的多个水平上积累随机和因果性改变(causal alterations)。癌症进展的诊断和/或监控中的拷贝数变异包括，但不限于，检测杂合性丢失(LOH)和纯合的缺失，其可以导致肿瘤抑制基因的丢失和基因扩增事件(其可以导致细胞原癌基因的激活)。
在一些实施方式中，本文所公开的方法可以包括检测单核苷酸多态性。多态性是指群体中两种或更多种遗传决定的择一的序列或基因座的存在。多态性标志或位点是在其处发生趋异的基因座。在一些实施方式中，标志具有至少两个基因座，各自以所选择群体的大于约1％的频率发生，和在其他实施方式中，各自以所选择群体的大于10％或20％的频率度发生。多态性可包含一个或多个碱基变化，插入、重复或缺失。多态性基因座可小至一个碱基对。多态性标志可包括限制性片段长度多态性、可变数目串联重复序列(VNTR)、超变区、小卫星序列、二核苷酸重复序列、三核苷酸重复序列、四核苷酸重复序列、简单序列重复和插入元件例如Alu。可以随意指定第一个识别的等位基因型为参考型，且指定其他等位基因型为可选的或变体基因座。在选择的群体中最常出现的等位基因型有时被称为野生型。二倍体生物对于等位基因型可以是纯合的或杂合的。二等位基因多态性具有两种形式。三等位基因多态性具有三种形式，等等。两个核酸之间的多态性可以自然发生，或者通过暴露于或接触化学物质、酶或其他试剂或者暴露于引起核酸损伤的试剂(例如，紫外辐射、诱变剂或致癌剂)而引起。单核苷酸多态性(SNP)是人群中两种可选碱基以可感知的频率(大于约1％)发生的位置，且是最常见的人类基因变异类型。
术语基因型分型是指确定个体在基因组中的一个或多个位置携带的基因信息。例如，基因型分型可包括确定在哪个或哪些基因座个体携带了单一SNP，或者在哪个或哪些基因座个体携带了多个SNP。例如，基因组中的特定核苷酸在一些个体中可以是A，而在其他个体中可以是C。在该位置上具有A的那些个体具有A基因座，而具有C的那些个体具有C基因座。在二倍体生物中，个体将具有两个拷贝的含有多态性位置的序列，因此个体可以具有A基因座和C基因座或者可选地两个拷贝的A基因座或者两个拷贝的C基因座。具有两个拷贝的C基因座的那些个体对于C基因座是纯合的，具有两个拷贝的A基因座的那些个体对于C基因座是纯合的，而具有每个基因座的一个拷贝的那些个体是杂合的。可以设计阵列以区分这三种可能的结果的每一个。多态性位置可以具有两个或更多个可能的基因座，且可以设计阵列以区分所有可能的组合。
在一些实施方式中，本文所公开的方法可包括测定多个不同靶核酸的至少一部分的甲基化程度。启动子区S中的CpG岛中的DNA甲基化与转录沉默及其他细胞过程有关。然而，异常的DNA甲基化与几种遗传性人类疾病有关，且特别地肿瘤抑制基因中CpG岛的甲基化已经牵涉到肿瘤发生。已经开发了甲基化特异性MLPA(MS-MLPA)以检测涉及多种失调的基因中的表观遗传学变化(参见，例如Nygren等，Nucleic Acids Res.33:e128(2005)，其全部内容通过引用在此全文引入)。在MS-MLPA中，靶核酸含有识别未甲基化的GCGC序列的内切酶HhaI的限制性酶切位点。在杂交步骤后，退火的探针组可用HhaI处理，其消化与未甲基化的DNA杂交的探针组，留下与甲基化DNA杂交的未消化的探针组。因此，只扩增与甲基化DNA结合的探针组。甲基化水平可通过与对照比较来定量。在一些实施方式中，本文所公开的用以测定甲基化程度的方法可用于诊断普拉德-威利综合征(PWS)或安格尔曼综合症(AS)。在一些实施方式中，本文所公开的用于检测甲基化程度的方法可用于评估肿瘤中基因的超甲基化，这样的基因包括但不限于MGMT、TIMP3和CDKN2A。
如本领域技术人员将意识到的，本文中关于DNA公开的方法可等同应用于基于RNA的检测。因此，在一些实施方式中，本文所公开的方法可包括定量靶mRNA。反转录酶MLPA(RT-MLPA)是特别开发用于mRNA谱分析的MLPA变型。用于mRNA检测和定量的RT-MLPA可用于查询各种细胞凋亡和炎症基因。
通常在MLPA中采用的MLPA连接酶不连接与RNA靶退火的DNA寡聚物。为避开这种情况，RT-MLPA开始于采用RT-引物的反转录酶反应，该RT-引物邻近探针识别位点或者甚至与探针识别位点重叠直接退火，因而将短mRNA片段反转录为cDNA。由于短cDNA片段早已足以用于探针结合，RNA降解对于RT-MLPA结果的影响是小的。
在RT反应后，RT-MLPA如同在标准MLPA中一样继续进行，以探针与它们的靶cDNA的杂交开始。在一些实施方式中，RT-MLPA探针设计为包括它们的靶序列中的外显子边界：探针的一部分可与外显子1的最后25个核苷酸杂交，而另一部分与外显子2的前35个核苷酸杂交。这样的“内含子跨越”设计防止探针产生经常存在于RNA样品中的污染基因组DNA的信号。
在一些实施方式中，本文所公开的方法可用于测定拷贝数、单核苷酸多态性的存在、甲基化程度和mRNA的量中的至少一个或其任意组合。
将意识到，各种上文所公开的和其他特征和功能，或其替代，可以期望地结合到许多其他不同的系统或应用中。另外，目前未预见的或未预料的其各种替代、改变、变化或改进可随后由本领域技术人员进行，并且也旨在为如下权利要求所包括。
虽然上述描述是涉及特定实施方式，但是应理解可进行许多改变而不背离其精神。所附权利要求旨在覆盖这样的改变，因为其将落入本文中的实施方式的真正范围和精神内。
因此，当前公开的实施方式被认为在所有方面都是说明性的而非限制性的，实施方式的范围是由所附权利要求而非前面的描述所指明。在权利要求的等同的含义和范围内的所有变化都旨在被包括于其中。
实施例
下文所给出的实施例是可用于实践本实施方式的不同组成和条件的说明。除非另有说明，所有的比例都是按重量计。然而明显地，根据上述的公开内容和如下文所指出的，本实施方式可以以许多类型的组成来实践并且可以具有许多不同的用途。
实施例I
进行性假肥大性肌营养不良(DMD)基因中的拷贝数变异
这个实施例示出了使用MLPA-SBS在单一MLPA-SBS分析中筛选79个外显子的DMD基因。
来自在DMD基因中具有已知拷贝数变异的两位进行性假肥大性肌营养不良患者的DNA和正常对照购自生物储藏库(biological repository)(万维网http://wwwn.cdc.gov/dls/genetics/rmmaterials/pdf/duchenne_becker.pdf)。购买针对DMD基因的所有外显子的设计的传统MLPA探针并与这些基因组DNA杂交，并使其经受热稳定连接酶(依照万维网http://www.mlpa.com上所描述的实验方案)。连接后，反应是用如下所指的引物进行的PCR扩增：
用恒定区修饰的引物1.0
CACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGGGTTCCCTAAGGGTTGGA-3’SEQID NO:1
SBS索引#1，用反向恒定区的互补序列修饰
ACGACCGTGTCTAGCCTTCTCGTGTGCAGACTTGAGGTCAGTGTAGTGCTAGAGCATACGGCAGAAGACGAAC-5’(索引#1引物，SEQ ID NO:2)
.ACGACCGTGTCTAGCCTTCTCGTGTGCAGACTTGAGGTCAGTGCGGTTATAGAGCATACGGCAGAAGACGAAC-5’(索引#6引物，SEQ ID NO:3)
.ACGACCGTGTCTAGCCTTCTCGTGTGCAGACTTGAGGTCAGTGGAACATTAGAGCATACGGCAGAAGACGAAC-5’(索引#12引物，SEQ ID NO:4)
Ed探针实例。代表MRC-holland DMD探针对#01691-L00465的两个寡核苷酸被示出。下划线区ideize基因组，而突出显示区域对于所有MLPA探针寡核苷酸是恒定的。潜在连接通过“-”表示
Sed为扩增连接的MLPA探针，并同时制备它们以在Illumina eq系统上进行多重SBS测序。
这些引物设计为1)批扩增全部成功连接的MLPA探针(经由恒定区)，2)添加Illumina-特异性接头序列以使得能够进行SBS，和3)应用样品特异性条码以在汇合(pooled)测序运行上进行样品-样品识别。在Illumina MiSeq(San Diego，CA)上对扩增后产物一并进行纯化、定量和测序。将测序阅读片段与人基因组比对，如图4中，映射到每个DMD探针的阅读片段的数目进行计数、标准化和作图。从图4的图表中明显地，标准化的阅读片段计数揭示了男性患者的外显子49-52的完全缺失，和女性携带患者(男性患者的母亲)的外显子49-52的杂合缺失。DMD是X连锁基因，且因此缺失将在男性中显示为零阅读片段计数，而在携带者女性中显示为大约为对照的一半的阅读片段计数。这些注释符合从基因储藏库获得的原始患者基因型的注释，且因此证实了通过MLPA-SBS的拷贝数检测。
实施例II
MLPA原理论证
这个实施例示出了采用用于读出的商业化系统(Illumina，Inc.，San Diego，CA)的高度多重MLPA的用途。
如下设计用于DMD、BRCA1/2、PMS2、SMN1/2和对照基因的无填充探针。左和右探针序列(LPO和RPO)附带有使得能够用Illumina索引引物进行扩增的序列。对于每个探针对，LPO序列(其与基因组退火)在它的5'端附接以产生如下寡核苷酸：
5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT—[LPO]-3'，SEQ ID NO:5。类似地，各个探针对中的RPO在它的3'端附接以产生如下寡核苷酸
5'-P-[RPO]-AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCA C-3'，SEQ ID NO:6。这个RPO寡核苷酸也用5'磷酸酯修饰以利于在邻近LPO退火时的连接。
部分左接头：
5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT—LPO，SEQ ID NO:7
LPO是左探针寡核苷酸，其对应于与基因组DNA靶退火的互补序列。
部分右接头(具有标记为“P”的5'磷酸酯)：
P-RPO-AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-3'，SEQ ID NO:8
RPO＝＝右侧探针寡核苷酸，其对应于与直接邻近LPO的基因组DNA靶退火的互补序列。
使用标准寡核苷酸合成方法合成了两百五十七个探针对并以等摩尔量合并。
将上述探针对的池与变性的基因组DNA杂交，将退火的探针对连接并使用下述引物扩增。
在成功的杂交和连接之后，探针对构型如下：
5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT—LPO-RP O-AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-'3，SEQ ID NO:9
使用所示引物的连接后扩增添加了Illumina测序所要求的额外序列，特别是流动池扩增和样品多重识别。
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT，SEQ ID NO:10
ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT—LPO-RPO-A GATCGGAAGAGCACACGTCTGAA CTCCAGTCAC，SEQ ID NO:11
CTTGAGGTCAGTG(TAGTGC)TAGAGCATACGGCAGAAGAC GAAC，SEQ ID NO:12
PCR引物，索引1(ATCACG)SEQ ID NO:13
这个试验在含有前文表征的DMD基因拷贝数变化的八个样品上进行。使用50bp单端运行在Illumina MiSeq上对产物进行测序。将阅读片段映射到基于标签的参照物上，将每个标签的命中针对每个样品的总产率标准化。标准化的标签计数示于图5到12中。所有八个事件都是可容易检测的，而不需要标准化阅读片段计数的复杂分析。
原始提交的和可能经过修改的权利要求包括本文所公开的实施方式和教导的变化、替代、改变、改进、等同和基本上等同，包括目前未预见的或未预料的，和例如可由申请人/专利权人和其他人得出的那些。除非在权利要求中明确记载，权利要求的步骤或组分有关任何特定顺序、数量、位置、尺寸、形状、角度、颜色或材料不应从说明书或其他权利要求中暗示或得出。
本文中涉及的所有专利和申请都据此明确通过引用在此将全文并入本说明书中。
Figure IDA0000775102760000011
Figure IDA0000775102760000021
Figure IDA0000775102760000031
Figure IDA0000775102760000041

Claims (5)

1.一种通过多重连接依赖性探针扩增在单次运行中查询多个不同靶核酸的体外、非诊断性的且非治疗性的方法，其包括：
(a)提供样品组织以查询至少100个不同靶核酸，其中所述靶核酸是基因组DNA；
(b)针对所述至少100个不同靶核酸中的每一个提供多个不同的探针组，其中每个探针组包含：
第一基因座特异性探针，其由第一接头序列和第一靶特异性部分组成；和
第二基因座特异性探针，其由第二接头序列和邻近所述第一靶特异性部分的第二靶特异性部分组成；
(c)将所述多个不同探针组与所述至少100个不同靶序列杂交以形成至少100个杂交复合体；
(d)连接所述至少100个杂交复合体以形成至少100个不同的连接的探针；
(e)扩增所述至少100个不同的连接的探针以形成至少100个不同扩增子，其中所述扩增步骤使用第一通用引物和第二通用引物进行，所述第一通用引物包含与所述第一接头序列互补的区域，所述第二通用引物包含与所述第二接头序列互补的区域；和
(f)通过对所述至少100个不同扩增子的每一个进行测序在检测系统中与长度无关地检测所述至少100个不同扩增子，
其中所述至少100个不同靶核酸在100到1000个靶核酸的范围内。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少100个不同靶核酸在100到500个靶核酸的范围内。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测系统包括合成测序。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述检测系统包括配置在包含所述至少100个不同扩增子的阵列上进行合成测序循环的流体处理系统，所述检测系统被配置为将辐射从源引导至所述阵列并将荧光发射从所述阵列引导至照相机，和配置为自动改变所述检测系统以增加引导至所述阵列的所述辐射的暴露水平和在所述增加的暴露下检测从所述阵列到所述照相机的荧光发射的系统控制界面。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其还包括测定所述至少100个不同扩增子的序列。
CN201380072327.3A 2012-12-07 2013-12-06 多重核酸检测方法 Active CN104995309B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261734838P 2012-12-07 2012-12-07
US61/734,838 2012-12-07
PCT/US2013/073745 WO2014089536A1 (en) 2012-12-07 2013-12-06 Multiplex nucleic acid detection methods

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104995309A CN104995309A (zh) 2015-10-21
CN104995309B true CN104995309B (zh) 2020-12-08

Family

ID=50884061

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380072327.3A Active CN104995309B (zh) 2012-12-07 2013-12-06 多重核酸检测方法

Country Status (10)

Country Link
US (1) US9624533B2 (zh)
EP (1) EP2929044B1 (zh)
JP (1) JP6484177B2 (zh)
CN (1) CN104995309B (zh)
BR (1) BR112015013234B1 (zh)
CA (1) CA2894381C (zh)
CL (1) CL2015001568A1 (zh)
HK (1) HK1216653A1 (zh)
IL (1) IL239258B (zh)
WO (1) WO2014089536A1 (zh)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110283888B (zh) 2013-08-19 2021-06-22 卓异生物公司 用于单分子检测的测定及其应用
WO2016070164A1 (en) * 2014-11-01 2016-05-06 Singular Bio, Inc. Assays for single molecule detection and use thereof
AU2016219943A1 (en) 2015-02-18 2017-10-12 Singular Bio, Inc. Assays for single molecule detection and use thereof
CN107083427B (zh) * 2016-04-01 2021-07-30 广州市基准医疗有限责任公司 Dna连接酶介导的dna扩增技术
WO2017181161A1 (en) * 2016-04-15 2017-10-19 Predicine, Inc. Systems and methods for detecting genetic alterations
US11174503B2 (en) 2016-09-21 2021-11-16 Predicine, Inc. Systems and methods for combined detection of genetic alterations
US11268137B2 (en) 2016-12-09 2022-03-08 Boreal Genomics, Inc. Linked ligation
EP3565906B1 (en) * 2017-01-05 2021-01-27 Tervisetehnoloogiate Arenduskeskus AS Quantifying dna sequences
US20180237853A1 (en) * 2017-02-19 2018-08-23 Yan Wang Methods, Compositions and Kits for Detection of Mutant Variants of Target Genes
CN107177693B (zh) * 2017-07-19 2020-11-06 中山大学 一种多倍pcr扩增方法
WO2019046768A1 (en) * 2017-08-31 2019-03-07 William Marsh Rice University SYMBOLIC SEQUENCING OF DNA AND RNA BY SEQUENCE CODING
CN110656159B (zh) * 2018-06-28 2024-01-09 深圳华大生命科学研究院 一种拷贝数变异的检测方法
JP7361774B2 (ja) * 2018-07-27 2023-10-16 ミリアド・ウィメンズ・ヘルス・インコーポレーテッド シーケンスリードの独立したアラインメントおよびペアリングによって高度に相同なシーケンスにおける遺伝的変異を検出するための方法
CN109402232A (zh) * 2018-10-23 2019-03-01 中国农业大学 一种用于检测的组合物及检测方法
CA3117898A1 (fr) * 2018-11-05 2020-05-14 Centre Henri Becquerel Methode de diagnostic d'un cancer et kit associe

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101395280A (zh) * 2006-03-01 2009-03-25 凯津公司 基于测序的高通量SNPs连接检测技术
WO2011091106A2 (en) * 2010-01-22 2011-07-28 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for gene signature - based chemical screening
CN102648295A (zh) * 2009-12-07 2012-08-22 伊鲁米那股份有限公司 用于多重基因分型的多样品索引
WO2012158967A1 (en) * 2011-05-17 2012-11-22 Dxterity Diagnostics Incorporated Methods and compositions for detecting target nucleic acids

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US5508179A (en) 1994-03-18 1996-04-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Use of deoxyribose nicotinamide adenine dinucleotide to enhance the specificity of NAD+ -dependent ligation reactions
CA2255774C (en) * 1996-05-29 2008-03-18 Cornell Research Foundation, Inc. Detection of nucleic acid sequence differences using coupled ligase detection and polymerase chain reactions
US6544732B1 (en) 1999-05-20 2003-04-08 Illumina, Inc. Encoding and decoding of array sensors utilizing nanocrystals
GB0400584D0 (en) 2004-01-12 2004-02-11 Solexa Ltd Nucleic acid chacterisation
SE0401270D0 (sv) 2004-05-18 2004-05-18 Fredrik Dahl Method for amplifying specific nucleic acids in parallel
WO2009092035A2 (en) * 2008-01-17 2009-07-23 Sequenom, Inc. Methods and compositions for the analysis of biological molecules
CA2757300C (en) * 2009-04-01 2018-01-09 Dxterity Diagnostics Incorporated Chemical ligation dependent probe amplification (clpa)
WO2012018397A2 (en) * 2010-08-02 2012-02-09 The Regents Of The University Of California Molecular subtyping of oral squamous cell carcinoma to distinguish a subtype that is unlikely to metastasize

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101395280A (zh) * 2006-03-01 2009-03-25 凯津公司 基于测序的高通量SNPs连接检测技术
CN102648295A (zh) * 2009-12-07 2012-08-22 伊鲁米那股份有限公司 用于多重基因分型的多样品索引
WO2011091106A2 (en) * 2010-01-22 2011-07-28 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for gene signature - based chemical screening
WO2012158967A1 (en) * 2011-05-17 2012-11-22 Dxterity Diagnostics Incorporated Methods and compositions for detecting target nucleic acids

Also Published As

Publication number Publication date
EP2929044B1 (en) 2019-02-06
JP2016500257A (ja) 2016-01-12
IL239258B (en) 2019-12-31
US9624533B2 (en) 2017-04-18
CL2015001568A1 (es) 2016-08-26
US20140235470A1 (en) 2014-08-21
IL239258A0 (en) 2015-07-30
HK1216653A1 (zh) 2016-11-25
EP2929044A4 (en) 2016-07-13
BR112015013234B1 (pt) 2021-12-21
EP2929044A1 (en) 2015-10-14
CA2894381C (en) 2021-01-12
JP6484177B2 (ja) 2019-03-13
WO2014089536A1 (en) 2014-06-12
CN104995309A (zh) 2015-10-21
BR112015013234A2 (pt) 2018-02-06
CA2894381A1 (en) 2014-06-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104995309B (zh) 多重核酸检测方法
US20210388430A1 (en) Compositions of toehold primer duplexes and methods of use
US10072287B2 (en) Methods of targeted sequencing
EP3495497B1 (en) Methods and compositions for multiplex pcr
US20020098484A1 (en) Method of analyzing single nucleotide polymorphisms using melting curve and restriction endonuclease digestion
US10174368B2 (en) Methods and systems for sequencing long nucleic acids
JP2003518951A (ja) 多型核酸配列の同時増幅およびリアルタイム検出のための方法
KR101856205B1 (ko) 핵산의 대립형질 특이적 프라이머 및 이를 이용한 유전형 판별 방법
Tawata et al. Screening for genetic mutations. A review
CN109477139B (zh) 使用长ssDNA多核苷酸作为PCR测定中的引物的方法
CN108291254B (zh) 用于检测单核苷酸多态性的试剂盒和方法
EP2130927A1 (en) Method for amplification of dna fragment
US9909170B2 (en) Method for multiplexed nucleic acid patch polymerase chain reaction
Park et al. DNA Microarray‐Based Technologies to Genotype Single Nucleotide Polymorphisms
KR102079963B1 (ko) 소거 프로브 기반 염색체 수적이상 검출방법 및 염색체 수적이상 검출용핵산의 조성물
JP4395363B2 (ja) 核酸検出方法
Park et al. Universal probe amplification: Multiplex screening technologies for genetic variations
Dahl et al. Methods for detection of subtle mutations in cancer genomes
WO2009098998A1 (ja) 核酸検出方法及び核酸検出用キット
WO2024074669A1 (en) Detection of molecular analytes based on tailored probe competition
EP1354063A2 (en) Detecting specific nucleotide sequences
Lefferts et al. Essential Concepts and Techniques in Molecular Biology
O’Leary et al. 3 Blots, dots, amplification, and sequencing

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1216653

Country of ref document: HK

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: WD

Ref document number: 1216653

Country of ref document: HK