BR112015013234B1 - Método para amplificação multiplex de sonda dependente de ligação - Google Patents
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Abstract
métodos de detectação de ácido nucleico multiplex. métodos para amplificação multiplex de sonda dependente de ligação incluem (a) proporcionar uma amostra de tecido para acessar uma pluralidade de diferente s ácidos nucleicos alvos; (b) proporcionar uma pluralidade d e conjuntos de sonda diferentes para cada da pluralidade de diferentes ácidos nucleicos alvos, cada conjunto de sonda incluindo uma primeira sonda lócus específica tendo uma primeira sequência adaptadora e uma primeira porção específica alvo; e uma segunda sonda lócus específica tendo uma segunda sequência adaptadora, e uma segunda porção específica alvo adjacente à primeira porção específica alvo; (c) hibridização dos conjuntos de sonda às se quências alvos para formar complexos de hibridização; (d) ligar os complexos de hibridização para formar sondas ligada s; (e) amplificar as sondas ligadas para formar amplicons, e (f) detectar os amplicons em um sistema de detecção por sequenciação de cada dos amplicons.
Description
[001] Modalidades aqui descritas referem-se a ácidos nucleicos, e mais particularmente a métodos para a detecção multiplex de sequências de ácidos nucleicos alvos.
[002] A amplificação multiplex de sonda dependente de ligação (MLPA) é uma técnica de PCR multiplex que permite a avaliação do, inter alia, número de cópia de vários ácidos nucleicos alvos em um único experimento. Em MLPA, cada ácido nucleico alvo é detectado pela amplificação de uma sonda ligada. A sonda ligada é gerada por hibridização e ligação de um conjunto de sonda compreendendo um par de semi-sondas que se destinam a permanecer adjacentes uma a outra ao longo da sequência de ácidos nucleicos alvos de interesse. Só quando as semi-sondas hibridizam com o ácido nucleico alvo ligação e amplificação subsequentes irão ocorrer.
[003] Figura 1 mostra um fluxograma para um ensaio típico de MLPA. O ensaio começa por desnaturação da amostra de DNA e hibridização dos conjuntos da sonda com suas sequências de ácidos nucleicos alvos. Após a hibridização, as semi-sondas adjacentes são ligadas e os conjuntos de sonda ligadas resultantes estão sujeitas a amplificação por PCR. Os conjuntos de sondas ligadas amplificadas são, em seguida, analisadas por eletroforese capilar (CE). A altura do pico da leitura por CE serve como a leitura para o número de cópia alvo genômica.
[004] Conforme indicado na Figura 1, cada conjunto de sonda é composta por uma porção de meia-sonda 5' e 3' tendo uma sequência alvo específica e uma sequência de iniciador universal permitindo a amplificação por PCR multiplex simultânea de todos os conjuntos de sonda ligada. Além disso, uma (como mostrado na figura 1) ou ambas semi-sondas ainda incluem uma sequência stuffer que facilita a diferenciação em detecção das sondas amplificadas por CE. O uso dessas sequências stuffer que permitem a detecção por CE com base no comprimento de ácidos nucleicos tem imposto limites sobre o número de ácidos nucleicos alvos que podem ser acessados em uma única corrida. Atualmente, esse limite é de cerca de 40 ácidos nucleicos alvos. Devido ao baixo custo, potencial para alto rendimento e a capacidade para detectar pequenos rearranjos associados com MLPA, seria benéfico expandir o número de sequências de ácidos nucleicos alvos que podem ser acessadas em um único ensaio. A presente invenção proporciona métodos para tal expansão em número de acesso e proporciona também vantagens relacionadas.
[005] De acordo com modalidades aqui ilustradas, são proporcionados métodos para aumentar o número de ácidos nucleicos alvos que podem ser acessados no ensaio de amplificação multiplex de sonda dependente de ligação (MLPA).
[006] Em alguns aspectos, modalidades aqui descritas proporcionam métodos para a amplificação multiplex de sonda dependente de ligação que compreende: (a) proporcionar uma amostra de tecido para acessar uma pluralidade de diferentes ácidos nucleicos alvos, (b) proporcionar uma pluralidade de diferentes conjuntos de sonda para cada da pluralidade de diferentes ácidos nucleicos alvos, em que cada conjunto de sondas compreende uma primeira sonda lócus específica que compreende uma primeira sequência adaptadora e uma primeira porção específica alvo e uma segunda sonda lócus específica compreendendo uma segunda sequência adaptadora, e uma segunda porção específica alvo adjacente a primeira porção alvo específica, (c) hibridizar a pluralidade de diferentes conjuntos de sonda para a pluralidade de diferentes sequências alvos de modo a formar uma pluralidade de complexos de hibridização, (d) ligar a pluralidade de complexos de hibridização de modo a formar uma pluralidade de sondas ligadas, (e) amplificar a pluralidade de sondas ligadas para formar uma pluralidade de amplicons, em que a etapa de amplificação é realizada com um primeiro iniciador universal compreendendo uma região complementar à primeira sequência adaptadora e um segundo iniciador universal que compreende uma região complementar à segunda sequência adaptadora, e (h) detectar a pluralidade de amplicons em um sistema de detecção, independentemente do comprimento, por sequenciação de cada da pluralidade de amplicons.
[007] Em outros aspectos, modalidades aqui reveladas fornecem métodos compreendendo o fornecimento de um sistema de detecção que compreende um sistema de manuseio de fluidos configurado para executar ciclos de sequenciação por síntese em uma matriz que compreende uma pluralidade de amplicons, o sistema de detecção configurado para direcionar a radiação de uma fonte da matriz e direcionar a emissão de fluorescência da matriz de uma câmera, e uma interface de controle do sistema configurada para modificar automaticamente o sistema de detecção para aumentar o nível de exposição à radiação direcionada para a matriz e detectar emissão de fluorescência da matriz para a câmara sob exposição aumentada, proporcionando a pluralidade de amplicons através de amplificação multiplex de sonda dependente de ligação, e determinar as sequências da pluralidade de amplicons.
[008] Para uma melhor compreensão das modalidades presentes, referência pode ser feita às figuras anexas.
[009] Figura 1 mostra um fluxograma para amplificação multiplex de sonda dependente de ligação (MLPA) empregando sistemas de detecção por eletroforese capilar.
[010] Figura 2 mostra um fluxograma para MLPA- Sequenciamento-por-síntese (SBS), de acordo com modalidades aqui reveladas.
[011] Figura 3 mostra um fluxograma para MLPA-SBS empregando indexação, de acordo com modalidades aqui reveladas.
[012] Figura 4 mostra um gráfico de contagem de leitura versus o número de éxon para os 79 éxons associados com o gene da distrofia muscular de Duchenne (DMD), demonstrando o uso de uma única corrida do sistema MLPA-SBS para detectar a variação do número de cópia em amostras de fêmeas, machos e de controle, de acordo com modalidades aqui reveladas.
[013] Figura 5 mostra outro exemplo como na Figura 4 de contagem de leitura versus números de éxons normalizados no gene de DMD. Amostras de fêmeas estão na faceta superior e amostras de machos são mostradas na faceta inferior. Destacados na caixa são contagens de um macho (amostra de DNA Coriell id NA03782) com uma deleção em éxons 3 a 17.
[014] Figura 6 mostra outro exemplo como na Figura 5 de contagem de leitura versus números de éxons normalizados no gene de DMD. Destacados na caixa são contagens de um macho (amostra de DNA Coriell id NA03929) com uma deleção em éxons 46 a 50.
[015] Figura 7 mostra outro exemplo como na Figura 5 de contagem de leitura versus números de éxons normalizados no gene de DMD. Destacados na caixa são contagens de uma fêmea (amostra de DNA Coriell id NA04099) com uma deleção em éxons 49 a 52.
[016] Figura 8 mostra outro exemplo como na Figura 5 de contagem de leitura versus números de éxons normalizados no gene de DMD. Destacados na caixa são contagens de um macho (amostra de DNA Coriell id NA04100, filho de NA04099) com uma deleção em éxons 49 a 52.
[017] Figura 9 mostra outro exemplo como na Figura 5 de contagem de leitura versus números de éxons normalizados no gene de DMD. Destacados na caixa são contagens de uma fêmea (amostra de DNA Coriell id NA04315) com uma deleção em éxon 44.
[018] Figura 10 mostra outro exemplo como na Figura 5 de contagem de leitura versus números de éxons normalizados no gene de DMD. Destacados na caixa são contagens de um macho (amostra de DNA Coriell id NA043217) com uma deleção em éxons 5 a 7.
[019] Figura 11 mostra outro exemplo como na Figura 5 de contagem de leitura versus números de éxons normalizados no gene de DMD. Destacados na caixa são contagens de um macho (amostra de DNA Coriell id NA04364) com uma deleção em éxons 51 a 55.
[020] Figura 12 mostra outro exemplo como na Figura 5 de contagem de leitura versus números de éxons normalizados no gene de DMD. Destacados na caixa são contagens de um macho (amostra de DNA Coriell id NA04981) com uma deleção em éxons 45 a 53.
[021] Na descrição a seguir, entende-se que outras modalidades podem ser utilizadas e mudanças estruturais e operacionais podem ser feitas sem se afastar do escopo das presentes modalidades aqui reveladas.
[022] De acordo com modalidades aqui descritas, são fornecidos métodos que possam permitir que o número de ácidos nucleicos alvos que podem ser acessados no ensaio de amplificação multiplex de sonda dependente de ligação (MLPA) para ser substancialmente aumentados a partir da limitação atual de cerca de 40 sequências de ácidos nucleicos alvos por corrida. Por exemplo, o suo de sistemas de sequenciação por síntese (SBS) para a detecção de produtos amplificados pode remover as limitações do número de acesso definido por sistemas de detecção com base em CE. Em termos práticos, o número de sequências alvos acessadas em métodos aqui descritos só precisa de ser limitado pela disponibilidade de conjuntos de sondas apropriadas.
[023] Além disso, empregando sistemas de detecção SBS pode simplificar o design do conjunto de sonda eliminando a necessidade de sequências stuffer como os meios para diferenciar produtos de sonda amplificada e, portanto, pode reduzir os custos associados ao desenvolvimento de conjuntos de sondas. Sistemas de detecção de SBS podem utilizar indexação opcional dos conjuntos de sondas de uma forma independente do comprimento da sonda amplificada. Vantajosamente, utilizando sistemas de detecção de SBS com indexação pode facilitar, por exemplo, acesso simultânea de vários pacientes/amostras de tecido. Finalmente, a detecção de SBS pode fornece sensibilidade melhorada à detecção permitindo uma redução no tamanho da amostra em relação a técnicas baseadas em CE.
[024] Em algumas modalidades, são proporcionados métodos para amplificação multiplex de sonda dependente de ligação compreendendo (a) proporcionar uma amostra de tecido para acessar uma pluralidade de diferentes ácidos nucleicos alvos, (b) proporcionar uma pluralidade de diferentes conjuntos de sondas para cada da pluralidade de diferentes ácidos nucleicos alvos, em que cada conjunto de sondas compreende uma primeira sonda lócus específica que compreende uma primeira sequência adaptadora e uma primeira porção específica alvo, e uma segunda sonda lócus específica compreendendo uma segunda sequência adaptadora, e uma segunda porção específica alvo adjacente a primeira porção alvo específica, (c) hibridar a pluralidade de diferentes conjuntos de sondas para a pluralidade de diferentes sequências alvos de modo a formar uma pluralidade de complexos de hibridização, (d) ligar a pluralidade de complexos de hibridização de modo a formar uma pluralidade de sondas ligadas, (e) amplificar a pluralidade de sondas ligadas para formar uma pluralidade de amplicons, em que a etapa de amplificação é realizada com um primeiro iniciador universal que compreende uma região complementar à primeira sequência adaptadora e um segundo iniciador universal que compreende uma região complementar à segunda sequência adaptadora, e (f) detectar a pluralidade de amplicons em um sistema de detecção, independentemente do comprimento, por sequenciação de cada da pluralidade de amplicons.
[025] As modalidades aqui reveladas fornecem um número de diferentes ácidos nucleicos como iniciadores e sondas/conjuntos de sondas. Como aqui utilizado, "ácido nucleico" ou equivalentes gramaticais significam pelo menos dois nucleotídeos covalentemente ligados. Um ácido nucleico conterá geralmente ligações de fosfodiéster, apesar de em alguns casos, em particular para uso em sondas, análogos de ácidos nucleicos podem ser incluídos que podem ter estruturas principais alternativas, compreendendo, por exemplo, fosforamida (Beaucage et al., Tetrahedron 49 (10):1925 (1993) e referências deste; Letsinger, J. Org. Chem, 35:3800 (1970); Sprinzl et al., Eur. J. Biochem. 81: 579 (1977); Letsinger et al., Nucl. Acids Res. 14:3487 (1986); Sawai et al., Chem. Lett. 805 (1984), Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110: 4470 (1988); e Pauwels et al, Chemica Scripta 26: 141 91986)), fosforotiolato (Mag et al., Nucleic Acids Res. 19:1437 (1991); e patente US n° 5.644.048)), fosforoditioato (Briu et al., J. Am Chem Soc: 2321(1989), ligações de O-metilfoforoamidita (veja Eckstein, Oligonucleotides e Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press), e ligações e cadeias principaisde ácido nucleico e peptídeo (ver Egholm, J. Am Chem Soc. 114:1895 (1992); Meier et al., Chem Int Ed Engl 31:1008 (1992); Nielsen, Nature, 365:566 (1993): Carisson et al., Nature 380:207 (1996), todos os quais são incorporados por referência). Outros ácidos nucleicos análogos incluem aqueles com estruturas principais positivamente carregadas (Denpcy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6097 (1995); cadeias principais não iônicas (patentes US n°s 5.386.023, 5.637.684, 5.602.240, 5.216.141 e 4.469.863; Kiedrowshi et al., Angew. Chem. Intl. Ed. English 30:423 (1991); Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110:4470 (1988); Letsinger et al., Nucleoside & Nucleotide 13:1597 (1994); Capítulos 2 e 3, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y.S. Sanghui e P. Dan Cook; Mesmaeker et al., Bioorganic & Medidicinal Chem. Lett. 4: 395 (1994); Jeffs et al., J. Biomolecular NMR 34:17 (1994); Tetrahedron Lett. 37:743 (19986)) e estruturas principais com não ribose, incluindo as descritas nas Patentes n°s 5.235.033 e 5.034.506, e os capítulos 6 e 7, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y.S. Sanghui e P. Dan Cook. Os ácidos nucleicos contendo um ou mais açúcares carbocíclicos são também incluídos dentro da definição de ácidos nucleicos (ver Jenkins et al., Chem. Soc. Rev. (1995) pp 169-176). Vários análogos de ácidos nucleicos estão descritos em Rawls, C & E News News, 02 de junho de 1997, página 35. Os ácidos nucleicos podem também ser “ácidos nucleicos bloqueados”. Todas estas referências são, deste modo, expressamente incorporadas por referência na sua totalidade. Modificações da cadeia principal com ribose-fosfato podem ser feitas para facilitar a adição de marcadores, ou para aumentar a estabilidade e meia-vida de tais moléculas em ambientes fisiológicos, por exemplo. Como irá ser verificado por aqueles versados na técnica, todos estes análogos de ácidos nucleicos podem encontrar uso como sondas nos métodos aqui descritos. Além disso, as misturas de ácidos nucleicos de ocorrência natural e análogos podem ser preparadas. Alternativamente, misturas de diferentes análogos de ácidos nucleicos e misturas de ácidos nucleicos de ocorrência natural e análogos podem ser empregadas.
[026] O tamanho dos iniciadores e ácidos nucleicos de sonda empregados nos métodos aqui descritos pode variar, como irá ser verificado por aqueles versados na técnica, com cada iniciador universal e cada porção de meia-sonda e o comprimento total da meia-sonda, em geral, variando de cerca de 5 a cerca de 500 nucleotídeos de comprimento. Cada porção de meia-sonda em um conjunto de sondas pode estar em uma faixa de cerca de 10 a cerca de 100 nucleotídeos, de cerca de 15 a cerca de 50 nucleotídeos, ou de cerca de 10 a cerca de 35 nucleotídeos em comprimento, incluindo todas sub-faixas no meio. Por exemplo, as sequências adaptadoras das semi-sondas podem estar em uma faixa de 15 a 25 nucleotídeos em comprimento, sendo 20 típico. A porção específica alvo de cada meia-sonda pode estar em uma faixa de cerca de 15 a cerca de 50 nucleotídeos em comprimento, ou de cerca de 30 a cerca de 40 nucleotídeos em comprimento, incluindo todas as sub-faixas no meio. Assim, o comprimento total da sequência alvo em um produto ligado (ligação de duas meia-sondas) pode estar em uma faixa de cerca de 30 a cerca de 100 nucleotídeos em comprimento, ou de cerca de 60 a cerca de 80 nucleotídeos de comprimento, incluindo todas as sub-faixas no meio.
[027] Os métodos aqui descritos fornecem uma pluralidade de conjuntos de sonda alvo. "Conjuntos de sonda" inclui a pluralidade de pares de meia-sonda lócus específica que são usados em ensaios de MLPA. Nesse contexto, a pluralidade significa pelo menos dois ou pelo menos 10 ou pelo menos 50, ou pelo menos 100, e assim por diante, dependendo do ensaio, amostra e propósito do teste.
[028] Por "sítio de iniciação universal" entende-se aqui a uma sequência de que irá ligar um iniciador de PCR para amplificação. Cada meia-sonda compreende uma sequência adaptadora que fornece ou um sítio de iniciação universal a montante (UUP) ou um sítio de iniciação universal a jusante (DUP). "A montante" e "a jusante" não significam direcionar uma orientação 5'-3', e dependerá da orientação do sistema. Além disso, as sequências adaptadoras estão geralmente localizadas na extremidade 5' e 3' da meia-sonda ou os produtos ligados, uma vez que apenas as sequências flanqueadas por tais sequências de iniciação serão amplificadas.
[029] Além disso, as sequências de iniciação universais são geralmente escolhidas para serem tão únicas quanto possível, dado os ensaios particulares e genomas de hospedeiro para garantir a especificidade do ensaio. Em geral, as sequências de iniciação universal podem variar em tamanho de cerca de 5 a cerca de 35 nucleotídeos com cerca de 20 sendo típico.
[030] Como será observado por aqueles versados na técnica, a orientação dos dois sítios de iniciação nos conjuntos de sondas ligadas são diferentes. Isto é, um iniciador de PCR irá diretamente hidridizar com a primeira sequência adaptadora (primeiro sítio de iniciação universal), enquanto o outro iniciador de PCR irá hibridizar com o complemento da segunda sequência adaptadora (segundo sítio de iniciação universal). Estabelecido diferentemente, o primeiro sítio de iniciação está na orientação de sentido, e o segundo sítio de iniciação está na orientação anti-sentido.
[031] Além das sequências adaptadoras usadas como sítios de iniciador, as semi-sondas compreendem pelo menos uma primeira sequência específica local, que é substancialmente complementar a uma porção do ácido nucleico alvo. Como descrito abaixo, as sondas de ligação compreendem cada porção separada de uma sequência específica local. Como será observado por aqueles versados na técnica, a sequência lócus específica pode assumir uma ampla variedade de formatos, dependendo do uso da sonda. Embora referência seja feita à "meia-sondas", isto não pretende significar que as duas semi-sondas abrangendo um acesso de ácido nucleico alvo necessita ser complementar a exatamente a metade do alvo do ácido nucleico alvo. Por exemplo, as duas semi-sondas podem ser concebidas para dividir um ácido nucleico alvo de acesso em uma primeira porção lócus específica que compreende uma sequência que é complementar a cerca de um terço do ácido nucleico alvo, enquanto que a segunda porção lócus específica pode ser complementar a dois terços do ácido nucleico alvo. Além disso, as duas semi-sondas não tem necessariamente abranger a totalidade de uma sequência de ácido nucleico alvo. A pessoa versada na técnica irá observar que a escolha exata de concepção das meios-sondas apropriadas pode ser facilitada por, inter alia, métodos computacionais.
[032] Em algumas modalidades, a sequência lócus específica pode abranger uma junção de splice de interesse. Como aqui descrito, as sequências específicas locais podem ser concebidas para serem substancialmente complementares às sequências na extremidade de éxons alternativos individuais. Por substancialmente complementar aqui entende-se que as sondas são suficientemente complementares às sequências alvos para hibridar sob condições de reação normais, e fornecer a necessária especificidade de anelamento. Uma vez que os éxons estão separados por íntrons, as sequências de detecção podem residir em diferentes partes de uma molécula de RNA. Assim, uma sequência lócus específica pode compreender duas partes: uma parte a montante, complementar para o término de um primeiro éxon, e uma parte a jusante, complementar para o término de um segundo éxon. Somente se o splicing ocorreu e o íntron interveniente foi removido a sequência específica alvo irá hibridizar com a sequência de nucleico alvo sob as condições do ensaio.
[033] Em modalidades, as sondas específicas locais podem compreender sondas específicas alelas. Assim, a primeira sonda lócus específica e a segunda sonda lócus específica podem ser ambas sondas específicas alelas.
[034] Uma variedade de condições de hibridização pode ser utilizada na presente invenção, incluindo condições de alta, média e baixa restringência; ver, por exemplo, Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edição, 1989, e Short Protocols em Molecular Biology, ed. Ausubel, et al., aqui incorporada por referência. As condições de restringência são dependentes da sequência e serão diferentes em circunstâncias diferentes. Sequências mais longas hibridizam especificamente a temperaturas mais altas. Um guia extenso para a hibridização de ácidos nucleicos encontra-se em Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). Geralmente, as condições de restringência são selecionadas para ser cerca de 5 a cerca de 10°C menor do que o ponto de fusão térmico (Tm) para a sequência especifica em uma concentração iônica e pH definidos. O Tm é a temperatura (sob concentração iônica definida, pH e concentração de ácido nucleico) à qual 50% das sondas complementares ao alvo hibridizam com a sequência alvo em equilíbrio (já que as sequências alvo estão presentes em excesso, em Tm, 50% das sondas estão ocupadas em equilíbrio). As condições de restringência compreendem aquelas em que a concentração salina é menor do que cerca de íon sódio a 1,0M, tipicamente cerca de 0,01 a 1,0 M de concentração de íon sódio (ou outros sais) em pH 7,0 a 8,3 e a temperatura é pelo menos cerca de 30°C para sondas curtas (por exemplo, 10 a 50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60°C para sondas longas (por exemplo, maior do que 50 nucleotídeos). As condições de restringência podem também ser alcançadas com a adição de agentes desestabilizadores de hélice tal como formamida. As condições de hibridização podem também variar quando uma cadeia principal não-iônico, ou seja, PNA é usada, como é conhecido na técnica, em adição, agentes de reticulação podem ser adicionados após a ligação alvo para reticulação, ou seja, fixar de forma covalente as duas fitas do complexo de hibridização.
[035] Assim, os ensaios de MLPA são geralmente executados sob condições de restringência permitindo a formação do complexo de hibridização apenas na presença do alvo. Restringência pode ser controlada pela alteração de um parâmetro da etapa que é uma variável termodinâmica, incluindo, mas não limitados a temperatura, concentração de formamida, concentração salina, concentração de sal caotrópico, pH, concentração de solvente orgânico, e o semelhante. Estes parâmetros também podem ser utilizados para controlar a ligação não especifica, como está geralmente descrito na patente n° 5.681.697. Assim, pode ser desejável efetuar certas etapas em condições de restringência maiores para reduzir a ligação não- específica.
[036] Após os complexos de hibridização serem formados as semi-sondas estão ligadas e os produtos ligados podem ser amplificados para formar amplicons, que são então detectados. Isso pode ser feito, por exemplo, pela amplificação por PCR. Em algumas modalidades, marcadores podem ser incorporados nos amplicons.
[037] Muitos ligases conhecidas na técnica podem ser adequadas para utilização nos métodos aqui descritos, por exemplo, Lehman, Science, 186:790-797 (1974); Engler et al, DNA Ligases, páginas 3-30 em Boyer, editor, The Enzymes, Vol. 15B (Academic Press, Nova Iorque, 1982); e o semelhante. Alguns ligases incluem T4 DNA ligase, T7 DNA ligase, Taq ligase, Pfu ligase e Tth ligase. Os protocolos para seu uso são bem conhecidos, por exemplo, Sambrook et al., (citado acima); Barany, PCR Methods an Applications, 1:5-16 (1991); Marsh et al., Strategies, 5:73-76 (1992); e o semelhante. Geralmente, as ligases necessitam de um grupo 5' fosfato estar presente para ligação à hidroxila 3' de uma fita confrontante. Em algumas modalidades, ligases incluem ligases termostáveis ou (termofílicas), tais como pfu ligase, Tth ligase, Taq ligase e DNA ligase AMPLIGASE™ (Epicentre Technologies, Madison, Wis.). AMPLIGASE ™ tem uma baixa atividade de ligação de extremidade plana.
[038] Em algumas modalidades, a ligase é uma que tem pelo menos uma ligação incompatível. A especificidade da ligase pode ser aumentada substituindo as ligases dependentes de NAD+ mais específicos, tais como ligase de E. coli e Taq ligase (termoestável) para a T4 DNA ligase menos específica. O uso de análogos de NAD na reação de ligação aumenta ainda mais a especificidade da reação de ligação. Ver, patente US n° 5.508.179 de Wallace et al.
[039] Em algumas modalidades, a técnica de amplificação é PCR. A reação em cadeia da polimerase (PCR) é amplamente utilizada e descrita e envolve o uso de extensão do iniciador combinado com ciclos térmicos para ampliar uma sequência alvo; ver patentes US 4.683.195 e 4.683.202, e PCR Essential Data, J.W. Wiley & Sons, Ed. CR Newton, 1995, todas as quais são incorporadas por referência na sua totalidade.
[040] Em geral, o PCR pode ser descrito sucintamente como se segue. Os conjuntos de sondas ligadas de fita dupla são desnaturados, geralmente aumentando a temperatura, e, em seguida, resfriando na presença de um excesso de um iniciador de PCR, que então hibridiza com a primeira sequência adaptadora. Uma DNA polimerase então atua para estender o iniciador com dNTPs, resultando na síntese de uma nova fita que forma um complexo de hibridização. A amostra é então novamente aquecida para dissociar o complexo de hibridização e o processo é repetido. Através do uso de um segundo iniciador de PCR para a fita alvo complementar que hibrida com a segunda sequência adaptadora, amplificação rápida e exponencial ocorre. Assim, etapas de PCR são desnaturação, hibridização e extensão. Os dados de PCR são bem conhecidos, e incluem o uso de uma polimerase termoestável tal como Taq I polimerase e ciclos térmicos. DNA polimerase adequada inclui, mas não está limitada a, fragmento de Klenow de DNA polimerase I, SEQUENASE 1.0 e SEQUENASE 2.0 (US Biochemical), T5 DNA polimerase e Phi29 DNA polimerase.
[041] A reação de PCR pode ser iniciada pela introdução dos conjuntos de sondas ligadas a uma solução que compreende os iniciadores universais, uma polimerase e um conjunto de nucleotídeos. Por "nucleotídeo", nesse contexto aqui, entende-se um trifosfato de nucleosídeo (também denominados desoxinucleotídeos ou dNTP, por exemplo, dATP, dTTP, dCTP e dGTP). Em algumas modalidades, como descrito abaixo, um ou mais dos nucleotídeos podem compreender um marcador detectável, o qual pode ser tanto um marcador primário ou secundário. Além disso, os nucleotídeos podem ser análogos de nucleotídeos, dependendo da configuração do sistema. Similarmente, os iniciadores podem compreender um marcador primário ou secundário.
[042] Por conseguinte, a reação de PCR utiliza dois iniciadores de PCR (avançado e reverso), uma polimerase, e um conjunto de dNTP. Como aqui descrito, os iniciadores podem compreender um marcador, ou um ou mais dos dNTP podem compreender um marcador. Em algumas modalidades, pelo menos um dos primeiro iniciador universal e segundo iniciador universal compreende ainda uma sequência de indexação. O uso de uma sequência de indexação tal como a descrito no pedido W005068656, os conteúdos dos quais são aqui incorporados por referência na sua totalidade, permite que várias amostras diferentes a serem analisadas na mesma corrida de sequenciação enquanto preserva a identidade de cada amostra.
[043] Em algumas modalidades, os amplicons podem ser marcados com um marcador de detecção. Por "marcador de detecção" entende-se aqui uma porção que permite a detecção. Em algumas modalidades, o marcador de detecção é um marcador primário. Um marcador primário é aquele que pode ser detectado diretamente, tal como um fluoróforo. Em geral, marcadores são classificados em três classes: a) marcadores isotópicos, que poderão ser isótopos radioativos ou pesados; b) marcadores elétricos, magnéticos e térmicos; e c) corantes coloridos ou luminescentes. Marcadores podem também incluir enzimas (peroxidase de rábano, etc) e partículas magnéticas. Marcadores incluem cromóforos ou fósforos e corantes fluorescentes. Corantes adequados para uso em processos aqui descritos incluem, mas não estão limitados a, complexos de lantanídeo fluorescente, incluindo aqueles de európio e térbio, fluoresceína, rodamina, tetrametilrodamina, eosina, eritrosina, cumarina, metil-cumarinas, ponto quântico (também referido como "nanocristais"; ver US de n° de série 09/315.584, aqui incorporada por referência), pireno, verde malaquita, estilbenos, Lucifer amarelo, CASCADE BLUE™, Texas Red, corantes Cy (Cy3, Cy5, etc.), corantes Alexa, ficoeritina, bodipy, e outros descritos na 6a edição do Molecular Probes Handbook por Richard P. Haugland, aqui expressamente incorporado por referência na sua totalidade.
[044] Os amplicons gerados na etapa de amplificação de PCR podem ser analisados de várias maneiras, de uma forma que é independente do comprimento. Em algumas modalidades, amplicons podem ser caracterizados através de métodos de sequenciação por síntese (SBS). A sequenciação pode ser realizada utilizando qualquer técnica adequada de "sequenciação por síntese", em que os nucleotídeos são sucessivamente adicionados a um grupo de 3'-hidroxila livre, normalmente fornecidos por anelamento de um iniciador de sequenciação, o que resulta na síntese de uma cadeia de polinucleotídeo no sentido 5' a 3'. A natureza do nucleotídeo adicionado pode ser determinada depois de cada adição.
[045] Um método de sequenciação adequado que pode ser utilizado nos métodos da invenção baseia-se na utilização de nucleotídeos modificados que podem atuar como terminadores de cadeia. Uma vez que o nucleotídeo modificado foi incorporado na cadeia crescente de polinucleotídeo complementar à região da sonda ligada sendo sequenciada não existe grupo 3'-OH livre disponível para direcionar ainda uma sequência da extensão e, por conseguinte, a polimerase não pode adicionar mais nucleotídeos. Uma vez que a natureza da base incorporada na cadeia em crescimento tem sido determinada, o bloco 3' pode ser removido para permitir a adição do próximo nucleotídeo sucessivo. Ao ordenar os produtos derivados utilizando estes nucleotídeos modificados, é possível deduzir a sequência de ácido nucleico da sonda ligada. Tais reações podem ser feitas em um único experimento se cada um dos nucleotídeos modificados tenha ligado um marcador diferente, conhecido para corresponder à base particular, para facilitar a discriminação entre as bases adicionadas em cada etapa de incorporação. Alternativamente, uma reação separada pode ser realizada contendo cada dos nucleotídeos modificados separadamente.
[046] Os nucleotídeos modificados podem transportar um marcador para facilitar a sua detecção. Em algumas de tais modalidades, este pode ser um marcador fluorescente. Cada tipo de nucleotídeo pode transportar um marcador fluorescente diferente. No entanto, o marcador detectável não precisa ser um marcador fluorescente. Qualquer marcador pode ser utilizado que permite a detecção da incorporação do nucleotídeo na sequência de ácido nucleico.
[047] Um método para a detecção dos nucleotídeos marcados com fluorescência compreende utilizar a radiação de um comprimento de onda específico para os nucleotídeos marcados, ou o uso de outras fontes de iluminação adequadas. A fluorescência do marcador no nucleotídeo pode ser detectada por uma câmara CCD ou outros meios de detecção adequados.
[048] Os métodos aqui descritos não estão limitados à utilização do método de sequenciação descrito acima, mas podem ser utilizados em conjunto com, essencialmente, qualquer metodologia de sequenciação que se baseia na incorporação sucessiva de nucleotídeos em uma cadeia de polinucleotídeo. As técnicas adequadas incluem, por exemplo, PYROSEQUENCING™, FISSEQ (fluorescente na sequenciação in situ), MPSS (massivamente paralela na sequenciação de assinatura) e sequenciação por métodos baseados na ligação. Em algumas modalidades, é possível preparar as matrizes dos conjuntos de sondas ligadas. Com o uso de matrizes é possível sequenciar alvos múltiplos da mesma ou de diferentes sequências em paralelo.
[049] Referindo-nos agora à FIGURA 2, é mostrado um fluxograma que resume um método exemplar para o ensaio de MLPA-SBS, de acordo com modalidades aqui reveladas. Como indicado na FIGURA 2, uma amostra de acesso de DNA é hibridizada com um conjunto de sonda compreendendo semi- sondas5' e 3' (sonda esquerda e sonda direita) que hibridiza entre um alvo genômico. As meios-sondas são selecionadas para estarem adjacentes uma a outra sobre o alvo genômico, permitindo, assim, a ligação do conjunto de sondas. As semi-sondas também são fornecidas com sequências adaptadoras que serão utilizadas na amplificação por PCR. Após a ligação, o conjunto de sonda ligada é amplificado por PCR com o auxílio de iniciadores avançados e reversos. Estes são iniciadores universais selecionados para serem complementares às sequências adaptadoras que flanqueiam a porção específica alvo das meia-sondas. Os amplicons gerados por amplificação de PCR podem então ser sequenciados. Em algumas modalidades, métodos de sequenciação adequados podem incluir o sistema de Sequenciação de Nova Geração (NGS) desenvolvido utilizando as plataformas do sistema MISEQ® ou HISEQ® disponíveis de lllumina, Inc. (San Diego, CA). Em algumas modalidades, tais sistemas de detecção podem compreender um sistema de manuseio de fluidos configurado para executar ciclos de sequenciação por síntese em uma matriz que compreende uma pluralidade de amplicons, o sistema de detecção configurado para direcionar a radiação de uma fonte para a matriz e para direcionar a emissão de fluorescência da matriz para uma câmara, e uma interface de controle do sistema configurado para modificar automaticamente o sistema de detecção para aumentar o nível de exposição à radiação direcionada para a matriz e detectar emissão de fluorescência a partir da matriz para a câmara em uma exposição aumentada. FIGURA 3 mostra um fluxograma de um método similar como aquele mostrado na FIGURA 2 em que uma sequência de indexação é proporcionada no iniciador reverso modificado. A sequência do fluxograma é o mesmo, mas as sequências de indexação aparecem nos amplicons resultantes facilitando a identificação de ácidos nucleicos alvos a partir de múltiplas fontes.
[050] Em algumas modalidades, os métodos aqui descritos podem ser utilizados para acessar uma pluralidade de diferentes ácidos nucleicos alvos que são maiores do que cerca de 100 em único ensaio. Em algumas modalidades, os métodos aqui descritos podem ser utilizados para acessar uma pluralidade de diferentes ácidos nucleicos alvos que estão em uma faixa de cerca de 50 a cerca de 100 ácidos nucleicos alvos em uma única corrida. Em algumas modalidades, os métodos aqui descritos podem ser utilizados para acessar uma pluralidade de diferentes ácidos nucleicos alvos que estão em uma faixa de cerca de 100 a cerca de 500 ácidos nucleicos alvos com uma única corrida. Em algumas modalidades, os métodos aqui descritos podem ser utilizados para acessar uma pluralidade de diferentes ácidos nucleicos alvos que estão em uma faixa de cerca de 100 a cerca de 1.000 ácidos nucleicos alvos em uma única corrida. Em algumas modalidades, os métodos aqui descritos podem ser utilizados para acessar uma pluralidade de diferentes ácidos nucleicos alvos que estão em uma faixa de cerca de 100 a cerca de 108 ácidos nucleicos alvos em uma única corrida. Em princípio, o número de ácidos nucleicos alvos que pode ser acessado pode ser limitado apenas pela disponibilidade de um conjunto adequado de sonda.
[051] Em algumas modalidades, os métodos aqui revelados podem compreender determinar o número de cópias de cada da pluralidade de ácidos nucleicos alvos diferentes. Em algumas de tais modalidades, o levantamento dos dados da sequenciação por síntese pode fornecer diretamente informação do número da cópia. Em algumas modalidades, a determinação do número de cópia pode ser realizada na presença de um controle e cada ácido nucleico alvo acessado para o número de cópia pode ser normalizado com base nesse controle. Em algumas modalidades, a determinação do número de cópia pode ser utilizada para avaliar a presença de doença genética associada com variação do número de cópia aberrante (CNV). Assim, em algumas modalidades, é proporcionado um método de detecção de uma doença ou desordem associado com CNV aberrante que compreende a determinação do número de cópia de um ou mais ácidos nucleicos alvos. Em algumas de tais modalidades, a doença ou desordem pode incluir, sem limitação, a distrofia muscular de Duchenne (DMD), Distrofia Muscular de Becker (BMD), atrofia muscular espinhal (SMA), doença de Charcot- Marie-Tooth (GMT), neuropatia hereditária com responsabilidade para exercer pressão sobre a paralisia (HNNP), câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, polipose adenomatosa familiar (FAP), câncer colorretal sem polipose (HNPCC). Uma pessoa versada na técnica irá verificar que estas são doenças/desordens meramente exemplares e variação do número de cópia aberrante pode ocorrer em qualquer gene resultando em qualquer número de outras condições de doença.
[052] Em algumas modalidades, a determinação da CNV pode ser utilizada em métodos para diagnosticar e/ou monitorar a progressão de um câncer. A progressão subjacente de eventos genéticos que transformam uma célula normal em uma célula cancerosa pode ser caracterizada por uma mudança do estado diplóide para aneuplóide (Albertson et al., (2003), Nat Genet, Vol. 34, pp. 369-76 e Lengauer et al., (1998), Nature, vol. 396, pp. 643-9). Como resultado da instabilidade genômica, as células cancerosas acumulam alterações tanto aleatórias e causais em múltiplos níveis de mutações pontuais em aberrações completamente cromossômicas. Variação do número de cópia no diagnóstico e/ou monitoramento da progressão de câncer inclui, mas não está limitada a, detectar a perda de heterozigotia (LOH) e deleções de homozigoto, o que pode resultar na perda dos genes supressores de tumores, e eventos de amplificação de genes, que pode resultar na ativação celular do proto-oncogenes.
[053] Em algumas modalidades, os métodos aqui descritos podem compreender a detecção de um polimorfismo de um único nucleotídeo. Polimorfismo refere-se à ocorrência de duas ou mais sequências alternativas geneticamente determinadas ou locais em uma população. Um sítio ou marcador polimórfico é o lócus no qual ocorre divergência. Em algumas modalidades, os marcadores têm pelo menos dois lócus, cada ocorrendo com uma frequência superior a cerca de 1%, e em outras modalidades, maior do que 10% ou 20% de uma população selecionada. Um polimorfismo pode compreender uma ou mais alterações de bases, uma inserção, uma repetição ou uma deleção. Um lócus polimórfico pode ser tão pequeno como um par de bases. Marcadores polimórficos podem incluir polimorfismos com comprimento de fragmento de restrição, número variável de repetições em tandem (VNTR's), regiões hipervariáveis, minissatélites, repetições de dinucleotídeos, repetições de trinucleotídeos, repetições de tetranucleotídeos, repetições de seqüência simples, e elementos de inserção tal como Alu. A primeira forma alélica identificada pode ser arbitrariamente designada como a forma de referência e outras formas alélicas são designadas como alternativa ou lócus variante. A forma alélica mais frequente em uma população selecionada é por vezes referida como a forma de tipo selvagem. Organismos diplóides podem ser homozigotos ou heterozigotos para formas alélicas. Um polimorfismo dialélico tem duas formas. Um polimorfismo trialélico tem três formas, e assim por diante. Um polimorfismo entre dois ácidos nucleicos pode ocorrer naturalmente, ou ser causado por exposição ou contato com produtos químicos, enzimas, ou outros agentes, ou exposição a agentes que causam danos aos ácidos nucleicos, por exemplo, radiação ultravioleta, agentes mutagênicos ou cancerígenos. Polimorfismos de único nucleotídeo (SNPs) são posições em que duas bases alternativas ocorrem com uma frequência considerável (superior a cerca de 1%) na população humana, e são o tipo mais comum de variação genética humana.
[054] O termo genotipagem refere-se à determinação de informações genéticas que um indivíduo carrega em uma ou mais posições no genoma. Por exemplo, a genotipagem pode compreender a determinação de qual lócus ou loci um indivíduo carrega por um único SNP ou a determinação do lócus ou loci que um indivíduo carrega para uma pluralidade de SNPs. Por exemplo, um nucleotídeo particular em um genoma pode ser um A em alguns indivíduos e um C em outros indivíduos. Aqueles indivíduos que têm um A na posição tem o lócus A e aqueles que têm um C têm o lócus C. Em um organismo diplóide o indivíduo terá duas cópias da sequência contendo a posição polimórfica por isso o indivíduo pode ter um lócus A e um lócus C ou, alternativamente, duas cópias do lócus A ou duas cópias do lócus C. Aqueles indivíduos que têm duas cópias do lócus C são homozigóticos para o lócus C, aqueles indivíduos que têm duas cópias do lócus A são homozigóticos para o lócus C, e aqueles indivíduos que têm uma cópia de cada lócus são heterozigóticos. Uma matriz pode ser concebida para distinguir entre cada um destes três resultados possíveis. Uma localização polimórfica pode ter dois ou mais lócus possíveis e uma matriz pode ser concebida para distinguir entre todas as combinações possíveis.
[055] Em algumas modalidades, os métodos aqui divulgados podem compreender determinar um grau de metilação de pelo menos uma porção da pluralidade de diferentes ácidos nucleicos alvos. Metilação do DNA em ilhas CpG em regiões promotoras está associada com o silenciamento transcricional e outros processos celulares. No entanto, a metilação de DNA aberrante está associada a várias doenças hereditárias humanas e metilação de ilhas CpG em genes supressores de tumores, em particular, tem implicado em tumorigênese. A metilação específica de MLPA (MS-MLPA) foi desenvolvida para detectar alterações epigenéticas em genes envolvidos em várias desordens (ver, por exemplo, Nygren et al., Nucleic Acids Res. 33: E128 (2005), todo o conteúdo do qual é aqui incorporado por referência na sua totalidade). No MS-MLPA, os ácidos nucleicos alvos contem um sítio de restrição para a endonuclease Hhal, que reconhece sequências GCGC não metiladas. Após a etapa de hibridização, os conjuntos de sondas hibridadas podem ser tratados com Hhal que digere conjuntos de sondas hibridizadas em DNA não metilado, deixando conjuntos de sondas hibridizadas não digeridas em DNA metilado. Assim, apenas os conjuntos de sondas associadas com DNA metilado são amplificados. O nível de metilação pode ser quantificado por comparação com um controle. Em algumas modalidades, os métodos aqui descritos para determinar o grau de metilação podem ser usados para diagnosticar síndrome de Prader Willi (PWS) ou síndrome de Angelman (AS). Em algumas modalidades, os métodos aqui descritos para a detecção do grau de metilação podem ser usados para avaliar a hipermetilação de genes em tumores, tais genes incluindo, sem limitação, MGMT, TIMP3, e CDKN2A.
[056] Como será observado pelas pessoas versadas na técnica, os métodos aqui descritos com respeito ao DNA podem aplicar-se igualmente a detecção baseada em RNA. Assim, em algumas modalidades, os métodos aqui descritos podem compreender uma quantificação de RNAm alvo. Transcriptase reversa MLPA (RT-MLPA) é uma variante do MLPA desenvolvido especialmente para o perfil de RNAm. RT-MLPA para a detecção e quantificação de RNAm pode ser utilizado no acesso de vários genes de apoptose e inflamação.
[057] A enzima ligase MLPA tipicamente empregada em MLPA não liga oligonucleotídeos de DNA que são anelados em um RNA alvo. Para contornar isso, RT-MLPA começa com uma reação de transcriptase reversa empregando RT-iniciadores, que anelam diretamente adjacente ou mesmo sobrepõem com o sítio de reconhecimento da sonda, assim transcrevendo reversamente fragmentos de RNA curtos em DNAc. Como fragmentos de DNAc curtos são já suficientes para as sondas se ligarem, a influência de degradação do RNA em resultados de RT-MLPA é pequena.
[058] Após a reação de RT, RT-MLPA continuar como em MLPA padrão, começando com a hibridização de sondas para o seu DNAc alvo. Em algumas modalidades, as sondas de RT-MLPA destinam-se a incluir um contorno de éxon na sua sequência alvo: uma parte de uma sonda pode hibridizar para os últimos 25 nucleotídeos de éxon 1, enquanto que os outros se ligam aos primeiros 35 nucleotídeos do éxon 2. Tal concepção de "íntron spanning" impede a sonda de gerar um sinal de DNA genômico contaminante que está muitas vezes presente em amostras de RNA.
[059] Em algumas modalidades, os métodos aqui descritos podem ser utilizados para determinar, pelo menos, um de um número de cópias, a presença de um polimorfismo de um único nucleotídeo, um grau de metilação, e uma quantidade de RNAm, ou qualquer combinação dos mesmos.
[060] Será observado que vários dos acima-revelados e outros aspectos e funções, ou alternativas destes, podem ser desejavelmente combinados em muitos outros sistemas ou aplicações diferentes. Além disso, várias alternativas presentemente imprevistas, modificações, variações ou aperfeiçoamentos destes podem ser subsequentemente feitos por aqueles versados na técnica, e também se destinam a ser abrangidos pelas reivindicações a seguir.
[061] Embora a descrição acima refere-se a modalidades particulares, deve ser entendido que muitas modificações podem ser feitas sem se afastar do espírito desta. As reivindicações anexas destinam-se a cobrir tais modificações como estaria dentro do verdadeiro espírito e escopo das modalidades aqui.
[062] As modalidades presentemente descritas são, portanto, para serem consideradas em todos os aspectos como ilustrativas e não restritivas, o escopo das modalidades sendo indicado pelas reivindicações anexas em vez da descrição anterior. Todas as alterações que se enquadrem dentro do significado e da faixa de equivalência das reivindicações destinam-se para serem incluídas nesta. EXEMPLOS
[063] Os exemplos apresentados aqui a seguir e são ilustrativos das diferentes composições e as condições que podem ser utilizadas na prática das presentes modalidades. Todas as proporções são em peso, salvo indicação em contrário. Será evidente, no entanto, que as presentes modalidades podem ser praticadas com muitos tipos de composições e podem ter muitos usos diferentes de acordo com a descrição acima e apontados a seguir. Exemplo I Variação do número de cópia em gene da Distrofia Muscular de Duchenne (DMD)
[064] Esse exemplo ilustra o uso de SBS-MLPA para rastrear o gene de DMD no éxon 79 em um único ensaio de MLPA-SBS.
[065] DNA de dois pacientes com Distrofia Muscular de Duchenne com número de cópias conhecido variantes no gene de DMD, e um controle normal foram adquiridos de um repositório biológico (na rede mundial em http://wwwn.cdc.gov/dls/genetics/rmmaterials/pdf/duchenne_b ecker.pdf). Sondas de MLPA tradicionais concebidas contra todos os éxons do gene de DMD foram adquiridas e hibridizadas com estes DNAs genômicos, e submetidas a ligase termoestável (por protocolos descritos na rede mundial em http://www.mlpa.com). Pós-ligação, as reações foram amplificadas por PCR com os iniciadores descritos indicados a seguir: Primer 1.0 modificado com a região constante CACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGGGTTCCCTA AGGGTTGGA-3' SEQ ID N0:1 Índice #1 de SBS, modificado com complemento para região constante reversa ACGACCGTGTCTAGCCTTCTCGTGTGCAGACTTGAGGTCAGTGTAGTGCTAGA GCATACGGCAGAAGACGAAC-5'(Índice #1 do iniciador, SEQ ID N0: 2) ACGACCGTGTCTAGCCTTCTCGTGTGCAGACTTGAGGTCAGTGCGGTTATAGA GCATACGGCAGAAGACGAAC-5'(Índice #6 do iniciador, SEQ ID N0: 3) ACGACCGTGTCTAGCCTTCTCGTGTGCAGACTTGAGGTCAGTGGAACATTAGA GCATACGGCAGAAGACGAAC-5'(Índice #12 do iniciador, SEQ ID N0: 4)
[066] Exemplo de sonda Ed. Dois oligonucleotídeos são mostrados que representam par de sonda de DMD MRC-Holland #01691-L00465. A região sublinhada idealizada ao genoma, enquanto as regiões em negrito são constantes para todos os oligonucleotídeos de sonda de MLPA. O potencial de ligação é designado por "-".
[067] Sed para amplificar as sondas de MLPA ligadas e, simultaneamente, preparando-as para sequenciamento de SBS multiplexado no sistema lllumina eq.
[068] Estes iniciadores foram concebidos para 1) amplificar em lote todas as sondas de MLPA ligadas com sucesso (via as regiões constantes), 2) adicionar sequências adaptadoras específicas de lllumina para permitir SBS, e 3) aplicar códigos de barras específicos de amostra para identificação da amostra-amostra na corrida de sequenciamento em conjunto. Produtos da pós-amplificação foram purificados, quantificados, e sequenciados em conjunto em lllumina MiSeq (San Diego, CA). Leituras da sequência foram alinhadas com o genoma humano, e os números do mapeamento das leituras para cada sonda de DMD foram contados, normalizados, e representados graficamente como na Figura 4. É evidente a partir do gráfico na Figura 4 que as contagens de leitura normalizada revelaram uma deleção completa em éxons 49-52 para o paciente macho, e uma deleção heterozigótica em éxons 49-52 para a paciente fêmea portadora (a mãe do paciente macho). DMD é um gene ligado ao X e, assim, uma deleção irá se manifestar em machos como contagem de leitura zero, enquanto que em uma mulher portadora irá se manifestar como uma contagem de leitura de cerca de metade do controle. Estas anotações correspondem aquelas dos genótipos originais do paciente obtidas a partir do repositório genético, e assim demonstra, a detecção do número de cópia via MLPA-SBS. Exemplo II Prova de Princípio de MLPA
[069] Esse Exemplo mostra o uso de MPA altamente multiplexado usando um sistema comercial (IIIumina, Inc., San Diego, CA) para a leitura. Sondas livres de Stuffer para DMD, BRCA1/2, PMS2, SMN1/2, e genes de controle foram concebidos como se segue. Sequências de sonda esquerda e direita (LPO e RPO) foram acrescentados com sequências que permitem a amplificação com os iniciadores de indexação lllumina. Para cada par de sonda, a sequência de LPO (que hibridiza com o genoma) foi acrescentada na sua extremidade 5' para criar o oligonucleotídeo seguinte: 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-[LPO]-3', SEQ ID N0: 5. Similarmente, o RPO em cada par de sonda foi acrescentado em sua extremidade 3' para criar o seguinte oligonucleotídeo 5'-P-[RPO]- AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-3', SEQ ID N0: 6. Esse oligonucleotídeo de RPO também é modificado com um fosfato 5' para facilitar a ligação mediante anelamento adjacente ao LPO.
[070] Adaptador parcial esquerdo: 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-LPO, SEQ ID NO: 7 LPO é o oligonucleotídeo de sonda esquerda que corresponde à sequência complementar que anela com o DNA alvo genômico.
[071] Adaptador parcial direito (com fosfato 5' indicado como "P"): P-RPO-AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-3', ID SEQ N0: 8 RPO == oligonucleotídeo de sonda direita que corresponde às sequências complementares que anela com o DNA alvo genômico diretamente adjacente ao LPO.
[072] Duzentos e cinquenta e sete pares de sondas foram sintetizados e agrupados em quantidades equimolares utilizando síntese de oligonucleotídeos padrão.
[073] O conjunto acima descrito de pares de sondas foi hibridizado com DNA genômico desnaturado, pares de sondas anelados foram ligados e amplificados utilizando os iniciadores descritos a seguir.
[074] Após a hibridização e ligação bem sucedidas, o par da sonda como a configuração a seguir: 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-LPO-RPO- AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-'3, SEQ ID N0: 9
[075] Amplificação pós-ligação com os iniciadores indicados acrescenta sequências adicionais necessárias para sequenciamento com lllumina, especificamente a amplificação de célula-fluxo e identificação multiplex de amostras. AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTC TTCCGATCT, SEQ ID N0: 10 ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-LPO-RPO- AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC, SEQ ID N0: 11 CTTGAGGTCAGTG (TAGTGC) TAGAGCATACGGCAGAAGACGAAC, SEQ ID N0: 12 Primer de PCR, Índice 1 (ATCACG) SEQ ID N0: 13
[076] Esse ensaio foi realizado em oito amostras contendo alterações no número de cópia previamente caracterizadas do gene de DMD. Os produtos foram sequenciados em um MiSeq lllumina usando uma corrida final única de 50pb. Leituras foram mapeadas em uma referência à base de marcadores, acessos a cada marcador foram normalizados para um rendimento total para cada amostra. Contagens de marcador normalizados são mostradas nas Figuras 5 a 12. Todos os oito eventos eram facilmente detectáveis sem análise sofisticada de contagens de leitura normalizada.
[077] As reivindicações, como originalmente apresentadas e como elas podem ser emendadas, abrangem variações, alternativas, modificações, melhorias, equivalentes, e equivalentes substanciais das modalidades e os ensinamentos aqui descritos, incluindo aqueles que estão atualmente imprevistos ou não apreciados, e que, por exemplo, podem surgir a partir de requerentes/titulares de patentes e outros. A menos que especificamente descrito em uma reivindicação, etapas ou componentes de reivindicações não devem ser implícitos ou importados a partir do relatório ou quaisquer outras reivindicações como a uma qualquer ordem, número, posição, tamanho, forma, ângulo, cor ou material particular.
[078] Todas as patentes e pedidos aqui referidos são aqui especificamente, e aqui incorporados por referência na sua totalidade no presente pedido.
Claims (13)
1. Método para amplificação multiplex de sonda dependente de ligação, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) proporcionar uma amostra de tecido para acessar pelo menos 100 ácidos nucleicos alvos diferentes; (b) proporcionar uma pluralidade de conjuntos de sonda diferentes para cada um de pelo menos 100 ácidos nucleicos alvos diferentes, em que cada conjunto de sonda compreende: uma primeira sonda lócus específica que compreende uma primeira sequência adaptadora e uma primeira porção específica alvo; e uma segunda sonda lócus específica compreendendo uma segunda sequência adaptadora, e uma segunda porção específica alvo adjacente à primeira porção específica alvo; (c) hibridização da pluralidade de diferentes conjuntos de sonda com pelo menos 100 sequências alvos diferentes de modo a formar pelo menos 100 diferentes complexos de hibridização; (d) ligar, em um único recipiente ou tubo, os pelo menos 100 diferentes complexos de hibridização de modo a formar pelo menos 100 diferentes sondas ligadas; (e) amplificar as pelo menos 100 diferentes sondas ligadas para formar pelo menos 100 diferentes amplicons, em que (i) a etapa de amplificação é realizada com um primeiro iniciador universal que compreende uma região complementar à primeira sequência adaptadora e um segundo iniciador universal que compreende uma região complementar à segunda sequência adaptadora; e (ii) a amplificação das pelo menos 100 diferentes sondas ligadas é realizada em um único recipiente ou tubo; e (f) detectar os pelo menos 100 diferentes amplicons em um sistema de detecção, independentemente do comprimento, pelo sequenciamento de cada um de pelo menos 100 diferentes amplicons, em que as referidas pelo menos 100 diferentes sondas ligadas da etapa (d) são diretamente amplificadas na etapa (e), sem purificação.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a determinação do número de cópias para cada um dos pelo menos 100 diferentes ácidos nucleicos alvos.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os pelo menos 100 diferentes ácidos nucleicos alvos são pelo menos 1000 diferentes ácidos nucleicos alvos, os pelo menos 100 diferentes complexos de hibridização são pelo menos 1000 diferentes complexos de hibridização, as pelo menos 100 diferentes sondas ligadas são pelo menos 1000 diferentes sondas ligadas, e os pelo menos 100 diferentes amplicons são pelo menos 1000 diferentes amplicons.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os pelo menos 100 diferentes ácidos nucleicos alvos estão em uma faixa de 100 a 500 ácidos nucleicos alvos, os pelo menos 100 diferentes complexos de hibridização estão em uma faixa de 100 a 500 diferentes complexos de hibridização, as pelo menos 100 diferentes sondas ligadas estão em uma faixa de 100 a 500 diferentes sondas ligadas, e os pelo menos 100 diferentes amplicons estão em uma faixa de 100 a 500 diferentes amplicons.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os pelo menos 100 diferentes ácidos nucleicos alvos estão em uma faixa de 100 a 1000 ácidos nucleicos alvos, os pelo menos 100 diferentes complexos de hibridização estão em uma faixa de 100 a 1000 diferentes complexos de hibridização, as pelo menos 100 diferentes sondas ligadas estão em uma faixa de 100 a 1000 diferentes sondas ligadas, e os pelo menos 100 diferentes amplicons estão em uma faixa de 100 a 1000 diferentes amplicons.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os pelo menos 100 diferentes ácidos nucleicos alvos estão em uma faixa de 100 a 108 ácidos nucleicos alvos, os pelo menos 100 diferentes complexos de hibridização estão em uma faixa de 100 a 108 diferentes complexos de hibridização, as pelo menos 100 diferentes sondas ligadas estão em uma faixa de 100 a 108 diferentes sondas ligadas, e os pelo menos 100 diferentes amplicons estão em uma faixa de 100 a 108 diferentes amplicons.
7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos um do primeiro iniciador universal e o segundo iniciador universal compreende ainda uma sequência de indexação.
8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o sistema de detecção compreende o sequenciamento por síntese.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o sistema de detecção compreende um sistema de manuseio de fluidos configurado para executar ciclos de sequenciamento pela síntese em uma matriz que compreende pelo menos 100 diferentes amplicons, o sistema de detecção configurado para direcionar radiação de uma fonte para a matriz e para direcionar emissão de fluorescência a partir da matriz para uma câmera, e uma interface de controle do sistema configurada para modificar automaticamente o sistema de detecção para aumentar o nível de exposição à radiação direcionada para a matriz e detectar emissão de fluorescência a partir da matriz para a câmara sob a exposição aumentada.
10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método compreende a detecção de um polimorfismo de um único nucleotídeo.
11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método compreende determinar um grau de metilação de pelo menos uma porção dos pelo menos 100 diferentes ácidos nucleicos alvos.
12. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método compreende a quantificação de um RNAm alvo.
13. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a hibridização de (c), a ligação de (d) e a amplificação de (e) são realizadas em um único recipiente ou tubo.
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