JP2014083053A5 - - Google Patents

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  1. 増幅の間において高分子量生成物の形成が妨害されるか又は抑制される、試料中の核酸標的を増幅及び検出するための方法であって、当該方法が、以下の:
    a)当該試料中の核酸に、少なくともポリメラーゼと、ヌクレオシド三リン酸又は他のヌクレオシドモノマーと、少なくとも1種のアンプリコンを生成するための少なくとも1種の伸長フォワードプライマー及び/又は少なくとも1種の伸長リバースプライマーと、該アンプリコンに特異的な少なくとも1種の検出可能プローブ又はDNA結合色素とを含む増幅試薬を接触させる工程であって、該伸長フォワードプライマー及び/又はリバースプライマーの少なくとも1種は、当該プライマーの5’末端に付加されるアデノシン(A)、チミジン(T)、ウリジン(U)、シチジン(C)、又はグアノシン(G)から誘導される1種のヌクレオチド又は2種の異なるヌクレオチドからなり、標的配列に非相補的であるポリN配列を含むことを特徴とし、当該ポリN配列が、ポリA、ポリT、ポリAT、ポリU、ポリC、及びポリG配列からなる群から選ばれ、そして2〜10ヌクレオチドの長さである、工程;
    b)該核酸を該増幅試薬と、増幅反応が起きるのに充分な条件下で一定の時間インキュベートする工程であって、該増幅反応は50サイクルより前には停止されない工程;及び
    c)該検出可能プローブ又はDNA結合色素を介して該アンプリコンを検出する工程、とを含んでなる方法。
  2. 該ポリN配列は、4〜6ヌクレオチドの長さからなる、請求項1に記載の方法。
  3. 該標的核酸はウイルス核酸である、請求項1に記載の方法。
  4. 該ウイルス核酸はHCVの核酸である、請求項1に記載の方法。
  5. 工程b)は、ウラシル−DNAグリコシラーゼ活性を含む酵素の存在下で行われる、請求項1に記載の方法。
  6. 該ポリN配列は、プライマーの5’末端に付加されるアデノシン(A)又はチミジン(T)から誘導される1種のヌクレオチド又は2種の異なるヌクレオチドからなり、かつ標的配列に非相補的であり、インキュベーション工程b)は、ウラシル−DNAグリコシラーゼ活性を含む酵素の存在下で行われる、請求項1〜5に記載の方法。
  7. 請求項1〜7に記載の方法であって、少なくとも1種の該伸長フォワードプライマーは、
    AAAAGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTA(配列番号3)、
    AAAAAAGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTA(配列番号5)、
    AAAAAAAAGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTA(配列番号7)、
    TTTTGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTA(配列番号9)、
    TTTTTTGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTA(配列番号11)、
    GGGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTA(配列番号13)、
    ATATGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTA(配列番号15)、
    AAAAAACCCACTCTATGTCCGGTC(配列番号19)、
    ATATATGTACGCCGGAATTGCCGGAAA(配列番号21)、及び
    AAACCCACTCTATGTCCGGTC(配列番号23)、からなる群の1つの配列を含み、及び/又は、少なくとも1種の該伸長リバースプライマーは、
    AAAAGCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAA(配列番号4)、
    AAAAAAGCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAA(配列番号6)、
    AAAAAAAAGCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAA(配列番号8)、
    TTTTGCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAA(配列番号10)、
    TTTTTTGCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAA(配列番号12)、
    GGGCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAA(配列番号14)、
    ATATGCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAA(配列番号16)、
    AAATGGCGTCTCCCACGCGGCTGG(配列番号20)、及び
    ATATATCTTTCCCCAGGACCTGCCGGT(配列番号22)、からなる群の1つの配列を含んでなる方法。
  8. 少なくとも1種の該検出可能なプローブは、
    (配列番号27)、(配列番号28)、(配列番号29)、(配列番号30)、及びこれらの配列のそれぞれの相補配列又はサブ配列、からなる群の1つの配列を含んでなる、請求項1〜に記載の方法。
  9. PCR増幅中の高分子量生成物の形成を妨害又は抑制するための方法であって、該方法は、
    a)試料中の核酸に、少なくともポリメラーゼと、ヌクレオシド三リン酸又は他のヌクレオシドモノマーと、少なくとも1種のアンプリコンを生成するための少なくとも1種の伸長フォワードプライマー及び/又は少なくとも1種の伸長リバースプライマーと、該アンプリコンに特異的な少なくとも1種の検出可能プローブ又はDNA結合色素とを含む増幅試薬を接触させる工程であって、該伸長フォワードプライマー及び/又はリバースプライマーは、プライマーの5’末端に付加されるアデノシン(A)、チミジン(T)、ウリジン(U)、シチジン(C)、又はグアノシン(G)から誘導される1種のヌクレオチド又は2種の異なるヌクレオチドからなり、標的配列に非相補的であるポリN配列を含み当該ポリN配列が、ポリA、ポリT、ポリAT、ポリU、ポリC、及びポリG配列からなる群から選ばれ、そして2〜10ヌクレオチドの長さである、工程;
    b)該核酸を該増幅試薬と、増幅反応が起きるのに充分な条件下で所定の時間インキュベートする工程であって、該増幅反応は50サイクルより前には停止されないことを特徴とする、工程;及び
    c)該検出可能プローブ又はDNA結合色素を介して該アンプリコンを検出する工程、とを含んでなる方法。
  10. 該ポリN配列は、4〜6ヌクレオチドの長さからなる、請求項9に記載の方法。
  11. 該標的核酸はウイルス核酸である、請求項9又は10に記載の方法。
  12. 該ウイルス核酸はHCVの核酸である、請求項11のいずれかに記載の方法。
  13. 工程b)は、ウラシル−DNAグリコシラーゼ活性を含む酵素の存在下で行われる、請求項12のいずれかに記載の方法。
  14. 請求項13のいずれかに記載の方法であって、少なくとも1種の該伸長フォワードプライマーは、
    AAAAGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTA(配列番号3)、
    AAAAAAGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTA(配列番号5)、
    AAAAAAAAGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTA(配列番号7)、
    TTTTGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTA(配列番号9)、
    TTTTTTGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTA(配列番号11)、
    GGGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTA(配列番号13)、
    ATATGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTA(配列番号15)、
    AAAAAACCCACTCTATGTCCGGTC(配列番号19)、
    ATATATGTACGCCGGAATTGCCGGAAA(配列番号21)、及び
    AAACCCACTCTATGTCCGGTC(配列番号23)、からなる群の1つの配列を含み、及び/又は、少なくとも1種の該伸長リバースプライマーは、
    AAAAGCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAA(配列番号4)、
    AAAAAAGCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAA(配列番号6)、
    AAAAAAAAGCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAA(配列番号8)、
    TTTTGCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAA(配列番号10)、
    TTTTTTGCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAA(配列番号12)、
    GGGCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAA(配列番号14)、
    ATATGCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAA(配列番号16)、
    AAATGGCGTCTCCCACGCGGCTGG(配列番号20)、及び
    ATATATCTTTCCCCAGGACCTGCCGGT(配列番号22)、からなる群の1つの配列を含んでなる方法。
  15. 少なくとも1種の該検出可能なプローブは、
    (配列番号27)、(配列番号28)、(配列番号29)、(配列番号30)、及びこれらの配列のそれぞれの相補配列又はサブ配列、からなる群の1つの配列を含んでなる、請求項〜1のいずれかに記載の方法。
  16. 50サイクルより前には停止されないPCR増幅中に、高分子量生成物の形成を防止又は抑制するための、各プライマーの5’末端に付加されるアデノシン(A)、チミジン(T)、ウリジン(U)、シチジン(C)、又はグアノシン(G)から誘導される1種のヌクレオチド又は2種の異なるヌクレオチドからなるポリN配列を、それぞれが含んでなり、ここで当該ポリN配列が、ポリA、ポリT、ポリAT、ポリU、ポリC、及びポリG配列からなる群から選ばれ、そして2〜10ヌクレオチドの長さである、少なくとも1種の伸長フォワードプライマー及び/又は少なくとも1つの伸長リバースプライマーの使用。
  17. 請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法のためのキットの使用であって、当該キットが、(a)DNAポリメラーゼ活性を含む少なくとも1種の酵素と、
    (b)ウラシル−DNAグリコシラーゼ活性を含む少なくとも1種の酵素と、
    (c)ヌクレオシド三リン酸又は他のヌクレオシドモノマーと、
    (d)少なくとも1種のアンプリコンを生成するための、少なくとも1種の伸長フォワードプライマー及び/又は少なくとも1つの伸長リバースプライマーと、及び
    (e)該アンプリコンに特異的な少なくとも1種の検出可能プローブ、又はDNA結合色素とを含んでなり、
    少なくとも1種の該伸長フォワードプライマー及び/又はリバースプライマーは、プライマーの5’末端に付加される4〜10ヌクレオチドの長さの、アデノシン(A)、チミジン(T)、ウリジン(U)、シチジン(C)、又はグアノシン(G)から誘導される1種のヌクレオチド又は2種の異なるヌクレオチドからなり、標的配列に非相補的なポリN配列を含み、ここで当該ポリN配列が、ポリA、ポリT、ポリAT、ポリU、ポリC、及びポリG配列からなる群から選ばれ、そして2〜10ヌクレオチドの長さであることを特徴とするキットの使用
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