JP2015522271A5 - - Google Patents
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Description
本発明の方法の特徴の１つは、工程ｉｉｉ）において、ＰＣＲ反応におけるプライマーペアＡ）〜Ｒ）のそれぞれの産物である増幅された標的配列の存在が、以下の基準に基づく、サンプル中の下痢性病原体の存在の指標となることである。
− プライマーペアＡ）またはＢ）の産物は、ＥＨＥＣの存在の指標となり、
− プライマーペアＣ）の産物は、ＥＨＥＣ／ＥＰＥＣの存在の指標となり、
− プライマーペアＤ）の産物は、Salmonella の存在の指標となり、
− プライマーペアＥ）またはＦ）の産物は、Shigella／ＥＩＥＣの存在の指標となり、
− プライマーペアＧ），Ｈ）またはＩ）の産物は、ＥＴＥＣの存在の指標となり、
− プライマーペアＪ）の産物は、ＥＡＥＣの存在の指標となり、
− プライマーペアＫ）の産物は、Campylobacter jejuni の存在の指標となり、
− プライマーペアＬ）の産物は、Campylobacter coli の存在の指標となり、
− プライマーペアＭ）の産物は、Yersinia enterocolitica／Yersinia pseudotuberculosis の存在の指標となり、
− プライマーペアＮ）の産物は、Yersinia pseudotuberculosis／Yersinia pestis の存在の指標となり、
− プライマーペアＯ）の産物は、Vibrio cholerae の存在の指標となり、
− プライマーペアＰ）の産物は、Giardia lamblia の存在の指標となり、
− プライマーペアＱ）の産物は、Entamoeba histolytica（赤痢アメーバ）の存在の指標となり、そして
− プライマーペアＲ）の産物は、Cryptosporidium sp の存在の指標となる。
− プライマーペアＡ）またはＢ）の産物は、ＥＨＥＣの存在の指標となり、
− プライマーペアＣ）の産物は、ＥＨＥＣ／ＥＰＥＣの存在の指標となり、
− プライマーペアＤ）の産物は、Salmonella の存在の指標となり、
− プライマーペアＥ）またはＦ）の産物は、Shigella／ＥＩＥＣの存在の指標となり、
− プライマーペアＧ），Ｈ）またはＩ）の産物は、ＥＴＥＣの存在の指標となり、
− プライマーペアＪ）の産物は、ＥＡＥＣの存在の指標となり、
− プライマーペアＫ）の産物は、Campylobacter jejuni の存在の指標となり、
− プライマーペアＬ）の産物は、Campylobacter coli の存在の指標となり、
− プライマーペアＭ）の産物は、Yersinia enterocolitica／Yersinia pseudotuberculosis の存在の指標となり、
− プライマーペアＮ）の産物は、Yersinia pseudotuberculosis／Yersinia pestis の存在の指標となり、
− プライマーペアＯ）の産物は、Vibrio cholerae の存在の指標となり、
− プライマーペアＰ）の産物は、Giardia lamblia の存在の指標となり、
− プライマーペアＱ）の産物は、Entamoeba histolytica（赤痢アメーバ）の存在の指標となり、そして
− プライマーペアＲ）の産物は、Cryptosporidium sp の存在の指標となる。
上記の方法とは別に、上記綿棒を直接に溶解バッファーに懸濁することもできる。この場合は、サンプルを容積１００μｌに溶出させ、２μｌの溶出物をＰＣＲにおけるテンプレートとして用いる。このプロトコルは、完全に自動化・統合化されたサンプル作製とＰＣＲプレートのセットアップ工程に適する。
Claims (29)
- 生物学的サンプル中の下痢性病原体の存在を検出するための方法であって、
ｉ）サンプルまたはサンプルから単離した核酸を、２つ以上の個別のＰＣＲ反応を包含するマルチプレックスＰＣＲアッセイ中のプライマーペアと接触させ、但し、該プライマーペアに含まれるプライマーは、配列番号６１〜６３で定義されるＥＴＥＣのアンプリコンのそれぞれを少なくとも部分的に増幅するものであり、
ｉｉ）上記工程ｉ）で得た反応混合物を用いてポリメラーゼ連鎖反応を実施し、下痢性病原体の標的配列がサンプル中に存在した場合には、該配列を特異的に増幅し、そして
ｉｉｉ）反応混合物中の増幅された標的配列の存在を検出し、いずれかの標的配列の存在を、下痢性病原体がサンプル中に存在することの指標とする
ことを包含する方法。 - 工程ｉ）において、該プライマーペアのプライマーが更に配列番号６５〜６６で定義されるカンピロバクターのアンプリコンのそれぞれを少なくとも部分的に増幅することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- 工程ｉ）において、該プライマーペアのプライマーが更に配列番号６７〜６８で定義されるエルシニアのアンプリコンのそれぞれを少なくとも部分的に増幅することを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
- 工程ｉ）において、以下の配列：
Ｇ）フォワードプライマー：5'-AAAATTGCAAAATCCGTTTAACTAATC-3'（配列番号１３），
リバースプライマー： 5'-GACTGACTAAAAGAGGGGAAAG-3'（配列番号１４）；
Ｈ）フォワードプライマー：5'-TCCTGAAAGCATGAATAGTAGC-3'（配列番号１５），
リバースプライマー：5'-TTATTAATAGCACCCGGTACAAG-3'（配列番号１６）；
Ｉ）フォワードプライマー：5'-CCGGCAGAGGATGGTTACAG-3'（配列番号１７），
リバースプライマー：5'-TTGATTGATATTCCCTGAGATATATTGTG-3'（配列番号１８）
からなる群より選ばれる少なくとも１種を包含する、または少なくとも１種からなるプライマーペアと、サンプルまたはサンプルから単離した核酸を接触させることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。 - サンプルまたはサンプルから単離した核酸を、それぞれが配列番号１３〜１８に示したヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドからなるプライマーと接触させることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
- 該プライマーペアが、以下の配列：
Ｋ）フォワードプライマー：5'-GAGTGAAAAAGATTTTGTTCAAGTTG-3'（配列番号２１），
リバースプライマー：5'-AAAAGTCGCTCAGGTTATGC-3'（配列番号２２）、および
Ｌ）フォワードプライマー：5'-AGTGCCTGAACCTCAATTTG-3'（配列番号２３），
リバースプライマー：5'-TCGATAGGATTTTCTTCAAAATATTTAC-3'（配列番号２４）
からなる群より選ばれる少なくとも１種を更に包含するか、または少なくとも１種からなることを特徴とする、請求項４に記載の方法。 - 工程ｉ）において、サンプルまたはサンプルから単離した核酸を、以下の配列：
Ａ）フォワードプライマー：5'-GCGTTCTTATGTAATGACTGCTGAAG-3'（配列番号１），
リバースプライマー：5'-AGAAATTCTTCCTACACGAACAGAGTC-3'（配列番号２）；
Ｂ）フォワードプライマー：5'-TGCATCCAGAGCAGTTCTGC-3'（配列番号３），
リバースプライマー：5'-CGGCGTCATCGTATACACAGG-3'（配列番号４）；
Ｃ）フォワードプライマー：5'-CCAGGCTTCGTCACAGTTGC-3'（配列番号５），
リバースプライマー：5'-CAGTGAACTACCGTCAAAGTTATTACC-3'（配列番号６）；
Ｄ）フォワードプライマー： 5'-GCTCTTCGGCACAAGTAATATCAAC-3'（配列番号７），
リバースプライマー：5'-TCTATTTTAAATTCCGTGAAGCAAAACG-3'（配列番号８）；
Ｅ）フォワードプライマー：5'-TGGTCCATCAGGCATCAGAAGG-3'（配列番号９），
リバースプライマー：5'-GGCAGTGCGGAGGTCATTTG-3'（配列番号１０）；
Ｆ）フォワードプライマー：5'-TGTCTTTATAGGACATCCCTGATACTTTC-3'（配列番号１１），
リバースプライマー：5'-TATCTACTCTTGATGCCAGAAAACTAGC-3'（配列番号１２）；
Ｊ）フォワードプライマー：5'-GGAAGCAATACATATCTTAGAAATGAACTC-3'（配列番号１９），
リバースプライマー：5'-TCGGACAACTGCAAGCATCTAC-3'（配列番号２０）；
Ｍ）フォワードプライマー：5'-GTTTGGTACAGTTTATGGCATTTCAC-3'（配列番号２５），
リバースプライマー：5'-CATGGCAATATCAACAATACTCATCTTAC-3'（配列番号２６）；
Ｎ）フォワードプライマー：5'-CAGGAGCATGAGGTTCACAGTATG-3'（配列番号２７），
リバースプライマー：5'-TCTCTGGCCCCGCACAATG-3'（配列番号２８）；
Ｏ）フォワードプライマー：5'-GGGCTACAGAGATAGATATTACAGTAACTTAG-3'（配列番号２９），
リバースプライマー：5'-CCACGGCTCTTCCCTCCAAG-3'（配列番号３０）；
Ｐ）フォワードプライマー：5'-TTCCGGTCGATCCTGCC-3'（配列番号３１），
リバースプライマー：5'-GTTGTCCTGAGCCGTCC-3'（配列番号３２）；
Ｑ）フォワードプライマー：5'-AGACGATCCAGTTTGTATTAG-3'（配列番号３３），
リバースプライマー：5'-GGCATCCTAACTCACTTAG-3'（配列番号３４）；および
Ｒ）フォワードプライマー：5'-TCTGGAAAACAATGTGTTC-3'（配列番号３５），
リバースプライマー：5'-GGCATGTCGATTCTAATTC-3'（配列番号３６）。
からなる群より選ばれる少なくとも１種を包含する、または少なくとも１種からなるプライマーペアと更に接触させることを特徴とする、請求項４〜６のいずれかに記載の方法。 - 各核酸プライマーが、配列番号１〜３６に示したヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドからなるものであることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
- ＰＣＲ反応におけるそれぞれのプライマーペアの産物である増幅された標的配列の存在が、以下の基準に基づく、サンプル中の下痢性病原体の存在の指標となることを特徴とする、請求項７または８に記載の方法。
− プライマーペアＡ）またはＢ）の産物は、ＥＨＥＣの存在の指標となり、
− プライマーペアＣ）の産物は、ＥＨＥＣ／ＥＰＥＣの存在の指標となり、
− プライマーペアＤ）の産物は、Salmonella の存在の指標となり、
− プライマーペアＥ）またはＦ）の産物は、Shigella／ＥＩＥＣの存在の指標となり、
− プライマーペアＧ），Ｈ）またはＩ）の産物は、ＥＴＥＣの存在の指標となり、
− プライマーペアＪ）の産物は、ＥＡＥＣの存在の指標となり、
− プライマーペアＫ）の産物は、Campylobacter jejuni の存在の指標となり、
− プライマーペアＬ）の産物は、Campylobacter coli の存在の指標となり、
− プライマーペアＭ）の産物は、Yersinia enterocolitica／Yersinia pseudotuberculosis の存在の指標となり、
− プライマーペアＮ）の産物は、Yersinia pseudotuberculosis／Yersinia pestis の存在の指標となり、
− プライマーペアＯ）の産物は、Vibrio cholerae の存在の指標となり、
− プライマーペアＰ）の産物は、Giardia lamblia の存在の指標となり、
− プライマーペアＱ）の産物は、Entamoeba histolytica の存在の指標となり、そして
− プライマーペアＲ）の産物は、クリプトスポリジウム属の存在の指標となる。 - 該生物学的サンプルが、糞便サンプルまたは食品サンプルであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- 該プライマーペアの各プライマーの長さが５０ヌクレオチド未満であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- マルチプレックスＰＣＲアッセイをリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応で行い、各プライマーペアと共に、以下の配列を包含するか以下の配列からなる特定の核酸プローブを使用することを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
− プライマーペアＡ）のためのプローブ：
5'-TCCATGATARTCAGGCAGGACACTACTCAACCTTCC-3'（配列番号３７）
− プライマーペアＢ）のためのプローブ：
5'-TTGTCACTGTCACAGCAGAAGCCTTACGC-3'（配列番号３８）
− プライマーペアＣ）のためのプローブ：
5'-AGATTAACCTCTGCCGTTCCATAATGTTGTAACCA-3'（配列番号３９）
− プライマーペアＤ）のためのプローブ：
5'-CCAAACCTAAAACCAGTAAAGGCGAGCAGC-3'（配列番号４０）
− プライマーペアＥ）のためのプローブ：
5'-TCACTCCCGACACGCCATAGAAACGCATTT-3'（配列番号４１）
− プライマーペアＦ）のためのプローブ：
5'-ACAAACAGCAAAAGAGCATAGCATCCGAGAACT-3'（配列番号４２）
− プライマーペアＧ）のためのプローブ：
5'-CAAATATCCGTGAAACAACATGAC-3'（配列番号４３）
− プライマーペアＨ）のためのプローブ：
5'-AGGATTACAACACAATTCACAGCAGT-3'（配列番号４４）
− プライマーペアＩ）のためのプローブ：
5'-AGCAGGTTTCCCACCGGATCACCA-3'（配列番号４５）
− プライマーペアＪ）のためのプローブ：
5'-TCCGTATATTATCATCAGGGCATCCTTTAGGCGT-3'（配列番号４６）
− プライマーペアＫ）のためのプローブ：
5'-AAGACCCACAGTTTTACCAAGTTTT-3'（配列番号４７）
− プライマーペアＬ）のためのプローブ：
5'-AACTTGGCTCTTCTTATGTGCGT-3'（配列番号４８）
− プライマーペアＭ）のためのプローブ：
5'-CCTGGATAAGCGAGCGACGTATTCTCTATGC-3'（配列番号４９）
− プライマーペアＮ）のためのプローブ：
5'-AAACCAAAGCCGCCCACACCACAG-3'（配列番号５０）
− プライマーペアＯ）のためのプローブ：
5'-AACCTGCCAATCCATAACCATCTGCTGCTG-3'（配列番号５１）
− プライマーペアＰ）のためのプローブ：
5'-ACGAAGCCATGCATGCCCGCT-3'（配列番号５２）
− プライマーペアＱ）のためのプローブ：
5'-ACAAAATGGCCAATTCATTCAATGAA-3'（配列番号５３）
− プライマーペアＲ）のためのプローブ：
5'-CCTCCTAATCCAGAATGTCCTCCAG-3'（配列番号５４）
但し、上記配列において、下線を引いたヌクレオチドは、プローブの融解温度（Ｔｍ）を上昇させる修飾ヌクレオチドである。 - 該核酸プローブのそれぞれが、配列番号３７〜５４に示したヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドからなるものであることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
- プライマーペアＡ）〜Ｆ）とＧ）〜Ｎ）とがそれぞれ別のＰＣＲ反応に含まれることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
- 以下のＰＣＲ反応を包含することを特徴とする、請求項９に記載の方法。
プライマーペアＡ）〜Ｄ）を用いた第１反応、プライマーペアＫ）〜Ｌ）を用いた第２反応、プライマーペアＥ）、Ｆ）、Ｍ）、Ｎ）とＯ）を用いた第３反応、そしてプライマーペアＰ）〜Ｒ）を用いた第４反応。 - 以下のＰＣＲ反応を包含することを特徴とする、請求項９に記載の方法。
プライマーペアＡ）〜Ｄ）を用いた第１反応、プライマーペアＧ）〜Ｉ）とＫ）〜Ｎ）を用いた第２反応、プライマーペアＥ）、Ｆ）、Ｊ）とＯ）を用いた第３反応、そしてプライマーペアＰ）〜Ｒ）を用いた第４反応。 - 以下の配列：
Ａ）フォワードプライマー：5'-GCGTTCTTATGTAATGACTGCTGAAG-3'（配列番号１），
リバースプライマー：5'-AGAAATTCTTCCTACACGAACAGAGTC-3'（配列番号２）；
Ｂ）フォワードプライマー：5'-TGCATCCAGAGCAGTTCTGC-3'（配列番号３），
リバースプライマー：5'-CGGCGTCATCGTATACACAGG-3'（配列番号４）；
Ｃ）フォワードプライマー：5'-CCAGGCTTCGTCACAGTTGC-3'（配列番号５），
リバースプライマー：5'-CAGTGAACTACCGTCAAAGTTATTACC-3'（配列番号６）；
Ｄ）フォワードプライマー： 5'-GCTCTTCGGCACAAGTAATATCAAC-3'（配列番号７），
リバースプライマー：5'-TCTATTTTAAATTCCGTGAAGCAAAACG-3'（配列番号８）；
Ｅ）フォワードプライマー：5'-TGGTCCATCAGGCATCAGAAGG-3'（配列番号９），
リバースプライマー：5'-GGCAGTGCGGAGGTCATTTG-3'（配列番号１０）；
Ｆ）フォワードプライマー：5'-TGTCTTTATAGGACATCCCTGATACTTTC-3'（配列番号１１），
リバースプライマー：5'-TATCTACTCTTGATGCCAGAAAACTAGC-3'（配列番号１２）；
Ｇ）フォワードプライマー：5'-AAAATTGCAAAATCCGTTTAACTAATC-3'（配列番号１３），
リバースプライマー：5'-GACTGACTAAAAGAGGGGAAAG-3'（配列番号１４）；
Ｈ）フォワードプライマー：5'-TCCTGAAAGCATGAATAGTAGC-3'（配列番号１５），
リバースプライマー：5'-TTATTAATAGCACCCGGTACAAG-3'（配列番号１６）；
Ｉ）フォワードプライマー：5'-CCGGCAGAGGATGGTTACAG-3'（配列番号１７），
リバースプライマー：5'-TTGATTGATATTCCCTGAGATATATTGTG-3'（配列番号１８）；
Ｊ）フォワードプライマー：5'-GGAAGCAATACATATCTTAGAAATGAACTC-3'（配列番号１９），
リバースプライマー：5'-TCGGACAACTGCAAGCATCTAC-3'（配列番号２０）；
Ｋ）フォワードプライマー：5'-GAGTGAAAAAGATTTTGTTCAAGTTG-3'（配列番号２１）,
リバースプライマー：5'-AAAAGTCGCTCAGGTTATGC-3'（配列番号２２）；
Ｌ）フォワードプライマー：5'-AGTGCCTGAACCTCAATTTG-3'（配列番号２３）,
リバースプライマー：5'-TCGATAGGATTTTCTTCAAAATATTTAC-3'（配列番号２４）；
Ｍ）フォワードプライマー：5'-GTTTGGTACAGTTTATGGCATTTCAC-3'（配列番号２５），
リバースプライマー：5'-CATGGCAATATCAACAATACTCATCTTAC-3'（配列番号２６）；
Ｎ）フォワードプライマー：5'-CAGGAGCATGAGGTTCACAGTATG-3'（配列番号２７），
リバースプライマー：5'-TCTCTGGCCCCGCACAATG-3'（配列番号２８）；
Ｏ）フォワードプライマー：5'-GGGCTACAGAGATAGATATTACAGTAACTTAG-3'（配列番号２９），
リバースプライマー：5'-CCACGGCTCTTCCCTCCAAG-3'（配列番号３０）；
Ｐ）フォワードプライマー：5'-TTCCGGTCGATCCTGCC-3'（配列番号３１），
リバースプライマー：5'-GTTGTCCTGAGCCGTCC-3'（配列番号３２）；
Ｑ）フォワードプライマー：5'-AGACGATCCAGTTTGTATTAG-3'（配列番号３３），
リバースプライマー：5'-GGCATCCTAACTCACTTAG-3'（配列番号３４）；および
Ｒ）フォワードプライマー：5'-TCTGGAAAACAATGTGTTC-3'（配列番号３５），
リバースプライマー：5'-GGCATGTCGATTCTAATTC-3'（配列番号３６）
からなる群より選ばれる少なくとも１種を包含する、または少なくとも１種からなるプライマーからなるプライマーペアの、サンプル中の下痢性病原体の検出のための使用であって、該検出を２つ以上の個別のＰＣＲ反応を包含するマルチプレックスＰＣＲアッセイで実施することを特徴とする使用。 - 該サンプルが、糞便サンプルまたは食品サンプルであることを特徴とする、請求項１７に記載の使用。
- 検出のために、少なくともＥＴＥＣ、Campylobacter jejuni および Campylobacter coli の存在を検出可能なプライマーペアを使用することを特徴とする、請求項１７または１８に記載の使用。
- 配列番号１〜３６に示したプライマー配列のいずれかからなるヌクレオチドプライマー。
- 請求項１７および配列番号１〜３６に示したプライマーペアのいずれかの配列からなるヌクレオチドプライマーペア。
- 配列番号３７〜５４に示したプローブ配列のいずれかからなるヌクレオチドプローブ。
- 請求項１７〜１９のいずれかにおいて定義したヌクレオチドプライマー、プライマーペアまたはプローブの、サンプル中の下痢性病原体の存在を検出するための使用。
- サンプル中の下痢性病原体の存在を検出するためのキットであって、請求項２０のヌクレオチドプライマー、請求項２１のヌクレオチドプライマーペアまたは請求項２２のヌクレオチドプローブを包含するキット。
- ポリメラーゼ、ヌクレオチド、バッファー、塩類、界面活性剤および／または他の添加剤からなる群より選ばれる他のＰＣＲ用試薬成分を包含する、請求項２４に記載のキット。
- 少なくとも１種の対照用のプライマー、プローブまたはヌクレオチド配列を更に包含する、請求項２４または２６に記載のキット。
- 少なくともＥＴＥＣ、Campylobacter jejuni および Campylobacter coli の存在を検出するためのキットであって、以下のプライマーペア：
Ｇ）フォワードプライマー：5'-AAAATTGCAAAATCCGTTTAACTAATC-3'（配列番号１３），
リバースプライマー：5'-GACTGACTAAAAGAGGGGAAAG-3'（配列番号１４）；
Ｈ）フォワードプライマー：5'-TCCTGAAAGCATGAATAGTAGC-3'（配列番号１５），
リバースプライマー：5'-TTATTAATAGCACCCGGTACAAG-3'（配列番号１６）；
Ｉ）フォワードプライマー：5'-CCGGCAGAGGATGGTTACAG-3'（配列番号１７），
リバースプライマー：5'-TTGATTGATATTCCCTGAGATATATTGTG-3'（配列番号１８）；
Ｋ）フォワードプライマー：5'-GAGTGAAAAAGATTTTGTTCAAGTTG-3'（配列番号２１），
リバースプライマー：5'-AAAAGTCGCTCAGGTTATGC-3'（配列番号２２）；
Ｌ）フォワードプライマー：5'-AGTGCCTGAACCTCAATTTG-3'（配列番号２３），
リバースプライマー：5'-TCGATAGGATTTTCTTCAAAATATTTAC-3'（配列番号２４）；
Ｍ）フォワードプライマー：5'-GTTTGGTACAGTTTATGGCATTTCAC-3'（配列番号２５），
リバースプライマー：5'-CATGGCAATATCAACAATACTCATCTTAC-3'（配列番号２６）；および
Ｎ）フォワードプライマー：5'-CAGGAGCATGAGGTTCACAGTATG-3'（配列番号２７），
リバースプライマー：5'-TCTCTGGCCCCGCACAATG-3'（配列番号２８）
からなる群より選ばれるプライマー配列を包含する、または該プライマー配列からなることを特徴とする、請求項２４〜２６のいずれかに記載のキット。 - 生物学的サンプル中の下痢性病原体の存在を検出するための方法であって、
ｉ）サンプルまたはサンプルから単離した核酸を、２つ以上の個別のＰＣＲ反応を包含するマルチプレックスＰＣＲアッセイ中のプライマーペアと接触させ、但し、該プライマーペアに含まれるそれぞれのプライマーは、以下の配列からなる群より選ばれる少なくとも１種を包含する、または少なくとも１種からなるプライマーであり：
Ａ）フォワードプライマー：5'-GCGTTCTTATGTAATGACTGCTGAAG-3'（配列番号１），
リバースプライマー：5'-AGAAATTCTTCCTACACGAACAGAGTC-3'（配列番号２）；
Ｂ）フォワードプライマー：5'-TGCATCCAGAGCAGTTCTGC-3'（配列番号３），
リバースプライマー：5'-CGGCGTCATCGTATACACAGG-3'（配列番号４）；
Ｃ）フォワードプライマー：5'-CCAGGCTTCGTCACAGTTGC-3'（配列番号５），
リバースプライマー：5'-CAGTGAACTACCGTCAAAGTTATTACC-3'（配列番号６）；
Ｄ）フォワードプライマー： 5'-GCTCTTCGGCACAAGTAATATCAAC-3'（配列番号７），
リバースプライマー：5'-TCTATTTTAAATTCCGTGAAGCAAAACG-3'（配列番号８）；
Ｅ）フォワードプライマー：5'-TGGTCCATCAGGCATCAGAAGG-3'（配列番号９），
リバースプライマー：5'-GGCAGTGCGGAGGTCATTTG-3'（配列番号１０）；
Ｆ）フォワードプライマー：5'-TGTCTTTATAGGACATCCCTGATACTTTC-3'（配列番号１１），
リバースプライマー：5'-TATCTACTCTTGATGCCAGAAAACTAGC-3'（配列番号１２）；
Ｇ）フォワードプライマー：5'-AAAATTGCAAAATCCGTTTAACTAATC-3'（配列番号１３），
リバースプライマー：5'-GACTGACTAAAAGAGGGGAAAG-3'（配列番号１４）；
Ｈ）フォワードプライマー：5'-TCCTGAAAGCATGAATAGTAGC-3'（配列番号１５），
リバースプライマー：5'-TTATTAATAGCACCCGGTACAAG-3'（配列番号１６）；
Ｉ）フォワードプライマー：5'-CCGGCAGAGGATGGTTACAG-3'（配列番号１７），
リバースプライマー：5'-TTGATTGATATTCCCTGAGATATATTGTG-3'（配列番号１８）；
Ｊ）フォワードプライマー：5'-GGAAGCAATACATATCTTAGAAATGAACTC-3'（配列番号１９），
リバースプライマー：5'-TCGGACAACTGCAAGCATCTAC-3'（配列番号２０）；
Ｋ）フォワードプライマー：5'-GAGTGAAAAAGATTTTGTTCAAGTTG-3'（配列番号２１）,
リバースプライマー：5'-AAAAGTCGCTCAGGTTATGC-3'（配列番号２２）；
Ｌ）フォワードプライマー：5'-AGTGCCTGAACCTCAATTTG-3'（配列番号２３）,
リバースプライマー：5'-TCGATAGGATTTTCTTCAAAATATTTAC-3'（配列番号２４）；
Ｍ）フォワードプライマー：5'-GTTTGGTACAGTTTATGGCATTTCAC-3'（配列番号２５），
リバースプライマー：5'-CATGGCAATATCAACAATACTCATCTTAC-3'（配列番号２６）；
Ｎ）フォワードプライマー：5'-CAGGAGCATGAGGTTCACAGTATG-3'（配列番号２７），
リバースプライマー：5'-TCTCTGGCCCCGCACAATG-3'（配列番号２８）；
Ｏ）フォワードプライマー：5'-GGGCTACAGAGATAGATATTACAGTAACTTAG-3'（配列番号２９），
リバースプライマー：5'-CCACGGCTCTTCCCTCCAAG-3'（配列番号３０）；
Ｐ）フォワードプライマー：5'-TTCCGGTCGATCCTGCC-3'（配列番号３１），
リバースプライマー：5'-GTTGTCCTGAGCCGTCC-3'（配列番号３２）；
Ｑ）フォワードプライマー：5'-AGACGATCCAGTTTGTATTAG-3'（配列番号３３），
リバースプライマー：5'-GGCATCCTAACTCACTTAG-3'（配列番号３４）；および
Ｒ）フォワードプライマー：5'-TCTGGAAAACAATGTGTTC-3'（配列番号３５），
リバースプライマー：5'-GGCATGTCGATTCTAATTC-3'（配列番号３６）、
ｉｉ）上記工程ｉ）で得た反応混合物を用いてポリメラーゼ連鎖反応を実施し、下痢性病原体の標的配列がサンプル中に存在した場合には、該配列を特異的に増幅し、そして
ｉｉｉ）反応混合物中の増幅された標的配列の存在を検出し、いずれかの標的配列の存在を、下痢性病原体がサンプル中に存在することの指標とする
ことを包含する方法。 - 各核酸プライマーが、配列番号１〜３６に示したヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドからなるものであることを特徴とする、請求項２８に記載の方法。
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