KR20110138289A - 염기 변이 판별용 프로브 세트 및 염기 변이의 판별 방법 - Google Patents

염기 변이 판별용 프로브 세트 및 염기 변이의 판별 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 표적 핵산상의 변이 부위를 포함하는 염기 서열이며, 상기 변이 부위에 목적의 염기를 포함하는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖고, 5' 말단에 형광 물질이, 3' 말단에 소광 물질이 부가되고, 프로브의 융해 온도가 카운터 프로브의 융해 온도보다 3 ℃ 이상 높아지는 수식이 도입된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 검출용 프로브와, 변이 부위를 포함하는 염기 서열이며, 상기 변이 부위에 상기 목적의 염기와는 상이한 염기를 포함하는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 카운터 프로브를 포함하는 프로브 세트를 사용하여 형광 리얼 타임 PCR을 행함으로써, 표적 핵산의 변이 부위에서의 염기의 종류를 특정한다.

Description

염기 변이 판별용 프로브 세트 및 염기 변이의 판별 방법{PROBE SET FOR IDENTIFICATION OF NUCLEOTIDE MUTATION, AND METHOD FOR IDENTIFICATION OF NUCLEOTIDE MUTATION}
본 발명은, 염기 변이 부위에서의 염기의 종류를 판별하기 위해 사용되는 프로브 세트 및 염기 변이의 판별 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 바이러스의 약제 내성 등에 관여하는 변이를 판별하기 위한 프로브 세트 및 변이의 판별 방법에 관한 것이다.
염기 변이(염기 다형을 포함함)는 생물의 표현형에 큰 영향을 주는 인자이며, 변이의 종류를 조사함으로써 그 표현형을 예측하거나, 약제의 효과를 예측하는 것이 빈번히 행해지고 있다. 변이 염기의 종류를 판별하는 방법으로서는, 직접 시퀀스법, 인베이더법, 다형 특이적 프로브를 고정화한 DNA 칩을 사용하는 방법, 대립 유전자(allele) 특이적 PCR법 등이 알려져 있지만, 판별에 걸리는 시간이나 검출 감도의 면에서 충분하지 않기 때문에, 보다 간편하며 고감도로 변이 염기의 종류를 판별할 수 있는 방법의 개발이 요망되고 있다.
또한, 비특허문헌 1에는 잠금 핵산(LNA)을 사용한 염기의 미스매치의 판별 방법이 개시되어 있지만, 이것은 표적 서열에 혼성화시켜 검출하는 것이었다.
C형 간염 바이러스(Hepatitis C virus; 이하, HCV라고도 함)는 인간 간장 질환의 원인이 되는 감염 인자이며, 일본에서의 비A 비B 간염의 대부분이 HCV에 의한 것이라는 것이 분명히 되어 있다. HCV에 감염된 만성 간염 환자에게서 병변이 진행되어 간경변 또는 간세포암에 이른다는 것도 분명히 되어 있으며, 수혈에 의한 감염도 문제가 되고 있다.
HCV의 치료약으로서는 인터페론과 리바비린 등이 사용되고 있지만, 최근에는 프로테아제 저해제의 개발도 진행되고 있다. 그러나, 바이러스의 종류에 따라서는 프로테아제 저해제가 듣지 않는 변이형 바이러스의 존재도 보고되어 있으며, 치료를 유효하게 진행시키기 위해서는 변이형을 미리 검출하고, 그 결과에 기초하여 투약 방침을 결정하는 것이 중요하다.
그러나, 종래의 검사 방법에서는 낮은 카피수의 바이러스를 검출하는 것은 곤란하며, 보다 정확하게 고감도로 검출할 수 있는 방법이 요구되고 있다.
HCV의 프로테아제 저해제 내성 변이를 검출하는 방법으로서 택맨 미스매치 증폭 돌연변이 분석 (TaqMan Mismatch Amplification Mutation Assay) 법이 보고되어 있지만(비특허문헌 2), 이 방법은 프라이머에 미스매치를 넣어 목적 서열 변이의 경우에만 증폭 시그널이 검출되는 방법이며, 음성인 경우에는 상기 부위의 변이의 동정에는 별도의 분석법이 필요해진다는 등의 점에서 충분하지 않았다.
Nucleic Acid Research, 2006, Vol.34, No.8, e60 Journal of Virological Methods, 2008, Vol.153, p.156-162
본 발명은, 염기 변이를 보다 간편하며 고감도로 판별할 수 있는 방법을 제공하는 것 및 그를 위한 시약을 제공하는 것을 과제로 한다. 또한, 본 발명은, 바이러스 게놈에서의 약제 내성 등에 관여하는 변이를 판별하기 위한 방법 및 그에 사용하는 시약을 제공하는 것, 보다 구체적으로는 개체의 프로테아제 저해제에 대한 응답 예측에 있어서 유용한 HCV-1b형 바이러스의 NS3 프로테아제 유전자에서의 염기 변이를 결정하기 위한 방법, 및 그에 사용하는 시약을 제공하는 것을 과제로 하고 있다.
본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해 집중적으로 검토를 행하였다. 그 결과, 변이 부위를 포함하는 염기 서열이며, 상기 변이 부위에 목적의 염기를 포함하는 염기 서열 또는 상기 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖고, 5' 말단에 형광 물질이, 3' 말단에 소광 물질이 부가되고, 프로브의 융해 온도가 카운터 프로브의 융해 온도보다 3 ℃ 이상 높아지는 수식이 도입된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 검출용 프로브와, 변이 부위를 포함하는 염기 서열이며, 상기 변이 부위에 상기 목적의 염기와는 상이한 염기를 포함하는 염기 서열 또는 상기 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 카운터 프로브를 포함하는 프로브 세트를 사용하여 리얼 타임 PCR을 행함으로써, 간편하면서도 고감도로 목적 변이를 판별할 수 있다는 것을 발견하였다. 또한, 상기 프로브 세트를 변이형 바이러스의 판별용에 설계함으로써 약제 내성 변이 등의 변이를 갖는 바이러스를 동정할 수 있으며, 그에 따라 항바이러스약의 투여 방침의 결정 등이 가능해진다는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하를 제공한다.
(1) 형광 리얼 타임 PCR에 의해 표적 핵산의 변이 부위에서의 염기의 종류를 판별하기 위해 사용되는 프로브 세트이며,
표적 핵산상의 변이 부위를 포함하는 염기 서열이며, 상기 변이 부위에 목적의 염기를 포함하는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖고, 5' 말단에 형광 물질이, 3' 말단에 소광 물질이 부가되고, 프로브의 융해 온도가 카운터 프로브의 융해 온도보다 3 ℃ 이상 높아지는 수식이 도입된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 검출용 프로브와,
변이 부위를 포함하는 염기 서열이며, 상기 변이 부위에 상기 목적의 염기와는 상이한 염기를 포함하는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 카운터 프로브를 포함하는 프로브 세트.
(2) 상기 (1)에 있어서, 상기 수식이 잠금 핵산에 의한 수식인 프로브 세트.
(3) 상기 (1) 또는 (2)에 있어서, 표적 핵산이 바이러스에서 유래하는 프로브 세트.
(4) 상기 (3)에 있어서, 바이러스가 C형 간염 바이러스인 프로브 세트.
(5) 상기 (4)에 있어서, C형 간염 바이러스가 1b형인 프로브 세트.
(6) 상기 (5)에 있어서, 변이가 바이러스의 약제 내성에 관여하는 변이인 프로브 세트.
(7) 상기 (6)에 있어서, 약제가 프로테아제 저해제인 프로브 세트.
(8) 상기 (6)에 있어서, 약제가 텔라프레비어(Telaprevir)인 프로브 세트.
(9) 상기 (7) 또는 (8)에 있어서, 프로테아제가 C형 간염 바이러스의 NS3 프로테아제인 프로브 세트.
(10) 상기 (9)에 있어서, 상기 변이가 야생형 NS3 프로테아제의 이하 중 어느 하나의 아미노산을 치환하는 변이인 프로브 세트.
(i) 156 위치의 Ala
(ii) 155 위치의 Arg
(iii) 156 위치의 Ala와 158 위치의 Val
(iv) 54 위치의 Thr
(v) 132 위치의 Val 또는 Ile
(11) 상기 (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 기재된 프로브 세트를 사용하여 형광 리얼 타임 PCR을 행함으로써, 표적 핵산의 변이 부위에서의 염기의 종류를 판별하는 방법.
(12) 상기 (7) 내지 (10) 중 어느 하나에 기재된 프로브 세트를 사용하여 형광 리얼 타임 PCR을 행함으로써, C형 간염 바이러스 1b형의 프로테아제 저해제 내성에 관여하는 변이 부위에서의 염기의 종류를 특정하고, 상기 염기의 종류에 기초하여 상기 바이러스가 프로테아제 저해제 내성 바이러스인지 아닌지를 결정함으로써, C형 간염 환자의 프로테아제 저해제 응답성을 예측하는 방법.
(13) 상기 (12)에 기재된 방법에 의해 C형 간염 환자의 프로테아제 저해제 응답성을 예측하여, 프로테아제 저해제 내성 변이가 검출되지 않는 C형 간염 환자에게는 프로테아제 저해제를 투여하고, 프로테아제 저해제 내성 변이가 검출된 C형 간염 환자에게는 프로테아제 저해제를 투여하지 않거나 또는 투여를 중지하는 C형 간염의 치료 방법.
(14) 상기 (7) 내지 (10) 중 어느 하나에 기재된 프로브 세트를 포함하는 C형 간염 환자의 프로테아제 저해제 응답성을 예측하기 위한 진단 키트.
(15) 상기 (14)에 있어서, (i) 프로테아제 저해제 내성 변이가 검출되지 않는 경우에는 프로테아제 저해제를 투여할 수도 있고, (ii) 프로테아제 저해제 내성 변이가 검출된 경우에는 프로테아제 저해제의 투여를 중지하거나 또는 행하지 않는다는 치료 지침이 기재된 인스트럭션을 포함하는 진단 키트.
(16) 상기 (7) 내지 (10) 중 어느 하나에 기재된 프로브 세트의 C형 간염 환자의 프로테아제 저해제 응답성을 예측하기 위한 사용.
(17) 상기 (7) 내지 (10) 중 어느 하나에 기재된 프로브 세트의 C형 간염 환자의 프로테아제 저해제 응답성을 예측하여, 프로테아제 저해제 내성 변이가 검출되지 않는 C형 간염 환자에게는 프로테아제 저해제를 투여하고, 프로테아제 저해제 내성 변이가 검출된 C형 간염 환자에게는 프로테아제 저해제를 투여하지 않거나 또는 투여를 중지한다는 방침에 기초하여 C형 간염을 치료하기 위한 사용.
(18) C형 간염 바이러스 1b형에 있어서, NS3 프로테아제의 하기 a. 내지 d. 중 어느 하나의 변이를 형광 리얼 타임 PCR에 의해 검출하는 방법.
a. 156 위치의 Ala가 Phe로 치환되는 변이
b. 156 위치의 Ala가 Tyr로 치환되는 변이
c. 158 위치의 Val이 Ile로 치환되는 변이
d. 132 위치의 Val 또는 Ile가 Leu로 치환되는 변이
본 발명의 프로브 세트를 사용하여 리얼 타임 PCR을 행함으로써, 간편하면서도 고감도로 목적 변이를 특이적으로 판별할 수 있다. 본 발명의 프로브 세트를 사용하여 SNP 해석을 행함으로써, 개체의 질환으로의 이환성이나 약제의 효과 또는 부작용 등을 간편하게 조사할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브 세트를 사용하여 바이러스 변이형의 판별을 행함으로써, 약제 내성 바이러스나 병원성 바이러스의 존재를 간편하게 조사할 수 있다.
도 1은, 본 발명의 프로브 세트를 사용한 NS3 프로테아제 A156V 변이의 검출 결과를 나타낸 도면(중간조 화상)이다. (A) 주형에 A156V 변이형 NS3 프로테아제 cDNA를 사용한 경우의 결과를 나타낸다. 주형량은 좌측으로부터 각각 106, 105, 104, 103, 102 카피이다. (B) 주형에 A156V 변이형 NS3 프로테아제 cDNA와 과잉량(105 카피)의 야생형 NS3 프로테아제 cDNA를 사용한 경우의 결과를 나타낸다. A156V 변이형 NS3 프로테아제 cDNA의 주형량은 좌측으로부터 각각 106, 105, 104, 103 카피이다.
도 2는, 본 발명의 프로브 세트를 사용한 NS3 프로테아제 각 변이형의 검출 결과를 나타낸 도면(중간조 화상)이다. (A) A156T 변이형, (B) A156F 변이형, (C) A156V 변이형을 나타낸다. 주형량은 좌측으로부터 각각 106, 105, 104, 103, 102, 101 카피이다.
본 발명의 프로브 세트는, 형광 리얼 타임 PCR에 의해 염기 변이 부위에서의 염기의 종류를 특정하기 위해 사용되는 뉴클레오티드 프로브 세트이며,
변이 부위를 포함하는 염기 서열이며, 상기 변이 부위에 목적의 염기를 포함하는 염기 서열 또는 상기 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖고, 5' 말단에 형광 물질이, 3' 말단에 소광 물질이 부가되고, 프로브의 융해 온도를 높이는 수식이 도입된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 검출용 프로브와,
변이 부위를 포함하는 염기 서열이며, 상기 변이 부위에 상기 목적의 염기와는 상이한 염기를 포함하는 염기 서열 또는 상기 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 카운터 프로브를 포함하는 세트이다.
여기서, 변이는 염기 치환이 바람직하다.
<검출용 프로브>
본 발명에서 형광 리얼 타임 PCR이란, 5' 말단을 형광 물질로, 3' 말단을 소광 물질로 표지한 올리고뉴클레오티드 프로브를 표적으로 하는 주형 핵산 서열에 혼성화시키고, 열 안정성 DNA 폴리메라아제의 작용에 의해 프라이머로부터 상보쇄가 신장될 때, 상기 프로브가 분해되어 형광을 발하고, 그 형광 강도에 기초하여 목적 서열을 검출, 정량하는 방법이다(미국 특허 제6,214,979호, 동 5,804,375호, 동 5,487,972호 및 동 제5,210,015호 등). 즉, 상기 프로브는 어닐링 스텝에서 주형 DNA에 특이적으로 혼성화되며, 프로브 상에 소광 물질이 존재하기 때문에 통상 여기광을 조사하여도 형광의 발생은 억제되어 있지만(FRET(형광 공명 에너지 전이) 현상), 그 후의 신장 반응 스텝에서 DNA 폴리메라아제가 갖는 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성에 의해 주형에 혼성화한 프로브가 분해되면, 형광 색소가 프로브로부터 유리되고, 소광 물질에 의한 억제가 해제되어 형광을 발하게 된다. 이러한 프로브로서, 예를 들면 택맨(등록 상표) 프로브가 사용되고 있다.
본 발명의 프로브 세트에 포함되는 검출용 프로브에 있어서, 5' 및 3' 말단의 표지는 플루오레세인 패밀리의 색소와 같은 음의 전하를 갖는 형광 색소, 또는 로다민 패밀리의 색소와 같은 중성의 전하를 갖는 형광 색소, 또는 시아닌 패밀리의 색소와 같은 양의 전하를 갖는 형광 색소를 사용하여 행할 수 있다. 플루오레세인 패밀리의 색소에는, 예를 들면 FAM, HEX, TET, JOE, NAN 및 ZOE가 포함된다. 로다민 패밀리의 색소에는, 텍사스 레드(Texas Red), ROX, R110, R6G 및 TAMRA가 포함된다. FAM, HEX, TET, JOE, NAN, ZOE, ROX, R110, R6G 및 TAMRA는, 퍼킨 엘머(Perkin-Elmer)(Foster City, Calif.)로부터 시판되어 있으며, 텍사스 레드는 모레큘러 프로브사(Molecular Probes, Inc.)(Eugene, OR)로부터 시판되어 있다. 시아닌 패밀리의 색소에는 Cy2, Cy3, Cy5 및 Cy7이 포함되고, 이들은 아머샴(Amersham)(Amersham Place, LittleChalfont, Buckinghamshire, England)로부터 시판되어 있다. 또한, Iwoa, DABCYL 및 EDANS 등도 사용할 수 있다.
이러한 물질 중으로부터, FRET를 일으킬 수 있는 형광 물질과 소광 물질의 조합을 적절하게 선택하여 사용할 수 있다. 예를 들면, FAM은 488 nm의 파장을 갖는 빛에 의해 가장 효율적으로 여기되고, 500 내지 650 nm의 스펙트럼 및 525 nm의 방사 극대를 갖는 빛을 방사한다. FAM은, 예를 들면 여기 극대 514 nm를 갖는 소광제로서의 TAMRA와 함께 사용하기 위한 적당한 도너 표지이다.
또한, FAM과 Iowa의 조합도 사용할 수 있다.
또한, 형광 색소로부터 흡수된 에너지를 방산시키는 예시적인 비형광성 소광제에는, 바이오서치ㆍ테크놀로지스사(Biosearch Technologies, Inc.)(Novato, Calif.)로부터 시판되어 있는 블랙ㆍ홀ㆍ켄처(BlackHole Quenchers)(등록 상표)도 포함된다.
검출용 프로브는 변이 부위를 포함하는 염기 서열이며, 상기 변이 부위에 목적의 염기를 포함하는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖는다. 여기서 목적의 변이란 검출하고자 하는 염기를 말하며, 예를 들면 변이 개소의 염기의 종류가 A 또는 G일 때에 A를 특이적으로 검출하고자 하는 경우, 검출용 프로브는 이 변이 개소의 염기가 A인(상보쇄인 경우에는 T) 것을 의미한다. 검출용 프로브의 길이는 표적 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있는 길이일 수 있지만, 변이 부위를 포함하는 15 내지 18 염기의 서열인 것이 바람직하다. 또한, 목적의 염기가 프로브의 말단이 되지 않도록 하는 것이 바람직하다.
검출용 프로브는, 융해 온도(Tm)가 후술하는 카운터 프로브에 비해 3 ℃ 이상 높아지도록 수식되어 있다. 또한, 카운터 프로브를 복수개 사용할 때에는, 가장 Tm이 높은 것에 비해 3 ℃ 이상 높아지도록 한다. 이러한 수식으로서는 당-인산 골격에서의 수식이 바람직하고, 잠금 핵산(LNA: 등록 상표)이나 펩티드 핵산(PNA)을 사용한 수식을 들 수 있다.
여기서, LNA란, 당-인산 골격에 있어서 리보오스의 2' 위치의 산소 원자와 4' 위치의 탄소 원자 사이가 메틸렌 가교된 구조를 가진 RNA 아날로그를 말한다. 통상의 뉴클레오티드 대신에 LNA를 포함하는 핵산 유도체를 도입함으로써, 표적 핵산과 혼성화되어 2본쇄를 형성했을 때에 2본쇄의 스태킹(stacking)이 양호해지고, 안정성이 상승한다.
Figure pct00001
또한, 펩티드 핵산이란 이하와 같은 구조를 말한다.
Figure pct00002
Tm이 카운터 프로브에 비해 3 ℃ 이상 높아지도록 수식하기 위해서는, 이하의 계산식에 기초하여 LNA나 PNA 등의 수식 물질을 도입할 수 있다.
기본이 되는 올리고뉴클레오티드의 Tm(단위 K, 염 농도 1 M NaCl)의 최근접 이웃(nearest-neighbor)법에 의한 계산식은 이하와 같다.
Tm(DNA/LNA)=ΔH°/(ΔS°+Rㆍln[올리고(oligo)])
여기서 R은 기체 상수(1.987 cal/Kㆍmol), [올리고]는 올리고뉴클레오티드의 몰 농도이다.
DNA 올리고뉴클레오티드의 경우의 최근접 이웃 파라미터 ΔH° 및 ΔS°는 문헌 [SantaLucia, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, Vol.95, p.1460-1465]의 표 2에 기재된 수치를 이용하였다.
LNA를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 최근접 이웃 파라미터는 문헌 [McTigue 외, Biochemistry, 2004, Vol.43, p.5388-5405]의 표 4에 기재된 수치를 이용하였다.
PNA를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 Tm은 문헌 [Giesen 외, Nucleic Acid Research, 1998, Vol.26, No.21, p.5004-5006]에 이하와 같이 기재된 계산식에 기초하여 계산된다.
Tm(PNA)=20.79+0.83ㆍTm(DNA)-26.13ㆍfpyr+0.44ㆍL
여기서 fpyr은 피리미딘 염기의 비율을 나타내고, L은 PNA의 염기 길이이다.
이들 Tm은, 마그네슘 이온 및 1가 양이온 존재하에서는 문헌 [Owczaryzy 외, Biochemistry, 2008, Vol.47, p.5336-5353의 p.5339]의 식 4에 따라, 보정값을 얻을 수 있다. 예를 들면, PCR 조건의 염 농도(150 mM Na+, 1.5 mM Mg2 +, 0.3 mM dNTP)에서의 보정식은 이하와 같다.
1/Tm(PCR)=1/Tm(1 M NaCl)+(4.29ㆍfGC-3.95)×10-5ㆍln[Na+]+9.40×10-6ㆍ(ln[Na+])2
여기서 fGC는 푸린 염기의 비율, [Na+]는 1가 양이온의 몰 농도이다.
15 내지 18 염기의 검출용 프로브이면, 2 내지 5개의 수식 물질을 도입하는 것이 바람직하다.
또한, LNA나 PNA로 수식하는 경우, 수식되는 염기는 5' 말단이나 3' 말단 이외의 염기인 것이 바람직하고, 연속되지 않는 것이 바람직하다. 또한, 적어도 변이 부위의 염기는 LNA나 PNA 등의 수식 핵산인 것이 바람직하다.
최근접 이웃법에 의해 계산된 예측값과 실측값에는 각 논문에서 2 ℃ 정도의 차가 존재하기 때문에, 검출용 프로브의 Tm 예측값은 카운터 프로브보다 충분히 높은 것이 바람직하지만, 지나치게 높으면 PCR의 실용적 온도의 상한을 초과한다는 것을 고려하여 결정할 필요가 있다. 따라서, 검출용 프로브의 Tm 예측값은 카운터 프로브보다 9 내지 11 ℃ 높은 것이 바람직하고, 예측값으로서 70 내지 80 ℃가 적합하며, 특히 70 내지 76 ℃, 보다 바람직하게는 74 내지 76 ℃이다.
반응 온도 및 어닐링 온도는 카운터 프로브 DNA의 Tm 예측값과 동등(60-65 ℃)하고, 프라이머 DNA의 Tm은 그 중간에 위치(+5 ℃, 65-70 ℃)하는 것이 바람직하다.
상기한 바와 같은 검출용 프로브는 인테그레이티드 DNA 테크놀로지스(Coralville, IA) 등의 수탁 합성 서비스에 의해 입수 가능하다.
<카운터 프로브>
카운터 프로브는 변이 부위를 포함하는 염기 서열이며, 상기 변이 부위에 목적의 염기와는 상이한 염기를 포함하는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖지만, LNA나 PNA 등으로 수식되어 있지 않은 것을 말한다.
예를 들면, 검출용 프로브가 아데닌(A)을 목적 염기로 하는 경우, 카운터 프로브는 해당 염기가 구아닌(G), 시토신(C) 또는 티민(T)인 올리고뉴클레오티드의 1종 또는 복수종을 사용할 수 있다. 또한, 카운터 프로브는 5'과 3' 말단이 형광 물질과 소광 물질로 표지된 것일 수도 있다.
카운터 프로브의 길이도 표적 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있는 길이일 수 있지만, 15 내지 18 염기가 바람직하다.
카운터 프로브를 검출용 프로브와 함께 사용함으로써 비특이적 증폭에 의한 오류 검출을 방지할 수 있다. 카운터 프로브의 첨가량은 검출용 프로브와 동일하거나 그 이상이 바람직하다.
<프라이머>
프라이머는, 표적 핵산에 있어서 프로브가 혼성화되는 영역의 5'측에 혼성화되는 5'측 프라이머(센스 프라이머)와 3'측에 혼성화되는 3'측 프라이머(안티센스 프라이머)의 2종이 사용된다. 한쪽이 표적 유전자의 센스쇄에, 다른쪽이 안티센스쇄에 혼성화되고, PCR에 의해 양 프라이머간의 영역을 증폭할 수 있는 것이다. 프라이머는 표적 핵산에 있어서 보존되어 있는 영역에 설정하는 것이 바람직하다. 또한, 100 내지 250 뉴클레오티드 길이의 영역을 증폭할 수 있는 위치에 설정하는 것이 바람직하다.
프라이머의 길이는 15 내지 25 염기가 바람직하고, 상기한 올리고뉴클레오티드, DNA 올리고뉴클레오티드의 계산식을 이용하여 예측되는 Tm은 검출용 프로브의 Tm보다 낮고, 카운터 프로브의 Tm 예측값보다 높게 하는 것이 실용적이며, 구체적인 Tm 예측값으로서는 60 내지 69 ℃가 바람직하고, 특히 65 내지 69 ℃가 바람직하다. 목적으로 하는 Tm 예측값의 프라이머는 프라이머 익스프레스(어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems)) 등의 소프트웨어를 사용하여 설계할 수 있다.
<반응 조건>
본 발명의 프로브를 사용한 리얼 타임 PCR은 상기 프로브 세트와, 프라이머와, 주형인 표적 핵산과, 디옥시리보뉴클레오티드 혼합물(dNTP)과, 열 안정성 DNA 폴리메라아제를 포함하는 완충액 중에서 통상의 PCR에 준한 조건에 의해 행할 수 있다.
본 발명의 효과를 발휘하기 위해 PCR 반응에서의 어닐링 온도는 60 내지 69 ℃가 바람직하며, 프로브의 Tm보다 낮고, 카운터 프로브의 Tm과 동일하거나 그 이상인 것이 바람직하다. 통상 신장 반응은 어닐링 온도보다 높은 온도에서 행하지만, 어닐링과 신장 반응을 동일한 온도에서 행할 수도 있다.
PCR의 온도 사이클을 목적 서열을 검출할 수 있는 데 충분한 사이클수 반복하고, 형광 검출기로 증폭에 기초한 형광을 검출함으로써, 목적 변이의 존재를 검출할 수 있다.
본 명세서에서 "열 안정성 DNA 폴리메라아제"라는 용어는, 예를 들면 PCR의 반응 조건에서 안정적이고, 프라이머에 디옥시리보뉴클레오티드를 중합시켜 DNA의 상보쇄를 신장시키는 반응을 촉매함과 함께, 그 5'→3' 뉴클레아제 활성에 의해 프라이머 사이에 개재하는 어닐링된 프로브를 가수분해할 수 있는 것을 말한다. 대표적인 열 안정성 DNA 폴리메라아제로서, 테르무스ㆍ아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus; Taq)로부터 단리된 DNA 폴리메라아제가 미국 특허 제4,889,818호에 기재되어 있으며, PCR에서 그것을 사용하기 위한 기본적인 방법은 문헌 [Saiki 외, 1988, Science 239: 487-91]에 기재되어 있다.
본 명세서에서 "표적 핵산"은 PCR 반응으로 증폭시킬 수 있으며, 1개 또는 복수개의 염기 변이 부위를 함유하고 있는 DNA나 RNA 등의 핵산을 말한다.
인간 또는 비인간 포유 동물, 세균, 효모, 바이러스, 비로이드, 곰팡이, 진균, 식물, 또는 기타 임의의 생물에서 유래하는 것일 수도 있고, 또는 임의의 재조합 기원에서 유래할 수도 있고, 시험관 내에서 또는 화학 합성에 의해 합성된 것일 수도 있다.
또한, 표적 핵산을 포함하는 시료를 사용하여 반응을 행할 수도 있다.
여기서 "시료"란, 개체로부터 단리된 조직 또는 체액 등의 시료를 말하며, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면 조직 생검 재료, 혈장, 혈청, 전혈, 수액, 림프액, 피부의 외측 절편, 기도, 장관, 비뇨 생식관, 눈물, 타액, 유즙, 혈액 세포, 종양, 기관 등을 포함한다.
또한, 토양이나 배수 등으로부터 얻어지는 시료를 사용할 수도 있다.
바이러스의 변이를 검출하는 경우에는, 바이러스의 RNA 게놈을 바탕으로 역전사 효소를 사용하여 cDNA를 합성하고, 얻어진 cDNA 또는 cDNA의 증폭 산물을 표적 핵산으로서 사용할 수 있다.
본 명세서에서 "염기 변이"라는 용어는, 특정한 유전자의 참조 염기 서열의 어느 위치에서의 1개 또는 복수개의 뉴클레오티드의 변화를 의미하며, "변이"는 천연적으로 발생하는 것일 수도 있고, 인공적으로 발생하는 것일 수도 있다. 일염기 다형(SNP)도 당연히 염기 변이의 개념에 포함된다.
염기 변이가 질환이 되기 쉬운 변이인 경우, 본 발명의 방법에 의해 해당 염기 변이를 판별함으로써 질환으로의 이환성의 예측을 행할 수 있다. 또한, 염기 변이가 약제의 부작용에 관계된 변이인 경우, 본 발명의 방법에 의해 해당 염기 변이를 판별함으로써 약제의 부작용의 예측을 행할 수 있다.
염기 변이가 종(種) 또는 주(株)에 특이적인 변이인 경우, 본 발명의 방법에 의해 해당 염기 변이를 판별함으로써 종이나 주의 특정을 행할 수 있다. 또한, 특정하고자 하는 종이나 주가 병원을 갖는 종이나 주, 또는 약제 내성을 갖는 종이나 주이면, 병원균, 병원 바이러스의 검출이나 약제 내성주의 검출을 행할 수 있다.
변이형 바이러스를 검출하는 경우 바이러스로서는, 인간 면역 부전 바이러스(HIV), 인플루엔자 바이러스, C형 간염 바이러스(HCV), B형 간염 바이러스(HBV) 등이 예시된다.
HCV로서는 HCV1형이 예시되며, 그 중에서도 본 발명은 HCV-1b형에서의 변이의 검출에 바람직하게 사용된다.
현재, HCV에 대해서는 프로테아제 저해제인 텔라프레비어(Telaprevir) 등의 약제의 임상 개발이 진행되고 있지만, 약제가 듣지 않는 변이형 바이러스가 존재한다는 것이 분명히 되어 있기 대문에, 약제 투여 전 및 치료 기간 중에 바이러스의 변이의 유무를 조사하여 두는 것은 중요하다.
또한, 상기 텔라프레비어 이외에 보세프레비어(Boceprevir), 날라프레비어(Narlaprevir), 도나프레비어(Donaprevir, R7227/ITMN-191), MK-7009, TMC435, BMS65082, BI201335, MK-5172, GS9256, ABT450 등의 프로테아제 저해제도 본 발명과 동일한 효과를 발휘하는 한, 본 발명에서 의도하는 프로테아제 저해제에 포함된다.
본 발명의 방법에 따르면, HCV 환자에 있어서 상기 환자에게 감염된 HCV의 약제 내성에 관여하는 변이의 유무를 조사하는 것은 투약 방침의 결정에 매우 유용하다.
텔라프레비어의 작용 메커니즘으로서는, HCV의 NS3 프로테아제 활성을 저해하여 HCV의 증식을 억제한다는 메커니즘이 주장되고 있다. 그러나, NS3 프로테아제를 코드하는 영역(서열 번호 1)에서의 변이가 발생하면 텔라프레비어가 듣지 않게 되는 경우(텔라프레비어 내성)가 있다.
<156 위치의 변이>
이러한 변이로서는, NS3 프로테아제(서열 번호 2)의 156 위치의 아미노산(야생형에서는 Ala)을 Val, Thr, Ser, Phe, Tyr 등의 다른 아미노산으로 치환하는 변이를 들 수 있다.
야생형의 NS3 프로테아제 코드 서열에서는 서열 번호 1의 466 내지 468이 GCT이고, 코드되는 아미노산은 Ala이다.
한편, A156V에서는 서열 번호 1의 467 위치의 변이에 의해 코돈이 GTT로 변경되어 있으며, 코드되는 아미노산은 Val로 변화된다.
A156V의 검출용 프로브의 예를 이하에 나타낸다. 또한, (+)의 염기는 당-인산 골격에 LNA를 사용하고 있는 것을 나타낸다(이하 동일). 또한, 형광 물질로서 FAM을, 소광 물질로서 Iowa를 예시하고 있지만, 다른 조합도 물론 사용 가능하다.
5'(FAM)-G(+G)CA(+T)CT(+T)C(+C)GGG(+T)TG-3'(Iowa)(서열 번호 6)
16 염기 Tm 74.4 ℃(PCR의 염 농도하)
또한, LNA를 도입하지 않을 때의 Tm은 61.1 ℃이다.
5'(FAM)-TC(+C)GGG(+T)TG(+C)TG(+T)GT-3'(Iowa)(서열 번호 22)
15 염기 Tm 74.4 ℃(PCR의 염 농도하)
또한, LNA를 도입하지 않을 때의 Tm은 61.9 ℃이다.
A156F에서는, 서열 번호 1의 466, 467 위치의 변이에 의해 코돈이 TTT로 변경되어 있으며, 코드되는 아미노산은 Phe로 변화된다.
A156F의 검출용 프로브의 예를 이하에 나타낸다.
5'(FAM)-G(+G)CA(+T)CT(+T)C(+C)GGT(+T)TGC-3'(Iowa)(서열 번호 7)
17 염기 Tm 74.8 ℃(PCR의 염 농도하)
또한, LNA를 도입하지 않을 때의 Tm은 62.3 ℃이다.
5'(FAM)-TC(+C)GG(+T)TTG(+C)TG(+T) ATGCA-3'(Iowa)(서열 번호 23)
18 염기 Tm 73.6 ℃(PCR의 염 농도하)
또한, LNA를 도입하지 않을 때의 Tm은 63.0 ℃이다.
A156T에서는, 서열 번호 1의 466 위치의 변이에 의해 코돈이 ACT로 변경되어 있으며, 코드되는 아미노산은 Thr로 변화된다.
A156T의 검출용 프로브의 일례를 이하에 나타낸다.
5'(FAM)-GGCA(+T)CT(+T)C(+C)GG(+A)CTGC-3'(Iowa)(서열 번호 8)
17 염기 Tm 74.1 ℃(PCR의 염 농도하)
또한, LNA를 도입하지 않을 때의 Tm은 63.8 ℃이다.
5'(FAM)-TC(+C)GG(+A)CTG(+C)TG(+T)GTG-3'(Iowa)(서열 번호 24)
18 염기 Tm 73.9 ℃(PCR의 염 농도하)
또한, LNA를 도입하지 않을 때의 Tm은 62.4 ℃이다.
A156S에서는, 서열 번호 1의 466 위치의 변이에 의해 코돈이 TCT로 변경되어 있으며, 코드되는 아미노산은 Ser로 변화된다.
A156S의 검출용 프로브의 일례를 이하에 나타낸다.
5'(FAM)-GGCA(+T)CT(+T)C(+C)GG(+T)CTGC-3'(Iowa)(서열 번호 9)
17 염기 Tm 74.4 ℃(PCR의 염 농도하)
또한, LNA를 도입하지 않을 때의 Tm은 63.8 ℃이다.
A156Y에서는, 서열 번호 1의 466 위치의 변이에 의해 코돈이 TAT로 변경되어 있으며, 코드되는 아미노산은 Tyr로 변화된다.
A156Y의 검출용 프로브의 일례를 이하에 나타낸다.
5'(FAM)-TC(+C)GG(+T)ATG(+C)TG(+T)ATGCA-3'(Iowa)(서열 번호 25)
18 염기 Tm 73.2 ℃(PCR의 염 농도하)
또한, LNA를 도입하지 않을 때의 Tm은 61.9 ℃이다.
야생형 검출용 프로브의 일례를 이하에 나타낸다.
5'(FAM)-GCA(+T)CTTC(+C)GGG(+C)TGC-3'(Iowa)(서열 번호 5)
16 염기 Tm 73.7 ℃(PCR의 염 농도하)
또한, LNA를 도입하지 않을 때의 Tm은 64.4 ℃이다.
따라서, A156V의 아미노산 치환을 초래하는 변이를 특이적으로 검출하고자 하는 경우, 상기 A156V의 프로브를 검출용 프로브로 사용하고, 야생형을 포함시킨 그 이외의 변이형의 프로브(LNA 수식되어 있지 않은 것)의 1 종류 이상을 카운터 프로브로 사용하여 리얼 타임 PCR을 행할 수 있다.
다른 변이형을 특이적으로 검출하고자 하는 경우에도 동일하다.
<155 위치의 변이>
텔라프레비어 내성에 관여하는 다른 변이로서는, NS3 프로테아제(서열 번호 2)의 155 위치의 아미노산(야생형에서는 Arg)을 Gly, Leu, Lys 등의 다른 아미노산으로 치환하는 변이를 들 수 있다.
야생형의 NS3 프로테아제 코드 서열에서는 서열 번호 1의 463 내지 465에 상당하는 위치가 CGG이고, 코드되는 아미노산은 Arg이다.
한편, R155G에서는, 서열 번호 1의 463 위치의 변이에 의해 코돈이 GGG로 변경되어 있으며, 코드되는 아미노산은 Gly로 변화된다.
R155G의 검출용 프로브의 일례를 이하에 나타낸다.
5'(FAM)-TC(+G)GG(+G)CTG(+C)TG(+T)A(+T)G-3'(Iowa)(서열 번호 11)
16 염기 Tm 75.4 ℃(PCR의 염 농도하)
또한, LNA를 도입하지 않을 때의 Tm은 62.3 ℃이다.
R155L에서는, 서열 번호 1의 464 위치의 변이에 의해 코돈이 CTG로 변경되어 있으며, 코드되는 아미노산은 Leu로 변화된다.
R155L의 검출용 프로브의 일례를 이하에 나타낸다.
5'(FAM)-TCC(+T)GG(+C)TG(+C)TG(+T)GTG-3'(Iowa)(서열 번호 12)
16 염기 Tm 74.3 ℃(PCR의 염 농도하)
또한, LNA를 도입하지 않을 때의 Tm은 62.9 ℃이다.
R155K에서는, 서열 번호 1의 463, 464 위치의 변이에 의해 코돈이 AAG로 변경되어 있으며, 코드되는 아미노산은 Lys로 변화된다.
R155K의 검출용 프로브의 일례를 이하에 나타낸다.
5'(FAM)-TCA(+A)GG(+C)TG(+C)TG(+T)ATGCA-3'(Iowa)(서열 번호 13)
18 염기 Tm 74.4 ℃(PCR의 염 농도하)
또한, LNA를 도입하지 않을 때의 Tm은 62.8 ℃이다.
야생형 검출용 프로브의 일례를 이하에 나타낸다.
5'(FAM)-TC(+C)GGG(+C)TG(+C)TG(+T)AT-3'(Iowa)(서열 번호 10)
15 염기 Tm 75.3 ℃(PCR의 염 농도하)
또한, LNA를 도입하지 않을 때의 Tm은 61.0 ℃이다.
따라서, R155G의 아미노산 치환을 초래하는 변이를 특이적으로 검출하고자 하는 경우, 상기 R155G의 프로브를 검출용 프로브로 사용하고, 야생형을 포함시킨 그 이외의 변이형 프로브(LNA 수식되어 있지 않은 것)의 1 종류 이상을 카운터 프로브로 사용하여 리얼 타임 PCR을 행할 수 있다.
다른 변이형을 특이적으로 검출하고자 하는 경우에도 동일하다.
<156 위치와 158 위치의 조합 변이>
또한, 156 위치와 158 위치의 조합 변이도 들 수 있다.
야생형에서는 156 위치는 Ala이고 158 위치는 Val이지만, A156V/V158I는 467 위치와 472 위치의 변이에 의해 코돈이 각각 GTT, ATA로 변경되어 있으며, 코드되는 아미노산은 각각 Val, Ile로 변화된다.
A156V/V158I의 검출용 프로브의 일례를 이하에 나타낸다.
5'(FAM)-TC(+C)GGG(+T)TG(+C)T(+A)TA(+T)GCA-3'(Iowa)(서열 번호 14)
18 염기 Tm 74.3 ℃(PCR의 염 농도하)
또한, LNA를 도입하지 않을 때의 Tm은 62.0 ℃이다.
또한, A156T/V158I는 466 위치와 472 위치의 변이에 의해 코돈이 각각 ACT, ATA로 변경되어 있으며, 코드되는 아미노산은 각각 Thr, Ile로 변화된다.
A156V/V158I의 검출용 프로브의 일례를 이하에 나타낸다.
5'(FAM)-TC(+C)GG(+A)CTG(+C)T(+A)TA(+T)GCA-3'(Iowa)(서열 번호 15)
18 염기 Tm 73.6 ℃(PCR의 염 농도하)
또한, LNA를 도입하지 않을 때의 Tm은 61.3 ℃이다.
<54 위치의 변이>
텔라프레비어 내성에 관여하는 다른 변이로서는, NS3 프로테아제(서열 번호 2)의 54 위치의 아미노산(야생형에서는 Thr)을 Ala, Ser 등의 다른 아미노산으로 치환하는 변이를 들 수 있다.
야생형의 NS3 프로테아제 코드 서열에서는 서열 번호 1의 160 내지 162가 ACT이고, 코드되는 아미노산은 Thr이다.
한편, T54A에서는, 서열 번호 1의 160 위치의 변이에 의해 코돈이 GCT로 변경되어 있으며, 코드되는 아미노산은 Ala로 변화된다.
T54A의 검출용 프로브의 일례를 이하에 나타낸다.
5'(FAM)-G(+T)G(+T)GT(+T)GG(+G)CTG(+T)CT-3'(Iowa)(서열 번호 17)
16 염기 Tm 73.1 ℃(PCR의 염 농도하)
또한, LNA를 도입하지 않을 때의 Tm은 60.2 ℃이다.
T54S에서는, 서열 번호 1의 160 위치의 변이에 의해 코돈이 TCT로 변경되어 있으며, 코드되는 아미노산은 Ser로 변화된다.
T54S의 검출용 프로브의 일례를 이하에 나타낸다.
5'(FAM)-CG(+T)G(+T)GT(+T)GG(+T)CTG(+T)CT-3'(Iowa)(서열 번호 18)
17 염기 Tm 72.3 ℃(PCR의 염 농도하)
또한, LNA를 도입하지 않을 때의 Tm은 60.1 ℃이다.
야생형 검출용 프로브의 일례를 이하에 나타낸다.
5'(FAM)-CG(+T)G(+T)GT(+T)GG(+A)CTG(+T)CT-3'(Iowa)(서열 번호 16)
17 염기 Tm 72.1 ℃(PCR의 염 농도하)
또한, LNA를 도입하지 않을 때의 Tm은 60.1 ℃이다.
따라서, T54A의 아미노산 치환을 초래하는 변이를 특이적으로 검출하고자 하는 경우, 상기 T54A의 프로브를 검출용 프로브로 사용하고, 야생형을 포함시킨 그 이외의 변이형 프로브(LNA 수식되어 있지 않은 것)의 1 종류 이상을 카운터 프로브로 사용하여 리얼 타임 PCR을 행할 수 있다.
다른 변이형을 특이적으로 검출하고자 하는 경우에도 동일하다.
<132 위치의 변이>
텔라프레비어 내성에 관여하는 다른 변이로서는, NS3 프로테아제(서열 번호 2)의 132 위치의 아미노산(야생형에서는 Val 또는 Ile)을 Leu 등의 다른 아미노산으로 치환하는 변이를 들 수 있다.
야생형의 NS3 프로테아제 코드 서열에서는 서열 번호 1의 394 내지 396에 상당하는 위치가 GTC 또는 ATC이고, 코드되는 아미노산은 Val 또는 Ile이다.
V/I132L에서는, 서열 번호 1의 394 위치의 변이에 의해 코돈이 CTC로 변경되어 있으며, 코드되는 아미노산은 Leu로 변화된다.
V/I132L의 검출용 프로브의 일례를 이하에 나타낸다.
5'(FAM)-CCAGGC(+C)T(+C)TCT(+C)CT(+A)C-3'(Iowa)(서열 번호 21)
17 염기 Tm 72.7 ℃(PCR의 염 농도하)
또한, LNA를 도입하지 않을 때의 Tm은 61.2 ℃이다.
야생형(V132) 검출용 프로브의 일례를 이하에 나타낸다.
5'(FAM)-CCAGGC(+C)TG(+T)CT(+C)CT(+A)C-3'(Iowa)(서열 번호 19)
17 염기 Tm 72.5 ℃(PCR의 염 농도하)
또한, LNA를 도입하지 않을 때의 Tm은 61.8 ℃이다.
야생형(I132) 검출용 프로브의 일례를 이하에 나타낸다.
5'(FAM)-CCA(+G)GC(+C)TA(+T)CT(+C)CT(+A)C-3'(Iowa)(서열 번호 20)
17 염기 Tm 72.0 ℃(PCR의 염 농도하)
또한, LNA를 도입하지 않을 때의 Tm은 58.4 ℃이다.
따라서, V/I132L의 아미노산 치환을 초래하는 변이를 특이적으로 검출하고자 하는 경우, 상기 V/I132L의 프로브를 검출용 프로브로 사용하고, 야생형을 포함시킨 그 이외의 변이형 프로브(LNA 수식되어 있지 않은 것)의 1 종류 이상을 카운터 프로브로 사용하여 리얼 타임 PCR을 행할 수 있다.
다른 변이형을 특이적으로 검출하고자 하는 경우에도 동일하다.
상기한 변이 중, 다음의 4 종류의 바이러스 변이체는 본 발명자들이 새롭게 발견한 것이지만, 이들도 형광 리얼 타임 PCR에 의해 검출할 수 있다.
a. 156 위치의 Ala가 Phe로 치환되는 변이
b. 156 위치의 Ala가 Tyr로 치환되는 변이
c. 158 위치의 Val이 Ile로 치환되는 변이
d. 132 위치의 Val 또는 Ile가 Leu로 치환되는 변이
<프로테아제 저해제에 대한 응답의 예측 방법>
본 발명은, 상기 프로브 세트를 사용하여 HCV-1b에 감염된 환자의 프로테아제 저해제에 대한 응답을 예측하는 방법을 제공한다. 하나의 양태에 있어서, 그 방법은, HCV NS3 아미노산 서열상의 156 위치에 상당하는 염기 서열을 포함하는 인간 환자 유래 HCV-1b 폴리뉴클레오티드를 준비하는 것, 및 아미노산 서열상에서 156 위치의 Ala에 상당하는 염기가 변이되어 있는지 아닌지를 결정하고, 이때 156 위치에서의 Ala의 존재가 프로테아제 저해제에 대한 지속적인 바이러스학적 응답성(약제 감수성)을 결정짓는 것을 포함한다.
또 하나의 양태에 있어서, 그 방법은, HCV NS3 아미노산 서열상의 54 위치에 상당하는 염기 서열을 포함하는 인간 환자 유래 HCV-1b 폴리뉴클레오티드를 준비하는 것, 및 아미노산 서열상에서 54 위치의 Thr에 상당하는 염기가 변이되어 있는지 아닌지를 결정하고, 이때 54 위치에서의 Thr의 존재가 프로테아제 저해제에 대한 지속적인 바이러스학적 응답성(감수성)을 결정짓는 것을 포함한다.
또 하나의 양태에 있어서, 그 방법은, HCV NS3 아미노산 서열상의 132 위치에 상당하는 염기 서열을 포함하는 인간 환자 유래 HCV-1b 폴리뉴클레오티드를 준비하는 것, 및 아미노산 서열상에서 132 위치의 Val 또는 Ile에 상당하는 염기가 변이되어 있는지 아닌지를 결정하고, 이때 132 위치에서의 Val 또는 Ile의 존재가 프로테아제 저해제에 대한 지속적인 바이러스학적 응답성(감수성)을 결정짓는 것을 포함한다.
또 하나의 양태에 있어서, 그 방법은, HCV NS3 아미노산 서열상의 155 위치에 상당하는 염기 서열을 포함하는 인간 환자 유래 HCV-1b 폴리뉴클레오티드를 준비하는 것, 및 아미노산 서열상에서 155 위치의 Arg에 상당하는 염기가 변이되어 있는지 아닌지를 결정하고, 이때 155 위치에서의 Arg의 존재가 프로테아제 저해제에 대한 지속적인 바이러스학적 응답성(감수성)을 결정짓는 것을 포함한다.
또 하나의 양태에 있어서, 그 방법은, HCV NS3 아미노산 서열상의 156 및 158 위치에 상당하는 염기 서열을 포함하는 인간 환자 유래 HCV-1b 폴리뉴클레오티드를 준비하는 것, 및 아미노산 서열상에서 156 및 158 위치의 Ala 및 Val에 상당하는 염기가 변이되어 있는지 아닌지를 결정하고, 이때 156 및 158 위치에서의 Ala 및 Val의 존재가 프로테아제 저해제에 대한 지속적인 바이러스학적 응답성(감수성)을 결정짓는 것을 포함한다.
이에 따라, HCV-1b에 감염된 인간 환자의 치료 방침을 결정할 수 있다. 예를 들면, HCV NS3 아미노산 서열상의 156 위치의 Ala에 상당하는 염기가 변이되어 있는지 아닌지를 결정하고, 이때 156 위치가 Ala이면 프로테아제 저해제 치료를 개시하거나, 또는 이미 개시되어 있는 경우에는 계속하고, 변이형이면 프로테아제 저해제 치료를 행하지 않거나, 또는 이미 개시되어 있는 경우에는 투여를 중지하는 것을 포함한다.
또한, HCV NS3 아미노산 서열상의 54 위치의 Thr에 상당하는 염기가 변이되어 있는지 아닌지를 결정하고, 이때 54 위치가 Thr이면 프로테아제 저해제 치료를 개시하거나, 또는 이미 개시되어 있는 경우에는 계속하고, 변이형이면 프로테아제 저해제 치료를 행하지 않거나, 또는 이미 개시되어 있는 경우에는 투여를 중지하는 것을 포함한다.
또한, HCV NS3 아미노산 서열상의 132 위치의 Val 또는 Ile에 상당하는 염기가 변이되어 있는지 아닌지를 결정하고, 이때 132 위치가 Val 또는 Ile이면 프로테아제 저해제 치료를 개시하거나, 또는 이미 개시되어 있는 경우에는 계속하고, 변이형이면 프로테아제 저해제 치료를 행하지 않거나, 또는 이미 개시되어 있는 경우에는 투여를 중지하는 것을 포함한다.
또한, HCV NS3 아미노산 서열상의 155 위치의 Arg에 상당하는 염기가 변이되어 있는지 아닌지를 결정하고, 이때 155 위치가 Arg이면 프로테아제 저해제 치료를 개시하거나, 또는 이미 개시되어 있는 경우에는 계속하고, 변이형이면 프로테아제 저해제 치료를 행하지 않거나, 또는 이미 개시되어 있는 경우에는 투여를 중지하는 것을 포함한다.
또한, HCV NS3 아미노산 서열상의 156 및 158 위치의 Ala 및 Val에 상당하는 염기가 변이되어 있는지 아닌지를 결정하고, 이때 156 및 158 위치가 Ala 및 Val이면 프로테아제 저해제 치료를 개시하거나, 또는 이미 개시되어 있는 경우에는 계속하고, 변이형이면 프로테아제 저해제 치료를 행하지 않거나, 또는 이미 개시되어 있는 경우에는 투여를 중지하는 것을 포함한다.
<C형 간염 환자의 프로테아제 저해제 응답성을 예측하기 위한 진단 키트>
본 발명은, 상기 프로브 세트를 포함하는 C형 간염 환자의 프로테아제 저해제 응답성을 예측하기 위한 진단 키트를 제공한다. 상기 진단 키트는, (i) 프로테아제 저해제 내성 변이가 검출되지 않는 경우에는 프로테아제 저해제를 투여할 수도 있고, (ii) 프로테아제 저해제 내성 변이가 검출된 경우에는 프로테아제 저해제의 투여를 중지하거나 또는 행하지 않는다는 치료 지침이 기재된 인스트럭션(첨부 문서)을 포함하는 것일 수도 있다.
이하에 제시되는 본 발명의 실시예는 예시를 위해서만 제공되며, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다. 첨부의 특허청구범위에 포함되는 다수의 본 발명의 양태는, 이상의 본문 및 이하의 실시예를 참조함으로써 당업자에게 분명하다고 생각된다.
[실시예]
HCV-1b의 NS3 프로테아제의 156 위치의 아미노산은 야생형에서는 Ala이지만, 변이형 바이러스에서는 염기 변이인 결과, Val, Phe, Thr, Ser 등으로 치환된다. 여기서는, 156 위치의 아미노산의 치환을 초래하는 변이 중, 156 위치를 Val로 치환하는 변이, 구체적으로는 NS3 프로테아제를 코드하는 염기 서열에서의 467 위치의 C→T 치환을 특이적으로 검출하기 위한 형광 프로브를 사용한 리얼 타임 PCR을 행하였다.
<프라이머>
프라이머는, 156번째의 아미노산을 코드하는 염기의 상류측과 하류측 각각에 있어서, 텔라프레비어 임상 시험 등록 환자 및 공개 데이터 베이스(The Entrez Nucloetide Database)의 HCV NS3 프로테아제 영역에 공통인 영역(서열 번호 1의 289 내지 305 위치(Fw 프라이머), 및 487 내지 503 위치(Re 프라이머))로 설정하였다.
Fw 프라이머 5'-TGCACCTGCGGCAGCTC-3'(서열 번호 3) Tm=69.2 ℃(PCR의 염 농도하)
Re 프라이머 5'-TCCACCGCCTTCGCRAC-3'(서열 번호 4) Tm=66.4/68.4 ℃(PCR의 염 농도하)
(R은 G 또는 A를 나타냄)
<검출용 프로브>
검출용 프로브는 서열 번호 1의 454 내지 469의 영역에 설정하고, 5' 말단에는 FAM을 형광 색소로서, 3' 말단에는 Iowa를 소광제로서 결합시켰다. 또한, 2, 5, 8, 10, 14번째의 염기에 LNA를 사용하였다(인테그레이티드 DNA 테크놀로지스사의 수탁 합성 서비스를 이용함).
FAM 프로브 A156V
5'(FAM)-G(+G)CA(+T)CT(+T)C(+C)GGG(+T)TG-3'(Iowa)(서열 번호 6)
여기서, (+)의 염기는, 당-인산 골격에 LNA를 사용하고 있다. 또한, 검출용 프로브의 Tm은 상술한 바와 같다.
<카운터 프로브>
카운터 프로브로서, 야생형 및 A156V 이외의 변이에 대응하는 올리고뉴클레오티드를 사용하였다. 또한, 카운터 프로브의 Tm은 상술한 바와 같다.
프로브 WT
5'-GCATCTTCCGGGCTGC-3'(서열 번호 5)
프로브 A156F
5'-GGCATCTTCCGGTTTGC-3'(서열 번호 7)
프로브 A156T
5'-GGCATCTTCCGGACTGC-3'(서열 번호 8)
프로브 A156S
5'-GGCATCTTCCGGTCTGC-3'(서열 번호 9)
<정량 PCR 반응계>
주형에는 A156V의 변이를 갖는 NS3 프로테아제 cDNA를 포함하는 플라스미드를 사용하고, 카피수를 106, 105, 104, 103 또는 102으로서 사용하였다(도 1A).
또한, 표 1의 반응액을 사용하여, 50 ℃ 2분, 95 ℃ 10분의 초기 가열 후, 95 ℃ 15초, 65 ℃ 1분의 사이클(2 스텝)을 50 사이클 반복하였다. 반응 장치는 프리즘 7900HT(어플라이드 바이오시스템스)를 사용하였다.
또한, 야생형 NS3 프로테아제 cDNA를 포함하는 플라스미드를 105 카피 공존시켜, 동일한 조건으로 반응을 행하였다(도 1B).
Figure pct00003
도 1A의 결과로부터, A156V 변이를 특이적으로 검출할 수 있다는 것을 알 수 있다.
또한, 도 1B의 결과로부터, 야생형 중에 변이형이 1 ％ 정도밖에 존재하지 않는 경우에도 변이형의 검출을 행할 수 있다는 것이 나타났다.
<기타 변이의 검출>
A156F 및 A156T에 대해서도 검출을 행하였다.
A156F 검출용 프로브는 이하의 것을 사용하고, 야생형 및 기타 변이에 대응하는 프로브를 카운터 프로브로서 사용하여 상기와 동일하게 반응을 행하였다.
5'(FAM)-G(+G)CA(+T)CT(+T)C(+C)GGT(+T)TGC-3'(Iowa)(서열 번호 7)
A156T 검출용 프로브는 이하의 것을 사용하고, 야생형 및 기타 변이에 대응하는 프로브를 카운터 프로브로서 사용하여 상기와 동일하게 반응을 행하였다.
5'(FAM)-GGCA(+T)CT(+T)C(+C)GG(+A)CTGC-3'(Iowa)(서열 번호 8)
결과를 A156V의 검출 결과와 함께 도 2에 나타낸다.
이 결과로부터, 본 발명의 프로브 세트를 사용하여 리얼 타임 PCR을 행함으로써, 10 카피라는 매우 적은 카피수여도 변이형을 검출할 수 있다는 것을 알 수 있었다.
SEQUENCE LISTING <110> Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation <120> Probe set for identifying nucleotide mutation and method of identifying nucleotide mutation <130> A10008-10041 <150> JP2009-104468 <151> 2009-04-22 <160> 25 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 543 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <220> <221> CDS <222> (1)..(543) <400> 1 gcg cct atc acg gcc tat tcc caa cag acg cgg ggc cta ctc ggc tgt 48 Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ser Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly Cys 1 5 10 15 atc atc act agc ctc aca ggt cgg gac aag aac cag gtc gag gga gag 96 Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly Glu 20 25 30 gtt cag gtg gtt tcc acc gca acg caa tct ttc ctg gcg acc tgt gtt 144 Val Gln Val Val Ser Thr Ala Thr Gln Ser Phe Leu Ala Thr Cys Val 35 40 45 aac ggc gtg tgt tgg act gtc tac cat ggt gcc ggc tca aag acc cta 192 Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Ser Lys Thr Leu 50 55 60 gcc ggc cca aag ggc cca atc acc caa atg tac acc aat gtg gac cag 240 Ala Gly Pro Lys Gly Pro Ile Thr Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp Gln 65 70 75 80 gac ctc gtc ggc tgg cag gcg ccc ccc ggg tcg cgc tcc ttg aca cca 288 Asp Leu Val Gly Trp Gln Ala Pro Pro Gly Ser Arg Ser Leu Thr Pro 85 90 95 tgc acc tgc ggc agc tcg gac ctt tat ttg gtc acg cgg cat gcc gat 336 Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His Ala Asp 100 105 110 gtc att ccg gtg cgc cgg cgg ggc gac aac agg ggg agc ctg ctc tct 384 Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Asn Arg Gly Ser Leu Leu Ser 115 120 125 ccc agg cct atc tcc tac ttg aag ggt tct tcg ggt ggg cca ctg ctc 432 Pro Arg Pro Ile Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu Leu 130 135 140 tgc cct ttg ggg cac gtt gtg ggc atc ttc cgg gct gct gta tgc acc 480 Cys Pro Leu Gly His Val Val Gly Ile Phe Arg Ala Ala Val Cys Thr 145 150 155 160 cgg ggg gtt gcg aag gcg gtg gac ttt ata ccc gtt gag tct atg gaa 528 Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile Pro Val Glu Ser Met Glu 165 170 175 act act atg cgg tct 543 Thr Thr Met Arg Ser 180 <210> 2 <211> 181 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 2 Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ser Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly Cys 1 5 10 15 Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly Glu 20 25 30 Val Gln Val Val Ser Thr Ala Thr Gln Ser Phe Leu Ala Thr Cys Val 35 40 45 Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Ser Lys Thr Leu 50 55 60 Ala Gly Pro Lys Gly Pro Ile Thr Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp Gln 65 70 75 80 Asp Leu Val Gly Trp Gln Ala Pro Pro Gly Ser Arg Ser Leu Thr Pro 85 90 95 Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His Ala Asp 100 105 110 Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Asn Arg Gly Ser Leu Leu Ser 115 120 125 Pro Arg Pro Ile Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu Leu 130 135 140 Cys Pro Leu Gly His Val Val Gly Ile Phe Arg Ala Ala Val Cys Thr 145 150 155 160 Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile Pro Val Glu Ser Met Glu 165 170 175 Thr Thr Met Arg Ser 180 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> 5'primer for 156 <400> 3 tgcacctgcg gcagctc 17 <210> 4 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ccaggccctc tcctac 16 <210> 22 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> probe for 156V <400> 22 tccgggttgc tgtgt 15 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> probe for 156F <400> 23 tccggtttgc tgtatgca 18 <210> 24 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> probe for 156T <400> 24 tccggactgc tgtgtg 16 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> probe for 156Y <400> 25 tccggtatgc tgtatgca 18

Claims (18)

  1. 형광 리얼 타임 PCR에 의해 표적 핵산의 변이 부위에서의 염기의 종류를 판별하기 위해 사용되는 프로브 세트이며,
    표적 핵산상의 변이 부위를 포함하는 염기 서열이며, 상기 변이 부위에 목적의 염기를 포함하는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖고, 5' 말단에 형광 물질이, 3' 말단에 소광 물질이 부가되고, 프로브의 융해 온도가 카운터 프로브의 융해 온도보다 3 ℃ 이상 높아지는 수식이 도입된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 검출용 프로브와,
    변이 부위를 포함하는 염기 서열이며, 상기 변이 부위에 상기 목적의 염기와는 상이한 염기를 포함하는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 카운터 프로브를 포함하는 프로브 세트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 수식이 잠금 핵산(locked nucleic acid)에 의한 수식인 프로브 세트.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 표적 핵산이 바이러스에서 유래하는 프로브 세트.
  4. 제3항에 있어서, 바이러스가 C형 간염 바이러스인 프로브 세트.
  5. 제4항에 있어서, C형 간염 바이러스가 1b형인 프로브 세트.
  6. 제5항에 있어서, 변이가 바이러스의 약제 내성에 관여하는 변이인 프로브 세트.
  7. 제6항에 있어서, 약제가 프로테아제 저해제인 프로브 세트.
  8. 제6항에 있어서, 약제가 텔라프레비어(Telaprevir)인 프로브 세트.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 프로테아제가 C형 간염 바이러스의 NS3 프로테아제인 프로브 세트.
  10. 제9항에 있어서, 상기 변이가 야생형 NS3 프로테아제의 이하 중 어느 하나의 아미노산을 치환하는 변이인 프로브 세트.
    (i) 156 위치의 Ala
    (ii) 155 위치의 Arg
    (iii) 156 위치의 Ala와 158 위치의 Val
    (iv) 54 위치의 Thr
    (v) 132 위치의 Val 또는 Ile
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 프로브 세트를 사용하여 형광 리얼 타임 PCR을 행함으로써, 표적 핵산의 변이 부위에서의 염기의 종류를 판별하는 방법.
  12. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 프로브 세트를 사용하여 형광 리얼 타임 PCR을 행함으로써, C형 간염 바이러스 1b형의 프로테아제 저해제 내성에 관여하는 변이 부위에서의 염기의 종류를 특정하고, 상기 염기의 종류에 기초하여 상기 바이러스가 프로테아제 저해제 내성 바이러스인지 아닌지를 결정함으로써, C형 간염 환자의 프로테아제 저해제 응답성을 예측하는 방법.
  13. 제12항에 기재된 방법에 의해 C형 간염 환자의 프로테아제 저해제 응답성을 예측하여, 프로테아제 저해제 내성 변이가 검출되지 않는 C형 간염 환자에게는 프로테아제 저해제를 투여하고, 프로테아제 저해제 내성 변이가 검출된 C형 간염 환자에게는 프로테아제 저해제를 투여하지 않거나 또는 투여를 중지하는 C형 간염의 치료 방법.
  14. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 프로브 세트를 포함하는 C형 간염 환자의 프로테아제 저해제 응답성을 예측하기 위한 진단 키트.
  15. 제14항에 있어서, (i) 프로테아제 저해제 내성 변이가 검출되지 않는 경우에는 프로테아제 저해제를 투여할 수도 있고, (ii) 프로테아제 저해제 내성 변이가 검출된 경우에는 프로테아제 저해제의 투여를 중지하거나 또는 행하지 않는다는 치료 지침이 기재된 인스트럭션을 포함하는 진단 키트.
  16. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 프로브 세트의 C형 간염 환자의 프로테아제 저해제 응답성을 예측하기 위한 사용.
  17. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 프로브 세트의 C형 간염 환자의 프로테아제 저해제 응답성을 예측하여, 프로테아제 저해제 내성 변이가 검출되지 않는 C형 간염 환자에게는 프로테아제 저해제를 투여하고, 프로테아제 저해제 내성 변이가 검출된 C형 간염 환자에게는 프로테아제 저해제를 투여하지 않거나 또는 투여를 중지한다는 방침에 기초하여 C형 간염을 치료하기 위한 사용.
  18. C형 간염 바이러스 1b형에 있어서, NS3 프로테아제의 하기 a. 내지 d.중 어느 하나의 변이를 형광 리얼 타임 PCR에 의해 검출하는 방법.
    a. 156 위치의 Ala가 Phe로 치환되는 변이
    b. 156 위치의 Ala가 Tyr로 치환되는 변이
    c. 158 위치의 Val이 Ile로 치환되는 변이
    d. 132 위치의 Val 또는 Ile가 Leu로 치환되는 변이
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