CN102459640A - 用于核苷酸突变鉴定的探针组及用于核苷酸突变鉴定的方法 - Google Patents

用于核苷酸突变鉴定的探针组及用于核苷酸突变鉴定的方法 Download PDF

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Abstract

可通过使用包含检测探针和反向探针的探针组进行荧光实时PCR来鉴定位于靶核酸突变位点的核苷酸的类型，其中检测探针包括寡核苷酸，该寡核苷酸包括含在靶核酸上的突变位点以及突变位点中还包含所关注的核苷酸的核苷酸序列、或与前述核苷酸序列互补的核苷酸序列，所述寡核苷酸具有添加到5’末端的荧光物质和添加到3’末端的猝灭物质，并具有引入其中的修饰，该修饰使所述探针的解链温度变得比反向探针的解链温度高3℃以上，并且其中反向引物包括寡核苷酸，该寡核苷酸包括含突变位点以及突变位点中还包含与所关注的核苷酸不同的核苷酸的核苷酸序列、或与前述核苷酸序列互补的核苷酸序列。

Description

用于核苷酸突变鉴定的探针组及用于核苷酸突变鉴定的方法
技术领域
本发明涉及用于鉴定核苷酸突变位点的核苷酸类型的探针组，和用于鉴定核苷酸突变的方法。本发明还涉及用于鉴定涉及病毒和/或类似物的抗药性的突变的探针组，和用于鉴定突变的方法。
背景技术
核苷酸突变(包括核苷酸多态性)是对生物体表型具有很大影响的因素，并且为了预测其表型或预测药物的效果经常进行突变类型的研究。用于鉴定突变核苷酸类型的已知方法的实例包括直接测序、侵入方法、使用其上固定多态性特异性探针的DNA芯片的方法和等位基因特异性PCR方法，但是考虑到鉴定和检测灵敏度所需的劳动这些方法是不充分的，因此需要允许更简单和更灵敏地鉴定突变核苷酸类型的方法。
此外，尽管非专利文献1公开了使用锁核酸(LNA)鉴定核苷酸错配的方法，但是该方法基于通过与靶序列杂交的检测。
丙型肝炎病毒(以下也称作HCV)是导致人类肝脏紊乱的感染原(infectant)，并且已揭示在日本大多数非甲非乙型肝炎是由于HCV引起的。还揭示感染HCV的慢性肝炎患者病变发展为肝硬化或肝细胞癌，并且通过输血的感染也已成为问题。
已使用干扰素和利巴韦林等作为HCV的治疗药，但是，近年来，开发了蛋白酶抑制剂。然而，已报道取决于病毒的类型，存在蛋白酶抑制剂对其无效的突变型病毒，因此对于有效治疗重要的是，初步检测突变类型并且基于其结果确定给药方针。
然而，对于常规测试方法检测低拷贝数的病毒是困难的，因此需要允许准确和高灵敏度检测的方法。
作为检测HCV蛋白酶抑制剂抗性突变的方法，已报道了TaqMan错配扩增突变测定(Mismatch Amplification MutationAssay)方法(非专利文献2)。在该方法中，将错配引入到引物，并且仅在存在期望的突变序列的情况下检测扩增信号。因此，在获得阴性结果的情况下，突变的鉴定需要另外的测定，该方法是不充分的。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Nucleic Acid Research，2006，34卷，8期，e60
非专利文献2：Journal of Virological Methods，2008，153卷，p156-162
发明内容
本发明旨在提供通过其可更简单和高灵敏度地鉴定核苷酸突变的方法，和为此使用的试剂。本发明还旨在提供用于鉴定涉及抗药性等的病毒基因组中的突变的方法，和为此使用的试剂，更具体地，提供确定HCV-1b型病毒的NS3蛋白酶基因中的核苷酸突变的方法，和为此使用的试剂，所述核苷酸突变用于预测个体对蛋白酶抑制剂的响应性。
本发明人深入研究以解决上述问题。作为结果，本发明人发现通过使用下述探针组进行实时PCR可简单和高灵敏度地鉴定所关注的突变，该探针组包括检测探针和反向探针(counterprobe)，其中检测探针由寡核苷酸组成，所述寡核苷酸具有：包括在所述靶核酸中的所述突变位点的核苷酸序列，所述突变位点包括所关注的核苷酸；或与所述核苷酸互补的核苷酸序列；所述寡核苷酸具有附着到5’端的荧光物质和附着到3’端的猝灭剂；所述反向探针由寡核苷酸组成，所述寡核苷酸具有：包括所述突变位点的核苷酸序列，所述突变位点包括不同于所关注的核苷酸的核苷酸；或与所述核苷酸序列互补的核苷酸序列，并且其中所述检测探针具有引入的修饰使得其解链温度比反向探针的解链温度高不小于3℃。
此外，本发明人发现，通过设计用于鉴定突变型病毒的探针组，可鉴定具有突变例如抗药性突变的病毒，并且因此，可以确定抗病毒药物的给药方针，从而完成了本发明。
(1)通过荧光实时PCR鉴定靶核酸的突变位点处的核苷酸类型的探针组，所述探针组包括：
由寡核苷酸组成的检测探针，所述寡核苷酸具有：在所述靶核酸中包括所述突变位点的核苷酸序列，所述突变位点包括所关注的核苷酸；或与所述核苷酸序列互补的核苷酸序列；所述寡核苷酸具有附着到5’端的荧光物质和附着到3’端的猝灭剂；和
由寡核苷酸组成的反向探针，所述寡核苷酸具有：包括所述突变位点的核苷酸序列，所述突变位点包括与所述所关注的核苷酸不同的核苷酸；或与所述核苷酸序列互补的核苷酸序列，和
其中所述检测探针具有引入的修饰，从而使其解链温度比反向探针的解链温度高不小于3℃。
(2)根据(1)的探针组，其中所述修饰是通过锁核酸的修饰。
(3)根据(1)或(2)的探针组，其中所述靶核酸源自病毒。
(4)根据(3)的探针组，其中所述病毒是丙型肝炎病毒。
(5)根据(4)的探针组，其中所述丙型肝炎病毒属于1b型。
(6)根据(5)的探针组，其中所述突变涉及所述病毒的抗药性。
(7)根据(6)的探针组，其中所述药物是蛋白酶抑制剂。
(8)根据(6)的探针组，其中所述药物是特拉匹韦(Telaprevir)。
(9)根据(7)或(8)的探针组，其中所述蛋白酶是丙型肝炎病毒的NS3蛋白酶。
(10)根据(9)的探针组，其中所述突变是导致野生型NS3蛋白酶中任何以下氨基酸的置换的突变：
(i)156位Ala；
(ii)155位Arg；
(iii)156位Ala和158位Val；
(iv)54位Thr；和
(v)132位Val或Ile。
(11)用于鉴定靶核酸的突变位点处的核苷酸类型的方法，其包括通过使用根据(1)至(10)任一项的探针组进行荧光实时PCR。
(12)用于预测丙型肝炎患者对蛋白酶抑制剂的响应性的方法，其包括通过使用根据(7)至(10)任一项的探针组进行荧光实时PCR以确定涉及丙型肝炎病毒1b型的蛋白酶抑制剂抗性的突变位点处的核苷酸类型，并且由此确定所述病毒是否为抗蛋白酶抑制剂的病毒。
(13)用于治疗丙型肝炎的方法，其包括通过根据(12)的方法预测丙型肝炎患者对蛋白酶抑制剂的响应性，并且在所述丙型肝炎患者中未检测出蛋白酶抑制剂抗性突变的情况下施用所述蛋白酶抑制剂，而在所述丙型肝炎患者中检测出蛋白酶抑制剂抗性突变的情况下不施用所述蛋白酶抑制剂或终止施用所述蛋白酶抑制剂。
(14)用于预测丙型肝炎患者对蛋白酶抑制剂的响应性的诊断试剂盒，所述试剂盒包括根据(7)至(10)任一项的探针组。
(15)根据(14)的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包括说明书，其中描述了治疗指南，所述治疗指南解释了(i)在未检测出蛋白酶抑制剂抗性突变的情况下可施用蛋白酶抑制剂；及(ii)在检测出蛋白酶抑制剂抗性突变的情况下终止或不进行施用蛋白酶抑制剂。
(16)根据(7)至(10)任一项所述的探针组在预测丙型肝炎患者对蛋白酶抑制剂的响应性中的用途。
(17)根据(7)至(10)任一项所述的探针组在丙型肝炎的治疗中的用途，所述丙型肝炎的治疗基于以下方针：预测丙型肝炎患者对蛋白酶抑制剂的响应性，和在所述丙型肝炎患者中未检测出蛋白酶抑制剂抗性突变的情况下施用所述蛋白酶抑制剂，而在所述丙型肝炎患者中检测出蛋白酶抑制剂抗性突变的情况下不施用所述蛋白酶抑制剂或终止施用所述蛋白酶抑制剂。
(18)检测丙型肝炎病毒1b型中的NS3蛋白酶的任何以下突变a至d的方法，其包含进行荧光实时PCR：
a.导致156位Ala置换为Phe的突变；
b.导致156位Ala置换为Tyr的突变；
c.导致158位Val置换为Ile的突变；及
d.导致132位Val或Ile置换为Leu的突变。
通过使用本发明的探针组进行实时PCR，可简单、高灵敏度和特异性地鉴定所关注的突变。通过使用本发明的探针组进行SNP分析，可简单地研究个体对疾病的易感性及药物的作用和副作用等。此外，通过使用本发明的探针组鉴定病毒的突变型，可简单地研究抗药性病毒或致病病毒的存在。
附图说明
图1示出了使用本发明的探针组检测NS3蛋白酶的A156V突变的结果的图(半色调图像)。(A)示出当使用A156V突变型NS3蛋白酶cDNA作为模板时获得的结果。从左边起模板的量为106、105、104、103和102个拷贝。(B)示出了当使用A156V突变型NS3蛋白酶cDNA和过量(105个拷贝)野生型NS3蛋白酶cDNA作为模板时获得的结果。从左边起A156V突变型NS3蛋白酶cDNA的模板的量为106、105、104和103个拷贝。
图2示出了使用本发明的探针组检测NS3蛋白酶的各个突变型的结果的图(半色调图像)。(A)A156T突变型；(B)A156F突变型；(C)A156V突变型。模板的量从左边起分别是106、105、104、103、102和101个拷贝。
具体实施方式
本发明的探针组是设置为用于通过荧光实时PCR确定核苷酸突变位点处的核苷酸类型的核苷酸探针组，所述探针组包含：
由以下寡核苷酸组成的检测探针，所述寡核苷酸具有：包括在所述靶核酸中的所述突变位点的核苷酸序列，所述突变位点包括所关注的核苷酸；或与所述核苷酸序列互补的核苷酸序列；所述寡核苷酸具有附着于5’端的荧光物质和附着于3’端的猝灭剂；和
由以下寡核苷酸组成的反向探针，所述寡核苷酸具有：包括所述突变位点的核苷酸序列，所述突变位点包含与所关注的核苷酸不同的核苷酸；或与所述核苷酸序列互补的核苷酸序列，和
其中所述检测探针具有引入的修饰，从而使其解链温度高于反向探针的解链温度不小于3℃。
本文的突变优选为核苷酸置换。
<检测探针>
在本发明中，荧光实时PCR是指以下方法，其中允许在5’端用荧光物质和在3’端用猝灭剂标记的寡核苷酸探针与靶模板核酸序列杂交，并且当通过热稳定性DNA聚合酶的作用从引物延伸互补链时，探针降解以发射荧光，然后使用其荧光强度来检测和定量所关注序列(例如，US 6,214,979B、US 5,804,375B、US 5,487,972B和US 5,210,015)。即，尽管在退火步骤中上述探针与模板DNA特异性杂交，由于在探针中存在猝灭剂，甚至激发光照射的条件下荧光的产生也通常被抑制(FRET(荧光共振能量转移)现象)，但是，在随后的延伸反应步骤中，已与模板杂交的探针通过DNA聚合酶的5’→3’核酸外切酶活性被降解，致使荧光染料从探针释放和消除通过猝灭剂的抑制，导致发射荧光。这种探针的实例包括Taq Man探针(注册商标)。
在本发明的探针组中包含的检测探针中，可通过使用以下荧光染料进行5’和3’端的标记：具有负电荷的荧光染料，例如荧光素家族的染料；具有中性电荷的荧光染料，例如若丹明家族的染料；或具有正电荷的荧光染料，例如花青家族的染料。荧光素家族的染料的实例包括FAM、HEX、TET、JOE、NAN和ZOE。若丹明家族的染料的实例包括德克萨斯红(Texas Red)、ROX、R110、R6G和TAMRA。FAM、HEX、TET、JOE、NAN、ZOE、ROX、R110、R6G和TAMRA从Perkin-Elmer(Foster City，Calif.)获得，并且德克萨斯红从Molecular Probes，Inc.(Eugene，OR)商购可得。花青家族的染料的实例包括从Amersham(Amersham Place，LittleChalfont，Buckinghamshire，England)商购可得的Cy2、Cy3、Cy5和Cy7。此外，还可使用Iwoa、DABCYL和EDANS等。
可引起FRET的荧光物质和猝灭剂的组合可适当地选自这些物质并使用。例如，FAM被具有488nm波长的光最有效地激发并且发射具有500至650nm光谱和525nm最大发射波长的光。FAM是与例如用作猝灭剂的具有514nm最大激发波长的TAMRA一起使用的合适的供体标记。
此外，还可使用FAM和Iowa的组合。
此外，从荧光染料发散吸收的能量的非荧光猝灭剂的实例包括从Biosearch Technologies，Inc.(Novato，Calif.)商购可得的BlackHole Quenchers(注册商标)。
检测探针具有包括突变位点的核苷酸序列或与其互补的核苷酸序列，所述突变位点包括所关注的核苷酸。本文中所关注的突变指待检测的核苷酸，并且指，例如，在突变位点处的核苷酸类型是A或G并且将特异性检测A的情况下，在该位点处的检测探针的核苷酸是A(在互补链情况下为T)。不限制检测探针的长度只要其为探针可特异性地与靶序列杂交的长度即可，并且探针优选具有包括突变位点的15至18个核苷酸的序列。所关注的核苷酸优选不位于探针的末端。
修饰检测探针使得解链温度(Tm)比稍后所述的反向探针高不小于3℃。在使用多个反向探针的情况下，检测探针的Tm设置为比具有最高Tm的反向探针高不小于3℃。这种修饰优选糖-磷酸骨架中的修饰，并且其实例包括使用锁核酸(LNA：注册商标)和肽核酸(PNA)的修饰。
本文的LNA意指具有其中在糖-磷酸骨架中核糖2’位的氧原子被亚甲基交联至4’位的碳原子的结构的RNA类似物。通过引入包括LNA的核酸衍生物代替正常核苷酸，当与靶核酸杂交以形成双链时，双链的折叠(stacking)得到改善并且稳定性增强。
Figure BDA0000122603270000091
此外，肽核酸意指如下所示的结构。
Figure BDA0000122603270000092
为了修饰检测探针以使得Tm比反向探针高不小于3℃，可基于以下等式引入修饰剂例如LNA或PNA。
根据最邻近方法(nearest-neighbor method)，用于寡核苷酸的Tm(单位是K；盐浓度是1M NaCl)的等式如下：Tm(DNA/LNA)＝ΔH°/(ΔS°+R·ln[oligo])。
在该等式中，R表示气体常数(1.987cal/K·mol)，并且[oligo]表示寡核苷酸的摩尔浓度。
在DNA寡核苷酸情况下作为最邻近参数ΔH°和ΔS°，使用SantaLucia，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998，95卷，p1460-1465的表2中所述的值。
在包含LNA的寡核苷酸情况下作为最邻近参数，使用McTigue等人，Biochemistry，2004，43卷，p5388-5405的表4中所述的值。
包含PNA的寡核苷酸的Tm根据Giesen等人，Nucleic AcidResearch，1998，26卷，21期，p5004-5006中所述的等式来计算，该等式如下所示：Tm(PNA)＝20.79+0.83·Tm(DNA)-26.13·fpyr+0.44·L。
在该等式中，fpyr表示嘧啶核苷酸的比率，并且L表示PNA的核苷酸长度。
在镁离子和单价阳离子的存在下，可根据Owczaryzy等人，Biochemistry，2008，47卷，p5336-5353中第5339页的等式4获得这些Tm的校正值。例如，在PCR条件下用于盐浓度(150mM Na+、1.5mM Mg2+、0.3mM dNTP)的校正等式如下：1/Tm(PCR)＝1/Tm(1M NaCl)+(4.29·fGC-3.95)×10-5·ln[Na+]+9.40×10-6·(ln[Na+])2
在该等式中，fGC表示嘌呤核苷酸的比率，并且[Na+]表示单价阳离子的摩尔浓度。
在检测探针具有15至18个核苷酸的情况下，优选引入2至5个修饰剂。
在使用LNA或PNA进行修饰的情况下，待修饰的核苷酸优选除了位于在5’端和3’端的核苷酸以外并且不位于连续位置的核苷酸。此外，至少突变位点的核苷酸是修饰核酸例如LNA或PNA。
因为在由最邻近方法计算的预测值与实际值之间在各论文中存在约2℃的差异，所以检测探针的Tm的预测值优选充分地高于反向探针的Tm的预测值，但是在Tm过高而超出用于PCR的实际温度的上限的情况下，有必要考虑该情况来确定所述值。因此，Tm的预测值优选高于反向探针的Tm的预测值9至11℃；作为预测值70℃至80℃是合适的；并且该值特别地为70至76℃，更优选74至76℃。
优选反应温度和退火温度与反向探针DNA的Tm的预测值相等(60至65℃)，并且引物DNA的Tm优选在这些之间(+5℃，65-70℃)。
如上所述的检测探针从由Integrated DNA Technologies(Coralville，IA)等的定制合成服务获得。
<反向探针>
反向探针意指具有以下核苷酸序列的探针，包括具有与所关注核苷酸不同的核苷酸的突变位点的核苷酸序列；或与其互补的核苷酸序列；但是不具有用LNA或PNA等的修饰。
例如，在腺嘌呤(A)是待用检测探针检测的核苷酸的情况下，采用的反向探针可以是一种或多种类型的其中核苷酸是鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)的寡核苷酸。反向探针可以是在5’和3’端用荧光物质和猝灭剂标记的反向探针。
不限制反向探针的长度只要它允许与靶序列特异性杂交即可，并且长度优选15至18个核苷酸。
通过与检测探针一起使用反向探针，可防止由于非特异扩增导致的错误检测。优选要加入的反向探针的量与检测探针的量相同或高于检测探针的量。
<引物>
作为引物，采用两种类型的引物，即，5’侧引物(正义引物)，其与靶核酸(探针与其杂交)中的5’侧区域杂交，及3’侧引物(反义引物)，其与3’侧杂交。这些中的一种与靶基因的正义链杂交，并且其它的与反义链杂交，允许通过PCR在两种引物之间的区域扩增。优选将每种引物设置于靶核酸中的保守区域。此外，优选将引物设置于允许扩增具有100至250核苷酸长度的区域的位置。
每种引物的长度优选15至25个核苷酸，并且基于上述DNA寡核苷酸用等式预测的Tm事实上低于检测探针的Tm并且高于反向探针的Tm的预测值。更具体地，Tm的预测值优选60至69℃，特别是65至69℃。可使用软件例如Primer Express(AppliedBiosystems)设计具有期望的Tm的预测值的引物。
<反应条件>
可在用于常态PCR的条件下，在包含探针组、引物、作为模板的靶核酸，脱氧核糖核苷酸混合物(dNTP)和热稳定性DNA聚合酶的缓冲液中使用本发明的探针进行实时PCR。
为了实现本发明的效果，PCR反应中的退火温度优选60至69℃，并且优选低于探针的Tm并且与反向探针的Tm相同或高于反向探针的Tm。通常地，在高于退火温度的温度下进行延伸反应，但是退火和延伸反应可在相同的温度下进行。
通过重复PCR的温度循环至足以检测所关注序列，并且用荧光检测器检测由于扩增而产生的荧光，可检测所关注突变的存在。
在本说明书中，术语“热稳定性DNA聚合酶”意指以下聚合酶，其在PCR反应条件下稳定并且能够催化反应以将脱氧核糖核苷酸聚合到引物，并由此延伸DNA的互补链，同时通过其5’→3’核酸酶活性水解存在于引物之间的退火的探针。作为代表性的热稳定性DNA聚合酶，从水生栖热菌(Thermus aquaticus)分离的DNA聚合酶(Taq)描述于US 4,889,818B中，并且在PCR中使用它的基本方法描述于Saiki等人，1988，Science 239：487-91中。
在本说明书中，“靶核酸”意指核酸如DNA或RNA，其可由PCR反应扩增并且具有一个或多个核苷酸突变位点。
靶核酸可源自人或非人哺乳动物、细菌、酵母、病毒、类病毒、霉菌(mold)、真菌、植物或其它任意生物体；源自任意重组体；或体外合成或通过化学合成。
此外，可将包含靶核酸的样本用于反应。
本文的“样本”意指例如从个体分离的组织或体液的样本，并且其实例包括，但不限于，组织活检材料、血浆、血清、全血、脊髓液、淋巴、外皮的部分、呼吸道、肠道、泌尿生殖道、眼泪、唾液、乳汁、血细胞、肿瘤和器官。
此外，可使用从土壤或废水等获得的样本。
在待检测病毒突变的情况下，可使用逆转录酶从病毒的RNA基因组合成cDNA，并且获得的cDNA或从cDNA扩增的产物可用作靶核酸。
在本说明书中，术语“核苷酸突变”意指在特定基因的参考核苷酸序列中的某一或某些位置处一个或多个核苷酸的改变，并且“突变”可以是天然或人工发生的突变。单核苷酸多态性(SNP)也包括于核苷酸突变的概念中。
在核苷酸突变是可能导致疾病的突变的情况下，对疾病的易感性可通过本发明的方法由核苷酸突变的鉴定来预测。此外，在核苷酸突变是涉及药物副作用的突变的情况下，药物副作用可通过本发明的方法由核苷酸突变的鉴定来预测。
在核苷酸突变是对物种或菌株特异的突变的情况下，该物种或菌株可通过本发明的方法由核苷酸突变的鉴定来确定。此外，在待确定的物种或菌株是具有致病性的物种或菌株、或具有抗药性的物种或菌株的情况下，可进行致病微生物或致病病毒的检测，或抗药菌株的检测。
在待检测突变型病毒的情况下，病毒的实例包括人免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒、丙型肝炎病毒(HCV)和乙型肝炎病毒(HBV)。
HCV的实例包括HCV1型，并且本发明特别适合用于检测HCV-1b型中的突变。
目前，对于HCV，为蛋白酶抑制剂的药物例如特拉匹韦，正在进行临床开发，但是已揭示药物对其无效的突变型病毒的存在，并因此在药物施用前和治疗期间研究病毒中突变的存在/缺乏是重要的。
除了上述特拉匹韦以外，蛋白酶抑制剂例如波塞匹韦(Boceprevir)、那拉匹韦(Narlaprevir)、多那匹韦(Donaprevir)(R7227/ITMN-191)、MK-7009、TMC435、BMS65082、BI201335、MK-5172、GS9256和ABT450也包括于本发明的蛋白酶抑制剂中，只要它们达到类似于本发明的效果即可。
对于HCV患者，研究涉及感染HCV患者的抗药性的突变的存在/缺乏对决定给药方针是非常有用的。
作为特拉匹韦的作用机制，已提出了抑制HCV的NS3蛋白酶活性并由此抑制HCV生长的机制。然而，在编码NS3蛋白酶(SEQ ID NO：1)的区域中发生突变的情况下，特拉匹韦可变得无效(特拉匹韦抗性)。
<156位突变>
这种突变的实例包括用其另一氨基酸例如Val、Thr、Ser、Phe或Tyr置换NS3蛋白酶(SEQ ID NO：2)的156位氨基酸(野生型中的Ala)的突变。
在野生型NS3蛋白酶的编码序列中，SEQ ID NO：1的466至468位是GCT，其编码氨基酸Ala。
在另一方面，在A156V中，由于SEQ ID NO：1的467位突变致使密码子变为GTT，并且编码的氨基酸变为Val。
用于A156V的检测探针的实例如下所示。(+)意指其中LNA用于糖-磷酸骨架(以下也同样应用)的核苷酸。尽管FAM显示为荧光物质的实例并且Iowa显示为猝灭剂的实例，但是还可使用其它组合。
5’(FAM)-G(+G)CA(+T)CT(+T)C(+C)GGG(+T)TG-3’(Iowa)(SEQ IDNO：6)
16核苷酸，Tm 74.4℃(在用于PCR的盐浓度下)
在未引入LNA的情况下，Tm为61.1℃；
5’(FAM)-TC(+C)GGG(+T)TG(+C)TG(+T)GT-3’(Iowa)(SEQ IDNO：22)
15核苷酸，Tm 74.4℃(在用于PCR的盐浓度下)
在未引入LNA的情况下，Tm为61.9℃。
在A156F中，由于SEQ ID NO：1的466和467位突变致使密码子变为TTT，并且编码的氨基酸变为Phe。
用于A156F的检测探针的实例如下。
5’(FAM)-G(+G)CA(+T)CT(+T)C(+C)GGT(+T)TGC-3’(Iowa)(SEQ ID NO：7)
17核苷酸，Tm 74.8℃(在用于PCR的盐浓度下)
在未引入LNA的情况下，Tm为62.3℃；
5’(FAM)-TC(+C)GG(+T)TTG(+C)TG(+T)ATGCA-3’(Iowa)(SEQID NO：23)
18核苷酸，Tm 73.6℃(在用于PCR的盐浓度下)
在未引入LNA的情况下，Tm为63.0℃.
在A156T中，由于SEQ ID NO：1的466位突变致使密码子变为ACT，并且编码的氨基酸变为Thr。
用于A156T的检测探针的实例如下。
5’(FAM)-GGCA(+T)CT(+T)C(+C)GG(+A)CTGC-3’(Iowa)(SEQID NO：8)
17核苷酸，Tm 74.1℃(在用于PCR的盐浓度下)
在未引入LNA的情况下，Tm为63.8℃；
5’(FAM)-TC(+C)GG(+A)CTG(+C)TG(+T)GTG-3’(Iowa)(SEQID NO：24)
18核苷酸，Tm 73.9℃(在用于PCR的盐浓度下)
在未引入LNA的情况下，Tm为62.4℃。
在A156S中，由于SEQ ID NO：1的466位突变致使密码子变为TCT，并且编码的氨基酸改变为Ser。
用于A156S的检测探针的实例如下。
5’(FAM)-GGCA(+T)CT(+T)C(+C)GG(+T)CTGC-3’(Iowa)(SEQID NO：9)
17核苷酸，Tm 74.4℃(在用于PCR的盐浓度下)
在未引入LNA的情况下，Tm为63.8℃。
在A156Y中，由于SEQ ID NO：1的466位突变致使密码子变为TAT，并且编码的氨基酸变为Tyr。
用于A156Y的检测探针的实例如下。
5’(FAM)-TC(+C)GG(+T)ATG(+C)TG(+T)ATGCA-3’(Iowa)(SEQID NO：25)
18核苷酸，Tm 73.2℃(在用于PCR的盐浓度下)
在未引入LNA的情况下，Tm为61.9℃。
用于野生型的检测的探针的实例如下。
5’(FAM)-GCA(+T)CTTC(+C)GGG(+C)TGC-3’(Iowa)(SEQ IDNO：5)
16核苷酸，Tm 73.7℃(在用于PCR的盐浓度下)
在未引入LNA的情况下，Tm为64.4℃。
因此，在导致A156V的氨基酸置换的突变将被特异性检测的情况下，可使用上述A156V探针作为检测探针以及一种或多种类型的其它突变型探针和未用LNA修饰的野生型探针作为反向探针进行实时PCR。
这还应用于将特异性检测其它突变类型的情况。
<155位突变>
涉及特拉匹韦抗性的其它突变的实例包括用另一氨基酸例如Gly、Leu或Lys置换NS3蛋白酶(SEQ ID NO：2)的155位氨基酸(野生型中的Arg)的突变。
野生型NS3蛋白酶的编码序列在对应于SEQ ID NO：1的463至465位具有CGG，其编码氨基酸Arg。
在另一方面，在R155G中，由于SEQ ID NO：1的463位突变致使密码子变为GGG。并且编码的氨基酸变为Gly。
用于R155G的检测探针的实例如下。
5’(FAM)-TC(+G)GG(+G)CTG(+C)TG(+T)A(+T)G-3’(Iowa)(SEQ ID NO：11)
16核苷酸，Tm 75.4℃(在用于PCR的盐浓度下)
在未引入LNA的情况下，Tm为62.3℃。
在R155L中，由于SEQ ID NO：1的464位突变致使密码子变为CTG，并且编码的氨基酸变为Leu。
用于R155L的检测探针的实例如下。
5’(FAM)-TCC(+T)GG(+C)TG(+C)TG(+T)GTG-3’(Iowa)(SEQ IDNO：12)
16核苷酸，Tm 74.3℃(在用于PCR的盐浓度下)
在未引入LNA的情况下，Tm为62.9℃。
在R155K中，由于SEQ ID NO：1的463和464位突变致使密码子变为AAG，并且编码的氨基酸变为Lys。
用于R155K的检测探针的实例如下。
5’(FAM)-TCA(+A)GG(+C)TG(+C)TG(+T)ATGCA-3’(Iowa)(SEQ ID NO：13)
18核苷酸，Tm 74.4℃(在用于PCR的盐浓度下)
在未引入LNA的情况下，Tm为62.8℃。
用于野生型的检测的探针的实例如下。
5’(FAM)-TC(+C)GGG(+C)TG(+C)TG(+T)AT-3’(Iowa)(SEQ IDNO：10)
15核苷酸，Tm 75.3℃(在用于PCR的盐浓度下)
在未引入LNA的情况下，Tm为61.0℃。
因此，在导致R155G的氨基酸置换的突变将被特异性检测的情况下，可使用上述R155G探针作为检测探针以及一种或多种类型的其它突变型探针和未用LNA修饰的野生型探针作为反向探针进行实时PCR。
这还应用于将特异性检测其它突变类型的情况。
<156和158位突变的组合>
突变的其它实例包括156和158位突变的组合。
野生型156位具有Ala并且158位具有Val。在A156V/V158I中，由于467和472位突变致使密码子分别变为GTT和ATA，并且编码的氨基酸分别变为Val和Ile。
用于A156V/V158I的检测探针的实例如下。
5’(FAM)-TC(+C)GGG(+T)TG(+C)T(+A)TA(+T)GCA-3’(Iowa)(SEQ ID NO：14)
18核苷酸，Tm 74.3℃(在用于PCR的盐浓度下)
在未引入LNA的情况下，Tm为62.0℃。
此外，在A156T/V158I中，由于466和472位突变致使密码子分别变为ACT和ATA，并且编码的氨基酸分别变为Thr和Ile。
用于A156V/V158I的检测探针的实例如下。
5’(FAM)-TC(+C)GG(+A)CTG(+C)T(+A)TA(+T)GCA-3’(Iowa)(SEQ ID NO：15)
18核苷酸，Tm 73.6℃(在用于PCR的盐浓度下)
在未引入LNA的情况下，Tm为61.3℃。
<54位突变>
涉及特拉匹韦抗性的其它突变的实例包括用另一氨基酸例如Ala或Ser置换NS3蛋白酶(SEQ ID NO：2)的54位氨基酸(野生型中的Thr)的突变。
野生型NS3蛋白酶的编码序列在SEQ ID NO：1的160至162位具有ACT，其编码氨基酸Thr。
在另一方面，在T54A中，由于在SEQ ID NO：1的160位突变致使密码子变为GCT，并且编码的氨基酸变为Ala。
用于T54A的检测探针的实例如下。
5’(FAM)-G(+T)G(+T)GT(+T)GG(+G)CTG(+T)CT-3’(Iowa)(SEQID NO：17)
16核苷酸，Tm 73.1℃(在用于PCR的盐浓度下)
在未引入LNA的情况下，Tm为60.2℃。
在T54S中，由于在SEQ ID NO：1的160位突变致使密码子变为TCT，并且编码的氨基酸变为Ser。
用于T54S的检测探针的实例如下。
5’(FAM)-CG(+T)G(+T)GT(+T)GG(+T)CTG(+T)CT-3’(Iowa)(SEQ ID NO：18)
17核苷酸，Tm 72.3℃(在用于PCR的盐浓度下)
在未引入LNA的情况下，Tm为60.1℃。
用于野生型的检测的探针的实例如下。
5’(FAM)-CG(+T)G(+T)GT(+T)GG(+A)CTG(+T)CT-3’(Iowa)(SEQ ID NO：16)
17核苷酸，Tm 72.1℃(在用于PCR的盐浓度下)
在未引入LNA的情况下，Tm为60.1℃。
因此，在导致T54A的氨基酸置换的突变将被特异性检测的情况下，可使用上述T54探针作为检测探针以及一种或多种类型的包括野生型(未用LNA修饰)的其它突变型探针作为反向探针进行实时PCR。
这还应用于将特异性检测其它突变类型的情况。
<132位突变>
涉及特拉匹韦抗性的其它突变的实例包括用另一氨基酸例如Leu置换NS3蛋白酶(SEQ ID NO：2)的132位氨基酸(野生型中为Val或Ile)的突变。
野生型NS3蛋白酶的编码序列在对应于SEQ ID NO：1的394至396位具有GTC或ATC，其编码序列编码氨基酸Val或Ile。
在V/I132L中，由于SEQ ID NO：1的394位突变致使密码子变为CTC，并且编码的氨基酸变为Leu。
用于V/I132L的检测探针的实例如下。
5’(FAM)-CCAGGC(+C)T(+C)TCT(+C)CT(+A)C-3’(Iowa)(SEQID NO：21)
17核苷酸，Tm 72.7℃(在用于PCR的盐浓度下)
在未引入LNA的情况下，Tm为61.2℃。
用于野生型(V132)的检测的探针的实例如下。
5’(FAM)-CCAGGC(+C)TG(+T)CT(+C)CT(+A)C-3’(Iowa)(SEQID NO：19)
17核苷酸，Tm 72.5℃(在用于PCR的盐浓度下)
在未引入LNA的情况下，Tm为61.8℃。
用于野生型(I132)的检测的探针的实例如下。
5’(FAM)-CCA(+G)GC(+C)TA(+T)CT(+C)CT(+A)C-3’(Iowa)(SEQ ID NO：20)
17核苷酸，Tm 72.0℃(在用于PCR的盐浓度下)
在未引入LNA的情况下，Tm为58.4℃。
因此，在导致V/I132L的氨基酸置换的突变将被特异性检测的情况下，可使用上述V/I132L探针作为检测探针以及一种或多种类型的包括野生型(未用LNA修饰)的其它突变型探针作为反向探针进行实时PCR。
这还应用于将特异性检测其它突变型的情况。
在上述突变中，由本发明人最新发现了以下4个类型的病毒突变体，并且这些也可通过荧光实时PCR检测。
a.导致156位Ala置换为Phe的突变；
b.导致156位Ala置换为Tyr的突变；
c.导致158位Val置换为Ile的突变；及
d.导致132位Val或Ile置换为Leu的突变。
<用于预测对蛋白酶抑制剂的响应的方法>
本发明提供使用上述探针组预测感染有HCV-1b的患者对蛋白酶抑制剂的响应的方法。在一个模型中，所述方法包括：提供源自人患者的包括对应于HCV NS3氨基酸序列156位的核苷酸序列的HCV-1b多核苷酸；并且确定是否对应于氨基酸序列中156位Ala的一个或多个核苷酸是突变的；其中156位Ala的存在显示出对蛋白酶抑制剂连续的病毒学响应(药物敏感性)。
在另一模型中，所述方法包括：提供源自人患者的包括对应于HCV NS3氨基酸序列54位的核苷酸序列的HCV-1b多核苷酸；并且确定是否对应于氨基酸序列中54位Thr的一个或多个核苷酸是突变的；其中54位Thr的存在显示出对蛋白酶抑制剂连续的病毒学响应(敏感性)。
在另一模型中，所述方法包括：提供源自人患者的包括对应于HCV NS3氨基酸序列的132位的核苷酸序列的HCV-1b多核苷酸；并且确定是否对应于氨基酸序列中132位Val或Ile的一个或多个核苷酸是突变的；其中132位Val或Ile的存在显示出对蛋白酶抑制剂连续的病毒学响应(敏感性)。
在另一模型中，所述方法包括：提供源自人患者的包括对应于HCV NS3氨基酸序列的155位的核苷酸序列的HCV-1b多核苷酸；并且确定是否对应于氨基酸序列中155位Arg的一个或多个核苷酸是突变的；其中155位Arg的存在显示出对蛋白酶抑制剂连续的病毒学响应(敏感性)。
在另一模型中，所述方法包括：提供源自人患者的包括对应于HCV NS3氨基酸序列的156和158位的核苷酸序列的HCV-1b多核苷酸；并且确定是否对应于氨基酸序列中156和158位Ala和Val的核苷酸是突变的；其中在156和158位Ala和Val的存在显示出对蛋白酶抑制剂连续的病毒学响应(敏感性)。
因此，可确定用于感染HCV-1b的人患者的治疗方针。所述方法包括，例如，其中确定是否对应于HCV NS3氨基酸序列的156位Ala的一个或多个核苷酸是突变的过程，并且在序列156位具有Ala的情况下，开始蛋白酶抑制剂治疗，或如果治疗已开始，则治疗继续；而在序列是突变型的情况下，不进行蛋白酶抑制剂的治疗，或如果治疗已开始，则终止治疗。
此外，所述方法包括其中确定是否对应于HCV NS3氨基酸序列的54位Thr的一个或多个核苷酸是突变的过程，并且在序列54位具有Thr情况下，开始蛋白酶抑制剂治疗，或如果治疗已开始，则治疗继续；而在序列是突变型的情况下，不进行蛋白酶抑制剂治疗，或如果治疗已开始，则终止治疗。
此外，所述方法包括其中确定是否对应于HCV NS3氨基酸序列的132位Val或Ile的一个或多个核苷酸是突变的过程，并且在序列132位具有Val或Ile情况下，开始蛋白酶抑制剂治疗，或如果治疗已开始，则治疗继续；而在序列是突变型的情况下，不进行蛋白酶抑制剂治疗，或如果治疗已开始，则终止治疗。
此外，所述方法包括其中确定是否对应于HCV NS3氨基酸序列的155位Arg的一个或多个核苷酸是突变的过程，并且在序列155位具有Arg情况下，开始蛋白酶抑制剂治疗，或如果治疗已开始，则治疗继续；而在序列是突变型的情况下，不进行蛋白酶抑制剂治疗，或如果治疗已开始，则终止治疗。
此外，所述方法包括其中确定是否对应于HCV NS3氨基酸序列的156和158位Ala和Val的核苷酸是突变的过程，并且在序列156和158位具有Ala和Val的情况下，开始蛋白酶抑制剂治疗，或如果治疗已开始，则治疗继续；而在序列是突变型的情况下，不进行蛋白酶抑制剂治疗，或如果治疗已开始，则终止治疗。
<用于预测丙型肝炎患者对蛋白酶抑制剂的响应性的诊断试剂盒>
本发明提供用于预测丙型肝炎患者对蛋白酶抑制剂的响应性的诊断试剂盒，所述试剂盒包括上述探针组。诊断试剂盒可包括其中描述治疗指南的说明书(包装插页(package insert))，所述治疗指南解释：(i)在未检测出蛋白酶抑制剂抗性突变的情况下，可施用蛋白酶抑制剂；及(ii)在检测出蛋白酶抑制剂抗性突变的情况下，终止或不进行施用蛋白酶抑制剂。
提供以下所述的本发明的实施例仅为说明目的，而非限制本发明的范围。认为通过参考上述文本和以下实施例，对本领域的技术人员来说，包括于所附权利要求的范围中的本发明的许多模型是明显的。
实施例
在HCV-1b NS3蛋白酶的156位氨基酸在野生型中是Ala，并且作为核苷酸置换的结果，用突变型病毒中的Val、Phe、Thr或Ser等将其置换。在此，使用以下荧光探针进行实时PCR，在导致156位氨基酸置换的突变中，所述荧光探针用于特异性检测导致156位置换为Val，更具体地，编码NS3蛋白酶的核苷酸序列的467位C→T置换的突变。
<引物>
在编码156位氨基酸的核苷酸上游侧和下游侧的每一侧中，引物固定于在登记Teraprevir的临床试验的患者和公共数据库(Entrez核苷酸数据库(The Entrez Nucloetide Database))的HCVNS3蛋白酶区域之间的共有区域中(SEQ ID NO：1的289至305位(Fw引物)和487至503位(Re引物)。
Fw引物5’-TGCACCTGCGGCAGCTC-3’(SEQ ID NO：3)
Tm＝69.2℃(在用于PCR的盐浓度下)；
Re引物5’-TCCACCGCCTTCGCRAC-3’(SEQ ID NO：4)
Tm＝66.4/68.4℃(在用于PCR的盐浓度下)；
(R表示G或A)。
<检测探针>
将检测探针固定于SEQ ID NO：1的454至469的区域中，并且FAM结合到其5’端作为荧光染料，并且Iowa结合到其3’端作为猝灭剂。对于第2、第5、第8、第10和第14个核苷酸，使用LNA(使用由Integrated DNA Technologies，Inc.的定制合成服务)。FAM探针A156V
5’(FAM)-G(+G)CA(+T)CT(+T)C(+C)GGG(+T)TG-3’(Iowa)(SEQ ID NO：6)；其中对于具有(+)的核苷酸，将LNA用于糖-磷酸酯骨架。检测探针的Tm如上所述。
<反向探针>
作为反向探针，使用对应于野生型和除了A156V之外的其它突变的寡核苷酸。反向探针的Tm如上所述。
探针WT
5’-GCATCTTCCGGGCTGC-3’(SEQ ID NO：5)；
探针A156F
5’-GGCATCTTCCGGTTTGC-3’(SEQ ID NO：7)；
探针A156T
5’-GGCATCTTCCGGACTGC-3’(SEQ ID NO：8)；
探针A156S
5’-GGCATCTTCCGGTCTGC-3’(SEQ ID NO：9)。
<定量PCR反应体系>
作为模板，使用包含具有A156V突变的NS3蛋白酶cDNA的质粒，该质粒具有106、105、104、103或102的拷贝数(图1A)。
使用表1中的反应液，在50℃初始加热2分钟然后在95℃10分钟，随后50个循环：95℃15秒；和65℃1分钟(2步骤)。作为反应装置，使用PRISM 7900HT(Applied Biosystems)。
此外，在包含野生型NS3蛋白酶cDNA的质粒的105个拷贝的共存下，在相同的条件下进行反应(图1B)。
表1.用于检测A156F的反应体系
Figure BDA0000122603270000251
从图1A中的结果，揭示能特异性检测突变A156V。
此外，从图1B中的结果，显示即使在相对于野生型仅以约1％的比率存在突变型的情况下，也可检测突变型。
<其它突变的检测>
还对A156F和A156T进行检测。
使用以下作为检测A156F的探针以及对应于野生型和其它突变的探针作为反向探针，以如上所述相同的方式进行反应。5’(FAM)-G(+G)CA(+T)CT(+T)C(+C)GGT(+T)TGC-3’(Iowa)(SEQ ID NO：7)
使用以下作为检测A156T的探针以及对应于野生型和其它突变的探针作为反向探针，以如上所述相同的方式进行反应。5’(FAM)-GGCA(+T)CT(+T)C(+C)GG(+A)CTGC-3’(Iowa)(SEQID NO：8)
结果与A156V的检测结果一起示于图2中。从这些结果中，揭示出通过使用本发明的探针组进行实时PCR，即使在突变型以非常小的拷贝数(10拷贝)存在的情况下也可检测突变型。
Figure IDA0000122603360000011
Figure IDA0000122603360000021
Figure IDA0000122603360000031
Figure IDA0000122603360000051
Figure IDA0000122603360000071
Figure IDA0000122603360000081

Claims (18)

1.一种探针组，其用于通过荧光实时PCR鉴定靶核酸的突变位点处的核苷酸类型，所述探针组包括：
由以下寡核苷酸组成的检测探针，所述寡核苷酸具有：包括在所述靶核酸中的所述突变位点的核苷酸序列，所述突变位点包含所关注的核苷酸；或与所述核苷酸序列互补的核苷酸序列；所述寡核苷酸具有附着于5’端的荧光物质和附着于3’端的猝灭剂；和
由以下寡核苷酸组成的反向探针，所述寡核苷酸具有：包括所述突变位点的核苷酸序列，所述突变位点包含与所述所关注的核苷酸不同的核苷酸；或与所述核苷酸序列互补的核苷酸序列，和
其中所述检测探针具有引入的修饰，从而使其解链温度高于反向探针的解链温度不小于3℃。
2.根据权利要求1所述的探针组，其中所述修饰是通过锁核酸的修饰。
3.根据权利要求1或2所述的探针组，其中所述靶核酸源自病毒。
4.根据权利要求3所述的探针组，其中所述病毒是丙型肝炎病毒。
5.根据权利要求4所述的探针组，其中所述丙型肝炎病毒属于1b型。
6.根据权利要求5所述的探针组，其中所述突变涉及所述病毒的抗药性。
7.根据权利要求6所述的探针组，其中所述药物是蛋白酶抑制剂。
8.根据权利要求6所述的探针组，其中所述药物是特拉匹韦。
9.根据权利要求7或8所述的探针组，其中所述蛋白酶是丙型肝炎病毒的NS3蛋白酶。
10.根据权利要求9所述的探针组，其中所述突变是导致野生型的NS3蛋白酶中任何以下氨基酸置换的突变：
(i)156位Ala；
(ii)155位Arg；
(iii)156位Ala和158位Val；
(iv)54位Thr；和
(v)132位Val或Ile。
11.一种鉴定靶核酸的突变位点处的核苷酸类型的方法，其包括通过使用根据权利要求1至10任一项所述的探针组进行荧光实时PCR。
12.一种预测丙型肝炎患者对蛋白酶抑制剂的响应性的方法，其包括通过使用根据权利要求7至10任一项所述的探针组进行荧光实时PCR，以确定涉及丙型肝炎病毒1b型的蛋白酶抑制剂抗性的突变位点处的核苷酸类型，并由此确定是否所述病毒是抗蛋白酶抑制剂的病毒。
13.一种治疗丙型肝炎的方法，其包含由根据权利要求12所述的方法预测丙型肝炎患者对蛋白酶抑制剂的响应性，和在所述丙型肝炎患者中未检测出蛋白酶抑制剂抗性突变的情况下施用所述蛋白酶抑制剂，而在所述丙型肝炎患者中检测出蛋白酶抑制剂抗性突变的情况下不施用所述蛋白酶抑制剂或终止施用所述蛋白酶抑制剂。
14.一种预测丙型肝炎患者对蛋白酶抑制剂的响应性的诊断试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求7至10任一项所述的探针组。
15.根据权利要求14所述的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包含其中描述治疗指南的说明书，所述治疗指南解释(i)在未检测出蛋白酶抑制剂抗性突变的情况下可施用蛋白酶抑制剂；和(ii)在检测出蛋白酶抑制剂抗性突变的情况下终止或不进行施用蛋白酶抑制剂。
16.根据权利要求7至10任一项所述的探针组在预测丙型肝炎患者对蛋白酶抑制剂的响应性中的用途。
17.根据权利要求7至10任一项所述的探针组在治疗丙型肝炎中的用途，所述治疗基于以下方针：预测丙型肝炎患者对蛋白酶抑制剂的响应性，和在所述丙型肝炎患者中未检测出蛋白酶抑制剂抗性突变的情况下施用所述蛋白酶抑制剂，而在所述丙型肝炎患者中检测出蛋白酶抑制剂抗性突变的情况下不施用所述蛋白酶抑制剂或终止施用所述蛋白酶抑制剂。
18.一种检测丙型肝炎病毒1b型中NS3蛋白酶的任何以下突变a至d的方法，所述方法包括进行荧光实时PCR：
a.导致156位Ala置换为Phe的突变；
b.导致156位Ala置换为Tyr的突变；
c.导致158位Val置换为Ile的突变；和
d.导致132位Val或Ile置换为Leu的突变。
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