CN109913482B - Pik3ca-i874r突变基因及其在乳腺癌辅助诊断中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了PIK3CA‑I874R突变基因及其在乳腺癌辅助诊断中的应用，所述PIK3CA基因突变与PIK3CA正常野生型基因序列相比具有g.179229442T>G位点突变，该碱基突变为错义突变，其编码序列氨基酸由异亮氨酸I转变为精氨酸R，同时还公开了一种检测上述突变基因的特异性引物以及含有该特异性引物的试剂盒。本发明公开的PIK3CA基因g.1792224821GA突变基因可用于早期诊断乳腺癌。

Description

PIK3CA-I874R突变基因及其在乳腺癌辅助诊断中的应用

技术领域

本发明属于医学和生物技术，具体涉及一种PIK3CA-I874R突变基因及其在乳腺癌辅助诊断中的应用。

背景技术

乳腺癌已被认知属于一种全身性疾病，乳腺癌的病因至今尚未明确揭示，随着肿瘤分子遗传学、肿瘤细胞遗传学和分子流行病学的发展，目前认为环境因素和遗传因素共同作用影响乳腺癌的发生，在遗传性癌综合征中，癌相关基因的种系突变决定了该家族的肿瘤遗传易感性；而在散发性癌症中，主要危险因素是环境因子，与此相关基因的遗传多态性决定了个体对这些因素的易感性。

磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)是一种可使肌醇环第三位羟基磷酸化的磷脂酰肌醇激酶，具有磷脂酰肌醇激酶和丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶双重活性，调节细胞增殖、存活、迁移、凋亡和细胞周期等多种生物学功能。PIK3CA基因编码Ⅰ类PI3K催化亚单位P110α，其定位于3q26.3，包含21个外显子，编码1068个氨基酸。现有研究显示，应用PCR或基因测序的方法检测组织中PIK3CA基因的突变情况，可提高肿瘤诊断的敏感性；PIK3CA基因突变的肿瘤细胞对PI3K抑制剂更敏感，特异性地针对PIK3CA突变的靶向治疗可有效降低恶性肿瘤的发病率和死亡率。尽管PIK3CA突变对乳腺癌的诊治及预后的影响还需进一步研究，但从目前已有的研究数据可以看出PIK3CA高频突变和突变热点区域的发现对于乳腺癌基因诊断以及靶向治疗的选择具有重要的临床意义。

发明内容

发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种乳腺癌相关基因PIK3CA位点g.179229442T>G突变体、检测该突变体的特异性引物以及含有特异性引物的试剂盒，以便快速方便的辅助判断乳腺癌。

技术方案：为实现上述目的，本发明的一种用于乳腺癌辅助诊断的PIK3CA突变基因，其野生型PIK3CA基因序列如SEQID NO:1所示，其突变型PIK3CA基因如SEQID NO:2所示，突变型PIK3CA基因序列与野生型PIK3CA基因序列具有g.179229442T>G位点突变，其编码序列氨基酸由异亮氨酸I转变为精氨酸R。

进一步的，一种用于检测上述的一种用于乳腺癌辅助诊断的PIK3CA突变基因的特异性引物，所述特异性引物的上游引物的序列如SEQID NO:5所示，所述特异性引物的下游引物的序列如SEQID NO:6所示；用于检测PIK3CA基因g.179229442T>G位点突变；所述PIK3CA基因g.179229442T>G位点突变是指突变位点在SEQID NO:1序列的第297位碱基T突变为G。

进一步的，一种乳腺癌辅助诊断试剂盒，包括上述的用于检测基因PIK3CA位点g.179229442T>G突变体的特异性引物。

本发明的有益效果如下所述：一种用于乳腺癌辅助诊断的PIK3CA基因位点g.179229442T>G突变体、检测该突变体的特异性引物以及含有特异性引物的试剂盒，可使得乳腺癌的诊断更加方便易行，为临床医生快速准确掌握患者病情，为临床治疗效果评价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。

附图说明

附图1为乳腺癌相关基因PIK3CA位点g.179229442T>G突变体检测凝胶电泳图；

附图2为乳腺癌相关基因PIK3CA位点g.179229442T>G突变体的基因测序图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作更进一步的说明。

如附图1至2所述的一种用于乳腺癌辅助诊断的PIK3CA突变基因，其野生型PIK3CA基因序列如SEQID NO:1所示，其突变型PIK3CA基因如SEQID NO:2所示，突变型PIK3CA基因序列与野生型PIK3CA基因序列具有g.179229442T>G位点突变，其编码序列氨基酸由异亮氨酸I转变为精氨酸R。

本发明通过对100例有肿瘤家族史的乳腺癌病人及300名正常的对照成员PIK3CA基因g.179229442T>G突变位点进行筛查，发现4名患者在具有PIK3CA基因g.179229442T>G突变(4.0％)。该变异为一个错义变异。这个变异在300例对照组中仅1名携带(0.3％)，说明这一变异位点增加乳腺的患病风险。该变异在乳腺癌患者中发生频率显著高于正常对照，说明该突变位点与乳腺癌密切相关。

以上研究所发现的与乳腺癌辅助诊断相关的突变位点为g.179229442T>G，该突变发生于第3号染色体的179229442位置，该基因在NCBl参考数据库GRCh38.p12中的编号为NC_000003.12(179148114～179240093)，这里列出在该数据库中包含有本位点野生型的部分碱基序列供参考，如SEQID NO:1所示，PIK3CA基因突变相对应的序列如SEQID NO:2所示，其中突变位点在SEQID NO:1序列的第297位由碱基T突变为G。PIK3CA基因编码序列野生型氨基酸序列如SEQID NO:3所示，突变型氨基酸序列如SEQID NO:4所示；其中突变位点在SEQID NO:3序列的第874位由异亮氨基酸I转变为为精氨酸R。

SEQIDNO:1

TGGGGAAAGGCAGTAAAGGTCATGCATGACAAATTTACTAATAAAATACTCATGTTTTAGCCTGTTAAAACATTTGCTATTTTAAAATTCCATCATTTAATTGTAAACGTGTTACTCCTCTTTCAGAATGTTACCTTATGGTTGTCTGTCAATCGGTGACTGTGTGGGACTTATTGAGGTGGTGCGAAATTCTCACACTATTATGCAAATTCAGTGCAAAGGCGGCTTGAAAGGTGCACTGCAGTTCAACAGCCACACACTACATCAGTGGCTCAAAGACAAGAACAAAGGAGAAATGTGAGTTGTATTATTCTTTCTTCCTATGTTAATCTAAGTTTTTGTTAGATGAGTCTGTCGGTGTTTGTGTATTCCTCTGAGTTAGAACAGAGAAAACAATTGTACTTTCTATGGAAAAAAATATGCTCAACCTTTGAAATATTTGATGTTAATGGATTTAAATGATTATAATTACTTTTAATTTGGTAAAATCTTAAACATTCATCT

SEQIDNO:2

TGGGGAAAGGCAGTAAAGGTCATGCATGACAAATTTACTAATAAAATACTCATGTTTTAGCCTGTTAAAACATTTGCTATTTTAAAATTCCATCATTTAATTGTAAACGTGTTACTCCTCTTTCAGAATGTTACCTTATGGTTGTCTGTCAATCGGTGACTGTGTGGGACTTATTGAGGTGGTGCGAAATTCTCACACTATTATGCAAATTCAGTGCAAAGGCGGCTTGAAAGGTGCACTGCAGTTCAACAGCCACACACTACATCAGTGGCTCAAAGACAAGAACAAAGGAGAAAGGTGAGTTGTATTATTCTTTCTTCCTATGTTAATCTAAGTTTTTGTTAGATGAGTCTGTCGGTGTTTGTGTATTCCTCTGAGTTAGAACAGAGAAAACAATTGTACTTTCTATGGAAAAAAATATGCTCAACCTTTGAAATATTTGATGTTAATGGATTTAAATGATTATAATTACTTTTAATTTGGTAAAATCTTAAACATTCATCT

SEQIDNO:3

MPPRILVECLLPNGMIVTLECLREATLITIKHELFKEARKYPLHQLLQDESSYIFVSVTQEAEREEFFDETRRLCDLRLFQPFLKVIEPVGNREEKILNREIGFAIGMPVCEFDMVKDPEVQDFRRNILNVCKEAVDLRDLNSPHSRAMYVYPPNVESSPELPKHIYNKLDKGQIIVVIWVIVSPNNDKQKYTLKINHDCVPEQVIAEAIRKKTRSMLLSSEQLKLCVLEYQGKYILKVCGCDEYFLEKYPLSQYKYIRSCIMLGRMPNLMLMAKESLYSQLPMDCFTMPSYSRRISTATPYMNGETSTKSLWVINSALRIKILCATYVNVNIRDIDKIYVRTGIYHGGEPLCDNVNTQRVPCSNPRWNEWLNYDIYIPDLPRAARLCLSICSVKGRKGAKEEHCPLAWGNINLFDYTDTLVSGKMALNLWPVPHGLEDLLNPIGVTGSNPNKETPCLELEFDWFSSVVKFPDMSVIEEHANWSVSREAGFSYSHAGLSNRLARDNELRENDKEQLKAISTRDPLSEITEQEKDFLWSHRHYCVTIPEILPKLLLSVKWNSRDEVAQMYCLVKDWPPIKPEQAMELLDCNYPDPMVRGFAVRCLEKYLTDDKLSQYLIQLVQVLKYEQYLDNLLVRFLLKKALTNQRIGHFFFWHLKSEMHNKTVSQRFGLLLESYCRACGMYLKHLNRQVEAMEKLINLTDILKQEKKDETQKVQMKFLVEQMRRPDFMDALQGFLSPLNPAHQLGNLRLEECRIMSSAKRPLWLNWENPDIMSELLFQNNEIIFKNGDDLRQDMLTLQIIRIMENIWQNQGLDLRMLPYGCLSIGDCVGLIEVVRNSHTIMQIQCKGGLKGALQFNSHTLHQWLKDKNKGEIYDAAIDLFTRSCAGYCVATFILGIGDRHNSNIMVKDDGQLFHIDFGHFLDHKKKKFGYKRERVPFVLTQDFLIVISKGAQECTKTREFERFQEMCYKAYLAIRQHANLFINLFSMMLGSGM

SEQIDNO:4

MPPRILVECLLPNGMIVTLECLREATLITIKHELFKEARKYPLHQLLQDESSYIFVSVTQEAEREEFFDETRRLCDLRLFQPFLKVIEPVGNREEKILNREIGFAIGMPVCEFDMVKDPEVQDFRRNILNVCKEAVDLRDLNSPHSRAMYVYPPNVESSPELPKHIYNKLDKGQIIVVIWVIVSPNNDKQKYTLKINHDCVPEQVIAEAIRKKTRSMLLSSEQLKLCVLEYQGKYILKVCGCDEYFLEKYPLSQYKYIRSCIMLGRMPNLMLMAKESLYSQLPMDCFTMPSYSRRISTATPYMNGETSTKSLWVINSALRIKILCATYVNVNIRDIDKIYVRTGIYHGGEPLCDNVNTQRVPCSNPRWNEWLNYDIYIPDLPRAARLCLSICSVKGRKGAKEEHCPLAWGNINLFDYTDTLVSGKMALNLWPVPHGLEDLLNPIGVTGSNPNKETPCLELEFDWFSSVVKFPDMSVIEEHANWSVSREAGFSYSHAGLSNRLARDNELRENDKEQLKAISTRDPLSEITEQEKDFLWSHRHYCVTIPEILPKLLLSVKWNSRDEVAQMYCLVKDWPPIKPEQAMELLDCNYPDPMVRGFAVRCLEKYLTDDKLSQYLIQLVQVLKYEQYLDNLLVRFLLKKALTNQRIGHFFFWHLKSEMHNKTVSQRFGLLLESYCRACGMYLKHLNRQVEAMEKLINLTDILKQEKKDETQKVQMKFLVEQMRRPDFMDALQGFLSPLNPAHQLGNLRLEECRIMSSAKRPLWLNWENPDIMSELLFQNNEIIFKNGDDLRQDMLTLQIIRIMENIWQNQGLDLRMLPYGCLSIGDCVGLIEVVRNSHTIMQIQCKGGLKGALQFNSHTLHQWLKDKNKGERYDAAIDLFTRSCAGYCVATFILGIGDRHNSNIMVKDDGQLFHIDFGHFLDHKKKKFGYKRERVPFVLTQDFLIVISKGAQECTKTREFERFQEMCYKAYLAIRQHANLFINLFSMMLGSGM

该突变位点为本研究首次在中国汉族女性乳腺癌患者中发现，数据库显示欧美人群该区域的扫描也未发现该突变位点。通过纳入前瞻性队列研究，证明了携带该突变的患者最终发展成了乳腺癌，证明了该位点是乳腺癌的致病因素。

本发明通过控制年龄对疾病发展的影响因素，研究突变位点在乳腺癌辅助诊断的应用前景，阐述突变位点对于乳腺癌进展的影响，揭示其诊断价值。

一种用于检测上述的一种用于乳腺癌辅助诊断的PIK3CA突变基因的特异性引物，所述特异性引物的上游引物的序列如SEQID NO:5所示，所述特异性引物的下游引物的序列如SEQID NO:6所示；用于检测PIK3CA基因g.179229442T>G位点突变；所述PIK3CA基因g.179229442T>G位点突变是指突变位点在SEQID NO:1序列的第297位碱基T突变为G。

一种乳腺癌辅助诊断试剂盒，包括上述的用于检测基因PIK3CA位点g.179229442T>G突变体的特异性引物。

本发明的检测方法是利用人类PIK3CA基因不同基因型的特异性序列位点的改变，设计出针对突变位点的引物序列，进行聚合酶链反应来完成的。

本发明采用Sanger测序方法，用PCR扩增引物，对PIK3CA基因进行突变检测；其中PCR扩增引物的上游引物的序列如为SEQIDNO:5所示，下游引物的序列如SEQIDNO:6所示。

具体的实施方式如下：

DNA模板的制备

采用购置的试剂盒提取全血基因组DNA，具体步骤如下：

(1)取无菌2.0mL离心管一只，加入1mL细胞裂解液；

(2)轻轻震荡然经EDTA抗凝的全血样本，直到彻底混匀；然后吸取500μL血样加入上述含有细胞裂解液的离心管中，轻轻倾倒离心管5～6次混匀；

(3)室温孵育10分钟(期间颠倒离心管2～3次混匀)；

(4)12000rpm室温离心5分钟；

(5)用移液器缓慢的尽可能将上清液移弃干净，注意勿将两相交界处的白色物质吸出；

(6)使用涡旋振荡器(Votex)剧烈混匀，直至白细胞重悬(10～15秒)；

(7)向重悬细胞溶液中加入核裂解液300μL。用移液枪头吸放溶液5～6次裂解白细胞，此时溶液应变得很粘稠。若混合后可见细胞团块，则将溶液置于37℃孵育直至团块消散，若孵育1小时后仍可见细胞团块，则另加核裂解液100μL并重复置于37℃孵育；

(8)向核裂解物中加入蛋白沉淀液100μL，用涡旋振荡器剧烈震荡10～20秒；

(9)12000rpm室温离心5分钟；

(10)将其上清液转至对应编号的已加入300μL室温异丙醇的2.0mL离心管中；

(11)轻轻颠倒以混匀溶液，直至白色线状DNA形成沉淀；

(12)12000rpm室温离心1分钟；

(13)弃去上清液，加入与样本量等体积的室温70％乙醇，轻轻颠倒离心管数次；

(14)用移液器缓慢的尽可能将乙醇液移弃干净。将离心管置于50℃烘烤5～10分钟，尽量让残余的乙醇液挥发干净；

(15)向离心管中加入50～100μL的DNA溶解液，轻轻混匀；

(16)用1％琼脂糖凝胶电泳来评估DNA提取效果，Nanodrop核酸仪检测含量，定量到20～50ng/μL，-20℃保存；

PIK3CA基因g.179229442T>G突变基因检测技术方案：

仪器：Veriti96型PCR仪、BIO-RAD Gel Doc XR+型凝胶成像仪(美国伯乐公司)、凝胶电泳仪(北京六一公司)。

试剂：QIAamp DNA提取试剂盒(德国Qiagen公司)；DNA Isolation Kit提取试剂盒(北京PELFREEZ公司)；PCR缓冲液、dNTP、Taq酶(美国ABI公司)；引物由上海生工生物有限公司合成。

(1)引物设计：根据美国国家生物信息中心(NCBI)GenBank记录的PIK3CA基因(序列号:NC_000003.12)，通过Oligo6.0引物软件设计引物，最终确定1对特异性寡核苷酸引物序列为F:5’-GACAAGAACAAAGGAGAAAT-3’(SEQIDNO:5)和R:5’-TAATCATTTAAATCCATTAACAT-3’(SEQIDNO:6)，扩增产物片段长度为188bp。

(2)反应总体积：50μL，含PCR5×缓冲液10μL，DNA模板5.0μL，Taq聚合酶(1U/μL)1.0μL，MgCl2终浓度2.0mmol/L，dNTP终浓度200nmol/L，以及特异性上、下引物终浓度200nmol/L，并加消毒双蒸水至总体积50μL。

反应条件：95℃预变性5分钟，然后依次95℃变性30秒，接着55℃退火30秒，72℃延伸30秒分钟，共35个循环。

(3)PIK3CA基因g.179229442T>G突变基因检测：用1.5％琼脂糖凝胶对将步骤(2)所得的增扩产物进行电泳，以检测其是否有目的片段。通过凝胶成像仪观察结果并拍照，PCR产物经电泳后显示为单一条带，无杂带，则提示PCR产物单一，无非特异扩增。若条带位置位于适当大小的位置，则为目的片段。如图1所示，M：50bp梯度分子量标记物，1：空白对照，2：野生型对照，3：PIK3CA基因g.179229442T>G突变样本。

(4)扩增产物纯化：本研究采用Takara公司的Agarose Gel DNA PurificationKit试剂盒将琼脂糖凝胶电泳后的PCR产物进行纯化回收，准备测序。

(5)Sanger测序与结果判断：纯化后PCR产物在ABI3730型全自动DNA测序仪上进行测序。将测序结果与PIK3CA野生型参考序列(NCBI Reference Sequence:NC_000003.12)进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。检测所得基因突变图如图2所示，图中箭头所示为PIK3CA基因显示g.179229442T>G突变

用于乳腺癌辅助诊断突变位点试剂盒的制作

突变位点试剂盒的制作和操作流程是基于PCR扩增和Sanger测序扫描检测技术。试剂盒含有一批突变位点特异性引物(包括下列引物：g.179229442T>G突变位点的引物序列为SEQIDNO:5和SEQIDNO:6)，该试剂盒还可以包括PCR反应常用的试剂，如Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、去离子水等；这些常用试剂都是本领域技术人员熟知的，另外还可以含有标准品和/或对照品(如确定基因型的标准品和空白对照等)。此试剂盒的价值在于只需要外周血而不需要其它组织样品，通过最精简和特异的引物对检测突变位点，再通过突变位点谱辅助判断乳腺癌，不仅稳定，检测方便，且精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导诊断和更有效的个体化治疗。

相关突变位点寡核苷酸引物序列如表1所示。

表1

其中*F为正向引物序列；R为反向引物序列

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 无锡市第五人民医院

<120> PIK3CA-I874R突变基因及其在乳腺癌辅助诊断中的应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 504

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

tggggaaagg cagtaaaggt catgcatgac aaatttacta ataaaatact catgttttag 60

cctgttaaaa catttgctat tttaaaattc catcatttaa ttgtaaacgt gttactcctc 120

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ggtgcgaaat tctcacacta ttatgcaaat tcagtgcaaa ggcggcttga aaggtgcact 240

gcagttcaac agccacacac tacatcagtg gctcaaagac aagaacaaag gagaaatgtg 300

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tttgtgtatt cctctgagtt agaacagaga aaacaattgt actttctatg gaaaaaaata 420

tgctcaacct ttgaaatatt tgatgttaat ggatttaaat gattataatt acttttaatt 480

tggtaaaatc ttaaacattc atct 504

<210> 2

<211> 504

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

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tgctcaacct ttgaaatatt tgatgttaat ggatttaaat gattataatt acttttaatt 480

tggtaaaatc ttaaacattc atct 504

<210> 3

<211> 995

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Met Pro Pro Arg Ile Leu Val Glu Cys Leu Leu Pro Asn Gly Met Ile

1 5 10 15

Val Thr Leu Glu Cys Leu Arg Glu Ala Thr Leu Ile Thr Ile Lys His

20 25 30

Glu Leu Phe Lys Glu Ala Arg Lys Tyr Pro Leu His Gln Leu Leu Gln

35 40 45

Asp Glu Ser Ser Tyr Ile Phe Val Ser Val Thr Gln Glu Ala Glu Arg

50 55 60

Glu Glu Phe Phe Asp Glu Thr Arg Arg Leu Cys Asp Leu Arg Leu Phe

65 70 75 80

Gln Pro Phe Leu Lys Val Ile Glu Pro Val Gly Asn Arg Glu Glu Lys

85 90 95

Ile Leu Asn Arg Glu Ile Gly Phe Ala Ile Gly Met Pro Val Cys Glu

100 105 110

Phe Asp Met Val Lys Asp Pro Glu Val Gln Asp Phe Arg Arg Asn Ile

115 120 125

Leu Asn Val Cys Lys Glu Ala Val Asp Leu Arg Asp Leu Asn Ser Pro

130 135 140

His Ser Arg Ala Met Tyr Val Tyr Pro Pro Asn Val Glu Ser Ser Pro

145 150 155 160

Glu Leu Pro Lys His Ile Tyr Asn Lys Leu Asp Lys Gly Gln Ile Ile

165 170 175

Val Val Ile Trp Val Ile Val Ser Pro Asn Asn Asp Lys Gln Lys Tyr

180 185 190

Thr Leu Lys Ile Asn His Asp Cys Val Pro Glu Gln Val Ile Ala Glu

195 200 205

Ala Ile Arg Lys Lys Thr Arg Ser Met Leu Leu Ser Ser Glu Gln Leu

210 215 220

Lys Leu Cys Val Leu Glu Tyr Gln Gly Lys Tyr Ile Leu Lys Val Cys

225 230 235 240

Gly Cys Asp Glu Tyr Phe Leu Glu Lys Tyr Pro Leu Ser Gln Tyr Lys

245 250 255

Tyr Ile Arg Ser Cys Ile Met Leu Gly Arg Met Pro Asn Leu Met Leu

260 265 270

Met Ala Lys Glu Ser Leu Tyr Ser Gln Leu Pro Met Asp Cys Phe Thr

275 280 285

Met Pro Ser Tyr Ser Arg Arg Ile Ser Thr Ala Thr Pro Tyr Met Asn

290 295 300

Gly Glu Thr Ser Thr Lys Ser Leu Trp Val Ile Asn Ser Ala Leu Arg

305 310 315 320

Ile Lys Ile Leu Cys Ala Thr Tyr Val Asn Val Asn Ile Arg Asp Ile

325 330 335

Asp Lys Ile Tyr Val Arg Thr Gly Ile Tyr His Gly Gly Glu Pro Leu

340 345 350

Cys Asp Asn Val Asn Thr Gln Arg Val Pro Cys Ser Asn Pro Arg Trp

355 360 365

Asn Glu Trp Leu Asn Tyr Asp Ile Tyr Ile Pro Asp Leu Pro Arg Ala

370 375 380

Ala Arg Leu Cys Leu Ser Ile Cys Ser Val Lys Gly Arg Lys Gly Ala

385 390 395 400

Lys Glu Glu His Cys Pro Leu Ala Trp Gly Asn Ile Asn Leu Phe Asp

405 410 415

Tyr Thr Asp Thr Leu Val Ser Gly Lys Met Ala Leu Asn Leu Trp Pro

420 425 430

Val Pro His Gly Leu Glu Asp Leu Leu Asn Pro Ile Gly Val Thr Gly

435 440 445

Ser Asn Pro Asn Lys Glu Thr Pro Cys Leu Glu Leu Glu Phe Asp Trp

450 455 460

Phe Ser Ser Val Val Lys Phe Pro Asp Met Ser Val Ile Glu Glu His

465 470 475 480

Ala Asn Trp Ser Val Ser Arg Glu Ala Gly Phe Ser Tyr Ser His Ala

485 490 495

Gly Leu Ser Asn Arg Leu Ala Arg Asp Asn Glu Leu Arg Glu Asn Asp

500 505 510

Lys Glu Gln Leu Lys Ala Ile Ser Thr Arg Asp Pro Leu Ser Glu Ile

515 520 525

Thr Glu Gln Glu Lys Asp Phe Leu Trp Ser His Arg His Tyr Cys Val

530 535 540

Thr Ile Pro Glu Ile Leu Pro Lys Leu Leu Leu Ser Val Lys Trp Asn

545 550 555 560

Ser Arg Asp Glu Val Ala Gln Met Tyr Cys Leu Val Lys Asp Trp Pro

565 570 575

Pro Ile Lys Pro Glu Gln Ala Met Glu Leu Leu Asp Cys Asn Tyr Pro

580 585 590

Asp Pro Met Val Arg Gly Phe Ala Val Arg Cys Leu Glu Lys Tyr Leu

595 600 605

Thr Asp Asp Lys Leu Ser Gln Tyr Leu Ile Gln Leu Val Gln Val Leu

610 615 620

Lys Tyr Glu Gln Tyr Leu Asp Asn Leu Leu Val Arg Phe Leu Leu Lys

625 630 635 640

Lys Ala Leu Thr Asn Gln Arg Ile Gly His Phe Phe Phe Trp His Leu

645 650 655

Lys Ser Glu Met His Asn Lys Thr Val Ser Gln Arg Phe Gly Leu Leu

660 665 670

Leu Glu Ser Tyr Cys Arg Ala Cys Gly Met Tyr Leu Lys His Leu Asn

675 680 685

Arg Gln Val Glu Ala Met Glu Lys Leu Ile Asn Leu Thr Asp Ile Leu

690 695 700

Lys Gln Glu Lys Lys Asp Glu Thr Gln Lys Val Gln Met Lys Phe Leu

705 710 715 720

Val Glu Gln Met Arg Arg Pro Asp Phe Met Asp Ala Leu Gln Gly Phe

725 730 735

Leu Ser Pro Leu Asn Pro Ala His Gln Leu Gly Asn Leu Arg Leu Glu

740 745 750

Glu Cys Arg Ile Met Ser Ser Ala Lys Arg Pro Leu Trp Leu Asn Trp

755 760 765

Glu Asn Pro Asp Ile Met Ser Glu Leu Leu Phe Gln Asn Asn Glu Ile

770 775 780

Ile Phe Lys Asn Gly Asp Asp Leu Arg Gln Asp Met Leu Thr Leu Gln

785 790 795 800

Ile Ile Arg Ile Met Glu Asn Ile Trp Gln Asn Gln Gly Leu Asp Leu

805 810 815

Arg Met Leu Pro Tyr Gly Cys Leu Ser Ile Gly Asp Cys Val Gly Leu

820 825 830

Ile Glu Val Val Arg Asn Ser His Thr Ile Met Gln Ile Gln Cys Lys

835 840 845

Gly Gly Leu Lys Gly Ala Leu Gln Phe Asn Ser His Thr Leu His Gln

850 855 860

Trp Leu Lys Asp Lys Asn Lys Gly Glu Ile Tyr Asp Ala Ala Ile Asp

865 870 875 880

Leu Phe Thr Arg Ser Cys Ala Gly Tyr Cys Val Ala Thr Phe Ile Leu

885 890 895

Gly Ile Gly Asp Arg His Asn Ser Asn Ile Met Val Lys Asp Asp Gly

900 905 910

Gln Leu Phe His Ile Asp Phe Gly His Phe Leu Asp His Lys Lys Lys

915 920 925

Lys Phe Gly Tyr Lys Arg Glu Arg Val Pro Phe Val Leu Thr Gln Asp

930 935 940

Phe Leu Ile Val Ile Ser Lys Gly Ala Gln Glu Cys Thr Lys Thr Arg

945 950 955 960

Glu Phe Glu Arg Phe Gln Glu Met Cys Tyr Lys Ala Tyr Leu Ala Ile

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Glu Leu Phe Lys Glu Ala Arg Lys Tyr Pro Leu His Gln Leu Leu Gln

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Asp Glu Ser Ser Tyr Ile Phe Val Ser Val Thr Gln Glu Ala Glu Arg

50 55 60

Glu Glu Phe Phe Asp Glu Thr Arg Arg Leu Cys Asp Leu Arg Leu Phe

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Glu Leu Pro Lys His Ile Tyr Asn Lys Leu Asp Lys Gly Gln Ile Ile

165 170 175

Val Val Ile Trp Val Ile Val Ser Pro Asn Asn Asp Lys Gln Lys Tyr

180 185 190

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gacaagaaca aaggagaaat 20

<210> 6

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<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 6

taatcattta aatccattaa cat 23

Claims (1)

1.一种用于乳腺癌辅助诊断的PIK3CA突变基因，其特征在于：突变型PIK3CA基因如SEQID NO:2所示，相对于如SEQ ID NO:1所示的野生型PIK3CA基因序列，突变型PIK3CA基因序列具有g.179229442T>G位点突变，其编码序列氨基酸由异亮氨酸I转变为精氨酸R。

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