CN111154875A - 一种乳腺癌基因ERBB2位点g.39711928A>G突变体及其应用 - Google Patents

一种乳腺癌基因ERBB2位点g.39711928A>G突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种乳腺癌基因ERBB2位点g.39711928A>G突变体，该ERBB2基因突变与ERBB2正常野生型基因序列相比具有g.39711928A>G位点突变。本发明提供了乳腺癌致病的新的突变位点，可用于早期乳腺癌筛查。通过突变位点序列的改变进行相关诊断试剂盒的研制和应用，可使得乳腺癌的诊断更加方便易行。

Description

一种乳腺癌基因ERBB2位点g.39711928A＞G突变体及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种乳腺癌基因ERBB2位点g.39711928A＞G突变体及其应用。
背景技术
乳腺癌已被认知属于一种全身性疾病，乳腺癌的病因至今尚未明确揭示，随着肿瘤分子遗传学、肿瘤细胞遗传学和分子流行病学的发展，目前认为环境因素和遗传因素共同作用影响乳腺癌的发生，在遗传性癌综合征中，癌相关基因的种系突变决定了该家族的肿瘤遗传易感性；而在散发性癌症中，主要危险因素是环境因子，与此相关基因的遗传多态性决定了个体对这些因素的易感性。
有研究表明携带乳腺癌遗传易感基因的女性，乳腺癌的发病风险将会大大提高，以BRCA1和BRCA2基因为例，携带者终生患乳腺癌的风险高达80％，因此针对这些与乳腺癌相关的易感基因的检测可提高乳腺癌的二级预防(早发现、早诊断、早治疗)。其中，乳腺癌相关基因ERBB2又称为neu或HER-2基因，是一种细胞来原癌基因，在多种肿瘤中其癌基因及其蛋白产物(p185)均有过度表达和扩增。对ERBB2癌基因蛋白产物p185的病理研究首先多见于乳腺癌，其作用也较为明确。目前普遍认为，ERBB2蛋白产物的阳性表达可作为判断乳腺癌预后的一个独立指标，特别是ERBB2基因突变体在乳腺癌早期筛查中具有明显的临床指导意义。
研究发现有乳腺癌患者具有ERBB2基因g.39711928A＞G突变。该变异为一个错义变异。这个变异在300例正常对照组中未发现，说明这一变异位点具有增加乳腺癌患病风险。该变异在乳腺癌患者中发生频率显著高于正常对照，说明该突变位点与乳腺癌密切相关。我们针对新发现的ERBB2基因g.39711928A＞G位点突变建立了相应的检测方法。
发明内容
发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种乳腺癌基因ERBB2位点g.39711928A＞G突变体及其应用，本发明提供了乳腺癌致病的新的突变位点，可对乳腺癌筛查辅助应用。
技术方案：为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种乳腺癌基因ERBB2位点g.39711928A＞G突变体，该突变基因与ERBB2正常野生型基因序列相比具有g.39711928A＞G位点突变；所述ERBB2基因g.39711928A＞G位点突变是指突变位点在SEQIDNO:1序列的第229位碱基A突变为G。
进一步的，一种用于检测ERBB2突变基因的特异性引物，该特异性引物的上游引物序列如为SEQIDNO:3所示，下游引物序列如SEQIDNO:4所示，用于检测ERBB2基因g.39711928A＞G位点突变。
进一步的，一种乳腺癌辅助诊断试剂盒，包括用于检测ERBB2基因g.39711928A＞G位点突变的特异性引物。
有益效果：本发明的该突变位点在乳腺癌筛查和基因诊断中具有潜在的应用前景。通过突变位点序列的改变进行相关诊断试剂盒的研制和应用，可使得乳腺癌的诊断更加方便易行，为临床医生快速准确掌握患者病情，为临床治疗效果评价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。
附图说明
附图1为ERBB2基因g.39711928A＞G突变检测的凝胶电泳图；
附图2为ERBB2基因g.39711928A＞G突变测序图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作更进一步的说明。
一种乳腺癌基因ERBB2位点g.39711928A＞G突变体，该突变基因与ERBB2正常野生型基因序列相比具有g.39711928A＞G位点突变；所述ERBB2基因g.39711928A＞G位点突变是指突变位点在SEQIDNO:1序列的第229位碱基A突变为G。
本发明提供一种乳腺癌相关基因ERBB2位点g.39711928A＞G突变体，该突变发生于第17号染色体的39711928位置。该基因在NCBl参考数据库GRCh38.p13中的编号为NC_000017.11(39688084～39728662)。这里列出在该数据库中基因序列包含有本位点野生型的部分碱基序列如SEQIDNO:1所示，ERBB2基因突变相对应的序列如SEQIDNO:2所示，其中突变位点在SEQIDNO:1序列的第229位由碱基A突变为G。
SEQIDNO:1
TAATTTACAGAACTCTCTGCTTTGGTCTCCCTTTTTGCAAAATGGGAATCTCACAGTGCTGATCCCGTCTGGTTGTTGTGAGGGGTAAATGGATGTCAGGTGCTGATGCGTGGTAGGGCATTTAAGTATTGGTTGATATTATTCTTCTTGTGCCTGGGCACGGTAATGCTGCTCATGGTGGTGCACGAAGGGCCAGGGTATGTGGCTACATGTTCCTGATCTCCTTAGACAACTACCTTTCTACGGACGTGGGATCCTGCACCCTCGTCTGCCCCCTGCACAACCAAGAGGTGACAGCAGAGGATGGAACACAGCGGTGTGAGAAGTGCAGCAAGCCCTGTGCCCGAGGTACCCACTCACTGCCCCCGAGGCCAGCTGCAGTTCCTGTCCCTCTGCG
SEQIDNO:2
TAATTTACAGAACTCTCTGCTTTGGTCTCCCTTTTTGCAAAATGGGAATCTCACAGTGCTGATCCCGTCTGGTTGTTGTGAGGGGTAAATGGATGTCAGGTGCTGATGCGTGGTAGGGCATTTAAGTATTGGTTGATATTATTCTTCTTGTGCCTGGGCACGGTAATGCTGCTCATGGTGGTGCACGAAGGGCCAGGGTATGTGGCTACATGTTCCTGATCTCCTTAGGCAACTACCTTTCTACGGACGTGGGATCCTGCACCCTCGTCTGCCCCCTGCACAACCAAGAGGTGACAGCAGAGGATGGAACACAGCGGTGTGAGAAGTGCAGCAAGCCCTGTGCCCGAGGTACCCACTCACTGCCCCCGAGGCCAGCTGCAGTTCCTGTCCCTCTGCG
一种用于检测ERBB2突变基因的特异性引物，该特异性引物的上游引物序列如为SEQIDNO:3所示，下游引物序列如SEQIDNO:4所示，用于检测ERBB2基因g.39711928A＞G位点突变。
用于上述ERBB2基因的突变位点的特异性引物，进行PCR扩增，检测ERBB2基因有无该突变产物片段；并且采用Sanger测序方法检测有无该位点碱基突变，其中PCR扩增引物的上游引物序列如为SEQIDNO:3所示，下游引物序列如SEQIDNO:4所示。
通过基因扩增方法对包含突变基因的目标部位的检测区选择性地进行扩增，由此检测该突变基因的有无。所述检测方法如下：
(1)提取待检样本中DNA；
(2)以该DNA为模板，针对ERBB2基因g.39711928A＞G突变体区域的DNA序列设计的PCR引物进行PCR反应，得到PCR反应产物；
(3)测出PCR反应产物的核苷酸序列组成；
(4)将核苷酸序列与ERBB2野生型基因的序列进行比较，确定是否有ERBB2位点g.39711928A＞G突变。所述PCR反应产物的核苷酸序列组成可以将PCR反应产物通过测序仪进行测序。
所述一种乳腺癌相关基因ERBB2位点g.39711928A＞G突变体的检测，具体步骤如下：
(1)引物设计：根据美国国家生物信息中心(NCBI)GenBank记录的ERBB2基因(序列号：NC_000017.11)，通过Oligo 6.0引物软件设计引物，最终确定1对特异性寡核苷酸引物序列，上游引物序列如表1中SEQID NO:3所示；下游引物序列如SEQID NO:4所示，扩增产物片段长度为280bp；
表1.相关突变位点寡核苷酸引物序列
Figure BDA0002369792090000041
注：SEQIDNO:3所列碱基序列是正向引物序列；SEQIDNO:4为反向引物序列。
(2)ERBB2基因g.39711928A＞G突变体的增扩：反应体系总体积50μL；其中含PCR 5×缓冲液10μL，DNA模板5.0μL，1U/μL的Taq聚合酶1.0μL，MgCl2终浓度为2.0mmol/L，dNTP终浓度为200nmol/L，特异性正向引物和反向引物的终浓度均为200nmol/L；加消毒双蒸水至反应体系总体积50μL；将上述反应体系在PCR仪中反应，反应条件：95℃预变性5min，然后依次94℃变性30s，接着61℃退火40s，72℃延伸1min，共35个循环；
(3)ERBB2基因g.39711928A＞G突变体的检测：用琼脂糖凝胶对将步骤(2)所得的增扩产物进行电泳，以检测其是否有目的片段。
所述ERBB2基因编码序列野生型氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，其中氨基酸改变在SEQ ID NO：6序列中第332位由酪氨酸(Y)转变为半胱氨酸(C)。
SEQIDNO:5
MPRGSWKPQVCTGTDMKLRLPASPETHLDMLRHLYQGCQVVQGNLELTYLPTNASLSFLQDIQEVQGYVLIAHNQVRQVPLQRLRIVRGTQLFEDNYALAVLDNGDPLNNTTPVTGASPGGLRELQLRSLTEILKGGVLIQRNPQLCYQDTILWKDIFHKNNQLALTLIDTNRSRACHPCSPMCKGSRCWGESSEDCQSLTRTVCAGGCARCKGPLPTDCCHEQCAAGCTGPKHSDCLVCASALCPMCSTPQDARGGHPAWYCPIAPGTPGQNSTVKASHLSPQACLHFNHSGICELHCPALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFGASCVTACPYNYLSTDVGSCTLVCPLHNQEVTAEDGTQRCEKCSKPCARVCYGLGMEHLREVRAVTSANIQEFAGCK
SEQIDNO:6
MPRGSWKPQVCTGTDMKLRLPASPETHLDMLRHLYQGCQVVQGNLELTYLPTNASLSFLQDIQEVQGYVLIAHNQVRQVPLQRLRIVRGTQLFEDNYALAVLDNGDPLNNTTPVTGASPGGLRELQLRSLTEILKGGVLIQRNPQLCYQDTILWKDIFHKNNQLALTLIDTNRSRACHPCSPMCKGSRCWGESSEDCQSLTRTVCAGGCARCKGPLPTDCCHEQCAAGCTGPKHSDCLVCASALCPMCSTPQDARGGHPAWYCPIAPGTPGQNSTVKASHLSPQACLHFNHSGICELHCPALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFGASCVTACPCNYLSTDVGSCTLVCPLHNQEVTAEDGTQRCEKCSKPCARVCYGLGMEHLREVRAVTSANIQEFAGCK
其中DNA模板的制备：
采用购置的试剂盒提取全血基因组DNA，具体步骤如下：
(1)取无菌2.0mL离心管一只，加入1mL细胞裂解液。
(2)轻轻震荡然经EDTA抗凝的全血样本，直到彻底混匀；然后吸取500μL血样加入上述含有细胞裂解液的离心管中，轻轻倾倒离心管5～6次混匀。
(3)室温孵育10分钟(期间颠倒离心管2～3次混匀)。
(4)12000rpm室温离心5分钟。
(5)用移液器缓慢的尽可能将上清液移弃干净，注意勿将两相交界处的白色物质吸出。
(6)使用涡旋振荡器(Votex)剧烈混匀，直至白细胞重悬(10～15秒)。
(7)向重悬细胞溶液中加入核裂解液300μL。用移液枪头吸放溶液5～6次裂解白细胞。此时溶液应变得很粘稠。若混合后可见细胞团块，则将溶液置于37℃孵育直至团块消散。若孵育1小时后仍可见细胞团块，则另加核裂解液100μL并重复置于37℃孵育。
(8)向核裂解物中加入蛋白沉淀液100μL，用涡旋振荡器剧烈震荡10～20秒。
(9)12000rpm室温离心5分钟。
(10)将其上清液转至对应编号的已加入300μL室温异丙醇的2.0mL离心管中。
(11)轻轻颠倒以混匀溶液，直至白色线状DNA形成沉淀。
(12)12000rpm室温离心1分钟。
(13)弃去上清液，加入与样本量等体积的室温70％乙醇，轻轻颠倒离心管数次。
(14)用移液器缓慢的尽可能将乙醇液移弃干净。将离心管置于50℃烘烤5～10分钟，尽量让残余的乙醇液挥发干净。
(15)向离心管中加入50～100μL的DNA溶解液，轻轻混匀。
(16)用1％琼脂糖凝胶电泳来评估DNA提取效果，Nanodrop核酸仪检测含量，定量到20～50ng/μL，-20℃保存。
其中，ERBB2基因g.39711928A＞G突变基因检测技术方法：
仪器：Veriti96型PCR仪、BIO-RADGelDocXR+型凝胶成像仪(美国伯乐公司)、凝胶电泳仪(北京六一公司)。
试剂：QIAampDNA提取试剂盒(德国Qiagen公司)；DNAIsolationKit提取试剂盒(北京PELFREEZ公司)；PCR缓冲液、dNTP、Taq酶(美国ABI公司)；引物由上海生工生物有限公司合成。
(1)ERBB2基因g.39711928A＞G突变体的扩增：反应总体积：50μL，含PCR5×缓冲液10μL，DNA模板5.0μL，Taq聚合酶(1U/μL)1.0μL，MgCl2终浓度2.0mmol/L，dNTP终浓度200nmol/L，以及特异性上、下引物终浓度200nmol/L，并加消毒双蒸水至总体积50μL。
反应条件：95℃预变性5分钟，然后依次95℃变性30秒，接着61℃退火40秒，72℃延伸30秒至1分钟，共35个循环。
(2)ERBB2基因g.39711928A＞G突变体的检测：用1.5％琼脂糖凝胶对将步骤(2)所得的增扩产物进行电泳，以检测其是否有目的片段。通过凝胶成像仪观察结果并拍照，PCR产物经电泳后显示为单一条带，无杂带，则提示PCR产物单一，无非特异扩增。若条带位置位于适当大小的位置，则为目的片段。如图1所示，M：50bp梯度分子量标记物，1：空白对照，2：野生型对照，3：ERBB2基因g.39711928A＞G突变样本。
(3)扩增产物纯化：本研究采用Takara公司的AgaroseGelDNAPurificationKit试剂盒将琼脂糖凝胶电泳后的PCR产物进行纯化回收，准备测序。
(4)Sanger测序与结果判断：纯化后PCR产物在ABI3730型全自动DNA测序仪上进行测序。将测序结果与ERBB2野生型参考序列(NCBIReferenceSequence:NC_000017.11)进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。检测所得基因突变图如图2所示，图中箭头所示为ERBB2基因显示g.39711928A＞G突变。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 安徽省第二人民医院（安徽医学高等专科学校附属医院、安徽省职业病防治院）
<120> 一种乳腺癌基因ERBB2位点g.39711928A>G突变体及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 397
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
taatttacag aactctctgc tttggtctcc ctttttgcaa aatgggaatc tcacagtgct 60
gatcccgtct ggttgttgtg aggggtaaat ggatgtcagg tgctgatgcg tggtagggca 120
tttaagtatt ggttgatatt attcttcttg tgcctgggca cggtaatgct gctcatggtg 180
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ctacggacgt gggatcctgc accctcgtct gccccctgca caaccaagag gtgacagcag 300
aggatggaac acagcggtgt gagaagtgca gcaagccctg tgcccgaggt acccactcac 360
tgcccccgag gccagctgca gttcctgtcc ctctgcg 397
<210> 2
<211> 397
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
taatttacag aactctctgc tttggtctcc ctttttgcaa aatgggaatc tcacagtgct 60
gatcccgtct ggttgttgtg aggggtaaat ggatgtcagg tgctgatgcg tggtagggca 120
tttaagtatt ggttgatatt attcttcttg tgcctgggca cggtaatgct gctcatggtg 180
gtgcacgaag ggccagggta tgtggctaca tgttcctgat ctccttaggc aactaccttt 240
ctacggacgt gggatcctgc accctcgtct gccccctgca caaccaagag gtgacagcag 300
aggatggaac acagcggtgt gagaagtgca gcaagccctg tgcccgaggt acccactcac 360
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<213> Homo sapiens
<400> 3
gtggctacat gttcctgatc tccttagg 28
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
aggggtagag agtagaaggc agagacta 28
<210> 5
<211> 399
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Met Pro Arg Gly Ser Trp Lys Pro Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met
1 5 10 15
Lys Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg
20 25 30
His Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr
35 40 45
Tyr Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu
50 55 60
Val Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro
65 70 75 80
Leu Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn
85 90 95
Tyr Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr
100 105 110
Pro Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg
115 120 125
Ser Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro
130 135 140
Gln Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys
145 150 155 160
Asn Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala
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Cys His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu
180 185 190
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195 200 205
Cys Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln
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Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Val Cys
225 230 235 240
Ala Ser Ala Leu Cys Pro Met Cys Ser Thr Pro Gln Asp Ala Arg Gly
245 250 255
Gly His Pro Ala Trp Tyr Cys Pro Ile Ala Pro Gly Thr Pro Gly Gln
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305 310 315 320
Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu Ser
325 330 335
Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln Glu
340 345 350
Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys Pro
355 360 365
Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu Val
370 375 380
Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys
385 390 395
<210> 6
<211> 399
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
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Val Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro
65 70 75 80
Leu Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn
85 90 95
Tyr Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr
100 105 110
Pro Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg
115 120 125
Ser Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro
130 135 140
Gln Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys
145 150 155 160
Asn Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala
165 170 175
Cys His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu
180 185 190
Ser Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly
195 200 205
Cys Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln
210 215 220
Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Val Cys
225 230 235 240
Ala Ser Ala Leu Cys Pro Met Cys Ser Thr Pro Gln Asp Ala Arg Gly
245 250 255
Gly His Pro Ala Trp Tyr Cys Pro Ile Ala Pro Gly Thr Pro Gly Gln
260 265 270
Asn Ser Thr Val Lys Ala Ser His Leu Ser Pro Gln Ala Cys Leu His
275 280 285
Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val Thr
290 295 300
Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg Tyr
305 310 315 320
Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Cys Asn Tyr Leu Ser
325 330 335
Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln Glu
340 345 350
Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys Pro
355 360 365
Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu Val
370 375 380
Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys
385 390 395

Claims (3)

1.一种乳腺癌基因ERBB2位点g.39711928A>G突变体，其特征在于：该突变基因与ERBB2正常野生型基因序列相比具有g.39711928A>G位点突变；所述ERBB2基因g.39711928A>G位点突变是指突变位点在SEQ ID NO:1序列的第229位碱基A突变为G。
2.一种用于检测权利要求1所述的ERBB2突变基因的特异性引物，其特征在于：该特异性引物的上游引物序列如为SEQ ID NO:3所示，下游引物序列如SEQ ID NO:4所示，用于检测ERBB2基因g.39711928A>G位点突变。
3.一种乳腺癌辅助诊断试剂盒，其特征在于：包括权利要求2所述的用于检测ERBB2基因g.39711928A>G位点突变的特异性引物。
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