CN102108397A

CN102108397A - 一种检测儿童哮喘易发性的试剂盒

Info

Publication number: CN102108397A
Application number: CN200910260049XA
Authority: CN
Inventors: 胡文彬; 宋宏涛; 杨承刚
Original assignee: BEIJINGCHOI YUEN TECHNOLOGY Co Ltd; BEIJING YULI CHUANGTOU TECHNOLOGY DEVELOPMENT Co Ltd
Current assignee: BEIJINGCHOI YUEN TECHNOLOGY Co Ltd; BEIJING YULI CHUANGTOU TECHNOLOGY DEVELOPMENT Co Ltd
Priority date: 2009-12-24
Filing date: 2009-12-24
Publication date: 2011-06-29

Abstract

本发明公开了一种检测儿童哮喘易发性的试剂盒。该试剂盒包括检测ORMDL3基因YL-12号的SNP位点的特异性引物对、特异性核酸探针以及用于荧光定量PCR检测的常规试剂组件等。本发明的试剂盒通过同时检测分析儿童ORMDL3基因YL-12号的SNP位点来预测儿童哮喘病的易发性，为儿童哮喘的早期诊断及靶向治疗提供一定的支持。

Description

一种检测儿童哮喘易发性的试剂盒

技术领域：

本发明涉及一种检测试剂盒，具体而言，涉及一种能快速、有效的检测出儿童ORMDL3基因的基因多态性，从而快速判断儿童是否易发生哮喘病的试剂盒。

背景技术：

哮喘候选基因研究表明，儿童哮喘的易感性及哮喘严重程度与基因的多态性特征相关，但是存在显著的种族差异，因此其在验证与儿童哮喘相关的候选基因多态性与儿童哮喘易感性的差异具有重要意义。目前报道的与哮喘相关的候选基因达超过一百个，其中25个候选基因在6个以上独立研究中已得到重复性验证，这25个基因分布在1、2、5(6个基因)、6(4个基因)、7、11(3个基因)、12、16、17、19及20号染色体上。近5年研究表明，17号染色体的CCL5∏RANTES、17q21[BOUZIGON E，CORDAE，et al.Effect of 17q21 variants and smoking exposure inearly2onset asthma.N Engl J Med，2008，359：198521994.]、ORMDL3及其邻近基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNPs)[MOFFAT M F，KABESCHM M，et al.Genetic variants regulatingORMDL3 expression contribute to the risk of childhood asthma.Nature，2007，448：4702473.]与多个民族的哮喘易感性相关，因而17号染色体可能是继5、6、11号染色体之外的另一个与哮喘调控机制密切相关的染色体。最近报道显示基因17号染色体ORMDL3基因是与儿童期发作性哮喘有很强的关系[Miriam F.Moffatt，Genetic variantsregulating ORMDL3 expression contribute to the risk of childhoodasthma.NATURE，Vol 448，26 July 2007]。该基因上一个多态性位点rs7216389(GAGGC AACCC TGGAA AGTCA CAAAC A[C/T]GCA TGGAC TCGGCCCTGA TTGAT CA)与儿童哮喘有相互关系。

SNP是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括置换、颠换、缺失和插入。SNP在CG序列上出现最为频繁，而且多是C转换为T，原因是CG中的C常为甲基化的，自发地脱氨后即成为胸腺嘧啶。SNP成为第三代遗传标志，人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等等都可能与SNP有关。SNP将提供一个强有力的工具，用于高危群体的发现、疾病相关基因的鉴定、药物的设计和测试以及生物学的基础研究等。大量存在的SNP位点，使人们有机会发现与各种疾病，包括肿瘤相关的基因组突变；有些SNP并不直接导致疾病基因的表达，但由于它与某些疾病基因相邻，而成为重要的标记[Chen JZ，Xie XD，Wang XX，Tao M，Shang YP，Guo XG.Singlenucleotide polymorphisms of the SCN5A gene in Han Chinese and theirrelation with Brugada syndrome.Chin Med J 2004；117：652-656]。各种设计巧妙、性能优良的新型核酸探针被开发研制，并在基因分析、疾病诊断、生物工程等领域得到了广泛的应用。

因此制备一种简便的试剂盒，来检测哮喘的ORMDL3基因的某些SNP位点，显得非常重要，而本发明恰好解决了这一难题。本发明总国研究发现与多态性位点rs7216389(GAGGC AACCC TGGAA AGTCA CAAAC A[C/T]GCATGGAC TCGGC CCTGA TTGAT CA)有差异，本发明发现了该序列的另外一个多态性的位点，即该序列第19个碱基也呈现多态性，C与T的呈现比例与儿童哮喘易感性有密切关联，我们将该多态性位点暂命名为YL-12号。基于这一点，本发明用荧光标记探针，通过杂交检测基因序列，以判断该儿童是否容易发生哮喘。

本发明所述的检测儿童哮喘易发性的试剂盒能快速、有效的检测出儿童17号染色体ORMDL3基因是否含有纯和GTCA单体型，从而快速儿童是否容易发生哮喘。如果不携带此单体型，则该儿童容易发生哮喘，可较早选进行预防而减少发病率，同时减轻家庭经济负担。

附图说明：

图1为哮喘病儿童与正常儿童的YL-12号SNP位点检测结果比较图；

发明内容：

本发明基于17号染色体ORMDL3基因的YL-12号SNP位点用于评估儿童发生哮喘的概率，提供了一种检测儿童哮喘易发性的试剂盒。本发明所要解决的关键问题在于，快速诊断儿童是否携带GTCA单体型，为哮喘易发性儿童更早的做好预防工作提出建议。

本试剂盒包括：检测ORMDL3基因YL-12号的SNP位点的特异性引物对以及特异性核酸探针、荧光定量PCR反应缓冲液、dNTP混合液、MgCl2溶液、Taq DNA聚合酶、去离子水。

本试剂盒中所述的特异性引物对是指对ORMDL3基因YL-12号的SNP位点设计，能特异性扩增出靶位点的DNA片段的引物对。设计这类引物对是本领域技术人员容易完成的。优选地，试剂盒中包含具有SEQ ID NO：1和2所示序列的引物对。特异性地引物对可以用常规地合成技术进行合成。本领域地技术人员能够理解，本发明地引物不限于这两对引物。

本试剂盒中所述的特异性荧光探针是指对ORMDL3基因YL-12号的SNP位点设计，能通过荧光定量PCR技术特异性扩增出靶位点的DNA片段的探针。设计这类引物对是本领域技术人员容易完成的。优选地，试剂盒中包含具有SEQ ID NO：3与SEQ ID NO：4所示序列的探针。特异性地探针可以用常规地合成技术进行合成。本领域的技术人员能够理解，本发明的引物不限于这两对引物，所有可用于荧光定量PCR检测ORMDL3基因YL-12号的SNP位点的探针均在本发明范围内。

本发明试剂盒的一人份组分盒含量包括：

1.0μl 10×荧光定量PCR反应缓冲液

0.25μl 25mM dNTP

0.5μl 25mM MgCl2溶液

0.05μl 5unit/μl Taq DNA聚合酶

0.2μl 25μM特异性引物

0.1μl 25μM特异性核酸探针

5.6μl去离子水

本试剂盒的保存温度位-20℃

具体实施方案：

下面结合具体的实施例，进一步阐述本发明。下面实施例中未表明具体条件的试验方法，通常按照常规的条件。

实施例检测试剂盒的使用方法

步骤一：DNA模板的提取步骤

抽取儿童外周血，提取DNA。

步骤二：荧光定量PCR试验步骤

使用检测儿童哮喘易发性的试剂盒，其中含有下列引物对和荧光探针(下述核苷酸序列均为5’-3’)：

有义引物：GGTGGGGTGGCTCACGCCTGTAATC(SEQ ID NO：1)

反义引物：TTGTCTTTGGAAATCCAGCCCTGCC(SEQ ID NO：2)

荧光探针1：GACTTTCCAGGGTTGCCTC (SEQ ID NO：3)

荧光探针2：GAGGCAACCCTGGAAAGTT (SEQ ID NO：4)

荧光定量PCR反应体系为总体积10μl，包含浓度25ng/μl的DNA模板2μl、1.0μl的10×荧光定量PCR反应缓冲液、0.25μl的25mM dNTP、0.5μl的25mMMgCl2溶液、0.05μl的5unit/μl Taq DNA聚合酶、0.2μl的25μM特异性引物的0.1μl的25μM特异性核酸探针以及5.6μl的去离子水。在荧光定量PCR扩增仪上进行反应，发应条件为55℃、3分钟，95℃、8分钟，进行50个循环的95℃、40秒，60℃、80秒。反应结束后，在荧光定量PCR仪上读取样品荧光量。

步骤三：SNP基因型分析方法

将荧光定量PCR仪上显示的最终样品荧光量和正常照相对比，荧光探针荧光信号明显高于正常对照，说明被检测样品中ORMDL3基因YL-12号的SNP位点为C型，不容易发生哮喘的儿童；荧光探针2荧光信号明显高于正常对照，说明被检测样品中ORMDL3基因YL-12号的SNP位点为T型，容易发生哮喘的儿童；两个荧光信号都比较强的为杂合型，也是容易发生哮喘的儿童。

实施例2：利用本发明检测北京儿童的ORMDL3基因的SNP位点

本发明的一种检测儿童哮喘易发性的试剂盒的优选实施例为，我们利用检测试剂盒，为哮喘儿童与正常儿童进行了ORMDL3基因的筛选(图1)。其中67例哮喘患儿中，GTCA型的11例占16.4％，GT[C/T]A型为37例占55.2％，GTTA型为19例占28.4％；65例正常儿童GTCA型的59例占90.8％，GT[C/T]A型为4例占6.2％，GTTA型为2例占3.1％。探针检测结果与测序结果一致，说明我们设计的探针试剂盒精确度高，产品成形后使用准确、快速、经济；快速的诊断儿童是否携带GTCA单体型，为儿童哮喘的早期诊断及靶向治疗提供一定的支持。

上述实施例仅供说明本发明之用，而并非是对本发明的限制，有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以作出各种变化和变型，因此所有等同的技术方案也应属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由各权利要求限定。

<110>北京预立创投科技开发有限公司

<120>一种检测儿童哮喘易发性的试剂盒

<160>4

<210>1

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>1

GGTGGGGTGG CTCACGCCTG TAATC

<210>2

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>2

TTGTCTTTGG AAATCCAGCC CTGCC

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>3

GACTTTCCAG GGTTGCCTC

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>4

GAGGCAACCC TGGAAAGTT

Claims

1.一种检测儿童哮喘易发性的试剂盒，包括：检测ORMDL3基因YL-12号的SNP位点的特异性引物对以及特异性核酸探针、荧光定量PCR反应缓冲液、dNTP混合液、MgCl2溶液、Taq DNA聚合酶、去离子水。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的异性引物对是指对ORMDL3基因YL-12号的SNP位点的SNP位点设计，能特异性扩增出靶位点的DNA片段的引物对。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的特异性荧光探针是指对ORMDL3基因YL-12号的SNP位点设计，能通过荧光定量PCR技术特异性扩增出靶位点的DNA片段的探针。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所含的特异性引物对选自具有SEQ ID NO：1和2所示序列的引物对。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所含的特异性荧光探针选自具有SEQ ID NO：3和4所示序列的探针。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：试剂盒的组分和含量包括浓度25ng/μl的DNA模板2μl、1.0μl的10×荧光定量PCR反应缓冲液、0.25μl的25mM dNTP、0.5μl的25mM MgCl2溶液、0.05μl的5unit/μlTaq DNA聚合酶、0.2μl的25μM特异性引物的0.1μl的25μM特异性核酸探针以及5.6μl的去离子水。所述试剂盒供一人份检测使用，保存温度为-20℃。