ES2377300T3 - Método de detección de herpesvirus en una muestra de ensayo - Google Patents

Abstract

Un método de detección de HSV'-1, HSV-2 y VZV que comprende la amplificación en un único tubo de una muestra que comprende material genético viral con el par de cebadores: HSV1S-18 (CCTTCGAACAGCTCCTGG) (SEQ ID Nº 3) y HSV1-AS (ATGACGCCGATGTACTTTTTCTT) (SEQ ID Nº 2); HSV2S-20 (TCCATTTTCGTTTTGTGCCG) (SEQ ID Nº 4) y HSV1-AS (ATGACGCCGATGTACTTTTTCTT) (SEQ ID Nº 2); y VV1S (AAGGTTATATATGGAGATACGGA) (SEQ ID Nº 9) y VV1AS (ATTACCCCAATGTACTTTTTCTT) (SEQ ID Nº 10), para obtener productos de amplificación que comprenden porciones de material genético de HSV-1, HSV-2 yVZV, si se hallan presentes.

Description

Campode la invención

[0001] La presente invención hace referencia a un método y kit para la detección e identificación de herpesvirus en una muestra de ensayo, concretamente el HSV-1, HSV-2 y VZV; opcionalmente también puede detectarse el HHV-6 en la muestra. También quedan aquí descritos un método y kit que permiten asimismo la detección eficiente de VZV, CMV, EBV, enterovirus, HHV-7 y HHV-8.

[0002]Se proporcionan distintas combinaciones particularmente ventajosas de cebadores de amplificación.

[0003]También quedan aquí descritos un método y kit para la detección e identificación, en caso de estar presentes en una muestra de ensayo, de uno o más agentes virales del grupo compuesto por HSV-1, HSV-2, HHV-6, VZV, CMV, EBV, Enterovirus, HHV-7 y HHV-8.

Antecedentes de la invención

[0004]Existen más de 100 herpesvirusconocidos pertenecientesa la familia de la Herpesviridae.De estos,se sabe que 8 infectan a humanos: el virus del herpes simple 1(HSV-1), el virus del herpes simple 2 (HSV-2), el virus de la varicela zoster (VZV), el virus de Epstein-Barr (EBV), el citomegalovirus (CMV), el virus del herpes 6 (HHV-6), el virus del herpes 7 (HHV-7) y el virus del herpes 8 (HHV-8).

[0005]Los herpesvirus son agentes infecciosos que, tras una infección inicial aguda, establecen una infección latente produciendo recurrencias periódicasen condiciones específicas. La recurrencia de la infección producida por herpesvirus se asocia auna patología neurológica y a alteración.Las manifestaciones clínicas más comunes de las infecciones del sistema nervioso central que se asocian a este grupo de virus son: meningitis aséptica, encefalitis, meningoencefalitis y polirradiculitis.

[0006] Además de infecciones neurológicas producidas por herpesvirus, existen otras infecciones neurológicas de origen viral causadas por virus del grupo enterovirus, como se describe en EP0789081. Tanto los enterovirus como los herpesvirus son capaces de producirsíndromes neurológicos, tanto en pacientes inmunocompetentes como en inmunodeprimidos.

[0007]Las técnicas generales de laboratorio para la detección viral comprendenel aislamiento de virus en células cultivadas, técnicas serológicas y detección de material genético por PCR. Estas dos últimas técnicas son lentas y de baja sensibilidad, por lo cual se han centrado los esfuerzos más recientes en esta última técnica.

[0008] Los herpesvirus son virus con envoltura cuyo genoma constituye una molécula de ADN bicatenario, mientras que los enterovirus son virus sin cubierta con un genoma formado por una molécula de ARN monocatenario de polaridad positiva.

[0009]Se describen algunos ejemplos de ensayos por PCR múltiplepara la detección de herpesvirus en WO93/25707, WO2004/016219 y US2007/0207453.

[0010] EnWO2004/016219 se describe un método para detectar e identificar uno o más herpesvirus en una muestra, donde tal método comprende el uso de cebadores consenso para la secuencia genética de la ADN-polimerasa de los herpesvirus en conservación. La detección e identificación proceden a realizarse mediante análisis de la movilidad de heteroduplos (HMSA por sus siglas en inglés), prueba dot blot o PCR en tiempo real.

[0011]Asimismo, se describe en EP0789081 un método para detectar algunos virus pertenecientes a la familia de la Herpesviridae (HSV-1, HSV-2, VZV, CMV, HHV-6 y EBV) y los Enterovirus.

[0012]En EP0789081 se describen mezclas de cebadores de reacción utilizadas para la amplificación enzimática de genomas de virus pertenecientes a la familia de la Herpesviridae, tales como el SV-1, HSV-2, VZV, CMV, HHV-6 o el EBV, así como enterovirus. Los cebadores se utilizan en una reacción múltiple que genera fragmentos de amplificación del mismo tamaño, a partir de los cuales la identificación del agente infeccioso presente en la muestra sólo puede realizarse a través de una segunda reacción de amplificación sobre los productos resultantes de la primera reacción de amplificación, o de otra forma, por hibridación de las secuencias amplificadas con sondas de oligonucleótidos específicas.

[0013]EnWO 2007/056463 se describen métodos y composiciones para ser utilizados en el análisis cuantitativo y simultáneo de dos o más patógenos virales, bacteriales o protozoarios en una muestra. Los métodos de esta invención implican la adición de cebadores de oligonucleótidos específicos para cada patógeno que desea detectarse, junto con moléculas competidoras de ácido nucleico que se amplifican con cebadores específicos de un patógeno a un nivel de eficiencia similar. Markoulatos P et al. (2000, Journal of Clinical Laboratory Analysis, Vol. 14,nº5, páginas 214-219) describe un método para la detección simultánea de HSV-1, HSV-2 y VZV en una muestra biológica por PCR múltiple. Asimismo, Shin CH et al. (2003, Yonsei Medical Journal, Vol. 44, nº 6, páginas 1001-7), detalla un método para la detección simultáneade HSV-1, HSV-2, CMV y EBV en una muestra también por PCR múltiple.

[0014]EnUS 2007/0141559 se describe un método para la detección y diferenciación entre HSV-1 y HSV-2 en una muestra mediante la utilización de secuencias de cebadoresespecíficaspara HSV-1 o HSV-2 a través de PCR múltiple o independiente.

[0015]Algunos aspectos de la presente invención se relacionan, además,con métodos para reducir la detección de hibridación cruzada no específica de secuencias diana de ácido nucleico amplificadas,particularmente, aunque no de forma exclusiva, en la ejecución del método de detección tal y como se ha descrito anteriormente.

[0016]EnWO 03/033735 se describe un sistema analítico de tira de ensayo por inmersión que comprende reactivos secos que pueden ser utilizados para detectar la presencia de secuencias específicas de ácido nucleico dentro de una muestra.

[0017]EnWO 2007/032748 se describe un método para la detección de metilación en una muestra de ADN que comprende la conversión química de residuos de citosina no metilada a uracilo, amplificando el ADN convertido químicamente con la utilización de cebadores, de los cuales el cebador superior (upper primer) se biotiniza,e hibridando el producto marcadoa una sonda oligonucleotídica, junto con la adición de estreptavidina.

[0018]En WO99/25867 se describe un método para la detección de ácidos nucleicos en varias muestras, lo cual comprende la preparación de los ácidos nucleicos en la muestra, la eliminación de inhibidores de amplificación, la generación de productos por PCR de secciones del ácido nucleico, y la detección automática de los productos de la amplificación.

[0019] EnUS2005/0287549 se describe un método para la detección simultánea de un número de polimorfismos de nucleótido simple (SNP). Se describe particularmente el uso de un par de cebadores de los cuales el primero es biotinizado.Tras ello,se inmoviliza el producto de amplificaciónmediante reacciones con avidina-biotina.

[0020] EnEP0795612 se describe un método para amplificar y detectar un ácido nucleicodiana en una muestra, lo cual comprende seguir un paso de incubación post-amplificación con anterioridad a la detección para inactivar las enzimas de la amplificación. Un producto amplificado con biotina puede entonces ser detectado por hibridación con unconjugado estreptavidina-enzima.

[0021]EnWO 01/094638 se describe un método para la amplificación del ácido nucleico, que incluye un protocolo de termociclado,y el uso de cebadores marcados de avance en el paso de amplificación.

[0022]En EP1595960 se describe un método para la detección selectiva de ácido nucleico en una muestra, lo cual comprende la amplificación del ácido nucleico con dos cebadores, uno de los cuales es biotinizado, y la hibridación del producto marcadocon una sonda de captura.

[0023]EnKR060015668 se describe un método para la detección de microorganismos patógenos, que comprende la amplificación de una secuencia diana con un cebador marcado y la hibridación del producto marcado con sondas inmovilizadas sobre la superficie de un biochip.

[0024]En la base de datos Geneseq (cebador de amplificación genómica del virus de la varicela zoster) (con números de accesoa la base de datos AAT37529 y AAT37524) se describe el uso de al menos un cebador de amplificación en AAT37520-T37522 y en AAT37523-T37532 para la amplificación de las secuencias de enterovirus y herpesvirus.

[0025]Enla base de datos Geneseq (sonda específica del virus herpes humano 2 con número de identificador de secuencia SEQ ID Nº: 5) sedescribe un chip genético de herpesvirus que comprende una sonda específica de herpesvirus.

[0026] EnUS 2004/110195 se detallan métodos por PCR capaces de identificar los 8 herpesvirus humanos, incluidos los subtipos EBV y HHV-6, mediante la amplificación del gen de la ADN-polimerasa del herpesvirus. En US 2004/110195 se describe también la amplificación tanto del HSV-1 como del HSV-5 con un único par de cebadores.

[0027]En la base de datos Geneseq (cebador de amplificación genómica del virus del herpes simple) se describe la utilización de al menos un cebador en AAT37520-T37522 y en AAT37523-T37532 para la amplificación de secuencias de enterovirus y herpesvirus.

[0028]Markoulatos Panayotis et al. (J. Clinical Microbiology) describe un ensayo por PCR múltiple para la amplificación en un solo tubo de HSV-1, HSV-2, VZV, CMV y EBV, seguido de la visualización de los productos amplificados por electroforesis en gel de agarosa.

Resumen de la invención

[0029]El problema que pretende resolver la presente invención es la consecución de un método que permita una mejor detección del HSV-1, HSV-2 y VZV que la que presentan otros métodos de trabajo hasta la fecha.

[0030] Lo deseable es que el método previsto pueda,además, permitir la detección deHHV-6, CMV, EBV y enterovirus.

[0031]Este problema ha sido resuelto con el diseño de cebadores de amplificación que, al ser utilizados en reacciones de amplificación según la presente invención, dan como resultado una mayor sensibilidad de detección.

[0032] El uso de cebadores de nuevo diseño es compatible con al menos los mismos índices de detección sensible de VZV, CMV, EBV y enterovirus que los de anteriores métodos de trabajo. Descritos aquí quedan también los cebadores para una amplificación y detección eficientes de HHV-7 y HHV-8.

[0033] La presente invenciónofrece pares de cebadores que no constituyen meras alternativas a los cebadores actuales ya conocidos, sino que dan como resultado unos niveles de amplificación más eficientes.

[0034]Una ventaja del método según la presente invención es que la eficiencia de los cebadores de amplificación no se ve afectada de forma negativa por la presencia de pares adicionales de cebadores de amplificación:

-

W1S y W1AS (para la amplificación del virus VZV), en el caso del método de amplificación de HSV-1 and HSV-2, o

-

CMVS y CMVAS-21 (para la amplificación del virus CMV), EBVAS-23 y CMVS (para la amplificación del virus EBV), HER1 y HER4 (para la amplificación de enterovirus), HV7-FW y HV7-RW (para la amplificación del virus HHV-7), y HV8S y HV8AS (para la amplificación del virus HHV-8), en el caso del método de amplificación del HHV-6.

[0035]Las dificultades que presenta el diseño de PCR múltiples con éxito es una cuestión ampliamente reconocidapor los expertos en la materia (véanse por ejemplo Markoulatos et al., 2000, Journal of Clinical Laboratory Analysis, Vol. 14, nº5, páginas 214-219, o Shin et al., 2003, Yonsei Medical Journal, Vol. 44, nº 6, páginas1001-7). Por tanto, es de reconocer que el diseño de cebadores para dichas reacciones múltiples no resulta una tarea rutinaria de emprender.

[0036]Otra ventaja de la presente invención es que la amplificación con cebadores de amplificacióntal y como prevé la invención da como resultado productos de amplificación de diferentes tamaños, permitiendo así al usuario distinguir entre los diferentes virus de interés sin tener que realizar pasos adicionales, como una segunda reacción de amplificación de los productos resultantes de la primera reacción de amplificación, o la hibridación de la secuencias amplificadas con sondas de oligonucleótidos específicas.

Breve descripción de los dibujos

[0037]

-

Figura 1. Electroforesis en gel de agarosa correspondiente a fragmentos de amplificación del Ejemplo 1. -Figura 2. Electroforesis en gel de agarosa correspondiente a fragmentos de amplificación del Ejemplo 2. -Figura 3. Electroforesis en gel de agarosa correspondiente a fragmentos de amplificación obtenidos en

condiciones experimentales. -Figura 4. Lista de cebadores de amplificación. -Figura 5. Comparación de los resultados obtenidos, con o sin biotinilación selectiva mediante cebador, y en

presencia de un control interno, para HSV-1 y HSV-2. Panel A: sinbiotinilación selectiva de los cebadores; Panel B: con biotinilación selectiva de los cebadores.

-

Figura 6. Comparación de los resultados obtenidos, con o sin biotinilación selectiva, y en presencia de un control interno, para CMV y EBV. Panel A: sin biotinilación selectiva de los cebadores; Panel B: con biotinilación selectiva de los cebadores.

-

Figura 7. Dibujo que ilustra la técnica de marcado de sondas para reducir la detección de hibridación cruzada.

Descripción detallada de las realizaciones de la invención

[0038]Definiciones. Los siguientes términos albergan los significados indicados en la especificación,a menos que se indique de forma expresa lo contrario:

-

Cebadores de amplificación: ácidos nucleicos que unen y permiten la amplificación de una o más secuencias diana.

-

Tubo AT:recipiente de matriz individualcon forma y tamaño típicos de un recipiente de reacción de laboratorio (por ejemplo, un tubo Eppendorf de 1,5 ml) con una micromatriz o microarray fijada en su interior, y en el cual se pueden realizar pruebas basadas en dicha micromatriz.

-

Recipiente de matriz: recipiente de reacción con base plana que comprende una micromatriz. Las moléculas de sonda de la micromatriz pueden estar impresas en un soporte sólido, el cual puede constituir el fondo de un recipiente de matriz, o un soporte sólido diferente fijado a la base de un recipiente de matriz.

-

Micromatriz: distribución de sondas moleculares sobre una superficie, en la que la posición de cada sonda se hace de forma separada. -Reacciones por PCR múltiple y RT-PCR: reacciones por PCR y RT-PCR que permiten la amplificación de dos o más secuencias de ácidos nucleicos si se hallan presentes.

-

Sondas: ácido nucleico apto para unirse específicamente a una secuencia diana de ácido nucleico. Se incluyen el ADN, ARN, APN y cualquier otra forma o modificación del mismo. -Sensibilidad de detección: número mínimo de copias detectadas. Se entenderá aquí por “sensibilidad mejorada” un número mínimo de copias detectablesmás bajo. -Tira de recipientes: conjunto de recipientes de matriz, normalmente 8, cada uno con una micromatriz en su

interior, en los que se pueden llevar a cabo pruebas basadas en micromatriz. -Secuencias diana: secuencias que se desea detectar. -Sondas diana específicas: sondas que hibridan de forma específica con secuencias diana amplificables en las

reacciones de amplificación.

Cebadores de amplificación originales para la detección del HSV-1 y HSV-2:

[0039]SEQ ID N° 1 (CGCATCATCTACGGGGACACGGA) y SEQ ID N° 2 (ATGACGCCGATGTACTTTTTCTT) (Mencionadas en EP0789081 con los números de identificador de secuencia SEQ ID N° 4 y 9respectivamente; véanse Figura 2 y Ejemplo 1 de EP0789081).

[0040]El producto de amplificación fue común a HSV-1 y HSV-2.

[0041]Para distinguirlos, se efectuó una segunda amplificación del producto de amplificación, como muestra el Ejemplo 9 deEP0789081.

Condiciones de amplificación para la detección del HSV-1 y HSV-2 según la presente invención:

[0042]

-

Amplificación del HSV-1: Cebador de nuevo diseño de SEQ ID N° 3HSV1S-18 (CCTTCGAACAGCTCCTGG), y de SEQ ID N° 2, el cebador HSV1AS (ATGACGCCGATGTACTTTTTCTT), referido como cebador SEQ ID N° 9 en EP0789081.

-

Amplificación del HSV-2: Cebador de nuevo diseño de SEQ ID N° 4 HSV2S-20 (TCCATTTTCGTTTTGTGCCG), y de SEQ ID N° 2, el cebador HSV1-AS (ATGACGCCGATGTACTTTTTCTT), referido como cebador de SEQ ID N° 9 en EP0789081.

[0043]La amplificación con los nuevos pares de cebadores de amplificación da como resultado una mayor sensibilidad de detección en comparación con la amplificacióncon los cebadores originales, como puede observarse en la Figura 1 correspondiente al Ejemplo 1.

[0044]Asimismo, la amplificación con los cebadores HSV1S-18 y HSV1-AS es específica para el HSV-1, y produce un fragmento de 262 bp si el HSV-1 está presente en la muestra, mientras que la amplificación con los cebadores HSV2S20 y HSV1-AS es específica para el HSV-2 y produce un fragmento de 170 bp si el HSV-2 se halla en la muestra.

[0045]Los productos de 262 y 170 bp se pueden distinguir en laelectroforesis en gel de agarosa, evitando así tener que hacer otra amplificación del producto de amplificación.

Cebadores de amplificación originales para la detección de HHV-6:

[0046] SEQ ID N° 5 (GAGGTAATTTATGGTGATACGGA) y SEQ ID N° 6 (TGTCTACCAATGTATCTTTTTTT), referidos como SEQ ID N° 7 y 12 respectivamente en EP0789081 (ver Figura 2 y Ejemplo 1 en EP0789081).

Cebadores de amplificación para la detección de HHV-5según la presente invención:

[0047] Cebador de nuevo diseñoHHV6A-AS (GGCGACTTGAACAGACGATC), de SEQ ID N° 7, y cebador de SEQ ID N° 5 HV6S (GAGGTAATTTATGGTGATACGGA), mencionado como SEQ ID N° 7 en EP0789081.

[0048] Se consigue unamejora aún mayor cuando, en la mezcla de cebadores HHV6A-AS y HV6S, el 50% de la cantidad del cebador HHV6A-ASes sustituido por el cebador de nuevo diseñoHHV6B-AS (GGCGATTTGAACAAGCGATC) de SEQ ID N° 8. La razón de esta diferencia es que el cebador HHV6A-AS amplifica de forma específica el subtipo A del HHV-6, mientras que el HHV6B-AS amplifica específicamente el subtipo B del HHV

6.

[0049]El Ejemplo 2 y su correspondiente Figura 2 muestran la mejora de la sensibilidad obtenida con los nuevos cebadores de amplificación con respecto a la obtenida con la mezcla original de cebadores de amplificación deSEQ ID N° 5 y SEQ ID N° 6 (referidas en EP0789081 como SEQ ID N° 7y SEQ ID N° 12, respectivamente).

[0050]Quedan también aquí descritas las condiciones de amplificación que permiten la amplificación de VZV, CMV, EBV y enterovirus en, al menos, los mismos índices de detección sensible que los de anteriores métodos de trabajo. Asimismo, se describen aquí los cebadores necesarios para una amplificación y detección eficientes del HHV-7 y HHV

8. Se proporcionan algunas imágenes representativas en las Figuras 1 a 3, correspondientes a los Ejemplos 1 y 2 que se muestranmás abajo.

[0051] En una realización preferente de la presente invención, los cebadores de amplificación corresponden a los de la Figura 4.

[0052] Los cebadores para la amplificación de enterovirus permite la amplificación de los diferentes tipos de enterovirus: ecovirus, poliovirus y el virus de Coxsackie,si se hallan presentes en la muestra.

5 [0053] En un aspecto preferente, el método para detectarHSV-1, HSV-2, HHV-6, VZV, CMV, EBV, HHV-7, HHV-8 y enterovirus comprende la amplificación de material genético viral en dos reacciones independientes:

Una reacción correspondiente a HSV-1, HSV-2 y VZV (tubo 1), y otra correspondiente a HHV-6, CMV, EBV, HHV-7, HHV-8 y enterovirus (tubo 2), donde los correspondientes cebadores respectivos se incuban con la muestra de interés. En un aspecto preferente, la reacción del tubo 1 es una PCR, y la del tubo 2 una RT-PCR.

10 [0054] En un aspecto preferente de la presente invención, los tubos 1 y 2 comprenden los siguientes componentes:

Tubo 1:

[0055]

Reactivos de la PCR múltiple 1

Volumen (µl)

Muestra

5

Buffer de ADN-polimerasa 10X

5

MgCl2, 25 mM

2

dNTPs, 10 mM

1

HSV1S-18, 0,1µg/µl

0,8

HSV1-AS, 0,1µg/µl

1,6

HSV2S-20, 0,1µg/µl

0,8

W1S, 0,1µg/µl

0,8

W1AS, 0,1µg/µl

0,8

ADN-polimerasa

0,8

Agua libre de nucleasas

hasta un volumen final de 50 µl

15 [0056]En una realización preferente, el par de cebadores utilizado para la amplificación del HSV-1 se compone de HSV1S-18 y HSV1-AS; el par de cebadores para HSV-2 está formado por HSV2S-20 y HSV1-AS; y el par de cebadores para VZV es: W1S (AAGGTTATATATGGAGATACGGA),SEQ ID N° 9, y W1AS (ATTACCCCAATGTACTTTTTCTT), SEQ ID N° 10. (Estos últimos cebadores corresponden, respectivamente, a los de SEQ ID N° 5 y 10 de la Figura 2 de EP0789081).

20 [0057]Los tamaños esperados de los correspondientes cebadores de amplificación son los siguientes:

Virus

Tamaño (bp)

HSV-1

262

HSV-2

170

VZV

193

Tubo 2:

[0058]

Reactivos de la RT-PCR múltiple 2

Volumen (µl)

Muestra

5

Buffer de RT-PCR 5x

10

dNTPs, 10 mM

2

HV6S, 0,1µg/µl

0,8

HHV6A-AS + HHV6B-AS, 0,1µg/µl (50% cada uno)

0,8

CMVS, 0,1 µg/µl

1,6

CMVAS-21, 0,1µg/µl

0,8

EBVAS-23, 0,1µg/µl

0,8

HV7-FW, 0,1µg/µl

0,8

HV7-RW, 0,1µg/µl

0,8

HV8S, 0,1µg/µl

0,7

HV8AS, 0,1µg/µl

0,7

HER1, 20 µM

0,4

HER4, 40 µM

0,2

Agua libre de nucleasas

hasta un volumen final de 50 µl

[0059]En un aspecto preferente, el par de cebadores utilizados para la amplificación del HHV-6 está formado por HV6S

5 (SEQ ID N° 5, referida como SEQ ID N° 7 en la Figura 2 de EP0789081) y una mezcla de los cebadores HHV6A-AS y HHV6B-AS, con números SEQ ID N° 7 y 8 respectivamente (ver la información anterior y la Figura 4para las secuencias correspondientes). El par de cebadores para CMV está compuesto por SEQ ID N° 11 CMVS (correspondiente a SEQ ID N° 6 de la Figura 2 en EP0789081) y SEQ ID N° 12 CMVAS-21 (Ver Figura 4). El par de cebadores para EBV es: SEQ ID N° 13 EBVAS-23 (Ver Figura 4) y SEQ ID N° 11 CMVS (correspondiente a SEQ ID N° 6 de la Figura 2 en

10 EP0789081).Los pares de cebadores que quedan son: HV7-FW y HV7-RW para HHV-7, HV8S y HV8AS para HHV-8, y HER1 y HER4 para enterovirus (ver Figura 4).

[0060]Los tamaños esperados de los correspondientes cebadores de amplificación son:

Virus

Tamaño (bp)

HHV-6

122

CMV

106

EBV

132

HHV-7

207

HHV-8

192

Enterovirus

328

[0061]En un aspecto preferente, las reacciones por PCR de los Tubos 1 y 2 se efectúan en un termociclador 15 programado con el siguiente perfil de ciclo:

1 ciclo

45°C 45 min

1 ciclo

95°C 15 min

45 ciclos

95°C 30 seg

56°C 1 min 30 seg

72°C 1 min

1 ciclo

72°C 10 min

Las diferencias entre los tamaños de los fragmentos permiten distinguir qué virus se halla en la muestra, sin necesidad de llevar a cabo una segunda reacción de amplificación.

5 [0062]Además, los valores de sensibilidad obtenidos con el método según la presente invención son, al menos, los mismos que los obtenidos con los pares de cebadores actuales (ver Ejemplos 1 y 2, así como las Figuras 1 a 3).

[0063]En otra realización preferente, uno o ambos tubos de reacción comprenden también controles internos. En una realización preferente, el protocolo de la presente invención incluye un control interno del paso de extracción de ácidos nucleicos. En otra realización preferente, el protocolo de la presente invención incluye un control interno del paso de

10 amplificación del ácido nucleico.

[0064] Un control interno preferente constituiría un plásmido de ADN susceptible de amplificación mediante cebadores de amplificación RTS (GCTTGGGCGTGTCTCAAAATCT, SEQ ID Nº 20) y RTA (GTCGCCACGGTTGATGAGAGCT, SEQ ID Nº 21). De forma preferente, el control interno sería:

Reactivosmúltiples

Volumen (µl)

Control interno de ADN, 103 copias

5

RTS 20 µM

0,5

RTA 20µM

0,5

[0065]En un volumen final de reacción de 50 µl.

[0066] El producto de la amplificación correspondiente al control interno de ADN es un fragmento de ADN de 885 bp.

[0067] Otros controles internos preferentes aquí descritos constituirían un fragmento de ARN que se añadiría preferentemente a la muestra de ensayo con anterioridad ala extracción del ácido nucleico.Otro control interno

20 preferente seríaun fragmento de ARN que se añadiría de forma preferente a los ácidos nucleicos con posterioridad a la extracción de la muestra de ensayo. En un aspecto de mayor preferencia, el fragmento de ARN estaría presente dentro del recipiente que contiene los reactivos de amplificación, con anterioridad a la incubación con los ácidos nucleicos obtenidos de la muestra de ensayo.

[0068] En un aspecto de mayor preferencia, el fragmento de ARN podría obtenerse por transcripción del ARN de un 25 plásmido. En otro aspecto preferente, el fragmento de ARN podría obtenerse por síntesis química.

[0069] Un problema inherente a las PCR múltiples constituye la presencia de varios cebadores en la misma reacción de amplificación, lo cual puede llevar a una interacción entre los cebadores presentes que podría impedir su hibridación con las secuencias diana y la correspondiente amplificación. Este impedimento técnico fue superado con la combinación específica de cebadores de amplificación de las PCR múltiples correspondientes al Tubo 1 y al Tubo 2.

30 [0070]En una realización preferente, los tipos de muestra que pueden procesarse mediante la presente invención sonfrotis, biopsias parafinadas, solución salina, plasma y líquido cefalorraquídeo.

[0071] En otra de las realizaciones preferentes, la extracción del material genético puede llevarse a cabo mediante lasúltimas técnicas automáticas o manuales.

[0072] En una realización aún más preferente,el sistema de extracción automática que puede emplearse para el aislamiento tanto de las muestras de ADN como de ARN de la presente invención es elNucliSENS easyMAG de BioMérieux (EP1694813), que utiliza partículas magnéticas en combinación con la tecnología BOOM® de BioMérieux para el aislamiento universal de ácidos nucleicos a partir de una amplia variedad de volúmenes y tipos de muestras.

[0073]El experto en la materiaes conocedor de las técnicas y métodos de procesamiento manual de muestras para extraer ADN y otros ácidos nucleicos; cualquiera de estos métodos puede ser empleado.

[0074]En un ejemplo en concreto, los ácidos nucleicos se extraen a partir de una muestra de ensayo de 50 µl. Tras efectuar el paso de extracción, el precipitado es resuspendido en 25 µl de agua libre de RNasa.

[0075]En una realización preferente/concreta,5 µl de los 25 µl que comprenden el material genético extraído de la muestra de ensayo son añadidos al recipiente que contiene los reactivos de amplificación, en un volumen final de 50 µl.

[0076] En una realización preferente de la presente invención, los productos de la PCR obtenidos con los cebadores de amplificación según la invención pueden caracterizarse aún más mediante la tecnología con micromatriz. Dicha tecnología ofrece una detección simultánea de marcadores moleculares múltiples para uso diagnóstico y proporciona los controles necesarios para asegurar la fiabilidad de los resultados.

[0077]En una realización preferente de la presente invención, se puede introducir un marcador al ADN amplificado durante el proceso de amplificación para permitir una detección posterior, preferiblemente un marcador que ofrezca una señal que pueda ser detectada por métodos colorimétricos. En la realización más preferente, dicho marcador es biotina. No obstante, se puede emplear cualquier otro tipo de marcador conocido en el ámbito (p. ej.digoxigenina). Se pueden utilizar marcadores radioactivos o fluoróforos en ciertas realizaciones. En una realización preferente, el marcadodel ADN amplificado puede lograrse mediante la adición de nucleótidos modificados que llevan un marcador (p. ej.derivados de digoxigenina-dUTP y biotina-dUTP) a la mezcla de amplificación. En otra realización aún más preferente, el marcador está contenido en los cebadores de amplificación.

[0078]En una realización preferente de la presente invención, el ADN amplificado, previamente desnaturalizado, es hibridadocon las secuencias diana específicas para minimizar el problema de las PCR múltiples, que consiste en la obtención de fragmentosde amplificación específicos, debido a la presencia de varias cebadores.

[0079] En una realización preferente, la desnaturalización del ADN amplificado puede realizarse mediante su calentamiento. Asimismo, se pueden utilizar otros procedimientos para prepararADN monocatenario después de la amplificación,por ejemplo, haciendo uso de medios químicos.

[0080]Los cebadores de la presente invención, marcados con biotina, fueron analizados para comprobar su eficacia de amplificación mediante electroforesis en gel de agarosa. Se analizó el marcado tanto de uno como de ambos cebadores de cada par. Las condiciones seleccionadas fueron las siguientes:

La presencia de X indica la condición escogida.

HSV-1

HSV-2 VZV CMV EBV HHV-6 HHV-7 HHV-8 Entero

1 cebadormarcado

X X

2 cebadoresmarcados

X X X X X X X

[0081] En general, el marcado de uno o de ambos cebadores con biotina no afectó la eficacia de amplificación de los cebadores. En la mayoría de casos, se seleccionó el marcado de ambos cebadores.

[0082] No obstante, cuando los productos de amplificación fueron desnaturalizados e hibridados con sondas específicas de cada virus, surgieron problemas de hibridación cruzada (esto es,de la unión con sondas específicas para otro virus). Se produjo hibridación cruzada entre el producto de amplificación del HSV-1 con la sonda específica para HSV-2, y entre el producto de amplificación del EBV con la sonda específica para CMV. No fue fácil resolver este problema debido a las secuencias homólogasde los virus.

[0083]Dicho problema fue resuelto de la siguiente forma: se marcó con biotina sólo un cebador de cada par de cebadores de amplificación de los virus en los que se produce hibridación cruzada (esto es, HSV-1 o EBV). De esta forma, no se marca la cadena de ácido nucleico de los fragmentos de amplificación que hibridan con la sonda específica para otro virus (es decir, se produce hibridación cruzada)y, por tanto,no se produce ninguna señal.

[0084]Así, aunque la cadena complementaria hibrida con la sonda correspondiente al otro virus, no se genera señal.

[0085] En este caso,no se marcóla cadena de HSV-1en la que se produce hibridación cruzada con HSV-2, ni la cadena

5 de EBV en la que se produce hibridación cruzada con CMV. En concreto, no fue marcado el HSV1S-18 para la amplificación del HSV-1, y el HSV1-ASfue marcadocon biotina. Para la amplificación del EBV, no fue marcado el EBVAS-23, y el CMVS fue marcado con biotina. Los dos cebadores para la amplificación del HSV-2 (HSV1-AS y HV2S20) y el del CMV (CMVS y CMVAS-21) se marcaron con biotina.

[0086] Se puede utilizar cualquier método de marcado.

10 [0087] En la Figura 7 se muestra un dibujo del plan marcado seguido.

[0088]Las condiciones adecuadas de amplificación de las reacciones de la PCR múltiple 1 y la RT-PCR múltiple 2 son las siguientes:

Reactivos de la PCR múltiple 1

Volumen (µl)

Muestra

5

Buffer de ADN-polimerasa 10X

5

MgCl2, 25 mM

2

dNTPs, 10 mM

1

HSV1S-18, 0,1µg/µl

0,8

B-HSV1-AS, 0,1µg/µl

1,6

B-HSV2S-20, 0,1µg/µl

0,8

B-VV1S, 0,1µg/µl

0,8

B-VV1AS, 0,1µg/µl

0,8

ADN-polimerasa

0,8

Agua libre de nucleasas

hasta un volumen final de 50 µl

Reactivos de la RT-PCR múltiple 2

Volumen (µl)

Muestra

5

Buffer de RT-PCR 5x

10

dNTPs, 10 mM

2

HV6S, 0,1µg/µl

0,8

B-HHV6A-AS + B-HHV6B-AS, 0,1µg/µl (50% cada uno)

0,8

B-CMVS, 0,1µg/µl

1,6

B-CMVAS-21, 0,1µg/µl

0,8

EBVAS-23, 0,1µg/µl

0,8

B-HV7-FW, 0,1µg/µl

0,8

B-HV7-RW, 0,1µg/µl

0,8

B-HV8S, 0,1µg/µl

0,7

B-HV8AS, 0,1µg/µl

0,7

B-HER1, 20 µM

0,4

HER4, 40 µM

0,2

Agua libre de nucleasas

hasta un volumen final de 50 µl

[0089] De forma preferente, una o ambas reacciones múltiples también comprende(n) un control interno de ADN, por ejemplo en forma de plásmido de ADN, así como cebadores para su amplificación. A modo de ejemplo:

Reactivos

Volumen (µl)

Control interno de ADN, 103 copias

5

RTS 20 µM

0,5

RTA 20µM

0,5

[0090] La introducción de los componentes anteriormente mencionados en cualquiera de las reacciones múltiples no afecta el resultado obtenido.

[0091] La comparación de los resultados obtenidos bajo las condiciones preferentes arriba mencionadas, tanto con biotinilización selectiva del cebador como sin ella, y en presencia del control interno anteriormente descrito, se muestran, para los casos de HSV-1 / HSV-2 y CMV / EBV respectivamente, en las Figuras 5 y 6.

[0092] Los fragmentos amplificados obtenidos fueron hibridados en un tubo AT con diferentes sondas selectivas correspondientes a cada virus, tal y como se indica.

[0093] En una realización preferente de la presente invención, se incuba el ADN monocatenario con una pluralidad de sondas diana específicas dispuestas en una micromatriz. Al menos una de ellas, aunque preferiblemente más de una con capacidad de hibridar con cada secuencia diana, se hallan dispuestas en la micromatriz. En ciertas realizaciones de la invención, el ADN monocatenario puede incubarse con sondas diana específicas en solución; no obstante, es preferible que las sondas se hallen sobre una superficie sólida.

[0094] En una realización preferente de la presente invención, las sondas se presentan dentro de una micromatriz, que puede colocarse en un portaobjetos o en un recipiente de reacción, lo cual pasa a denominarse recipiente de matriz. Los recipientes de matriz pueden tener diferentes formatos de presentación, entre los que se incluyen los recipientes de matriz individuales, en particular los tubos AT o sets de recipientes de matriz distribuidos en tiras o placas planas. Normalmente,las placas consisten en sets de tiras de recipientes de matriz. Por tanto, una micromatriz de la presente invención puede estar contenida en un recipiente de matriz individual. De forma alternativa, una tira de recipientes puede contener dos o más micromatrices. En una realización preferente, 8 recipientes componen la tira de recipientes. Asimismo, se pueden distribuir tres o más recipientes de matriz en un set de tiras de recipientes. En otra realización preferente, el set de tiras de recipientes constituye una placa de microtitulación.

[0095] En realizaciones preferentes, las moléculas de sonda de la micromatriz pueden estar impresas en un soporte sólido, el cual puede constituir el fondo de un recipiente de matriz o un soporte sólido distinto fijado al fondo de un recipiente de matriz. Esto significa que la superficie de la micromatriz puede ser el fondo plano del recipiente de matriz. De forma alternativa, la superficie de la micromatriz puede ser un soporte sólido fijado al fondo de un recipiente de matriz.

[0096] En una de las realizaciones de la presente invención, el recipiente de reacción presenta el tamaño típico de un recipiente de reacción de laboratorio. Los volúmenes de llenado típicos se situán entre los 100 µl y 2.5 ml, pero pueden ser mayores o menores en realizaciones especiales. Concretamente, el recipiente de reacción será preferiblemente un tubo AT,esto es, un recipiente de matriz con un volumen de llenado normal para un tubo Eppendorf estándar de hasta 1,5 ml. Otros volúmenes de llenado preferentes son aquellos con un máximo de 0,4 ml, 0,5 ml, 0,7 ml, 1,0 ml o 2,0 ml.

[0097] Debido al marcado del ADN amplificado, dondequiera que las moléculas de la muestra interactúen con moléculas sonda en la superficie de la micromatriz, un reactivo indicador se une al marcador y produce señales visibles que pueden ser detectadas por un dispositivo de detección. La sonda que interactúa y las moléculas de la muestra son identificadas por la localización de la señal en la superficie de la micromatriz. En el caso particular en que moléculas de ADN de la muestra se marcan con biotina, el reactivo indicador puede ser peroxidasa de rábano unido de forma covalente a estreptavidina. Esta última se une específicamente a la biotina, y la peroxidasa desencadena la precipitación de sustratos comotetrametilbencidina (TMB). Se puede utilizar otra reacción que dé como resultado un precipitado en los elementos de matriz y que pueda ser utilizado para detectar la interacción entre moléculas diana y moléculas sonda según la presente invención. Las sondas de la presente invención pueden obtenerse por diferentes métodos, tales como síntesis química (p. ej. por el método fosfodiéster convencional) o técnicas de ingeniería genética, como por ejemplo mediante la clonación molecular de plásmidos recombinantes en los que las secuencias nucleótidas correspondientes se han insertado y pueden ser después obtenidas por digestión con nucleasas.

[0098] Se pueden diseñar sondas específicas mediante la utilización del programa de alineamiento de ácido nucleico Oligo 6. Los parámetros de Tm y el ratio de GC se analizan en todos los casos, evitándose la formación de estructura secundaria. Las sondas preferentes de la presente invención son las que tienen la misma Tm sometidas a la concentración salina utilizada en el paso de hibridación. En una realización preferente, se seleccionan sondas para unirse a sus secuencias diana correspondientes en las mismas condiciones de hibridación. El experto en la materia es conocedor de otras formas en que pueden diseñarse sondas específicas.

[0099] En una realización concreta de la presente invención, se seleccionan las sondas de forma que no hibriden con ADN genómico, ni lo hagan de una forma no específica con fragmentos amplificados correspondientes a otros virus.

[0100] En una realización preferente, se presentan una o más sondas de la presente invención sobre un soporte sólido.

[0101] En otra realización preferente, dos o más sondas diana específicas para la misma secuencia diana se presentan sobre un soporte sólido para mejorar la detección de los agentes virales de interés.

[0102] En una realización preferente, las sondas de la presente invención son de 30 nt de longitud o menos.

[0103]Tales sondaso mezclas de sondas pueden ser inmovilizadas en una localización única del soporte sólido, preferiblemente en dos localizaciones distintas del soporte y, con mayor preferencia, en tres localizaciones distintas del soporte sólido.

[0104]En una realización preferente, las sondas de la invención se presentan en un soporte sólido localizado dentro de un recipiente de matriz.

[0105] En otra de las realizaciones, se sitúan las sondas de la presente invención en un soporte sólidocontenido enuna tira de recipientes de matriz o tira AS (array strip por sus siglas en inglés).

[0106]En una realización aún más preferente, la tira ASde la presente invención se compone de 8 recipientes de matriz.

[0107] En una realización preferente, el soporte sólido es un portaobjetos de vidrio con recubrimiento.

[0108] En otra realización preferente, el soporte sólido constituye el fondo de un recipiente de matriz, pudiendo ser éste un tubo AT individual o un componente de una tira de recipientes o un set de tiras de recipientes, como una placa de microtitulación.

[0109]En una realización preferente, las interacciones que tienen lugar entre el ADN amplificado y los pares de cebadores de la presente invención, así como las correspondientes sondas de detección, se producen en un recipiente de matriz individual, en una tira de recipientes o en un set de tiras de recipientes.

[0110] En una realización preferente, la visualización de dichas interacciones consta de los siguientes pasos:

-

En primer lugar, se captura la imagen de la matriz con un dispositivo óptico;

-

Después, se analiza la imagen;

-

Finalmente, se obtiene un informe que ofrece una interpretación del resultado.

[0111] De forma preferente, se analiza la imagen por medio deun software apropiado.

[0112] Se puede utilizar cualquier dispositivo adecuado para este proceso.

[0113]En una realización concreta, las sondas para la detección específica del control interno

amplificables mediante cebadores de amplificación RTS y RTA también están presentes en la micromatriz. En particular, pueden utilizarse las sondas Cl 1 5’(CAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGG, SEQ ID Nº 22), Cl 1 3’(TTGAAGTGGTGGCCTAACTACGG, SEQ ID Nº 23) y Cl 2 5’ (CGTTCCACTGAGCGTCAGACCC,SEQ ID Nº 24).

Ejemplos

[0114] Los ejemplos que se ofrecen más abajo simplemente ilustran la invención y no afectan en modo alguno el alcance de las reivindicaciones que acompañan.

EJEMPLO 1

[0115] 5 µl de la muestra objeto de análisis fueron añadidos a los reactivos de amplificación de la PCR múltiple 1, en un volumen final de reacción de 50 µl, tal y como se muestra a continuación:

Reactivos de la PCR múltiple 1

Volumen (µl)

Muestra

5

Buffer de ADN-polimerasa Taq Gold 10X

5

MgCl2, 25 mM

2

dNTPs, 10 mM

1

HSV1S-18, 0,1 µg/µl

0,8

HSV1-AS, 0,1µg/µl

1,6

HSV2S-20, 0,1µg/µl

0,8

VV1S, 0,1µ/µl

0,8

VV1AS, 0,1µg/µl

0,8

Control interno de ADN, 103 copias

5

RTS 20 µM

0,5

RTA 20µM

0,5

ADN-polimerasa Taq Gold

0,8

Agua libre de nucleasas

hasta un volumen final de 50 µl

[0116] Las reacciones por PCR se realizaron en un termociclador programado con el siguiente perfil de ciclado:

1 ciclo

45°C 45 min

1 ciclo

95°C 15 min

45 ciclos

95°C 30 seg

56°C 1 min 30 seg

72°C 1 min

1 ciclo

72°C 10 min

[0117] El par de cebadores compuesto por el cebador de nuevo diseñoSEQ ID N° 3 HSV1S-18 (CCTTCGAACAGCTCCTGG) y SEQ ID N° 2, HSV1-AS (ATGACGCCGATGTACTTTTTCTT), este último referido como cebador SEQ ID N° 9 en EP0789081, produce un fragmento de 262 bp que corresponde al HSV-1 (verFigura 1); Además, el par de cebadores formado por el cebador de nuevo diseño de SEQ ID N° 4, HSV2S-20 (TCCATTTTCGTTTTGTGCCG) y SEQ ID N° 2, HSV1-AS (ATGACGCCGATGTACTTTTTCTT), este último referido como cebador SEQ ID N° 9 en EP0789081, produce un fragmento de 170 bp que corresponde al HSV-2.

[0118] De forma alternativa, en una reacción por separado, se utilizó el par de cebadores usados enEP0789081,

5 formados por SEQ ID N° 1 (CGCATCATCTACGGGGACACGGA), referido como SEQ ID N° 4 en EP0789081,y SEQ ID N° 2 (ATGACGCCGATGTACTTTTTCTT), referido como SEQ ID N° 9 en EP0789081 (Figura 2 y Ejemplo 1 de EP0789081), en las mismas condiciones que las descritas más arriba, en lugar de HSV1S-18, HSV1-AS y HSV2S-20. Se utilizó un volumen de 1,8 µl de una solución de 0,1 µg/µl de cada cebador. El producto de la amplificación de estos cebadores es común a HSV-1 y HSV-2.

10 [0119] Los resultados comparados obtenidos a partir de los diferentes cebadores de amplificación se muestran en la Figura 1.

[0120] En ambas reacciones, el par de cebadores utilizados para la amplificación del VZV fue: SEQ ID N° 9, VV1S (AAGGTTATATATGGAGATACGGA) y SEQ ID N° 10, VV1AS (ATTACCCCAATGTACTTTTTCTT). Estos cebadores corresponden, respectivamente a los de SEQ ID N° 5 y 10 de la Figura 2 de EP0789081. El tamaño esperado del

15 correspondiente fragmento de amplificación es 193 bp.

[0121] Como puede observarse en la Figura 1, la reacción según la presente invención da como resultado unos valores de sensibilidad mejorados para la detección del HSV-1, HSV-2 y VZV, en comparación con la reacción que se lleva a cabo utilizando los cebadores actuales. En el caso de la VZV puede deberse a la particular combinación ventajosa de los cebadores de la reacción según la presente invención. La comparación de los niveles de sensibilidad obtenidos es la

20 siguiente:

Virus

Sensibilidad (HSV1S-18, SEQ HSV2S-20, HSV1-AS) Sensibilidad (HSV1-AS, ID N° 4 (CGCATCATCTACGGGGACACGGA))

HSV-I

10 102

HSV-II

10 >10

VZV

10 >10

EJEMPLO 2

[0122] 5 µl de la muestra objeto de análisis fueron añadidos a los reactivos de amplificación de la RT-PCR múltiple 2, en 25 un volumen final de 50 µl, tal y como se muestra a continuación:

Reactivos de la RT-PCR múltiple 2

Volumen (µl)

Muestra

5

Buffer de RT-PCR QIAGEN One Step 5X

10

Q-solution 5x

10

HV6S, 0,1 µg/µl

0,8

HHV6A-AS + HHV6B-AS, 0,1 µg/µl (50% cada uno)

0,8

dNTPs, 10 mM

2

CMVS, 0,1µg/µl

1,6

CMVAS-21, 0,1µg/µl

0,8

EBVAS-23, 0,1µg/µl

0,8

HV7-FW, 0,1 µg/µl

0,8

HV7-RW, 0,1µg/µl

0,8

HV8S, 0,1µg/µl

0,7

HV8AS, 0,1 µg/µl

0,7

HER1, 20 µM

0,4

HER4, 40 µM

0,2

Control interno de ADN, 103 copias

5

RTS 20 µM

0,5

RTA 20µM

0,5

Mezcla de enzimas de la RT-PCR con kit QUIAGEN OneStep RT-PCR

2

Agua libre de nucleasas

hasta un volumen final de 50 µl

[0123] Las condiciones de amplificación fueron las mismas que para la PCR múltiple 1.

[0124] De forma alternativa, se utilizó en una reacción aparte el par de cebadores descritos enEP0789081 para HHV-6, CMV, EBV y enterovirus (ver Figura 2 y Ejemplo 1 de EP0789081). La comparación de las sensibilidades 5 correspondientes a HHV-6 se muestra en la Figura 2 más abajo. La Figura 3 ofrece más fragmentos de amplificación obtenidos en las condiciones experimentales anteriormente expuestas.

LISTA DE SECUENCIAS

[0125]

<110> Genomica S.A.U 10 <120> Método de detección de Herpesvirus en una muestra de ensayo

<130> WPP291211

<150> 0806041.0 <151>

<160> 24 15 <170>Versión PatentIn 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> ADN

<213> Artificial

20 <220> <223>Cebador de amplificación del HSV

<400> 1 23 cgcatcatctacggggacacgga

<210> 2 25 <211> 23

<212> ADN

<213> Artificial

<220> <223>Cebador de amplificación del HSV

<400> 2 23 atgacgccgatgtactttttctt

<210> 3

<211> 18

<212> ADN

<213> Artificial

<220> <223>Cebador de amplificación del HSV-1

<400> 3 18 ccttcgaaca gctcctgg

<210> 4

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220> <223>Cebador de amplificación del HSV-2

<400> 4 20 tccattttcg ttttgtgccg

<210> 5

<211> 23

<212> ADN

<213> Artificial

<220> <223>Cebador de amplificación del HHV-6

<400> 5 23 gaggtaatttatggtgatacgga

<210> 6

<211> 23

<212> ADN

<213> Artificial

<220> <223>Cebador de amplificación del HHV-6

<400> 6

23 tgtctaccaatgtatcttttttt

<210> 7

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220> <223>Cebador de amplificación del HHV-6

<400> 7 20 ggcgacttga acagacgatc

<210> 8

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220> <223>Cebador de amplificación del HHV-6

<400> 8 20 ggcgatttga acaagcgatc

<210> 9

<211> 23

<212>ADN

<213> Artificial

<220> <223>Cebador de amplificación del VZV

<400> 9 23 aaggttatat atggagatac gga

<210> 10

<211> 23

<212> ADN

<213> Artificial

<220> <223>Cebador de amplificación del VZV

<400> 10 23 attaccccaatgtactttttctt

<210> 11

<211> 23

<212> ADN

<213> Artificial

<220> <223>Cebador de amplificación del CMV

<400> 11 23 cgggtcatctacggggacacgga

<210> 12

<211> 21

<212> ADN

<213> Artificial

<220> <223>Cebador de amplificación del CMV

<400> 12 21 aagccgtcac gtagtgcgcc a

<210> 13

<211> 18

<212> ADN

<213> Artificial

<220> <223>Cebador de amplificación del EBV

<400> 13 18 cagggagatg ggggccac

<210> 14

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220> <223>Cebador de amplificación HV7-FW

<400> 14 20 aggtccaaca tgcacagtga

<210> 15

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220> <223>Cebador de amplificación del HV7-RW

<400> 15

20 ggcaaagaaa atgtgggcta

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220> <223>Cebador de amplificación del HV8S

<400> 16 19 ggtcatatac ggcgacact

<210> 17

<211> 21

<212> ADN

<213> Artificial

<220> <223>Cebador de amplificación HV8AS

<400> 17 21 agtacccccacgtatctctt t

<210> 18

<211> 23

<212> ADN

<213> Artificial

<220> <223>Cebador de amplificación HER 1

<400> 18 23 ctccggcccc tgaatryggc taa

<210> 19

<211> 23

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223>Cebador de amplificación HER4

<220>

<221>Característica miscelánea

<222> (19)..(19) <223>n = i = inosina

<400> 19

23 ctgtgttgaw acytgagcnc cca

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220> <223>Cebador de amplificación RTS

<400> 20 22 gcttgggcgt gtctcaaaat ct

<210> 21

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220> <223>Cebador de amplificación RTA

<400> 21 22 gtcgccacggttgatgagagct

<210> 22

<211> 28

<212> ADN

<213>Artificial

<220>

<223> Sonda CI 1 5'

<400> 22 28 cagctggcacgacaggtttcccgactgg

<210> 23

<211> 23

<212> ADN

<213>Artificial

<220>

<223>Sonda CI 1 3'

<400> 23 23 ttgaagtggtggcctaactacgg

<210> 24

<211> 22

<212> ADN

<213>Artificial

<220>

<223>Sonda CI 2 5'

<400> 24 cgttccactgagcgtcagac cc 22

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un método de detección de HSV'-1, HSV-2 y VZV que comprende la amplificación en un único tubo de una muestra que comprende material genético viral con el par de cebadores:

   HSV1S-18 (CCTTCGAACAGCTCCTGG) (SEQ ID Nº3) y HSV1-AS (ATGACGCCGATGTACTTTTTCTT) (SEQ ID Nº 2);

   HSV2S-20 (TCCATTTTCGTTTTGTGCCG) (SEQ ID Nº 4) y HSV1-AS (ATGACGCCGATGTACTTTTTCTT) (SEQ ID Nº 2); y

   VV1S (AAGGTTATATATGGAGATACGGA) (SEQ ID Nº 9) y VV1AS (ATTACCCCAATGTACTTTTTCTT) (SEQ ID Nº 10),para obtener productos de amplificación que comprenden porciones de material genético de HSV-1, HSV-2 yVZV, si se hallan presentes.

2. 2.

   El método de la reivindicación 1 que comprende,además, la desnaturalización de los productos de amplificación y la hibridación de los productos con sondas diana específicas.

3. 3.

   El método de las reivindicaciones 1 y 2, que comprenden: a) La puesta en contacto la muestra con el set de cebadores de amplificación; b) El sometimiento de la muestra de ensayo mezclada con el set de cebadores de amplificación a una

   reacción de amplificación del ácido nucleico, con el objeto de que dicha reacción de

   amplificaciónamplifique las secuencias diana presentes en la muestra; c) La obtenciónde oligonucleótidos monocatenarios a partir de cualquiera de los productos de amplificación; d) La opciónde que los oligonucleótidos monocatenarios del punto c) hibriden con una pluralidad de sondas

   diana específicas, y e) La detección de oligonucleótidos hibridados.

4. 4.

   El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el cebador HSV1S-18 (SEQ ID Nº 3) no está marcado y el cebador HSV1-AS (SEQ ID Nº 2) sí está marcado, de forma que el producto de amplificación relevante comprenda una cadena de amplificación marcada y una cadena de amplificación sin marcar.

5. 5.

   El método de la reivindicación 4, que además comprende la desnaturalización de los productos de amplificación y la hibridación de los productos de amplificación con una o más sondas que pueden ser sondas diana o no diana, caracterizado porque la cadena marcada obtenida a partir del cebador marcado HSV1-AS (SEQ ID Nº 2) puede hibridar con una sonda diana específica, y la cadena no marcada obtenida del cebador no marcado HSV1S-18. (SEQ ID Nº 3) puede hibridar con la sonda nodiana (si se halla presente).

6. 6.

   Un kit para la detección e identificación de HSV-1, HSV-2 y VZV en una muestra de ensayo, que comprende:

   i. Una mezcla de amplificación de ácido nucleico que comprende los pares de cebadores de amplificación HSV1S-18 (SEQ ID Nº 3) y HSV1-AS (SEQ ID Nº 2), HSV2S-20 (SEQ ID Nº 4) y HSV1-AS (SEQ ID Nº2), y VV1S (SEQ ID Nº 9) y VV1AS (SEQ ID Nº 10)

   ii. Un recipientede matriz o un set de recipientes de matriz, cada uno con una micromatriz en la que se incluyen sondas diana,

   iii. Reactivos para ser utilizados en la visualización de la hibridación de ácidos nucleicos con las sondas de la micromatriz.

7. 7.

   Un kit según la reivindicación 6, que comprende asimismo los reactivos para la extracción del ácido nucleico y/o su purificación.

8. 8.

   El kit según las reivindicaciones 6 y 7, donde el par de cebadores constituido por HSV1S-18 y HSV1-AS comprende el cebador no marcado HSV1S-18 (SEQ ID Nº 3) y el cebador marcado HSV1-AS (SEQ ID Nº 2).

9. 9.

   El kit de las reivindicaciones 6, 7 y 8, que además incluye, como control interno, los cebadores de amplificación RTS (GCTTGGGCGTGTCTCAAAATCT) (SEQ ID Nº 20) y RTA (GTCGCCACGGTTGATGAGAGCT) (SEQ ID Nº 21), así como un ácido nucleico susceptible de amplificación por dichos cebadores.

10. 10.

    El kit de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, donde el recipiente de matriz es un tubo AT.

11. 11.

    El kit de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, donde el set de recipientes de matriz consiste en una tira AS.

12. 12.

    El kit de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, donde las moléculas sonda de la micromatriz son impresas en un soporte sólido, siendo éste el fondo de un recipiente dematriz.

    5 13. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12, donde las moléculas sonda de la micromatriz son impresas en un soporte sólido, el cual se halla fijado en el fondo de un recipiente de matriz.
13. 14. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 13, donde la micromatriz comprende sondas que se unen a sus correspondientes secuencias diana en las mismas condiciones de hibridación.
14. 15. El uso del método según las reivindicaciones 1 a 5, o el kit según las reivindicaciones 6 a 14, para la detección e identificación, en caso de estar presentes en la muestra de ensayo, de uno o más agentes virales seleccionados del grupo formado porHSV-1, HSV-2 y VZV.

    REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

    La lista de referencias citadas por el solicitante se incluye únicamente para la comodidad del lector, no formando parte del documento de la patente europea. A pesar del sumo cuidado durante la recopilación de las referencias, no se pueden excluir la presencia de errores u omisiones, declinando la OEP toda responsabilidad a este respecto.

    Documentos de patentes citados en la descripción

    •

    EP 0789081 A [0006] [0011] [0012] [0039] [0041][0042] [0046] [0047] [0049] [0056] [0059] [0117][0118] [0120] [0124]

    •

    WO 9325707 A [0009]

    •

    WO 2004016219 A [0009] [0010]

    •

    US 20070207453 A [0009]

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    WO 2007056463 A [0013]

    •

    US 20070141559 A [0014]

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    WO 03033735 A [0016]

    •

    WO 2007032748 A [0017]

    •

    WO 9925867 A [0018]

    •

    US 20050287549 A [0019]

    •

    EP 0795612 A [0020]

    •

    WO 01094638 A [0021]

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    EP 1595960 A [0022]

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    KR 060015668 [0023]

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    US 2004110195 A [0026]

    •

    EP 1694813 A [0072]

    Referencias bibliográficas no pertenecientes a patentes citadas en la descripción

    •

    MARKOULATOS P et al. Journal of Clinical • MARKOULATOS et al. Journal of Clinical

    LaboratoryAnalysis, 2000, vol. 14 (5), 214-219 [0013]

    LaboratoryAnalysis, 2000, vol. 14 (5), 214-219 [0035]

    •

    SHIN CH et al. Yonsei Medical Journal, 2003, vol.44 (6), 1001-7 [0013] • SHIN et al. YonseiMedical Journal, 2003, vol. 44 (6), 1001-7 [0035]