KR20060015668A

KR20060015668A - 멤브레인 측면 흐름 디엔에이 칩을 이용한 인체 유해미생물의 검출 방법과 이를 위한 검사 키트

Info

Publication number: KR20060015668A
Application number: KR1020060003006A
Authority: KR
Inventors: 신규철; 김기황
Original assignee: 다이아프로브 (주)
Priority date: 2006-01-11
Filing date: 2006-01-11
Publication date: 2006-02-17

Abstract

본 발명은 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction:PCR)방법과 멤브레인 측면 흐름 DNA 칩(Lateral flow membrane DNA chip)을 이용한 인체 유해 미생물의 검출 방법 및 그에 사용되는 키트에 대한 발명으로, 다양한 인체 검출물로부터 20종의 인체 유해 미생물을 단일 키트로 특이도 높게, 신속하게 검사 할 수 있는 효과가 있다.

본 발명의 핵산 서열 분석 방법 및 킷트는 마이크로웰 플레이트 핵산 교잡법이나 멤브레인 핵산 교잡법 그리고 DNA chip 등 기존의 핵산 분석 방법들에 비해, 단 시간내에 육안으로 정확하고 간편하게 분석 결과를 확인할 수 있으며, 특히 한번에 여러 종류의 핵산을 동시에 검출하는 것이 가능하므로, 핵산 중합 반응에 의한 핵산의 증폭 확인 시험 또는 세균이나 세포로부터 분리 추출한 시료내 특정 핵산의 검출 시험 등의 핵산 서열 분석 시험을 요하는 광범위한 유전자 관련 산업 및 연구 분야에서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

핵산, 멤브레인 측면 흐름 분석 기법, 핵산 중합 반응, 핵산 교잡 반응, 핵산 프로브, 핵산 프라이머, 비오틴, 스트렙트아비딘 부착 발색효소, 발색기질

Description

멤브레인 측면 흐름 디엔에이 칩을 이용한 인체 유해 미생물의 검출 방법과 이를 위한 검사 키트{Method for the detection and analysis of pathogenic microbes nucleotide sequence using membrane lateral flow, and kit for the same}

도 1은 본 발명에 따른 바람직한 일실시예를 나타낸 핵산서열 검출 및 분석용 키트,

도 2는 본 발명에 따른 바람직한 타실시예를 나타낸 핵산서열 검출 및 분석용 키트,

도 3는 본 발명의 간접표지방식 따른 핵산서열의 검출 및 분석방법의 메카니즘을 도식화한 도면,

도 4은 본 발명에서 인체 유해 미생물

의 각 미생물별 핵산들의 중합 반응 결과물에 대하여 본 발명의 방법을 실시한 결과 수득된 멤브레인 스트립 사진,

도 5는 본 발명에서 인체 유해 미생물

도 6는 본 발명에서 각 인체 유해 미생물

핵산의 각종별 양성 샘플들을 섞어서 본 발명의 방법을 실시한 결과 수득된 멤브레인 사진.

< 도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명 >

1 : 멤브레인 반응부 2 : 흡수 패드

3 : 프로브 고정 부위 4 : 양성 대조 부위

5 : 용액 흐름 방향 6 : 시료 주입 부위

7 : 멤브레인에 고정된 BSA와 핵산 프로브의 결합체

8 : 바이오틴이 표지된 단일 가닥 상태의 핵산 중합 반응 결과물

9 : 스트랩트 아비딘과 발색 효소 결합체

10 : 발색 기질 시약

11 : 발색 기질이 발색 효소와 반응하여 발생한 비수용성 유색 침전물

12 : 핵산표지물

13 : 결합단백질

14 : 발색 효소

본 발명은 각종 질환의 원인되는 인체 유해 미생물들의 검사 방법 및 그에 사용되는 키트에 대한 발명으로, 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction:PCR)방법과 멤브레인 측면 흐름 DNA 칩을 이용한 검사 방법과 그에 사용되는 키트에 관한 발명이다.

즉 본 발명은 다종의 인체 유해 미생물에 의해 감염된 환자의 여러 형태의 검출물로부터 채취된 시료에서 각 미생물들의 DNA를 검출하여 감염의 원인을 확인할 수 있는 방법 및 이를 위한 시약을 포함한다.

현재 사용되는 미생물 배양법을 통한 검사 방법은 배양에 오랜 시간이 소요되며 indirect assay이며 검출 하고자하는 다양한 종류의 미생물들에 대한 특이 배양 조건이 필요한 문제점을 갖고 있다. 이에 최근에는 핵산 서열 확인을 통한 분석 방법과 각 미생물의 특이 단백질의 확인을 통한 분석 방법이 활용되고 있다, 핵산서열 확인의 경우 PCR 등을 통한 direct sequencing (molecular identification)과 같은 보다 정확한 진단을 목표로 하는 방법이 필요하다. 다만, 현재 sequencing 방법 또한 시료의 양에 한계가 있으며 많은 시간과 노력이 필요하여 접근이 용이하지 않은 상황이다.

최근 다종 핵산 서열 분석을 위하여 많이 활용되고 있는 DNA chip 기법은 유리 등의 소재로 이루어진 플레이트 표면상에 분석하고자 하는 핵산에 대해 특이적으로 결합하는 다종의 핵산 프로브들을 부착한 다음, 물리, 화학적인 방법 등에 의해 변성시킨 표지된 핵산 시료를 핵산 결합 용액과 함께, 준비된 DNA chip 플레이트에 주입하고, 온도를 일정하게 유지시켜 핵산 교잡 반응을 시킨 후, 표지 물질을 판독하여 멤브레인상의 핵산 결합 여부를 확인하는 방법으로, 시험 과정이 복잡하여 최소 2시간이 소요된다는 단점을 가지고 있으며 결과의 육안 분석이 불가능하여 별도의 분석 장치를 사용하여야 하는 단점을 갖고 있다.

특이 단백질 확인의 경우 분석하고자하는 각 미생물들의 특이 단백질을 분석하는 ELISA 분석이 활용되고 있으나 각 미생물에 대하여 한번의 반응 분석 과정이기에 많은 시간과 노력이 수반된다. 이에 최근 단백질 칩을 이용한 병원성 미생물의 동정이 적용되고 있다. 그러나 단백질 칩의 경우 단백질 probe와 지표물질(marker) 간 결합특이성이 단백질의 구조에 따라 매우 민감하게 결정되므로 활성형 구조의 단백질을 지표물질의 고감도 인지에 적합한 위치/방향성으로 고정화시켜야 한다. 그러나 고정화 단계에서 활성부위가 masking되거나 비특이적인 단백질 clustering에 의한 불안정성, 집적도 저하 등, 비효율적인 고정화공정이 고감도 탐지의 저해요인으로 인식되어 검사방법의 안정성의 문제로 인한 제품화에 어려움을

격고 있는 실정이다.

이와 같이, 기존의 미생물 검출 및 분석 방법들은 대체로 시험 과정이 복잡하고, 장시간이 소요되는 문제점을 가지고 있었다. 이에, 본 발명자는 핵산 시료를 신속하고 간편하게 분석하고, 결과에 대한 정확도 또한 뛰어난 핵산 서열의 검출 및 분석 방법에 대한 연구 중에, 항체를 이용한 특정 단백질의 분석에 사용되고 있는 면역 멤브레인 측면 흐름 분석기법을 핵산 검출 과정에 응용함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 종래의 핵산 검출 및 분석 방법에 비해 단시간에 시료내 다종의 인체 유해 미생물의 핵산을 정확하고 간편하게, 효율적으로 검출할 수 있으며, 특히, 본 발명은 핵산 중합 반응을 수행한 후, 수득된 결과물의 핵산서열을 확인하는 과정으로서, 핵산 시료 내 증폭된 핵산을 검출하고 핵산 서열을 분석하는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 핵산서열 분석 방법을 용이하게 수행하기 위한 인체 유해 미생물 핵산 서열 분석용 키트를 제공하기 위한 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 시료 내 다종의 인체 유해 미생물의 핵산 서열을 검출 및 분석하는 방법에 있어서,

(1) 목적 인체 유해 미생물 핵산 서열과 상보적으로 결합 반응하는 프로브를 멤브레인 표면에 띠(band) 혹은 점(dot)의 형태로 고정하는 단계; (2) 인체 유해 미생물 핵산 시료를 목적 핵산서열과 특이적으로 반응하는 표지된 프라이머와 PCR로 증폭하여 획득한 표지된 핵산 중합 반응 결과물을 가열 또는 알칼리 처리로 단일 가닥 상태로 변성시켜주는 단계; (3) 상기 (2) 단계의 변성된 핵산 중합 반응 결과물 용액을 상기 (1) 단계의 프로브가 고정된 멤브레인 측면에 주입하여, 상기 용액이 멤브레인의 흡수력과 모세관 효과로 이동되면서 멤브레인 내에서

고정된 프로브와 변성된 핵산 중합 반응 결과물 사이에 상보적인 핵산 교잡 반응(hybridization)을 수행하여 표지된 핵산 중합 반응 결과물이 멤브레인에 고정되게 한

다음, 멤브레인에 고정된 프로브들과 핵산 교잡 반응을 이루지 못한 핵산 중합 반응 결과물을 멤브레인 상단에 흡수패드를 위치시켜 흡수되어 제거되도록 하거나

세척액으로 멤브레인을 세척하여 제거하는 단계; 및 (4) 상기 (3) 단계 종료 후, 상기 멤브레인에 고정된 프로브와 상보적인 핵산 교잡 반응으로 결합한 핵산 중합 반응 결과물의 프라이머 부위에 부착된 표지를 검출하여 멤브레인의 특정 위치에 나타난 띠 또는 점의 위치를 상기 (1) 단계의 멤브레인에 고정된 프로브 위치와 비교하는 단계를 포함하여 이루어지는 시료 내 인체 유해 미생물 핵산서열을 검출 및 분석하는 방법을 제공한다.

또한, 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인체 유해 미생물 핵산에 대한 프로브가 멤브레인 표면에 띠 또는 점의 형태로 고정상을 갖는 멤브레인 반응부와 정상동작여부를 판단하기 위한 양성 대조부가 멤브레인 상의 소정영역에 구비된 스트립; 및 적어도 시료를 투입하기 위한 시료 주입부를 포함하여 이루어지는 시료내 인체 유해 미생물 핵산서열의 검출 및 분석용 키트를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.

이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가진다.

또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다.

본 발명은 인체 유해 미생물의 감염 여부를 판독하기 위하여 멤브레인을 지지체로 사용하는 멤브레인 측면 흐름 DNA 칩을 활용하여 인체 유해 미생물 핵산 서열 분석 방법으로, 분석하고자하는 인체 유해 미생물 핵산에 반응하면서 서로 다른 서열로 구성된 프로브들을 멤브레인 표면에 서로 다른 위치에 각각 고정하고; 시료와 표지된 인체 유해 미생물 핵산의 프라이머(primer)를 사용하여 PCR로 증폭된 핵산 중합 반응 결과물을 상기 고정된 프로브와 핵산 교잡 반응을 하고; 상기 핵산 교잡 반응물에 포함된 표지를 검출수단을 통해 검출하여 인체 유해 미생물 핵산서열을 확인하는 방법과 이의 키트를 이용하여 간편하고 용이하게 시료 내 인체 유해 미생물 핵산서열을 검출할 수 있게 한 것이다.

그리고, 본 발명의 핵산 서열 검출 및 분석 방법은 세균이나 세포로부터 분리 및 증폭한 핵산 시료로부터 인체 유해 미생물 핵산 서열을 검출 및 분석하는데, 특히 핵산 중합 반응 등의 방법을 통해 증폭된 핵산 시료로부터 인체 유해 미생물 핵산 서열을 검출 및 분석하는데에 유용하게 적용할 수 있다.

또한, 본 발명의 방법에 의해 핵산 중합 반응 결과물로부터 인체 유해 미생물 핵산을 검출 및 분석하는 경우에 있어서는, 부착하고자 하는 표지물중 1종을, 핵산 중합 반응에 사용되는 핵산 프라이머(primer)에 미리 부착하여 핵산 중합 반응에 사용하는 것이 바람직하다.

보다 구체적으로, 본 발명의 바람직한 인체 유해 미생물 핵산서열의 검출 및 분석 방법은 다음과 같다.

먼저, 본 발명의 시료 내 인체 유해 미생물 핵산서열의 검출 및 분석하는 방법에서 상기(1) 단계의 서로 다른 핵산 서열로 이루어지는 복수개의 프로브들은 측면 흐름 분석용 멤브레인 표면에 각각 서로 다른 위치에 띠(band) 혹은 점(dot)의 형태로 고정한다.

그리고, 본 발명에서 사용되는 프로브들은 핵산 분석의 목적에 따라 분석하고자 하는 핵산의 내부 서열 차이를 구분하여 각 핵산의 동일 부위 또는 중첩되게 결합하도록 디자인한다.

이는 서로 다른 핵산서열로 이루어지는 프로브의 종류 수가 증가할수록 변형된 인체 유해 미생물 핵산서열의 분석이 보다 정밀하고 정확하기 때문이다.

또한, 상기 (4) 단계에서 상기 멤브레인에 고정된 프로브와 상보적인 핵산 교잡 반응으로 결합한 핵산 중합 반응 결과물의 프라이머 부위에 부착된 표지를 검출하는 방법은 경우에 따라 간접 표지 방식과 직접 표지 방식을 사용한다.

간접 표지 방식은 상기 멤브레인에 고정된 프로브와 상보적인 핵산 교잡 반응으로 결합한 핵산 중합 반응 결과물의 프라이머 부위에 부착된 비형광표지물과 상기 비형광표지물과 상보적으로 결합할 수 있으며 발색효소가 부착된 결합단백질을 반응시키고, 상기 상보적으로 결합된 결합단백질과 이에 부착된 발색효소 그리고 발색 기질을 이용하여 분석한다.

그러나, 상기 비형광표지물과 이에 대한 상보적인 결합단백질의 선택은 이들간의 결합 특이성이 높고 반응 친화력이 매우 강하여 극히 낮은 농도로 존재하더라도 탐지 가능할 정도의 민감성을 제공하는 것이라면, 그 어느 것이라도 사용할 수 있기 때문에, 본 특허에 예시된 표지물과 상보성 결합단백질 외에도 전술한 요건을 갖춘 것이라면 어떠한 물질도 본 발명의 방법에 적용될 수 있다.

이때, 본 발명에서 사용하기 적합한 비형광표지물의 구체적인 예로는 비오틴(Biotin) 또는 디곡시제닌(Digoxigenin) 등을 들 수 있다.

또한, 상기 비형광표지물에 상보적인 결합 능력을 지니면서 검출수단을 포함한 결합단백질로 스트랩트아비딘 또는 아비딘(streptavidin, avidin)[참조: Methods in Enzymology, Green. N. M., Vol. XVIII, p148(1970)], 항디곡시제닌 항체(anti digoxigenin antibody) 등

을 사용하는 것이 바람직하다.

그리고, 상기 표지물에 부착하여 사용하는 발색 효소는 펄옥시데이스(peroxidase) 혹은 알칼라인 포스파테이스(alkaline phosphatase)등을 사용한다.

그리고, 상술한 비형광표지물과 결합단백질은, 비형광표지물의 올리고뉴클레오타이드에 대한 부착의 용이성, 상기 비형광표지물과 결합단백질 간의 결합 특이성이 높고 반응 친화력이 매우 강하여 극히 낮은 농도로 존재하더라도 탐지 가능할 정도의 민감성, 양 물질의 입수 편의성 및 가격 등의 요건을 고려할 때 가장 바람직하여 선택한 것이다.

하지만, 상기 예시한 비형광표지물과 결합단백질 이외에도 전술한 요건을 갖춘 것이라면 어떠한 물질도 본 발명의 방법에 사용될 수 있다.

그리고, 간접 표지 방식에 의한 구체적인 예는 다음과 같다.

즉, 비형광표지물이 부착된 목적 핵산서열과 특이적으로 반응하는 프라이머를 사용하여 분석하고자 하는 핵산의 중합 반응 결과물을 산출시키고, 이를 가열 혹은 알칼리 처리에 의해 단일가닥으로 변성시켜 준비한 다음, 분석하고자 하는 핵산서열에 대하여 상보적인 특이 서열로 구성된 2종 이상의 프로브를 용액 성분이 모세관 현상을 통하여 이동할 수 있는 멤브레인의 측면에 고정, 부착하여 준비된 멤브레인에 적용하여 모세관 현상으로 용액이 멤브레인의 측면을 관통하여 이동하는 과정에 단일 가닥으로 변성된 핵산 중합 반응 결과물과 멤브레인에 고정된 프로브들 사이에 상보적인 핵산 교잡 반응이 이루어지도록 하고, 세척과정을 통해 핵산 교잡 반응을 이루지 못한 잔여 핵산을 제거한 후 핵산 중합 반응에 사용된 핵산 프로브에 결합된 비형광표지물(핵산표지물)에 대하여 특이적으로 결합 할 수 있는 결합단백질과 발색 효소의 결합체(예: streptavidin conjugated peroxidase, streptavidin conjugated alkaline phosphatase)를 상기 멤브레인에 적용하여 멤브레인의 프로브와 결합하여 남아있는 핵산 중합 반응 결과물의 표지자에 결합되도록 한다. 그리고, 발색 효소가 처리된 멤브레인을 세척하여 표지자와 상보적인 결합을 이루지 못한 잔여 발색 효소를 제거하고 발색 기질(TMB, NBT/BCIP)을 주입하여 발색 반응을 이루도록하여 보다 정확하고 정밀한 결과를 분석할 수 있게 한다.

그리고, 본 발명의 간접 표지방식에 의한 핵산서열의 검출 및 분석하는 방법에 있어, 보다 더 상세한 구체적인 예는 다음과 같다.

상기 (1) 단계는 분석하고자하는 핵산 서열로 제작된 프로브를 단면 크로마토그래프용(membrane for lateral flow chromatograph)으로 제작된 멤브레인의 표면에 고정하는 과정에서 일반적으로 멤브레인에 별도의 화학적인 처리를 하지 않은 경우, 고정하고자 하는 핵산 길이가 30개(mer) 이하인 짧은 프로브는 멤브레인에 고정되는 수율이 매우 낮아 서던 및 노던 블롯팅(southern and northern blotting)에 사용할 수 가 없다. 이러한 이유로 프로브의 고정 수율을 높여주기 위하여 핵산 프로브에 변형을 주어 멤브레인에 고정을 시켜주는 것이 바람직하다.

즉, 프로브의 변형 방법은 크게 두 종류의 방법이 있는데, 첫 번째 변형 방법은 핵산 프로브를 멤브레인에 대하여 부착, 고정 수율이 높은 단백질 분자와 핵산 프로브를 결합시켜서 사용하는 방법으로 단일 항체(monoclonal antibody)를 제조하기 위하여 사용되는 항원과 캐리어 단백질(carrier protein)의 결합 방법[참조 : Antibodies : A Laboratory Manual. Harlow, E 등, Chapter 5, 56-100(1988)]을 변형하여 사용할 수 있다. 그리고 두 번째 방법은 핵산 프로브의 말단에 단일종의 올리고 뉴클레오타이드를 20~100개 정도 부가하여 멤브레인에 고정될 수 있는 능력을 증가시켜주는 방법으로 핵산 말단 전이 효소(terminal deoxynucleotidyl transferase)를 사용하는 방법[참조 : J. Gen. Virol, Stuyver, L.등 74:1093-1102(1993)]과 핵산 접합 효소(DNA Ligase)를 사용하는 방법[참조 : Tissue Antigens, Bugawan, T. L등 44:137-147(1994)]등을 적용하는 것이 바람직하다.

그리고, 프로브가 고정되는 반응 멤브레인을 제작하는데 있어, 분석 과정에서 여러 종류의 핵산을 동시에 검출하고자 하는 경우에는 판독 부위내에 여러 핵산 프로브들을 서로 구별 가능하도록 일정 간격을 두고 띠 혹은 점의 형태로 배치하도록 하며, 판독 부위의 상단에는 대조선을 두어 시료의 유체 흐름과 반응성을 확인하도록 하는 것이 바람직하다.

아울러 핵산 프로브에 상기와 같은 변형을 가하지 않고 멤브레인 상에서 바로 고정이 이루어 질 수 있도록 하기 위하여 멤브레인에 카복실기(carboxyl) 혹은 아민(amin)과 같은 화학적인 반응기를 부가하여 사용할 수 있다.

또한, 상기 (2) 단계에서 분석하고자 하는 대상 핵산을 포함하는 시료를 핵산 중합 반응(PCR)을 시켜 증폭하고, 상기 핵산 중합 반응 결과물이 멤브레인 표면에 고정된 목적 핵산의 프로브들과 상보적인 핵산 교잡 반응이 높은 수율로 이루어질 수 있도록 멤브레인에 주입하기 전에 단일 가닥 핵산으로 변성시켜 주는 단계로서 일반적으로는 90 ℃ 이상의 온도로 가열하는 방법과 고 농도의 알칼리를 처리하는 방법이 사용된다.

그리고, 상기 (3) 단계는 핵산 시료를 멤브레인에 주입하여 용액이 멤브레인을 통하여 모세관 현상으로 흡수되어 이동하는 과정 동안 시료내의 표지된 핵산 중합 반응 결과물과 멤브레인에 고정된 프로브간의 핵산 교잡 반응에 의해 시료 핵산의 서열을 분석하는 과정으로서, 이들 반응에 사용되는 온도는 분석하고자 하는 핵산 및 프로브의 서열 구성, 예를 들면 GC 비율 등을 고려하여 적절히 선택하여 시행하나, 일반적으로는 프로브의 디자인 단계에 설정된 프로브의 열변성 온도(melting temperature)와 근접한 온도 조건에서 이루어져야 한다. 그리고 핵산 교잡 반응 과정에서의 정확도를 높여주기 위하여 0.5M 이상의 NaCl이 포함된 용액을 분석 용액으로 사용한다. 그리고 상기 단계 (2)에서 분석 용액 중의 핵산 시료들 중 멤브레인 상의 프로브들과 서열상의 차이로 인하여 핵산 교잡 반응을 이루지 못한 핵산 중합 반응 결과물들은 멤브레인을 모세관 현상을 통해 계속 이동하여 멤브레인 상단에 연결된 흡수 패드에 도달하게 된다. 흡수 패드는 멤브레인을 통해 모세관 현상으로 이동하는 용액의 이동 속도를 일정하도록 유지시켜주며 아울러 미 반응 핵산들을 흡수하여 제거하는 역할을 하게 된다. 그리고, 상기 핵산 교잡 반응을 이루지 못한 핵산 중합 반응 결과물과 핵산표지물이 부착된 프라이머를 멤브레인으로부터 세척하여 제거하는 단계를 더 포함하는 것이 바람직하다. 이는 보다 정밀한 결과를 얻을 수 있기 때문인 데, 이때 상기 세척에는 PBST(0.01 M disodim mono phosphate, 0.0027 M potassium chloride, 0.002 M potassium phosphate, 0.137 M sodium chloride, 0.1% Tween 20, pH 7.4) 용액을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 세척용액의 온도를 프로브의 변성 온도(melting temperature) 이상으로 높여줌으로서 멤브레인에 고정된 프로브와 비특이적으로 교잡된 핵산 중합 반응 결과물이 멤브레인에서 용이하게 제거되게 한다.

그런 다음, 핵산 중합 반응 과정에 사용된 프라이머에 부착되었던 핵산표지물과 특이적으로 결합을 이룰 수 있으며 발색효소가 부착되어 있는 결합 단백질을 상기 단계 (4)의 멤브레인에 주입하여 상보성 물질이 멤브레인에 고정된 프로브와 혼성화되어 결합된 핵산 중합 반응 결과물의 표지자와 결합을 이루도록 하는 단계이다. 발색 효소가 부착된 결합 단백질은 상업적으로 제조 판매가 되고 있으며 전술한 단백질 결합 방법[참조 : Antibodies : A Laboratory Manual. Harlow, E 등, Chapter 5, 56-100(1988)]을 활용하여 직접 제조하여 사용하는 것도 가능하다. 발색 효소가 부착된 결합 단백질은 표지자와의 결합이 원활하게 이루어지도록 PBS(0.01 M disodim mono phosphate, 0.0027 M potassium chloride, 0.002 M potassium phosphate, 0.137 M sodium chloride) 용액으로 희석하여 준비하고 멤브레인에 상온에서 10분간 반응을 시켜준다.

그리고, 상기 특이적 반응에서 결합을 이루지 못한 발색 효소가 부착된 표지물을 멤브레인으로부터 세척하여 제거하는 위하여, 세척용액 PBST(0.01 M disodim mono phosphate, 0.0027 M potassium chloride, 0.002 M potassium phosphate, 0.137 M sodium chloride, 0.1% Tween 20, pH 7.4)를 사용하는 것이 바람직하다.

그리고, 상기 특이적으로 결합된 표지물의 발색 효소를 확인하기 위하여, 발색 효소에 의해 분해되어 멤브레인 상에 비수용성 유색 침전물을 발생시켜 띠 혹은 점 모양의 반응 결과를 나타낼 수 있는 기질 시약(TMB, NBT/BCIP)을 멤브레인에 처리한다.

이때, 상기 발색 효소가 펄옥시데이스(peroxidase)인 경우에는 발색 기질로 TMB(3,3‘5,5’-tetramethylbenzidine)를 사용하는 것이 바람직하고, 발색 효소가 알칼라인 포스파테이스(alkaline phosphatase)인 경우에는 발색 기질로 BCIP/NBT (5-bromo,4-chloro,3-indolylphosphate /nitroblue tetrazolium)를 사용하는 데, 발색기질은 상온에서 발색 효소와 10분간 처리하고, 발색이 되면 증류수로 잔여 기질을 세척하고 상온에서 건조하여 분석하는 것이 바람직하다.

그리고, 발색에 의해 멤브레인에 고정된 프로브에 교잡하는 시료 내 인체 유해 미생물 핵산이 있는 경우에는 발색 띠 또는 점이 형성되고, 인체 유해 미생물 핵산이 없는 경우에는 프로브와의 교잡 반응이 이루어지지 않음에 따라 발색 띠 혹은 점이 형성되지 않는 것을 기준으로 판단하여 인체 유해 미생물 핵산이나 변형된 목적 핵산 등을 검출하거나 분석한다.

이와 같이, 본 발명의 간접 표지 방식에 의한 시료 내 핵산서열의 검출 및 분석방법은 육안으로 쉽게 관찰할 수 있는 발색 효소 및 기질 그리고 멤브레인 측면 흐름 분석 기법을 이용하여 핵산 분석 결과를 단시간내에 쉽게 확인할 수 있는 효과와 함께, 분석용 멤브레인 표면에 다종의 프로브들을 각기 다른 위치에 고정하여 동시에 여러 종류의 핵산 서열을 분석함으로서 간편하고 신속하게 시료내의 인체 유해 미생물 핵산 서열을 검출 및 분석할 수 있는 특징을 가지고 있다.

또한, 직접 표지방식의 구체적인 예로는 시료 내 핵산을 PCR로 증폭할 시 사용되는 목적 핵산의 프라이머 부위에 형광표지물을 직접 부착하고, 멤브레인에 고정된 프로브와 상보적인 핵산 교잡 반응으로 결합한 핵산 중합 반응 결과물의 표지물이 발생시키는 형광을 직접을 검출하여 분석 하는 것을 들 수 있다.

이때, 상기 형광표지물은 Cy3, Cy5, TAMRA, 및 FAM 등을 사용한다.

상기 형광표지물을 이용한 직접 표지 방식을 이용한 검출은 상기 간접 표지 방식에 의한 검출보다 단계가 짧아 훨씬 짧은 시간 내에 결과를 분석할 수 있는 장점이 있으며, 육안으로 분석하기 어려운 많은 수의 프로브를 멤브레인에 고정하는 고밀도 DNA 칩(high density DNA chip)의 경우에 적합하다.

이때, 상기 형광표지물의 검출은 콘포칼 레이저 스캐너(confocal laser scanner) 또는 칩 판독기(Chip reader 또는 chip scanner) 등을 사용한다.

그리고, 상기 물질의 검출 분석은 상기 간접 표지 방식과 동일한 방법으로 분석한다.

그리고, 상기 간접표지방식과 직접표시방식의 중간성 물질로 형광표지물인 플루오레세인(fluorescein)을 프라이머에 표지하고, 결합단백질로 항플루오레세인 항체(anti fluorescein antibody) 및 이에 표지된 발색효소를 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 분석용 멤브레인은 유체의 측면 흐름 분석용(lateral flow chromatograph) 멤브레인을 사용하는 데, 바람직하게 상업적으로 다양한 종류가 제조되어 판매되고 있으며 모세관 현상에 의해 핵산 용액이 멤브레인의 측면을 관통하여 이동할 수 있고, 원하는 결합 물질을 표면에 용이하게 고정시킬 수 있는 니트로셀룰로우즈 계통의 멤브레인을 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 멤브레인의 물리적인 특성으로 용액(시료)의 이동 속도를 기준으로 길이 4센티미터(4 cm)의 멤브레인에 용액(시료)이 이동하는데 50에서 250초가 소요되는 멤브레인을 사용하는 것이 바람직하다.

이는 상기 소요시간 범위가 시료(핵산 중합 반응 결과물)과

멤브레인에 고정된 프로브와의 핵산 교잡 반응에 충분하며, 250초가 초과될 시에는 비특이적인 반응으로 인하여 검출의 정확도가 저하되고 50초 미만에서는 충분한 핵산교잡반응이 수행되지 않기 때문이다.

한편, 본 발명은 인체 유해 미생물 핵산 서열 검출 및 분석방법을 실시하기 위한 핵산 분석용 킷트, 구체적으로는 분석하고자 하는 인체 유해 미생물 핵산 서열에 대해 상보적으로 결합할 수 있는 핵산 프로브들이 일정 간격을 두고 띠 혹은 점의 형태로 고정된 판독 부위를 포함하는 반응 멤브레인 및 시료가 모세관 현상을 통해 연속적으로 이동하도록 하고, 미 반응 시료 성분을 제거하기 위한 흡수 패드로 이루어진 멤브레인 스트립으로 구성되는 것을 특징으로 하는 목적 핵산서열 검출 및 분석용 키트를 제조한다.

도 1과 도2는 본 발명에 따른 바람직한 일실시예와 타실시예의 인체 유해 미생물 핵산서열 분석용 키트를 나타낸 것이다.

또한, 도 3은 본 발명에 따른 인체 유해 미생물 핵산서열의 검출 및 분석방법에 대한 메카니즘을 도면으로 나타낸 것이다.

이와 같이, 본 발명의 멤브레인 측면 흐름 분석 기법에 의한 인체 유해 미생물 핵산 검출 및 서열 분석 방법은 분석 대상 핵산 서열의 존재 유무를 판별하는 정성 분석 및 핵산 유형 분석(genotyping)에 특히 적합하다고 할 수 있다.

이하, 본 발명을 구체적인 실시예에 의해 보다 더 상세히 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 사상과 범위 내에서 여러가지 변형 또는 수정할 수 있음은 이 분야에서 당업자에게 명백한 것이다.

[실시예 1]

인체 유해 미생물 핵산 분석 실험

인체 유해 미생물 핵산 PCR에 사용한 프라이머는 아래와 같이 분석하고자하는 다양한 미생물들의 특이 핵산 서열을 바탕으로 제작되어졌으며 핵산 중합 반응의 결과물이 분석하고자하는 각 인체 유해 미생물의 특이적인 핵산 서열을 포함 할 수 있는 프라이머를 선정하여 사용하였다.

본 PCR 반응에 사용하는 센스 프라이머는 핵산표지물로 바이오틴을 사용하였다. 그리고, 본 실시예에 사용한 아래와 같은 핵산서열로 표시되는 프라이머는 분자 클로닝 3판(Molecular cloning, Sambrook과 Rusell, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, 2001년)의 10.42에 기술된 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 합성과 같은 방법을 사용하여 미국의 프롤리고(Proligo)사에 의뢰하여 합성하였다.

인체 유해 미생물

PCR용 프라이머

Chlamydia trachomatis,

CTF 5' aaccaagccttatgatcgacg

CTR 5' tcggctgggctatacgaatt

Neisseria gonorrhoeae,

NGF 5' cggaacgtaccgggtagc

NGR 5' gctacccacgctttcgga

Ureplasma urealyticum,

UUOF 5' gatattccatcaggtactgctattcg

UR55 5' tggtaatccatcagctgcttgtaa

Mycoplasma genitalium,

MGF 5' tgttgagaaataccttgatggtcag

MGR 5' agataggctcgccatttaaacc

Mycoplasma hominis

MHF 5' catgcatgtcgagcgaggt

MHR2 5' tcatcttttagtggcgccttac

Candida albicans,

CANF 5' gcgatacgtaatatgaattgcaga

CANR 5' ccgccgcaagcaatgt

Gardnella vaginalis,

GADF 5' tggtgtatcactgtaagggcgtat

GADR 5' aatcccacgaccccgaat

Group B Streptococcus,

GBSF 5' ggtacagttgcttcaggacgtatc

GBSR 5' acgttcgatttcatcacgttg

Klebsiella oxytoca,

PRF 5' gtggctaataccgcataatgtctac

PRR 5' cgggtaacgtcaattgatatggg

Proteus

KOF 5' gactacgccgtctatcgtcaag

KOR 5' gcctttatcaagcggatactgg

그리고, 인체 유해 미생물 핵산의 각 미생물별 특이 서열 부분에 결합할 수 있는 10종의 프로브들을 다음과 같이 선정하여 한국의 바이오닉스사에 의뢰하여 제작하였으며, 각 프로브의 말단에 단백질과 결합시킬 수 있도록 아민기를 부착하였다.

Chlamydia trachomatis,

CT2F 5' amine-cggagatccttgcgatcc

Neisseria gonorrhoeae,

NGMR 5' amine-tgctacccacgctttctga

Ureaplasma urealyticm,

UF55 5' amine-aactggtgatagcgttagattaggag

Mycoplasma genitalium,

MG155F 5' amine-gcataagaactttagttcgcatgaatt

Mycoplasma hominis

MH5F 5' amine-ggctaatgccggatacgc

Candida albicans,

CANP 5' amine-tcatcgaatctttgaacgca

Gardnerella vaginalis,

GADP 5' amine-acgcagggaagtgaaacatc

Group B Streptococcus

GBSP 5' amine-ccagcaggaacagaaatggt

Proteus,

PRP 5' amine-tggggagcaaacaggattag

Klebsiella oxytoca,

KOP 5' amine-gttgttcctgcacagcgata

(1) 인체 유해 미생물 핵산 프로브의 멤브레인 고정

각 인체 유해 미생물 핵산 프로브은 멤브레인에 부착, 고정 수율을 높이기 위하여 항원과 캐리어 단백질(carrier protein)의 결합 방법[참조 : Antibodies : A Laboratory Manual. Harlow, E 등, Chapter 5, 56-100(1988)]을 변형하여 Bovine serum albumin(BSA, Sigma, 미국)과 결합시켜서 사용하였다. 단백질과 결합된 각 인체 유해 미생물 핵산 프로브들은 양성 대조 프로브와 함께 각 5종씩을 각각 멤브레인(UniSart CN 140, sartorius AG, Germany)에 띠(band)의 형태로 고정하였다.

(2) 인체 유해 미생물의 시료

인체 유해 미생물 시료를 미국 세포주 은행(ATCC, American Type Culture Collection)로부터 구입하여 DNasol(MRC, USA)을 사용하여 제조사가 제안하는 방법에 따라 핵산을 추출하여 사용하였다.

(3) 인체 유해 미생물 핵산 시료의 PCR

PCR 반응은 구체적으로, 상기에서 추출한 DNA 10 ㎕, 프라이머 믹스 1 ㎕(프라이머별로 10 pmol씩), dNTP 믹스 1.5 ㎕(2 mM), 반응 완충액(10X) 3 ㎕, Taq 폴리머라제 0.2 ㎕(5 유니트/㎕)및 증류수 14.3 ㎕를 첨가하여 PCR 반응액 30 ㎕를 제조한 후, 이를 핵산 중합 반응 용기에 넣고, 95℃에서 3분간 변성 전처리(Pre-denature) 과정을 실시한 후, 95℃에서 40초간 변성(Denature), 55℃에서 40초간 결합(Annealing) 및 72℃에서 40초간 연장(Extension)하는 증폭 과정을 총 40회 실시하고, 72℃에서 3분간 연장 후처리(Post-extension) 과정을 실시하여 인체 유해 미생물 핵산의 중합반응을 수행하였다.

(4) 핵산 중합 반응 결과물의 변성

인체 유해 미생물의 핵산 중합 반응 결과물 10 ㎕에 1M NaCl 20 ㎕, 1% BSA 5 ㎕, 0.05% Tween 20 5 ㎕를 섞어주고 95℃에서 10분간 열 변성 시켜준 뒤 급속히 냉동하여 보관하였다.

(5) 프로브와 핵산 중합 반응 결과물의 교잡반응

열 변성되어진 상기의 핵산 중합 반응 결과물 용액을 각 인체 유해 미생물에 대한 프로브들이 고정된 멤브레인에 주입하여 모세관 현상으로 이동하도록 하였으며, 본 과정은 각 프로브들의 열변성 온도를 고려하여 55℃에서 10분간 시행하였다.

이때, 분석 용액 중의 핵산 시료들 중 멤브레인 상의 프로브들과 서열상의 차이로 인하여 핵산 교잡 반응을 이루지 못한 핵산 중합 반응 결과물들과 용액 성분은 멤브레인 상에서 모세관 현상을 통해 계속 이동하여 멤브레인 상단에 연결된 흡수 패드에 도달하게 하였다.

상기와 같이 핵산 중합 반응 결과물들을 멤브레인 크로마토그래프 시켜준 뒤 멤브레인 상단의 흡수 패드를 멤브레인으로부터 제거하고 60℃의 세척용액 PBST(0.01 M disodim mono phosphate, 0.0027 M potassium chloride, 0.002 M potassium phosphate, 0.137 M sodium chloride, 0.1% Tween 20, pH 7.4)로 멤브레인을 3회 세척하여 핵산 교잡 반응을 이루지 못한 핵산 중합 반응 결과물과 표지자가 부착된 프라이머를 멤브레인으로부터 세척하여 제거하였다.

그리고, 세척이 이루어진 멤브레인에 스트랩트아비딘 펄옥시데이스 결합체(2ug/ml) 100 ㎕를 주입하여 멤브레인에 고정된 프로브와 혼성화되어 결합된 핵산 중합 반응 결과물의 바이오틴과 결합을 이루도록 상온에서 10분간 반응시켜주었다.

이때, 상기 반응이 완료된 멤브레인을 세척용액 PBST(0.01 M disodim mono phosphate, 0.0027 M potassium chloride, 0.002 M potassium phosphate, 0.137 M sodium chloride, 0.1% Tween 20, pH 7.4)로 3회 세척하여 멤브레인에 고정된 핵산 중합 반응 결과물과 결합을 이루지 못한 발색 효소가 부착된 상보성 물질을 멤브레인으로부터 세척하여 제거하였다.

또한, 상기 세척된 멤브레인에 분해효소 펄옥시데이스에 의해 분해되어 멤브레인 상에 유색 띠 모양의 반응 결과를 나타낼 수 있는 기질 시약(TMB, 3,3‘5,5’-tetramethylbenzidine) 100 ㎕를 멤브레인에 주입하고 상온에서 10분간 반응시켜주었다. 발색을 발생시킨 뒤 증류수로 잔여 기질을 세척하고 상온에서 건조하였다.

그런다음, 발색 반응을 이룬 멤브레인 상에서 양성 대조선의 발생을 확인하여 핵산 교잡 반응이 원활하였음을 확인하고 대조선과 그 이외의 발생한 발색 띠의 위치 그리고 상기 (1)에서 멤브레인에 프로브를 고정하였던 위치를 비교하여 핵산 중합 반응 결과물과 핵산 교잡 반응에 참여한 프로브를 확인하여 분석하였다.

이의 결과, 도 4와 5에 도시된 바와 같이, 본 발명에서는 시료 내 인체 유해 미생물의 감염여부를 PCR을 통한 중합 반응 결과물에 의하여 각 미생물별로 구분하여 검출할 수 있었다.

이때, 도 4의 멤브레인 스트립 사진에서 스트립 1은 Chlamydia trachomatis 양성 시료, 스트립 3은 Neisseria gonorrhoeae 양성 시료, 스트립 5는 Ureplasma urealyticum 양성 시료, 스트립 7은 Mycoplasma genitalium 양성 시료, 스트립 9는 Mycoplasma hominis 양성 시료 등에 대한 분석 결과를 나타내고, 스트립 2, 4, 6, 8 및 10은 음성 시료로서 정상인 DNA에 대한 핵산 분석 결과를 나타낸 것이다.

그리고, 도 5의 멤브레인 스트립 사진에서 스트립 1은 Candida albicans 양성 시료, 스트립 3은 Gardnella vaginalis 양성 시료, 스트립 5는 Group B Streptococcus 양성 시료, 스트립 7은 Klebsiella oxytoca

양성 시료, 스트립 9는 Proteus 양성 시료 등에 대한 분석 결과를 나타내고, 스트립 2, 4, 6, 8 및 10은 음성 시료로서 정상인 DNA에 대한 핵산 분석 결과를 나타낸 것이다.

그리고, 도 6은 본 발명에서 각 인체 유해 미생물들의 양성 핵산 시료들을 섞어서 본 발명의 방법을 실시한 결과 수득된 멤브레인 사진으로, 양성 핵산 시료들을 섞을 경우에도 각 미생물에 따라 핵산서열을 구분하여 검출할 수 있음을 알 수 알 수 있었다. 이때, 스트립 A는 Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Ureplasma urealyticum, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis의 핵산들을 함께 핵산 중합 반응하여 얻어진 결과물을 분석한 결과를 나타내고, 스트립 B는 Candida albicans, Gardnella vaginalis, Group B Streptococcus, Klebsiella oxytoca

, Proteus의 핵산들을 함께 핵산 중합 반응하여 얻어진 결과물을 분석한 결과를 나타낸 것이다.

이상과 같이, 본 발명의 핵산 검출 방법은 마이크로웰 플레이트 핵산교잡법이나 멤브레인 핵산교잡법 및 유리 플레이트나 멤브레인을 핵산 지지체로 사용하는 DNA chip 등 기존의 핵산 분석 방법들에 비해, 단시간내에 시료내 특정 핵산의 서열을 정확하고 간편하게 분석할 수 있다.

또한, 본 발명의 핵산 서열 분석용 키트를 사용하면 종래의 분석법에서와는 달리 복잡한 별도의 분석 과정이나 장비 없이도, 누구나 육안으로 쉽게 분석 결과를 확인할 수 있어 보다 용이하게 핵산 서열 분석 시험을 실시할 수 있으며, 핵산 중합 반응에 의한 핵산의 증폭 확인 시험 또는 세균이나 세포로부터 분리 추출한 시료내 특정 핵산 서열의 검출 시험 등의 핵산 분석 시험을 요하는 광범위한 유전자 관련 산업 및 연구 분야에서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

Claims

시료 내 인체 유해 미생물의 핵산 서열을 검출 및 분석하는 방법에 있어서,

(1) 인체 유해 미생물의 핵산 서열과 상보적으로 결합반응하는 프로브를 멤브레인 표면에 띠(band) 혹은 점(dot)의 형태로 고정하는 단계;

(2) 시료와 인체 유해 미생물의 핵산서열과 특이적으로 반응하는 표지된 프라이머를 PCR로 증폭하여 획득한 표지된 핵산 중합 반응 결과물을 가열 또는 알칼리 처리로 단일 가닥 상태로 변성시켜주는 단계;

(3) 상기 (2) 단계의 변성된 핵산 중합 반응 결과물 용액을 상기 (1) 단계의 프로브가 고정된 멤브레인 측면에 주입하여, 상기 용액이 멤브레인의 흡수력과 모세관 효과로 이동되면서 멤브레인 내에서

고정된 프로브와 변성된 핵산 중합 반응 결과물 사이에 상보적인 핵산 교잡 반응(hybridization)을 수행하여 표지된 핵산 중합 반응 결과물이 멤브레인에 고정되게 한

다음, 멤브레인에 고정된 프로브들과 핵산 교잡 반응을 이루지 못한 핵산 중합 반응 결과물을 멤브레인 상단에 흡수패드를 위치시켜 흡수되어 제거되도록 하거나

세척액으로 멤브레인을 세척하여 제거하는 단계; 및

(4) 상기 (3) 단계 종료 후, 상기 멤브레인에 고정된 프로브와 상보적인 핵산 교잡 반응으로 결합한 핵산 중합 반응 결과물의 프라이머 부위에 부착된 표지를 검출하여 멤브레인의 특정 위치에 나타난 띠 또는 점의 위치를 상기 (1) 단계의 멤브레인에 고정된 프로브 위치와 비교하는 단계를 포함하여 이루어지는 시료 내 목적 핵산서열을 검출 및 분석하는 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 (1) 단계의 프로브는 서로 다른 핵산 서열로 이루어지는 복수개의 프로브를 멤브레인 표면에 각각 서로 다른 위치에 띠(band) 혹은 점(dot)의 형태로 고정하는 것을 특징으로 하는 시료 내 목적 핵산서열을 검출 및 분석하는 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 표지 검출은 멤브레인에 고정된 프로브와 상보적인 핵산 교잡 반응으로 결합한 핵산 중합 반응 결과물의 프라이머 부위에 부착된 형광표지물을 검출하는 것을 특징으로 하는 시료 내 인체 유해 미생물의 핵산서열을 검출 및 분석하는 방법.
제 3 항에 있어서,

상기 형광표지물은 Cy3, Cy5, TAMRA, 및 FAM으로 이루어진 군에서 선택된 표지물인 것을 특징으로 하는 시료 내 인체 유해 미생물의 핵산서열을 검출 및 분석하는 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 표지 검출은 멤브레인에 고정된 프로브와 상보적인 핵산 교잡 반응으로 결합한 핵산 중합 반응 결과물의 프라이머 부위에 부착된 비형광표지물과 상기 비형광표지물과 상보적으로 결합할 수 있으며 발색효소가 부착된 결합단백질을 반응시키고, 유색 침전물을 발생시키는 발색 기질 시약을 사용하여 상기 결합단백질을 검출하는 것을 특징으로 하는 시료 내 인체 유해 미생물의 핵산서열을 검출 및 분석하는 방법.
제 5 항에 있어서,

상기 비형광표지물은 비오틴 또는 디곡시제닌인 것을 특징으로 하는 시료 내 인체 유해 미생물의 핵산서열을 검출 및 분석하는 방법.
제 5 항 또는 제 6항에 있어서,

상기 발색 효소는 퍼옥시데이스(peroxidase) 또는 알칼라인 포스파테이스(alkaline phosphatase)인 것을 특징으로 하는 시료 내 인체 유해 미생물의 핵산서열을 검출 및 분석하는 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 멤브레인은 길이 4센티미터의 멤브레인 측면을 수용액이 흡수되어 이동하는데 50에서 250초가 소요되는 멤브레인인 것을 특징으로 하는 시료 내 인체 유해 미생물의 핵산서열을 검출 및 분석하는 방법.
인체 유해 미생물의 핵산에 대한 프로브가 멤브레인 표면에 띠 혹은 점의 형태로 고정상을 갖는 멤브레인 반응부(1)와 정상동작여부를 판단하기 위한 양성 대조부(4)가 멤브레인 상의 소정영역에 구비된 스트립(10); 및

적어도 시료를 투입하기 위한 시료 주입부(6)를 포함하여 이루어지는 시료내 인체 유해 미생물의 핵산서열의 검출 및 분석용 키트.
제 9 항에 있어서,

상기 스트립(10)에 흡수패드(2)가 더 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 시료내 인체 유해 미생물의 핵산서열의 검출 및 분석용 키트.