TW201317361A - 分子診斷試驗裝置及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供用於分子診斷試驗之橫向流動裝置及其使用方法。該方法適宜檢測或監控標靶，包括以極低濃度存在於生物樣品中之生物、化學及材料標靶。本申請案之方法及裝置可用作無能源就地照護測試。

Description

分子診斷試驗裝置及其使用方法
本發明係關於分子生物學、分子診斷、核酸檢測(NAT)、醫藥科學及生物技術之基本領域。本發明適宜檢測或監控以極低濃度存在於樣品(包括但不盡述生物樣品、材料、有機或無機樣品)中之化學及/或生物標靶之痕跡。化學及/或生物標靶之痕跡包括生物/化學產物、碎片或完整標靶，例如，核酸序列、細胞、病毒、病原體、化學物質，應用於涉及以下領域的就地照護/位點/關注點及實驗室，諸如，藥物基因體學、病原體檢測及監控、遺傳傾向性測定、臨床試驗之遺傳分類、診斷、預後、傳染性疾病診斷及監控、生物防禦、法醫化學分析、親子鑒定、動物及植物育種、食品檢驗、身份測定、基因改造生物體測試、化學污染、食品安全、生產鏈之監控及跟蹤、及生產線內監控/控制。
本申請案主張2011年9月16日申請之題目為「MOLECULAR DIAGNOSTIC ASSAY」之美國臨時專利申請案序號61,535,874之優先權，該案係以引用之方式併入本文。
分子診斷已成為生物檢測及監控之常規臨床實驗室步驟。來自各種生物源之生物樣品標本一般含有化學物質、代謝物、大分子、細胞、病毒粒子、生物體及核酸序列之混合物。一般而言，檢測及監控存在兩種常見挑戰：背景干擾及檢測極限(LOD)。換言之，標的生物樣品常以相較 於其他背景組分之極小量存在於生物樣品中。此類非標的背景組分可干擾檢測下游。當存在於樣品中之標靶無充足拷貝時將出現LOD問題。化學分析亦存在同樣之LOD挑戰，化學分析常需要高度複雜儀器用於進行分析工作。實例包括使用質譜法以檢測食品供應鏈中之苯二甲酸雙(正丁基)酯增塑劑污染、乳製品中之三聚氰胺污染、土壤或食品中之鎘及重金屬污染。背景干擾之數量級高於該等污染物。現場分析通常十分困難，除非在實驗室中進行大量處理，例如，此涉及諸如GC分光計或質譜儀之儀器。
背景干擾通常係透過在製備階段期間純化樣品來解決。捕捉標靶及藉由一或多種清洗步驟移除背景組分。常見實例包括：酶聯免疫吸附檢定(ELISA)及不同層析方法。亦將橫向流動工作台用於捕捉標靶，同時將背景組分自固定標靶移除。用於核酸標靶之純化步驟之另一實例係純化套組，如Qiagen QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit。
關於核酸之LOD問題通常係藉由首先擴增標的樣品來解決，此容許隨後藉由螢光發射、電學及電子方法(例如，伏安法、電流測量、電容測量或阻抗圖譜)檢測。於此等檢測或擴增方法中，需要電源以提供光或執行電學/電子檢測。解決因低豐度核酸標靶導致之LOD問題之一實例係利用聚合酶鏈反應(PCR)於體外擴增核酸標靶。與標的核酸之存在有關之訊號可藉由螢光方法進一步放大。當將螢光信標或探針用於檢測擴增子時，藉由螢光標籤標的之各PCR擴增子可於單次激發/測量期間產生多出1000或10,000 之質子。另一實例係曲桿菌樣生物體測試，其中幽門螺桿菌(H.pylori)細胞在培養物中增殖及藉此擴增，及可在細胞數量超過檢測臨限值後檢測擴增細胞分泌之脲酶。另一實例係MRSA篩選。此檢測方法區分在培養基上之增殖與擴增細胞群落。
然而，依賴於消除背景干擾與擴增檢測之各種組合之現有方法仍未滿足對用於標靶之可靠、具成本效益、快速、易用檢測方法之需求，此方法需可用於資源有限環境中。對於使用電源以透過對儀器供電或提供溫度培養來實施電流測試之需求在資源有限地區或條件下限制了此技術之使用。實施現有方法所需之時間很長。需要許多小時或天來產生足夠生物標靶以產生充足檢測訊號。用於病原體檢測、代謝物測定或核酸序列檢測之擴增步驟常需要大量實驗室儀器及熟練技術人員來運行該等儀器。於PCR情況中，需小心操作不穩定試劑，及必需特別小心以避免樣品之間污染。此外，實施PCR所需之儀器極昂貴及複雜。以上因素係阻礙POC(就地照護)使用或在少於30分鐘內提供快速樣品至結果之嚴重限制。本發明提供對此等及其他需求之解決方案。
本發明提供用於分子檢測或診斷試驗之方法及裝置。本文中所揭示之方法適宜檢測或監控以極低濃度存在於樣品(包括生物、化學及材料樣品但不限制於此等樣品)中之一或多種標靶，且基本上容許在標靶之複製或標靶之碎片或 部分之擴增不存在下檢測。本發明之方法及裝置可用於就地照護檢測而無需使用電源。
於一態樣中，本發明提供一種透過實施以下步驟檢測分析物之方法：i)提供橫向流動試驗裝置，其包含層析介質，該層析介質包含：(a)位於檢測區上游之樣品上料區；(b)位於樣品上料區與檢測區之間之報告載體區，其中該報告載體區包含可與分析物形成複合物之報告載體，該報告載體包含載體及一或多種健全型酶盒；及(c)檢測區，其中該檢測區包含用於分析物之捕捉組分及指示劑；ii)使樣品應用區與測試樣品接觸，其中該測試樣品沿層析介質經由報告載體區自樣品上料區移向檢測區並穿過檢測區；iii)將受質添加至檢測區，其中該受質於含有報告載體之健全型酶分析物存在下反應；及iv)於檢測區中產生對應在測試樣品中存在或不存在分析物之指示劑回應。
於另一態樣中，本發明提供一種檢測分析物之裝置，其包含：層析介質，該層析介質包含：位於檢測區上游之樣品上料區；位於樣品上料區與檢測區之間之報告載體區，其中該報告載體區包含可與分析物形成複合物之報告載體，該報告載體包含載體及一或多種健全型酶盒；及檢測區，其中該檢測區包含用於分析物之捕捉組分及指示劑，其中該指示劑檢測在健全型酶存在下之受質反應，藉此檢測分析物酶報告載體複合物之產物及檢測受質，藉此檢測分析物之存在。
於一態樣中，本發明提供一種用於檢測分析物之套組， 包含橫向流動試驗裝置，該橫向流動試驗裝置包含：多孔膜，該多孔膜包含：樣品上料區；位於上料區下游之報告載體區，其中該報告載體區包含可與分析物形成複合物之報告載體；位於報告載體區下游之檢測區，其中該檢測區包含捕獲組分及指示劑；及用於健全型酶之受質；其中該受質係於使測試樣品流過橫向流動裝置之後施用至檢測區及檢測酶與受質之產物。
於一些實施例中，亦可實施包含此等步驟但以不同於以上出示之順序之該方法。例如，可(a)固定來自疑含有分析物之樣品之分析物，(b)使固定之分析物與報告載體接觸以形成報告載體-分析物複合物，其中報告複合物包含健全型酶，(c)提供用於健全型酶之受質，及(d)檢測由健全型酶輔助反應而導致之波動，例如，反應產物，藉此檢測分析物之存在。
於此態樣之各實施例中，分析物係蛋白質、核酸細胞、細胞或病原體之部分、病原體、病毒粒子、細胞或細胞外基質之組分，或小分子。於此態樣之各實施例中，報告載體含有抗體或核酸。
於此態樣之特定實施例中，健全型酶可為脲酶、磷酸膽鹼磷酸酶、β-半乳糖苷酶、木糖還原酶、莽草酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶、新普魯蘭酶(neopullulanase)、枯草桿菌蛋白酶、4-植酸酶、乙醯膽鹼酯酶、漆酶、細菌亮胺醯基胺基肽酶、三肽基肽酶I、凝血因子VIIa、胰蛋白酶、β-呋喃果糖苷酶。
於此態樣之一實施例中，抗體係藉由非共價相互作用與健全型酶締合。或者，抗體或核酸共價連接至健全型酶。
於此態樣之另一實施例中，該方法進一步使用一或多種非活性酶原。酶原係作為酶之非活性前驅物且需要某些變化(如使遮蔽活性酶之片段水解)而變為活性之化合物群中之任一者。
於此態樣之另一實施例中，健全型酶之產物係藉由pH變化檢測，該pH變化係利用pH敏感性水凝膠測定，該pH敏感性水凝膠可具有因pH變化而變色之金奈米粒子。
於此態樣之另一實施例中，健全型酶之產物係藉由比色變化檢測，其中比色變化係因為健全型酶輔助反應(例如，染色材料之質子化或去質子化作用或銀離子還原)所導致之波動。
於此態樣之又一實施例中，健全型酶之產物係藉由健全型酶輔助反應作用所導致之沉澱檢測，例如，可溶性組分之沉澱，該可溶性組分可為蛋白質，包括BSA或pH敏感性聚合物，該沉澱形成聚結物及pH變化。該pH變化導致聚合物之表面電荷移動。由於表面電荷變化，聚合物分子之3-D結構變化及聚合物之疏水部分曝露。聚合物之疏水區域之曝露增大熵。聚合物之此等疏水部分可形成非共價相互作用，藉此形成聚結物。pH敏感性聚合物之實例包括：甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸2-(二甲基胺基)乙基酯及N-羥甲基丙烯醯胺。
於另一態樣中，本發明提供一種分子診斷裝置，其具有 (a)樣品上料區，(b)報告載體區，其中該報告載體區含有報告載體及健全型酶，(c)用於健全型酶之受質源；及(d)檢測區，其中檢測區含有捕捉組分。
於此態樣之某些實施例中，該裝置亦具有正對照區。
於此態樣之某些實施例中，樣品上料區係樣品上料墊。
於此態樣之某些實施例中，報告載體區係共軛物墊。
於此態樣之某些實施例中，檢測區包含多孔膜。
於此態樣之某些實施例中，該裝置具有剛性或可撓性背襯材料。
於此態樣之各實施例中，報告載體含有抗體或核酸。
於此態樣之某些實施例中，健全型酶可為脲酶、磷酸膽鹼磷酸酶、β-半乳糖苷酶、木糖還原酶、莽草酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶、新普魯蘭酶(neopullulanase)、羧酸酯酶、枯草桿菌蛋白酶、4-植酸酶、乙醯膽鹼酯酶、漆酶、細菌亮胺醯基胺基肽酶、三肽基肽酶I、凝血因子VIIa、胰蛋白酶、β-呋喃果糖苷酶。於本發明之特定實施例中，當採用酶原時，該酶原可為選自由以上健全型酶之酶原組成之群之酶原。
於此態樣之一實施例中，抗體係藉由非共價相互作用與健全型酶締合。或者，抗體或核酸共價連接至健全型酶。
於此態樣之另一實施例中，該方法進一步使用一或多種非活性酶原。
於此態樣之另一實施例中，健全型酶之產物係藉由pH變化檢測，該pH變化係利用pH敏感性水凝膠測定，該水凝 膠可具有因pH變化而變色之金奈米粒子。
於此態樣之另一實施例中，健全型酶之產物係藉由比色變化檢測，其中比色變化係由健全型酶輔助反應之作用(例如，染料材料之質子化或去質子化或銀離子還原)引起。
於此態樣之又一實施例中，健全型酶之產物係藉由健全型酶輔助反應之波動所導致之沉澱檢測，例如，可溶性組分之沉澱，該可溶性組分可為蛋白質，包括BSA或pH敏感性聚合物。pH敏感性聚合物之實例包括：甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸2-(二甲基胺基)乙基酯及N-羥甲基丙烯醯胺。
於另一態樣中，本發明提供一種分子診斷裝置，其具有(a)樣品上料區，(b)前報告載體區，若存在，其中該前報告載體區含有報告載體及健全型酶，(c)用於健全型酶之受質源及用於前報告載體之報告載體；及(d)檢測區，其中該檢測區含有捕捉組分。(段落A)
於另一態樣中，本發明提供一種分子診斷裝置，其具有檢測區，其中該檢測區含有捕捉組分。可將前報告載體、報告載體或受質依序添加至檢測區。(段落B)
於另一態樣中 本發明提供一種分子診斷裝置，其具有檢測區，其中檢測區含有捕捉組分。該檢測區可在多個溶劑容器之間放置及移動，該等容器含有以下一或多者：前報告載體、報告載體及受質。(段落C)
於又一態樣中，本發明提供一種分子診斷裝置，其採用 段落A、段落B及段落C中提出之方法之組合。
本發明基本上提供用於檢測樣品中之分析物及標靶之方法及裝置，其等具有充分低之檢測極限(LOD)以降低或消除對檢測前之擴增步驟之需求。本文中所揭示之方法提供顯著較不複雜方法，對樣品純度之要求降低。本發明之方法及裝置亦提供流線型樣品製備方法，包含樣品富集、純化、標記及檢測。
一種用於檢測在測試樣品中之分析物之存在之橫向流動分子診斷裝置，其包含層析介質，該層析介質包含：(a)位於檢測區上游之樣品上料區；(b)位於樣品上料區與檢測區之間之報告載體區，其中該報告載體區包含可與分析物形成複合物之報告載體；(c)用於健全型酶之受質；及(d)檢測區，其中該檢測區包含用於分析物之捕捉組分及用於健全型酶之受質；其中檢測酶與受質之產物。
用於檢測測試樣品中之分析物之存在之橫向流動診斷裝置可進一步包含位於檢測區下游之正對照區。
已嘗試開發用於床邊環境中之核酸檢測裝置。某些產品已透過在臨床實驗室外進行測試而部分滿足此需求。然而，此等方法無法(1)消除對擴增步驟及相關設備之依賴，(2)降低對檢測材料之保存要求，(3)消除對讀取來自擴增之光訊號之複雜分析儀之依賴；或(4)消除對電源之依賴。由核酸擴增測試而產生之擴增核酸片段基本上會增大樣品間交叉污染之風險。
探索以替代對掃描儀或分析儀之需求之橫向流動裝置亦已描述於，例如，US 2011086359、WO 2004092342、Anal.Chem,2004,V76,P888及Anal.Chem.2009,V81,P1660中。然而，此等方法雖然不需要複雜分析儀，但缺少對於直接檢測而不預擴增之敏感性。例如，病原體核酸檢測一般需要1,000個拷貝或更多以達成充分敏感性；其他報告描述需要至少100,000,000個擴增標靶拷貝用於檢測。此等方法需擴增儀器及試劑，而此等試劑對保存條件敏感；需專業人員實施標的核酸之擴增；及易於在相同擴增儀器之重複使用期間交叉污染。
亦有用於檢測病原體之存在之快捷套組，如CLO(http：//www.medicinenet.com/helicobacter_pylori/article.htm#2diagnosis)，但此等方法需(1)長時間培養(數小時至數天)以增殖生物標靶；(2)專業人員以進行活體組織檢查；及(3)專業人員以解釋結果。
如本文中所詳細描述，本發明提供檢測一或多種標靶(包括生物、化學或材料標靶)而在檢測前盡可能少或不擴增之方法及裝置。部分上，此係透過使用穩定及可靠健全型酶系統實現，該等系統容許直接檢測生物標靶而無需預擴增。於核酸檢測之情況中，交叉污染風險降低，係因為標靶不複製且整個裝置可丟棄。檢測時間短得多，其中樣品至結果時間少於1小時或短達15分鐘。用於本發明中之酶較佳在室溫下穩定。於某些實施例中，本發明可無需複雜儀器檢測，藉此容許本發明用於就地照護(POC)應用。
因此，本發明之方法及裝置提供顯著降低之建設費用及對就地照護檢測之設備要求及可應用於可棄式套組。此等特徵容許消費者或其他人員在不進行上崗培訓下直接操作實施例。此外，本發明之方法及裝置可整合至現有工作流程中以改良檢測極限(LOD)及/或檢測時間。
定義
應理解，本發明不限於特定方法、試劑、化合物、組合物或生物系統，此等理所當然地可變化。亦應理解，用於本文中之術語係僅針對描述特定態樣之目的，且無意限制。如本說明書及附接申請專利範圍中所使用，除非以其他方式另外說明，否則單數形式「一」及「該」包括複數形式。
當指可測量值(如量、時間及類似者)時，如本文中所使用之術語「約」意涵蓋指定值之±20%或±10%，更佳±5%，甚至更佳±1%，及仍更佳±0.1%之偏差，係因此等偏差適合實施所揭示之方法。
除非另外定義，否則本文中所使用之所有技術及科學術語具有本發明相關技藝的技術者通常理解之相同含義。雖然與本文中所描述者類似或等效之任何方法及材料可用於本發明之測試之實施中，但本文將描述較佳材料及方法。
「分析物」或「標靶」係指計劃檢測之化合物。此類化合物可包括細胞、細胞或病原體之部分、病原體、病毒粒子、細胞或細胞外基質之組分、小分子、肽、蛋白質、核酸、及其他化學實體。
層析介質可由測試樣品可通過之任何不同材料製成。例如，層析介質可為由均勻分散於多孔聚合物基質中之合成或天然存在材料形成之多孔膜，此材料如多糖(例如，纖維素材料，如紙及纖維素衍生物，如纖維素乙酸酯及硝基纖維素)；聚醚碸；聚乙烯；耐綸；聚偏氟乙烯(PVDF)；聚酯；聚丙烯；矽石；無機材料，如鈍化氧化鋁、矽藻土、MgSO4或其他無機細分材料，而此聚合物諸如氯乙烯、氯乙烯-丙烯共聚物及氯乙烯-乙酸乙烯酯共聚物；天然存在(例如，棉)及合成(例如，耐綸或人造絲)布料；多孔凝膠，如矽膠、瓊脂糖、葡聚糖及明膠；聚合膜，如聚丙烯醯胺；及諸如此類者。於一特定實施例中，層析介質係由硝基纖維素及/或聚醚碸材料形成。應理解，術語「硝基纖維素」係指纖維素之硝酸酯，其可為純硝基纖維素，或硝酸與其他酸(如具有1至7個碳原子之脂族羧酸)之混合酯。
層析介質之尺寸及形狀一般可變化，如熟習本項技術者輕易知曉般。例如，多孔膜條可具有約10至約100毫米，於某些實施例中，約20至約80毫米，及於某些實施例中，約40至約60毫米之長度。膜條之寬度亦可介於約0.5至約20毫米，於某些實施例中，約1至約15毫米，及於某些實施例中，約2至約10毫米範圍內。類似地，膜條之厚度一般小到容許透過檢測。例如，膜條可具有小於約500微米，於某些實施例中小於約250微米，及於某些實施例中，小於約150微米之厚度。
如上所述，載體材料承載該層析介質。例如，載體21可直接鄰接層析介質放置，如圖3中所顯示，或可將一或多個中間層置於層析介質與載體材料之間。不論如何，載體材料基本上可由任何可承載層析介質之材料形成。載體材料可由透光材料形成，如透明或光漫射(例如，半透明)材料。且，載體材料一般宜呈非滲液性以使流過介質之流體不經由載體材料洩漏。載體之合適材料之實例包括，但不限於，玻璃；聚合材料，如聚苯乙烯、聚丙烯、聚酯(例如，Mylar.RTM.膜)、聚丁二烯、聚氯乙烯、聚醯胺、聚碳酸酯、環氧樹脂、甲基丙烯酸酯及聚三聚氰胺；及諸如此類者。為了對層析介質提供充分結構背襯，一般對載體材料進行選擇以具有特定最小厚度。類似地，載體8之厚度一般會過大而影響其光學性質。因此，例如，載體材料可具有介於約100至約5,000微米，於某些實施例中，約150至約2,000微米，及於某些實施例中，約250至約1,000微米範圍內之厚度。
如本技藝所熟知，可將層析介質澆鑄於載體材料上，其中可將所獲得之層壓件衝切成所需尺寸及形狀。或者，可藉由例如黏著材料，簡單地將層析介質層壓至載體材料。於某些實施例中，將硝基纖維素或耐綸多孔膜黏附至膜。
橫向流動裝置亦含有吸附材料，該吸附材料鄰接層析介質遠端放置。彼遠端係距樣品上料區最遠之層析介質末端。吸附材料有助於增強毛細管作用及流體流過層析介質。此外，吸附材料接收通過整個層析介質之流體及因此 將任何未反應組分驅離檢測及對照區域以助益降低「假陽性」之可能性。可用於本發明中之某些合適吸附材料包括，但不限制於，硝基纖維素、纖維素材料、多孔聚乙烯墊、玻璃纖維濾紙及諸如此類者。吸附材料在併入裝置前可為濕或乾。預潤濕可促進某些流體之毛細管流動，但一般不要求。且，如本技藝所熟知，吸附材料可藉由表面活性劑處理以輔助芯吸過程。
樣品上料區可藉由不同材料(如墊)形成。可用於形成此類樣品墊之某些合適材料包括，但不限制於，硝基纖維素、纖維素、多孔聚乙烯墊及玻璃纖維濾紙。若需要，樣品上料區亦可含有擴散或非擴散附接之一或多種預處理試劑。於所說明之實施例中，測試樣品自樣品上料區移向與樣品上料區連通之報告載體區。報告載體區可形成於層析介質上。或者，如圖3中所顯示，報告載體區可由不同材料或墊形成。此試劑墊可由測試樣品可通過之任何材料形成，如玻璃纖維。
「指示劑」係指以下各種物質中之任一者，如石蕊、酚酞或溴百里酚藍、1-羥基-4-[1-(2-羥乙基磺醯基)苯基偶氮]-萘-2-磺酸鉀、纖維素乙酸酯偶合1-羥基-4-[1-(2-羥乙基磺醯基)苯基偶氮]-萘-2-磺酸鉀及類似者，其藉由特性變化尤其顏色變化指示另一物質之存在、不存在或濃度或兩或更多種物質之間之反應程度。
「樣品」係指疑含有分析物或標靶分子之任何源。可利用本發明測試之樣品之實例包括，但不限制於，尤其血 液、血清、血漿、尿液、唾液、腦脊髓液、淋巴液、組織及組織與細胞提取物、細胞培養物上清液、活體組織標本、石蠟包埋組織、土壤、水果、果汁、油、乳液、食品、水。樣品可懸浮或溶解於液體材料中，如緩衝液、提取劑、溶劑及類似者。
「報告載體」係指結合標靶或分析物並與其形成複合物及報告該標靶或分析物之存在之實體。報告載體可包含可與分析物或標靶分子形成複合物之蛋白質或核酸或另一部分。報告載體與健全型酶盒締合，該健全型酶盒可包含酶與受質之組合，僅在標靶或分析物存在時呈活性。酶盒含有至少一種共軛至報告載體之健全型酶。
於某些實施例中，該載體係抗體或寡核苷酸。
「健全型酶」或「高產率酶」係指可在接近擴散極限之高速率下產生產物之酶。
「捕捉組分」基本上係指特異識別及複合標靶或分析物但不阻礙報告載體與相同標靶或分析物形成複合物之分子。一般而言，捕捉組分固定至層析膜上之基質。
「前報告載體」基本上係指在報告載體締合前特異結合至分析物之分子。前報告載體一般不含有健全型酶。
「健全型酶共軛物」基本上係指共軛至報告載體之健全型酶。相互作用屬性係共價或非共價或兩者混合。
組分及方法 報告載體 A.載體
報告載體一般包含兩組分：第一組分係可與標靶或分析物(可為生物、化學或其他類型)形成特異複合物之載體。另一組分係一或多種健全型酶盒。可用於實施本發明之載體尤其包括，但不限制於，具有與標的核酸序列中之至少一部分互補之序列之核酸、抗體、適體、實心或多孔微粒及具有與標靶中之至少一部分互補之印迹結構之合成聚合物。實心、殼-核心或多孔微粒可為載體中之一部分，其可改良對流之控制以引導載體流向反應墊。此可藉由改變載體之尺寸或密度或利用磁力驅動粒子移動(若粒子可經磁力極性化，例如順磁性粒子)來達成。
於另一實施例中，不含健全型酶之前報告載體形成前報告載體-分析物複合物，稱為複合物A。複合物A可藉由固定劑捕捉及固定。前報告載體自身不與固定劑結合。當分析物不存在時，不形成複合物及前報告載體被洗脫。
報告載體對分析物具特異性。前報告載體可用於與分析物形成複合物。當所有三種組分存在於溶液中時，則可發生此類締合。於一較佳實施例中，將前報告載體添加至樣品溶液，然後將樣品溶液施加至橫向流動試驗裝置。分析物前報告載體複合物在報告載體區接觸，其中報告載體與複合物形成締合。分析物係藉由檢測區中之表面捕捉劑捕捉及固定。分析物與前報告載體之締合不抑制分析物之固定。當分析物及前報告載體存在時，該兩組分之複合物可藉由分析物與檢測區中之表面捕捉劑之相互作用固定。當報告載體與複合物締合時，報告載體得以固定。當分析物 或前報告載體分析物複合物不存在時，報告載體無法固定及可隨著溶劑移動及視需要沿橫向流動裝置清洗而通過檢測區。
前報告載體具有多個目的。一者係增大對標靶分析物之特異性。酶與報告載體之共軛可限制使與標靶分析物而非背景非標靶之結合選擇性最大化之能力。於核酸之情況中，共軛酶之空間位阻或庫侖電荷作用可影響雜交之選擇性。另一目的係藉由級聯結合增強訊號放大過程。一實例係檢測小分析物。當分析物之分子尺寸過小時，難以使多於一個報告載體與一分析物形成複合物。在與前報告載體形成複合物(稱為複合物A)後，每個分析物分子具有更多表面積。較大表面積及官能基係因複合物A形成而建立。增加之表面積及官能基可容許多於一個報告載體與包含一分析物之複合物締合。更多報告載體將產生更多訊號及因此，進一步改良訊雜比。利用前報告載體增大標靶表面積以容許每個分析物發生更多報告載體特異結合事件。
另一實施例降低報告載體設計之複雜性及增大對標靶分析物之多重性，例如，病毒基因多態現象或多個核酸序列標靶。可對各種前報告載體之混合物進行設計以與各特異性基因型或序列反應。所有前報告載體可含有一或多個對報告載體特異之標籤。當使用同一標籤時，報告載體特異地結合至該標籤而不會因前報告載體有差異。當使用不同標籤時，若不同報告載體係針對各種標籤設計，可分別歸類數種標靶。
圖6A至6H顯示用於核酸標靶檢測中之前報告載體之不同實例。例如，如圖6A及6B中所顯示，前報告載體可包含獨有標靶結合區域(例如I至N)，各區域具有獨有標籤(例如，a1至a3)。獨有標籤分別可結合不同報告載體。此變型之一優點係前報告載體(及因此，亦包括相應之報告載體)可在不同標靶位置結合。此降低由於前報告或報告載體與錯誤反應點之錯誤結合而導致之假陽性的風險。圖6C顯示獨有標靶結合區域(I至N)各攜帶相同標籤(「a」)之實例。如圖6D至6E中所顯示，各前報告載體可與同一標靶之某一部分雜交，利用帶有健全型酶共軛物之單一種報告載體檢測。於其他實例中，具有相同標籤(「a」)之各前報告載體可結合至不同標靶，而非同一標靶之不同部分(圖6F至6H)。
「抗體」係指結合至可用於操作本發明之特異抗原決定部位之任何免疫球蛋白或完整分子及其等片段。此類抗體包括，但不限制於，多株、單株、嵌合、人源化、單鏈、全抗體之Fab、Fab'、F(ab)'片段及/或F(v)部分及其等變異體。此術語涵蓋所有同型物，且該等同型物可用於操作本發明，包括IgA、IgD、IgE、IgG及IgM。
「抗體片段」專門係指抗體全序列中保留原抗體之抗原結合功能且亦可用於本發明中之不完整或單離部分。抗體片段之實例包括Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段；雙功能抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；及由抗體片段形成之多特異性抗體。
用於本發明中之完整「抗體」包含藉由二硫鍵互連之至少兩重(H)鏈及兩輕(L)鏈。各重鏈係由重鏈可變區(本文中縮寫為HCVR或VH)及重鏈恒定區組成。重鏈恒定區係由三個結構域CH1、CH2及CH3組成。各輕鏈係由輕鏈可變區(於本文中縮寫為LCVR或VL)及輕鏈恒定區組成。輕鏈恒定區係由一個結構域CL組成。VH及VL區可進一步細分為高變異區，稱為互補決定區(CDR)，散佈著較守恆區(稱為框架區(FR))。各VH及VL係由三個CDR及四個FR組成，依如下順序自胺基末端排列至羧基末端：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重及輕鏈之可變區含有與抗原相互作用之結合結構域。抗體之恒定區可介導免疫球蛋白對宿主組織或因子之結合，該等宿主組織或因子包括免疫系統之各種細胞(例如，效應細胞)及典型補體系統之第一組分(Clq)。術語抗體包括完整抗體中保留結合能力之抗原結合部分。結合之實例包括(i)Fab片段，其係由VL、VH、CL及CH1結構域組成之單價片段；(ii)F(ab')2片段，其係包含藉由鉸鏈區處之二硫橋鍵連接之兩Fab片段之二價片段；(iii)由VH及CH1結構域組成之Fd片段；(iv)由抗體之單臂之VL及VH結構域組成之Fv片段，(v)dAb片段(Ward等人，Nature,341：544-546(1989))，其係由VH結構域組成；及(vi)單離互補決定區(CDR)。
「單鏈抗體」或「單鏈Fv(scFv)」亦可用於本發明中。此術語係指包含Fv片段之兩個結構域VL及VH之抗體融合分子。雖然Fv片段之兩結構域VL及VH係藉由不同基因編 碼，然而其等可利用重組方法藉由合成連接子接合，該合成連接子可將其等製成單個蛋白質鏈，其中VL與VH配對以形成單價分子(稱為單鏈Fv(scFv)；參見Bird等人，Science,242：423-426(1988)；及Huston等人，Proc Natl Acad Sci USA,85：5879-5883(1988))。此等單鏈抗體係以引用的方式包含於術語「抗體」片段中，可藉由重組技術或完整抗體之酶或化學裂解製備。
「單株抗體」可用於本發明中。單株抗體係具有單分子組成之抗體分子之製劑。單株抗體組合物展示對特定抗原決定部位之單結合特異性及親和性。
可用於實施本發明之抗體之特異性之非限制性實例尤其包括對特定抗原特異之彼等抗體；用於甲基化DNA之檢測之甲基化特異性抗體；及用於磷蛋白之檢測之磷酸化特異性抗體。例如，可將病毒特異性抗體用於檢測樣品中之病毒粒子之存在。所有上述抗體及片段可藉由某些基團改質以容許抗體或片段連接至健全型酶。
於某些實施例中，將核酸用作載體。若使用核酸，則可使用具有與標靶核酸中之至少一部分互補之序列之寡核苷酸。用於合成核酸之方法係為本技藝熟知。本發明之核酸可藉由某些基團改質以容許核酸連接至健全型酶。可引入在載體核酸中之一或數個選擇鹼基對標靶之失配。利用人工引入之失配，可調節結合能以設計或工程化載體在不同樣品上因焓及焓變化獲得之選擇性。
除包含天然鹼基之寡核苷酸外，亦可使用包含核苷酸類 似物之寡核苷酸，如肽核酸(PNA)或鎖核酸(LNA)。相較於DNA及RNA，PNA之主鏈係由藉由肽鍵連接之重複N-(2-胺基乙基)-甘胺酸單元組成。鎖核酸(LNA)係經改質之RNA核苷酸。LNA核苷酸之核糖部分係藉由外橋連接2'氧及4'碳改質。橋「鎖閉」3'-末端(北)構形中之核糖，此常見於A-形雙螺旋。LNA核苷酸可視需要與寡核苷酸中之DNA或RNA殘基混合。此類寡聚物可化學合成及自市面購置。
B.健全型酶或載體酶
在實施本發明時，上述載體可與各種健全型酶或載體酶非共價或共價締合。可特別用於實施本發明之酶之特徵在於反應速率接近受質之擴散極限。本發明之健全型酶一般可具有103/秒/酶至108或更高/秒/酶之轉換常數。
合適健全型酶或載體酶之實例包含於以下EC類別中，但不限制於，氧化還原酶(EC1)、水解酶(EC3)、裂解酶(EC4)或連接酶(EC6)，或催化產生質子濃度之反應之酶、酶樣核酸或酶樣觸媒。
此類酶之實例係為本技藝已知。可用於實施本發明之酶之實例及其等特性及受質包括，但不限制於，以下顯示之彼等物。
1.脲酶
EC號：3.5.1.5，水解酶
a.轉換數：2.97×103 S-1
b.受質：尿液
參考文獻1：PDB: 1 fwj.
參考文獻2：Pearson, M. A.等人，<Kinetic and Structural Characterization of Urease Active Site Variants> Biochemistry, 2000, 39 (29) p 8575-8584
2.磷酸膽鹼磷酸酶
EC號：3.1.3.75 aka磷酸乙醇胺
Spec：綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)PA5292基因，於PAO1基因組野生型中(藉由在質粒結構中截斷及修改結構)
a.轉換數：5至7×106 S-1
b.受質：對硝基苯基磷酸酯
c.產物：對硝基苯酚
參考文獻1：Beassoni, P. R.等人，Current Microbiology, 2006 52 (6), p534-539
3. β-半乳糖苷酶
EC號：3.2.1.23來自馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)
a.轉換數：2.7×106 S-1
b.受質：4-硝基苯基-β-D-半乳糖苷
參考文獻1：OÇonnell, S.等人Applied Biochemistry and Biotechnology 2007 V141 (1) p1-13
4.木糖還原酶
EC號：1.1.1.307，來自埃默森籃狀菌(Talaromyces emersonii)
a.轉換數：1至3×105 S-1
b.受質：D-木糖，NADPH
參考文獻1：Fernandes, S.等人，J. Biosci. 34 (6) 2009 p881-890
5.莽草酸脫氫酶
EC 1.1.1.25大腸桿菌(Escherichia coli)
種：野生型(莽草酸鹽)、突變體S22A、Y39F、D107A、S67A、T106A
a.轉換數：1×105 S-1
b.受質：莽草酸鹽，或奎尼酸鹽或NAD+
參考文獻1：Lindner, H. A. J. Bio. Chem. 2004 V280, P7162-7169
6.蘋果酸脫氫酶
EC號：1.1.1.37小麥(Triticum aestivum)或埃默森籃狀菌
a.轉換數：1×105 S-1
b.受質：NADH
參考文獻1：Maloney, A. P.等人Eur. J. Biochem 271 2004 p3115-3126
7.新普魯蘭酶
EC號：3.2.1.135，來自嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Geobacillus stearothermophilus)
a.轉換數：1×105 S-1
b.受質：澱粉(Pullulan film aka E1204)
參考文獻1：Zareian, S等人，Enzyme Microb. Technol. 2010 46 p57-63
8.枯草桿菌蛋白酶
EC號：3.4.21.62，來自芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)
a.轉換數：1×105 S-1
b.受質：Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-對硝基苯胺
參考文獻1：Toogood, H. S. Biochem. J. 2000 250, p321-328 9. 4-植酸酶
EC號：3.1.3.26，來自煙麯菌(Aspergillus fumigatus)
a.轉換數：3.5至4.1×105 S-1
b. 4-硝基苯基磷酸酯或肌醇六磷酸酯
參考文獻1：Rodriguez, E.等人Biochem Biophys Res Commun. 2000 268 (2) p373-378
10.乙醯膽鹼酯酶
EC號：3.1.1.7
a.轉換數：1.4×105 S-1
b.受質：乙醯膽鹼
參考文獻1：Rothenberg M. A.等人J. Biol. Chem. 168 (1) p223-231
11.漆酶
EC號：1.10.3.2，來自擔子菌門(Basidiomycota)
a.轉換數：0.6×105 S-1
b.受質：2,2'-嗪基雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)
參考文獻1：Jordaan, J.等人，Enzyme Microb. Technol. 2004 V34, P635-641
12.細菌亮胺醯基胺基肽酶
EC號：3.4.11.10，來自肝片吸蟲(Fasciola hepatica)
a.轉換數：0.3×106 S-1
b.受質：L-Cys-7-醯胺基-4-甲基香豆素
參考文獻1：Acosta, D.等人，Molecular and Biochem. Parasitology 2008, V158 (1) p52-64.
13.三肽基-肽酶I
EC號：3.4.14.9，來自盤基網柄菌(Dictyostelium discoideum)
a.轉換數：0.55×106 S-1
b.受質：Ala-Ala-Phe-對硝基苯胺
參考文獻1：Krimper, R. P. Biochem and Molecular Biology International 1999 47 (6) p1079-1088
14.凝血因子VIIa
EC號：3.4.21.21，來自現代人
a.轉換數：0.35×106 S-1
b.受質：N-甲基磺醯基-D-Phe-Gly-Arg-對硝基苯胺
參考文獻1：Neuenschwander, P. E.等人Biochemistry 2002 41 p3364-3371
15.胰蛋白酶
EC號：3.4.21.4，來自美洲大蠊(Periplaneta Americana)
a.轉換數：0.91×106 S-1
b.受質：鄰胺基苯甲醯基-AGSRGAGQ-(2,3-二硝基苯基-乙二胺)
參考文獻1：Marana, S. R.等人Biochemical and Biophysical Research Communications 2002 290 p494-497
16. β-呋喃果糖苷酶
EC號：3.2.1.26，來自新阿波羅栖熱袍菌(Thermotoga neapolitana)
a.轉換數：0.73×106 S-1
b.受質：蔗糖
參考文獻1：Dipasquale, L.等人Extremophiles 2009 13 p345-354
分析物檢測之敏感性及特異性可藉由使用溫度跳躍或梯度進一步改良。某些最穩定酶需要較高溫度以達成最優化活性或作為活化該等酶之觸發事件。因此，反應溫度可較室溫高，於此溫度下，反應仍可行。當溫度低於最優化區域時，酶之活性會極大下降。可先移除或中和來自樣品之反應污染物或背景分子，然後使溫度升高至最優化區間。反應污染物之一可係溶液中之溶解二氧化碳，其干擾pH變化。升高溫度將降低二氧化碳之溶解度，藉此減小干擾。溫度可藉由物理方法(如聚集太陽能)或藉由放熱化學方法(如硫酸鎂或氯化鈣之溶劑化之焓變化)，或藉由電學方法(如藉由熱泵)提高。熱泵之一實例係Peltier裝置。出於相同原因，亦可藉由降低溫度而故意降低反應速率以使反應最優化。化學方法之一實例係硝酸銨之溶劑化。可使用熱泵以透過切換電極性降低溫度。於某些實施例中，反應溫度為約4℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃至約95℃或更高，同時仍維持酶活性，或介於該等溫度之間之任何溫度。
除上文所出示之酶及受質系統外，本發明可利用一或兩或更多種其他酶原(B、C、D或更多)。於此等實施例中，作為受質之酶原B可藉由報告基團中之酶盒A活化。在酶B活化後，酶B可進一步活化酶C，其將活化酶D及依此類推。於此等連接系統中之有效轉換常數係各活化酶原之轉換常數之數倍。例如，各酶(B、C、D及其他)之轉換常數可低達10或102/秒/酶。然而，倍增之轉換數可大於104/秒/酶。實例包括凝血級聯，其中活化因子Xa活化凝血酶，凝血酶活化來自纖維蛋白原之纖維蛋白。活化之凝血酶亦經由因子VIIIa及IXa活化因子Xa。
C.報告載體之形成
載體可與健全型酶或載體酶非共價或共價締合。共軛之實例包括，但不限制於，選殖及表現嵌合蛋白作為載體；利用化學改質碳二醯亞胺-NHS反應、S-Au複合、甲苯磺醯基-胺反應、甲醛共軛、二硫鍵結、分子印迹及使用此等方法中之任一者之位點-方向共軛或隨機共軛；及非共價：藉由嵌合體生物素-親和素或凝血酶-水蛭素締合。
可用於在製程中連接兩受關注分子之偶合或交聯化學(常稱為生物共軛)之其他實例係為本技藝已知。常見偶合化學使用賴胺酸胺基酸殘基之胺偶合(一般藉由胺反應性琥珀醯亞胺基酯)及半胱胺酸殘基之巰基偶合(藉由巰基反應性馬來醯亞胺)。其他鍵聯可藉由環化加成反應或「點擊化學」產生。參見，例如，Bioconjugation Techniques,Greg.T.Hermanson,Academic Press,1996；「Advances in Bioconjugation」，Kalia,J.及Raines,R.T.,Current Organic Chemistry,14：138-147(2010)。
或者，若將兩蛋白質結合，則載體可利用標準分子生物學及蛋白質純化技術製成融合蛋白。製得編碼所需融合蛋白之序列後，可將其等選殖至任何合適載體或複製子中。大量選殖載體係為熟習本項技術者已知，及合適選殖載體之選擇事關選擇。用於選殖之重組DNA載體及其等可轉型之宿主細胞之實例包括噬菌體λ(大腸桿菌(E.coli))、pBR322(大腸桿菌)、pACYC177(大腸桿菌)、pKT230(革蘭氏陰性細菌)、pGV1106(革蘭氏陰性細菌)、pLAFR1(革蘭氏陰性細菌)、pME290(非大腸桿菌革蘭氏陰性細菌)、pHV14(大腸桿菌及枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis))、pBD9(芽孢桿菌屬(Bacillus))、pIJ61(鏈球菌屬(Streptomyces))、pUC6(鏈球菌屬)、YIp5(酵母菌屬(Saccharomyces))、YCp19(酵母菌屬)及牛乳頭瘤病毒(哺乳動物細胞)。參見Sambrook等人，如前述；DNA Cloning，如前述；B.Perbal，如前述。可將基因置於啟動子、核糖體結合位置(用於細菌表現)及視需要操縱子(於本文中統稱為「控制」元件)之控制下，以使編碼所需蛋白質之DNA序列於藉由含有此表現結構之載體轉型之宿主細胞中轉錄為RNA。編碼序列可或可不含有單肽或前導序列。前導序列可藉由宿主以轉譯後加工方式移除。參見，例如，美國專利案4,431,739；4,425,437；4,338,397。
隨後可將表現載體用於轉型合適宿主細胞。許多哺乳動 物細胞株係為本技藝已知且包括獲自美國模式培養物研究所(ATCC)之無限增殖化細胞株，如但不限制於，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、海拉細胞、幼年倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎細胞(COS)、人肝細胞癌細胞(例如，Hep G2)、麻丁-戴比(Madin-Darby)牛腎(MDBK)細胞及其他。類似地，細菌宿主，如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌及鏈球菌可用於本發明表現結構中。可用於本發明中之酵母宿主包括但不限制於釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白色念珠菌(Candida albicans)、麥芽糖甲絲酵母(Candida maltosa)、多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha)、脆壁克魯維酵母菌(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克魯維酵母菌(Kluyveromyces lactis)、季也蒙畢赤酵母(Pichia guillerimondii)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)及耶羅維亞酵母(Yarrowia lipolytica)。供桿狀病毒表現載體用之昆蟲細胞包括但不限制於埃及伊蚊(Aedes aegypti)、苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)、家蠶(Bombyx mori)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)、草地貪夜蛾(Spodoptera fmgiperda)、及粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)。
捕捉組分
可將捕捉組分固定於膜表面用於捕捉報告載體-標靶複合物。捕捉分子識別及形成與標靶之複合物而不妨礙報告載體與同一標靶分子形成複合物。捕捉組分僅固定已與標靶形成複合物之報告載體。如圖1中所顯示，捕捉組分固 定報告載體-標靶導致夾層結構形成。不作為該結構之一部分之報告載體可溶及係藉由液體流動或清洗，例如，以橫向流動模式移除。當使用清洗溶液時，以具有約8至約9.5之pH之緩衝液較佳。當使用產質子酶及受質時，緩衝液之緩衝能力不應大於預期pH變化。常見清洗緩衝溶液可具有約0.03 mM至約0.1 mM之濃度。包含三(羥甲基)胺基甲烷(Tris)及磷酸鹽之水性、醇水及鹽緩衝液係合適緩衝溶液之非限制性實例。一般而言，捕捉組分係蛋白質或核酸。可利用本技藝中已知之方法將捕捉組分固定於層析介質表面。參見，例如，Nakanishi等人，Current Proteomics,5：161-197(2008)。用於將核酸固定於表面之方法亦已知。參見，例如，Wu等人，J.Biomater.Sci.Polymer.Edn.,19：725-753(2008)。可於一次測試中將多類捕捉組分及報告載體用於檢測多種標靶。例如，該多種標靶可為多種核酸或核酸與非核酸(例如，蛋白質標靶)之組合。可將本技藝中已知之許多固定方法中之任一者(共價及非共價)用於實施本發明。
基本檢測方法
圖1顯示用於基本標靶檢測之各個階段，包括樣品製備、報告載體附接至標靶、訊號載體-標靶固定化、洗去過量試劑及結果展示。
製備樣品：作為第一步驟，製備用於本發明方法及裝置中之樣品。熟習本項技術者將瞭解，於此階段中之可行步驟可隨著實現及標靶分子類型變化。可用於此階段中之步 驟之實例包括，但不限制於：改良標靶分子之濃度之方法，自細胞進行核酸提取及樣品純化。於某些實施例中，在應用樣品(例如，液體樣品，如血液或尿液)前完全不需要製備樣品。
附接報告載體：如圖1中所顯示，此步驟使用含有酶盒之報告載體。該報告載體將與所關注之標靶分子形成複合物。
固定報告載體：將捕捉組分之固定劑陣列用於捕捉生物標靶。如圖1中所顯示，當固定劑捕捉到與報告載體呈複合物之標靶時，形成固定劑-生物標靶-報告載體之夾層結構。於不同實施例中，陣列中可具有多種固定劑(或捕捉組分)以用於不同標靶分子。
洗去過量分子：此視需要步驟將洗去其他分子、過量樣品、報告載體或未被固定劑陣列捕捉到之其他分子。在檢測區上游施加清洗溶液以使其藉由毛細管作用移經檢測區及對照區(若存在)到達位於測試條遠端之吸附墊。視需要清洗溶液之量係視測試條之尺寸及測試屬性而定且可由熟習本項技術者輕易測定。
展示結果：將在此階段中經固定之報告載體與試劑(一般係受質)混合，該試劑與載體中之健全型或高產率酶反應以快速形成可觀察到之產物。亦可添加一或多種酶以加速產物之形成，藉此形成反應級聯。視酶及試劑之選擇，可採用不同檢測方法。此等方法尤其包括，但不限制於，例如pH變化、顏色變化、顏色密度變化或光透射。受質一 般係藉由噴撒、塗佈、滴管或傾倒而施加至層析測試條。
圖2說明本發明於核酸測試中之應用。基本流程類似於圖1中所顯示者，適用於核酸標靶分子。
製備樣品：就此應用而言，樣品製備可包括常規步驟，如核酸提取、樣品濃縮、RNA提取及核酸酶抑制。就某些應用而言，DNA(例如，基因組DNA)可能需在尺寸上打碎，例如，藉由在用於該方法之前剪切。
附接報告載體：於此應用中，將高度健全或高產率酶附接至所合成之多核苷酸，形成報告載體或酶盒。於某些實施例中，可存在用於核酸標靶之多於一種多核苷酸。使報告載體中之多核苷酸雜交至標靶核酸。
固定報告載體：如圖2中所顯示，固定劑陣列可包含一或多個對標靶核酸特異之多核苷酸。若匹配，則固定劑與標靶核酸雜交以形成報告載體-標靶-固定劑複合物。此複合物之形成將報告載體鎖定在原位。於報告載體及固定劑中之核苷酸之選擇可用於不同應用中，包括但不限制於，單核苷酸變異之檢測、甲基化或標靶測序。
洗去過量分子：於此階段，洗去過量分子及酶盒，留下結合之報告載體-標靶複合物。
顯示訊號：隨後可使報告載體與受質試劑反應以形成可觀察產物。於某些實施例中，可添加另一或多種酶以加速反應。
橫向流動平台
圖3說明本發明在橫向流動平台中之實施。將瞭解，在 該平台之各個區段之不同組件之位置上可針對不同樣品類型而改變實施以獲得最優性能。於圖3中，樣品墊1下游係共軛物墊2，其下游係層析膜3，其下游係檢測區(測試線)4，其下游係對照區(對照線)5，其下游係吸附劑墊6。整個裝置位於支撐材料8上。
類似於橫向流動之其他形式，樣品可進入該裝置樣品墊及藉由沿在背襯材料頂部上之膜移動而最終到達吸附劑墊。可將報告載體沉積在共軛物墊中，及固定劑陣列可存在於讀出及對照線中。將輕易瞭解，對照及讀出線之順序可不同，及於某些實施例中可存在多個讀出線。受質試劑及其他酶(若需要)亦可存在於對照及讀出線中。
當樣品穿過共軛物墊時，形成報告載體與標靶之複合物。當樣品前端到達讀出線時，已與報告載體形成複合物之標靶可藉由該陣列固定。隨後發生反應以形成可監控之足量產物。若所固定之探針(捕捉組分)與樣品中之標靶不匹配，則樣品核酸將流過膜，在檢測線上留下極小濃度之酶。對照線用作裝置之正對照。正對照證實測試條工作，藉此將假陰性測試結果降至最低。
圖7說明陽性測試結果。檢測區4指示酶之存在，說明分析物-報告載體複合物已被捕捉於檢測區中。正指示劑反應係由於測試樣品移過檢測區後將受質添加至測試條之結果。對照區5亦指示酶之存在，說明未複合報告載體亦遷移測試裝置之長度及已被捕捉於對照區中，在施加酶受質後提供指示劑變化，確認未複合報告載體之存在。
圖8說明分析物報告載體複合物不形成或不被捕捉於檢測區中之負測試結果。在對照區中指示之陽性反應確認測試條正常工作及酶及報告載體存在並呈活性。
以下實施本發明之具體態樣之實例係僅針對說明目的提供，及非意欲以任何方式限制本發明。
實例 實例1：橫向流動裝置之實施例
圖4顯示可用於實施本發明之橫向流動裝置之各實施例。提供樣品上料區1。沿箭頭所指示之方向之流動導致樣品與存在於報告載體上料區2中之報告載體7之相互作用。檢測區4含有捕捉組分(上行實心箭頭)及展示結果材料，如受質，及若需要時使用之其他酶原，以進一步擴大訊號。可提供正對照區5。若存在，則樣品所通過之支撐歧管基質可為多孔基質或支化聚合物之化學塗層或膜。如圖4B至4D中所顯示，歧管基質可安裝在固體無孔背襯8上，背襯8具可撓性或多孔性。於某些實施例中，檢測區4可含有一種型態之固定劑陣列8(如抗體、抗原、核酸等)或多種型態之固定劑陣列，其等可位於檢測區中之不同空間位置4a、4b及4c。圖4E說明非活性酶原9，其可存在於固定劑陣列中，當活化時可讓該系統達到高度完全轉換。於其他實施例中，固定劑陣列附近之支撐歧管基質可包含pH敏感性材料，如含有10，例如，金奈米粒子10a之pH敏感性水凝膠。此pH敏感性材料可用於檢測酶之反應，該酶之催化活性導致pH變化。如圖4G及4H中所顯示，可用於實 施本發明之表面pH敏感性展示分子之實例包括吖啶橙、花青、脂質體或螢光葡聚糖11或可溶性分子(如BSA)12。
實例2：橫向流動裝置之實施例之操作
圖5說明本發明之各實施例之操作。可將樣品標靶13導至樣品上料區1中(步驟A)。沿箭頭所指示之方向之橫向流動可使樣品標靶13與報告載體7接觸(步驟B)。橫向流動進一步將樣品標靶與報告載體之複合物14運載至檢測區4(步驟C)。於檢測區中之捕捉組分(上行實心箭頭)固定樣品標靶與報告載體之複合物15(步驟D及4-E)。於各實施例中，捕捉組分可為單一或若干變體之群簇(將圖D中之上行箭頭與E比較)。沿著捕捉組分及樣品標靶與報告載體之固定複合物之橫向流動移除過量材料，如未結合報告載體、未結合樣品標靶及類似者，及用作清洗步驟(步驟F)。於步驟G中，可將酶受質及其他可溶性分子施用至固定劑陣列區。於各實施例中，酶可為將受質轉化為產物17、18之單一健全型酶，或可使用多連接酶原19。許多可行性顯示選項顯示於步驟J至L中。例如，反應產物17之檢測可藉由水凝膠(如含有金奈米粒子10、10b、21、22之pH敏感性水凝膠)顏色變化指示(步驟J)。其他顯示選項可依賴於顏色變化(例如，銀還原)11、23、24(步驟K)。於另一實施例中，可溶性分子(如BSA)之pH敏感性沉澱可用於視檢12、25(步驟L)。
於本發明之一較佳實施例中，該裝置係橫向流動單元。整個裝置極低成本、可攜帶、無儀器及敏感。該裝置藉由 明確態樣特徵化。一特徵係將酶附接至共軛物及另一特徵係將指示劑印迹或固定在檢測區。酶反應產物與指示劑反應以提供在檢測區之視覺差異。
指示劑可為pH敏感性，當指示劑之質子化狀態變化時會變色或發出螢光。於實施例之一者中，pH指示劑與載體膜分子(如纖維素乙酸酯)反應。於另一實施例中，將pH指示劑封裝於質子可穿透塑膠中[「Full-range optical pH sensor based on imaging techniques」，Capel-Cuevas,S.,Cuellar,M.P.、deOrbe-Paya,I.、Pegalajar,M.C.、Capitan-Vallvey,L.F.,Analytica Chimica Acta,681(2010)71-81]。於兩情況中，pH指示劑沉積於膜上不干擾在橫向流動裝置中之共軛結合。
於一較佳實施例中，將指示劑印迹或噴撒於位於共軛物墊下游之膜上以形成線或區。各線或區係藉由不含指示劑之膜緩衝區域自另一指示劑線或區分離。該緩衝區域亦可含有固定之緩衝組分層以防止不同線/區間之交叉反應。
於一實施例中，透過混合溴百里酚藍2.1 mg；三(十二烷基)甲基氯化銨(TDMAC)2.8 mg；癸二酸二辛基酯(DOS)19.6 mg；乙二醇19.6 mg及四氫呋喃(THF)1 ml以製備染料(溴百里酚藍)。溴百里酚溶液具有約8至約9.5之pH。利用氣刷槍將指示劑-聚合物溶液噴塗於膜上。氣刷槍係Iwata所製造之High Performance C PLUS Airbrush。以聚合物/指示劑僅塗覆在橫向流動條上之對照/測試線區域。噴撒後，將整個條放置在乾燥器中過16小時才使用。
於一較佳實施例中，可將pH指示劑與諸如纖維素(US 4,029,597)之聚合物共價連接。於一實施例中，將pH敏感性染料專門設計成具有羥基磺醯端基用於染料分子與纖維素之共價化學。藉由硫酸在室溫下處理pH敏感性染料分子以形成磺基酯端基。然後，將染料在硫酸中之溶液稀釋至去離子水中及藉由氫氧化鈉中和。於此階段將纖維素乙酸酯添加至溶液中。5分鐘後，添加碳酸鈉及再過5分鐘後將氫氧化鈉添加至溶液中。磺基酯基團在強鹼條件下形成乙烯基碸端基及使纖維素乙酸酯水解以與羥端基形成纖維素。於相同鹼性條件下，於染料分子上之乙烯基碸基與纖維素之羥基反應以於pH指示劑染料與纖維素之間形成共價連接。藉由去離子水清洗最終反應產物。將pH敏感性纖維素溶於溶劑中以製備10重量%溶液。以水溶液較佳。將指示劑溶液噴塗於硝基纖維素膜上以將pH指示劑染料固定於橫向流動裝置上。
用於羧酸酯酶之較佳受質溶液包含以下式： 10 mM己酸烯丙酯
0.1 mM Tris pH 8.5
5%異丙醇
受質係己酸烯丙酯。水解後，一己酸烯丙酯分子產生一己酸及一2-丙醇。反應之起始pH係由pH 8.5下之0.1 mM Tris決定。受質溶液之緩衝能力可小於50微莫耳。於pH8.5下平衡之總質子可產生質子過剩，如此一來pH值可因水解而下降。
由水解導致之pH變化會導致例如如上所述之溴百里酚藍之指示劑自藍色變為黃色。
於一較佳實施例中，使裝置避免接觸空氣中之二氧化碳，否則會使溶液pH逐漸變為pH 6.5。該隔離可藉由層壓或包裹達成。
較佳載體係具有約10 nm至約500 nm之直徑之微粒。較佳，該等粒子將具有約10 nm至約100 nm之直徑。較佳粒子係乳膠或金。藉由可與健全型酶結合或複合之材料塗覆顆粒。較佳塗料係鏈黴抗生素。較佳粒子係具有鏈黴抗生素塗層之20 nm金粒。較佳酶係羧酸酯酶。用於羧酸酯酶之較佳受質係在pH 8之0.1 mM Tris緩衝液中之丁酸苯乙基酯及於pH 8.5之0.1 mM Tris緩衝液之5%異丙醇中之10 mM己酸烯丙酯。
較佳粒子組合物係依照以下方案藉由鏈黴抗生素塗覆之40 nm Innovacoat金粒：
1.製備0.2 mg/mL鏈黴抗生素之磷酸鹽緩衝液溶液，pH 7.4
2.將來自Innovacoat Gold套組之42 μL反應緩衝液
<http：//www.innovabiosciences.com/gold-conjugation-kits/innovacoat-gold.html>(20OD 40 nm)，與12 μL鏈黴抗生素溶液混合
3.將45 μL該混合物轉移至一份Innovacoat金中。
4.在套組中，室溫培養10分鐘，然後藉由5 μL淬冷劑終止。
5.旋轉沉降粒子及移除上清液
6.藉由100 μL PBS緩衝液再懸浮
7.重複步驟5
8.再懸浮於50 μL PBS中及添加至最終0.1% BSA及0.01%(20K MW)聚乙二醇中
9.混合1 μL生物素化抗體(約12 μg/mL)、2 μL生物素化羧酸酯酶(約7 μg/mL)、2 μL鏈黴抗生素改質Innovacoat金以形成報告載體共軛物。
雖然以描述及說明本發明之具體態樣，然而此等態樣僅視為本發明之說明而非限制本發明，而係由附接申請專利範圍限制。
本說明書中所引述之所有公開案及專利申請案係以引用其等全文之方式併入本文用於所有目的，正如各個別公開案或專利申請案專門及個別地以引用方式合併用於所有目的。
雖然為理解之簡明而藉由說明及實例之方式較詳細描述以上本發明，然而一般技術者透過本發明之教義將輕易瞭解可對此進行特定變化及修改而不脫離附接申請專利範圍之精神或範圍。
1‧‧‧樣品墊
2‧‧‧共軛物墊
3‧‧‧層析膜
4‧‧‧檢測區
4a‧‧‧檢測區中位置
4b‧‧‧檢測區中位置
4c‧‧‧檢測區中位置
5‧‧‧對照區
6‧‧‧吸附劑墊
7‧‧‧報告載體
8‧‧‧支撐材料
9‧‧‧非活性酶原
10‧‧‧金奈米粒子
10a‧‧‧金奈米粒子
10b‧‧‧金奈米粒子
11‧‧‧葡聚糖
12‧‧‧可溶性分子
13‧‧‧樣品標靶
14‧‧‧複合物
15‧‧‧複合物
17‧‧‧產物
18‧‧‧產物
19‧‧‧多連接酶原
21‧‧‧金奈米粒子
22‧‧‧金奈米粒子
a1‧‧‧標籤
a2‧‧‧標籤
a3‧‧‧標籤
圖1顯示標靶檢測之基本步驟，包括樣品製備、訊號載體附接、訊號載體固定、過量分子移除及結果顯示。
圖2顯示核酸檢測之基本步驟。
圖3顯示橫向流動裝置之運行。
圖4A-4H顯示橫向流動裝置之各實施例。
圖5A-5L顯示橫向流動裝置之功能之各實施例。
圖6A-6I顯示用於檢測核酸標靶之前報告載體之不同實施例。
圖7說明具有正測試結果之橫向流動裝置。
圖8說明具有負測試結果之橫向流動裝置。
1‧‧‧樣品墊
2‧‧‧共軛物墊
3‧‧‧層析膜
4‧‧‧檢測區
5‧‧‧對照區
6‧‧‧吸附劑墊
8‧‧‧支撐材料

Claims (90)

  1. 一種檢測測試樣品中之分析物之方法，該方法包含：i)提供包含層析介質之橫向流動試驗裝置，該層析介質包含：(a)位於檢測區上游之樣品上料區；(b)位於該樣品上料區與該檢測區之間之報告載體區，其中該報告載體區包含可與該分析物形成複合物之報告載體，該報告載體包含載體及一或多種健全型酶盒；及(c)檢測區，其中該檢測區包含用於分析物之捕捉組分及指示劑；ii)使該樣品施用區與該測試樣品接觸，其中該測試樣品沿該層析介質經由該報告載體區自該樣品上料區移向該檢測區並超出該檢測區；iii)將受質添加至該檢測區，其中該受質在含有報告載體之健全型酶分析物存在下發生反應；及iv)於該檢測區內之指示劑產生對應於在該測試樣品中存在或不存在該分析物之反應。
  2. 如請求項1之方法，其中該橫向流動裝置進一步包含位於該檢測區下游之對照區，及該對照區包含用於該報告載體之捕捉組分及指示劑；將受質添加至該對照區，其中該受質在含有報告載體之健全型酶存在下發生反應；及於該對照區內之指示劑產生對應於該報告載體存在或 不存在之反應。
  3. 如請求項1之方法，其進一步包含維持反應溫度。
  4. 如請求項1之方法，其中該分析物係蛋白質。
  5. 如請求項1之方法，其中該分析物係小分子。
  6. 如請求項1之方法，其中該分析物係核酸。
  7. 如請求項1之方法，其中該健全型酶共軛物包含抗體。
  8. 如請求項1之方法，其中該健全型酶共軛物包含核酸。
  9. 如請求項1之方法，其中該健全型酶共軛物包含選自由以下組成之群之健全型酶：脲酶、磷酸膽鹼磷酸酶、β-半乳糖苷酶、木糖還原酶、莽草酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶、羧酸酯酶、新普魯蘭酶(neopullulanase)、枯草桿菌蛋白酶、4-植酸酶、乙醯膽鹼酯酶、漆酶(laccase)、細菌亮胺醯基胺基肽酶、三肽基-肽酶I、凝血因子VIIa、胰蛋白酶、β-呋喃果糖苷酶。
  10. 如請求項3之方法，其中將該反應溫度維持在約4℃至約95℃，或更高，同時仍保持酶活性。
  11. 如請求項7之方法，其中該抗體與健全型酶非共價相互作用，以形成該健全型酶共軛物。
  12. 如請求項8之方法，其中該核酸共價附接至健全型酶，以形成該健全型酶共軛物。
  13. 如請求項7之方法，其中該抗體共價附接至健全型酶，以形成該健全型酶共軛物。
  14. 如請求項1之方法，其進一步在該檢測區提供一或多種非活性酶原。
  15. 如請求項1之方法，其中該健全型酶共軛物之活性係藉由監控該健全型酶輔助反應之作用來檢測。
  16. 如請求項15之方法，其中該健全型酶輔助反應之作用係質子釋放。
  17. 如請求項16之方法，其中該質子釋放產生pH變化。
  18. 如請求項17之方法，其中該pH變化係利用固定在膜上之pH敏感性1-羥基-4-[1-(2-羥乙基磺醯基)苯基偶氮]-萘-2-磺酸鉀指示劑聚合物測定。
  19. 如請求項17之方法，其中該pH變化係利用pH敏感性纖維素乙酸酯偶合染料測定。
  20. 如請求項1之方法，其中該健全型酶共軛物之活性係藉由顏色變化檢測。
  21. 如請求項1之方法，其中該健全型酶共軛物之活性係藉由螢光發射檢測。
  22. 如請求項1之方法，其中該健全型酶共軛物之活性係藉由電化學法檢測。
  23. 如請求項18之方法，其中該顏色變化係由銀離子還原引起。
  24. 如請求項1之方法，其中該健全型酶共軛物之活性係藉由可溶性組分之沉澱檢測。
  25. 如請求項24之方法，其中該可溶性組分係蛋白質或pH敏感性聚合物。
  26. 如請求項25之方法，其中該蛋白質係BSA。
  27. 如請求項25之方法，其中該pH敏感性聚合物係選自由以 下組成之群：甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸2-(二甲基胺基)乙基酯及N-羥甲基丙烯醯胺。
  28. 如請求項1之方法，其進一步包含將前報告載體添加至該測試樣品，然後使該樣品施加區與該測試樣品接觸。
  29. 如請求項1之方法，其進一步包含位於該層析介質遠端之吸附墊。
  30. 如請求項1之方法，其中該受質係己酸烯丙酯及該健全型酶係羧酸酯酶。
  31. 一種用於檢測測試樣品內之分析物之存在之橫向流動試驗裝置，該橫向流動試驗裝置包含：層析介質，其包含：位於檢測區上游之樣品上料區；位於該樣品上料區與檢測區之間之報告載體區，其中該報告載體區包含可與該分析物形成複合物之報告載體，該報告載體包含載體及一或多種健全型酶盒；及檢測區，其中該檢測區包含用於該分析物之捕捉組分及指示劑，其中該指示劑檢測在健全型酶存在下之受質反應，藉此檢測該分析物之存在。
  32. 如請求項31之橫向流動試驗裝置，其進一步包含對照區，其中該對照區包含用於報告載體之捕捉組分及用於檢測在健全型酶存在下之受質反應之指示劑；其中檢測該酶報告載體複合物與受質之產物，藉此檢測該報告載體之存在。
  33. 如請求項31之橫向流動試驗裝置，其中該健全型酶共軛 物包含抗體。
  34. 如請求項31之橫向流動試驗裝置，其中該健全型酶共軛物包含核酸。
  35. 如請求項31之橫向流動試驗裝置，其中該健全型酶共軛物包含選自由以下組成之群之健全型酶：脲酶、磷酸膽鹼磷酸酶、β半乳糖苷酶、木糖還原酶、莽草酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶、羧酸酯酶、新普魯蘭酶、枯草桿菌蛋白酶、4-植酸酶、乙醯膽鹼酯酶、漆酶、細菌亮胺醯基胺基肽酶、三肽基-肽酶I、凝血因子VIIa、胰蛋白酶、β-呋喃果糖苷酶。
  36. 如請求項31之橫向流動試驗裝置，其中該抗體與健全型酶非共價相互作用，以形成該健全型酶共軛物。
  37. 如請求項31之橫向流動試驗裝置，其中該核酸共價附接至健全型酶以形成健全型酶共軛物。
  38. 如請求項31之橫向流動試驗裝置，其進一步在該檢測區中提供一或多種非活性酶原。
  39. 如請求項31之橫向流動試驗裝置，其中該健全型酶共軛物之活性係藉由監控該健全型酶輔助反應之作用檢測。
  40. 如請求項31之橫向流動試驗裝置，其中該指示劑係pH敏感性指示劑。
  41. 如請求項31之橫向流動試驗裝置，其中該指示劑係pH敏感性指示劑，係1-羥基-4-[1-(2-羥乙基磺醯基)苯基偶氮]-萘-2-磺酸鉀。
  42. 如請求項31之橫向流動試驗裝置，其中該指示劑係pH敏 感性指示劑，係pH敏感性纖維素乙酸酯偶合染料。
  43. 如請求項31之橫向流動試驗裝置，其中該報告載體區包含共軛物墊。
  44. 如請求項31之橫向流動試驗裝置，其中該樣品上料區包含樣品上料墊。
  45. 如請求項31之橫向流動試驗裝置，其進一步包含剛性或可撓性背襯材料。
  46. 如請求項31之橫向流動試驗裝置，其中該抗體係藉由非共價相互作用與該健全型酶締合。
  47. 如請求項31之橫向流動試驗裝置，其中該抗體或核酸共價附接至該健全型酶。
  48. 如請求項31之橫向流動試驗裝置，其進一步包含一或多種非活性酶原源。
  49. 如請求項31之橫向流動試驗裝置，其中該檢測區藉由檢測pH變化來檢測該健全型酶之產物。
  50. 如請求項31之橫向流動試驗裝置，其中該pH變化係利用pH敏感性水凝膠測定。
  51. 如請求項31之橫向流動試驗裝置，其中該檢測區藉由顏色變化來檢測該健全型酶之產物。
  52. 如請求項31之橫向流動試驗裝置，其中該檢測區藉由螢光發射來檢測該健全型酶之產物。
  53. 如請求項31之橫向流動試驗裝置，其中該檢測區藉由電化學法檢測該健全型酶之產物。
  54. 如請求項51之橫向流動試驗裝置，其中該顏色變化係由 銀離子還原引起。
  55. 如請求項31之橫向流動試驗裝置，該檢測區藉由可溶性組分之沉澱檢測該健全型酶之產物。
  56. 如請求項31之橫向流動試驗裝置，其中該可溶性組分係蛋白質或pH敏感性聚合物。
  57. 如請求項56之橫向流動試驗裝置，其中該蛋白質係BSA。
  58. 如請求項56之橫向流動試驗裝置，其中該pH敏感性聚合物係選自由以下組成之群：甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸2-(二甲基胺基)乙基酯及N-羥甲基丙烯醯胺。
  59. 如請求項31之橫向流動試驗裝置，其進一步包含在該層析介質遠端之吸附墊。
  60. 如請求項31之橫向流動試驗裝置，其中該受質係己酸烯丙酯及該健全型酶係羧酸酯酶。
  61. 一種用於檢測在測試樣品內之分析物之存在之橫向流動試驗套組，該橫向流動試驗裝置包含：多孔膜，其包含樣品上料區；位於該上料區下游之報告載體區，其中該報告載體區包含可與該分析物形成複合物之報告載體；位於該報告載體區下游之檢測區，其中該檢測區包含捕捉組分及指示劑；及用於該健全型酶之受質；其中係於該測試樣品流過 該橫向流動裝置後才施加該受質至該檢測區，並檢測該酶與該受質之產物。
  62. 如請求項61之橫向流動試驗套組，其進一步包含對照區，其中該對照區包含用於該報告載體之捕捉組分及用於檢測在健全型酶存在下之受質反應之指示劑；其中檢測該酶報告載體複合物與受質之產物，藉此檢測該報告載體之存在。
  63. 如請求項61之橫向流動試驗套組，其中該健全型酶共軛物包含抗體。
  64. 如請求項61之橫向流動試驗套組，其中該健全型酶共軛物包含核酸。
  65. 如請求項61之橫向流動試驗套組，其中該健全型酶共軛物包含選自由以下組成之群之健全型酶：脲酶、磷酸膽鹼磷酸酶、β半乳糖苷酶、木糖還原酶、莽草酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶、羧酸酯酶、新普魯蘭酶、枯草桿菌蛋白酶、4-植酸酶、乙醯膽鹼酯酶、漆酶、細菌亮胺醯基胺基肽酶、三肽基-肽酶I、凝血因子VIIa、胰蛋白酶、β-呋喃果糖苷酶。
  66. 如請求項61之橫向流動試驗套組，其中該抗體與健全型酶非共價相互作用，以形成健全型酶共軛物。
  67. 如請求項61之橫向流動試驗套組，其中該核酸共價附接至健全型酶，以形成健全型酶共軛物。
  68. 如請求項61之橫向流動試驗套組，其進一步在該檢測區中提供一或多種非活性酶原。
  69. 如請求項61之橫向流動試驗套組，其中該健全型酶共軛物之活性係藉由監控健全型酶輔助反應之作用檢測。
  70. 如請求項61之橫向流動試驗套組，其中該指示劑係pH敏感性指示劑。
  71. 如請求項70之橫向流動試驗套組，其中該指示劑係pH敏感性指示劑，係1-羥基-4-[1(2-羥乙基磺醯基)苯基偶氮]-萘-2-磺酸鉀。
  72. 如請求項70之橫向流動試驗套組，其中該指示劑係pH敏感性纖維素乙酸酯偶合染料。
  73. 如請求項61之橫向流動試驗套組，其中該報告載體區包含共軛物墊。
  74. 如請求項61之橫向流動試驗套組，其中該樣品上料區包含樣品上料墊。
  75. 如請求項61之橫向流動試驗套組，其進一步包含剛性或可撓性背襯材料。
  76. 如請求項61之橫向流動試驗套組，其中該抗體係藉由非共價相互作用與該健全型酶締合。
  77. 如請求項61之橫向流動試驗套組，其中該抗體或核酸共價附接至該健全型酶。
  78. 如請求項61之橫向流動試驗套組，其進一步包含一或多種非活性酶原源。
  79. 如請求項61之橫向流動試驗套組，其中該檢測區藉由檢測pH變化來檢測該健全型酶之產物。
  80. 如請求項79之橫向流動試驗套組，其中該pH變化係利用 pH敏感性水凝膠測定。
  81. 如請求項61之橫向流動試驗套組，其中該檢測區藉由顏色變化檢測該健全型酶之產物。
  82. 如請求項61之橫向流動試驗套組，其中該檢測區藉由螢光發射檢測該健全型酶之產物。
  83. 如請求項61之橫向流動試驗套組，其中該檢測區藉由電化學法檢測該健全型酶之產物。
  84. 如請求項81之橫向流動試驗套組，其中該顏色變化係由銀離子還原引起。
  85. 如請求項61之橫向流動試驗裝置，其中該檢測區藉由可溶性組分之沉澱檢測該健全型酶之產物。
  86. 如請求項85之橫向流動試驗裝置，其中該可溶性組分係蛋白質或pH敏感性聚合物。
  87. 如請求項86之橫向流動試驗裝置，其中該蛋白質係BSA。
  88. 如請求項86之橫向流動試驗裝置，其中該pH敏感性聚合物係選自由以下組成之群：甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸2-(二甲基胺基)乙基酯及N-羥甲基丙烯醯胺。
  89. 如請求項60之橫向流動試驗裝置，其進一步包含位於該層析介質遠端之吸附墊。
  90. 如請求項60之橫向流動試驗裝置，其中該受質係己酸烯丙酯及該健全型酶係羧酸酯酶。
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